Artyku³ przegl¹dowy Review
Powszechnie wprowadzone programy kontroli in-wazji paso¿ytniczych polegaj¹ g³ównie na stosowaniu syntetycznych lub pó³syntetycznych zwi¹zków prze-ciwpaso¿ytniczych. Leki te kumuluj¹ siê w tkankach zwierz¹t, co z punktu widzenia zdrowia cz³owieka budzi obawy. Niepokoj¹ce jest tak¿e gromadzenie siê tych zwi¹zków w rodowisku. Substancje te, nie pod-legaj¹c degradacji i nie trac¹c swojej aktywnoci, przez d³ugi czas mog¹ oddzia³ywaæ na organizmy wolno ¿yj¹ce (35). Ponadto, b³êdy w sposobie odrobaczania zwierz¹t prowadz¹ do pojawiania siê zjawiska
leko-opornoci (3, 20). Badania w ramach programów kontrolowania inwazji paso¿ytniczych zmierzaj¹ do opracowania nowych, bezpiecznych dla rodowiska rozwi¹zañ powstrzymuj¹cych rozprzestrzenianie siê chorób paso¿ytniczych. Jedn¹ z propozycji jest wyko-rzystanie w³aciwoci leczniczych zió³ stosowanych od dawna w medycynie i weterynarii. Spo¿ycie wielu zió³ powoduje ustêpowanie objawów towarzysz¹cych chorobom paso¿ytniczym prawdopodobnie z na-³o¿enia siê dwóch efektów, przeciwpaso¿ytniczego i wzmacniaj¹cego uk³ad odpornociowy ¿ywiciela. Ustalono, ¿e wiele gatunków rolin leczniczych po-siada w³aciwoci przeciwwirusowe,
immunomodu-Caenorhabditis elegans dogodny nicieñ
do badania przeciwpaso¿ytniczej aktywnoci
saponin rolinnych*
)
KINGA JÓWICKA, KATARZYNA DONSKOW-£YSONIEWSKA, MARIA DOLIGALSKA
Zak³ad Parazytologii Instytutu Zoologii Wydzia³u Biologii UW, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa
Jówicka K., Donskow-£ysoniewska K., Doligalska M.
Caenorhabditis elegans nematode convenient for the study of anthelmintic activity in plant saponins
Summary
Widely introduced parasitic control programs rely heavily on the use of synthetic or semi-synthetic antiparasitic compounds. The ineffectiveness of these therapies and growing drug resistance of nematodes leads researchers to search for new alternative methods to combat parasites. One proposal is to use the medicinal properties of herbs that have been used in medicine and veterinary practice for a longer period.
The research of activity of plant extracts and their fractions are increasingly important to develop therapies that improve the health of humans and also animals. Anthelmintic properties of plant compounds may be used in an environment where invasive forms of parasites develop. At this stage different compounds can affect the growth and development of parasites, such as inhibiting the molting process.
Knowledge of the development of nematodes is still incomplete. On account of the simple structure and transparent body of the nematode, Caenorhabditis elegans is a model species to study many phenomena. Development of the nematode (parasitic and free-living) is strictly programmed. Apoptosis is one of the major mechanisms involved in nematode development. The main apoptotic pathway proteins are CED-3, CED-4 (pro-apoptotic) and CED-9 (anti-apoptotic). Changes in the levels of these proteins may alter the course of organogenesis leading to adverse phenotypic effects.
Saponins are compounds commonly occurring in the plant kingdom (both in edible plants and herbs). The mechanism of the action of triterpenoidsaponins per cell is not fully understood. They show numerous properties such as immunomodulatory, antiviral, cytotoxic, or antitumor. Particularly derivatives of oleanolic acid and ursolic acid exhibit a variety of pharmacological properties without toxic side-effects.
Due to their characteristics active plant compounds, mainly derivatives of pentacyclictriterpenoids, are a potential source of anticancer, cytotoxic and anthelmintic new generation substances. These may affect the development of the parasite to regulate apoptosis. The discovery of the manner in which saponins are involved in apoptosis can be the first step toward the development a new drug for parasite diseases.
Keywords: Caenorhabditis elegans, plant saponins, nematodes
*) Badania finansowane ze rodków MNiSZW nr N304 17 32/4335, BW nr
luj¹ce, a nawet przeciwnowotworowe. Badania aktyw-noci ekstraktów rolinnych i ich frakcji maj¹ coraz wiêksze znaczenie dla opracowania terapii poprawia-j¹cych stan zdrowia nie tyko cz³owieka, ale i zwierz¹t hodowlanych (9). Kontrolowanie zara¿enia poprzez fitoterapiê mog³oby obni¿yæ koszty hodowli oraz ogra-niczyæ toksyczn¹ chemioterapiê.
Wskazanie substancji pochodzenia rolinnego i po-znanie, w jaki sposób wp³ywaj¹ one na procesy ko-mórkowe (30), jest kluczowe dla wyjanienia mecha-nizmów obni¿aj¹cych inwazyjnoæ paso¿ytów. Immu-nostymuluj¹ce w³aciwoci tych zwi¹zków mog¹ byæ wykorzystane do podniesienia ogólnego poziomu od-pornoci w populacji ¿ywiciela. To, co stwarza nadziejê na pomylne zastosowanie fitoterapii w chorobach paso¿ytniczych, to prosta, bo pokarmowa droga poda-nia leku, a tak¿e w³aciwoci stymuluj¹ce uk³ad od-pornociowy i toksyczny wp³yw na paso¿yta. W celu poznania w³aciwoci zwi¹zków zawartych w roli-nach niezbêdne s¹ zatem badania mechanizmów klu-czowych dla prze¿ycia na poziomie komórkowym, jak i ca³ego organizmu.
Przeciwnicieniowe w³aciwoci zwi¹zków pocho-dzenia rolinnego mog¹ byæ wykorzystane w rodo-wisku, w którym rozwijaj¹ siê formy inwazyjne paso-¿yta. Na tym etapie ró¿ne substancje mog¹ wp³ywaæ na wzrost i rozwój paso¿ytów, np. hamuj¹c proces li-nienia. Wiedza dotycz¹ca rozwoju nicieni jest wci¹¿ niepe³na, a w opracowaniu metod zwalczania paso¿y-tów niezbêdne jest okrelenie mechanizmów regulu-j¹cych ich rozwój, w tym apoptozy.
Caenorhabditis elegans to modelowy gatunek do badañ wielu zjawisk. Zdecydowa³y o tym prosta bu-dowa i przezroczyste cia³o tego nicienia. Cechy te umo¿liwiaj¹ obserwacjê podzia³ów ró¿nicuj¹cych siê komórek w organizmie pod mikroskopem. Ustalono ju¿ mapy linii rozwojowych dla ka¿dej komórki so-matycznej. Liczba komórek poszczególnych linii jest sta³a i u dojrza³ej formy hermafrodytycznej wynosi 959, a u samca 1031 komórek. Podczas rozwoju linii rozwijaj¹cej siê w neurony w procesie apoptozy eli-minowane s¹ 131 komórki (10, 32).
Nastêpn¹ cech¹ u³atwiaj¹c¹ prowadzenie badañ na C. elegans jest mo¿liwoæ obserwacji w krótkim cza-sie efektów wywo³anych dysfunkcji genów w prze-¿ywaj¹cym organizmie. Jest to uwarunkowane mozai-kowym typem rozwoju nicienia (18). Pozycja komó-rek w zarodku nie ma wp³ywu na ich dalsz¹ specjali-zacjê, gdy¿ podlegaj¹ one autosomalnej regulacji pod wp³ywem czynników obecnych w cytoplazmie. Ka¿da komórka jeszcze na poziomie zarodka ma wyznaczo-n¹ liczbê podzia³ów. Zakoñczenie podzia³ów oznacza pojawienie siê komórki o zdefiniowanej funkcji w ukszta³towanym narz¹dzie. Je¿eli komórka zosta-nie wyizolowana z zarodka, nicieñ rozwija siê dalej, ale jest pozbawiony tych struktur, w które rozwinê³a-by siê linia usuniêtej komórki (5, 39). Geny w tych liniach ulegaj¹ okrelonej ekspresji i s¹ w³¹czane
se-lektywnie (4, 40). Wydaje siê, ¿e po³¹czenie analizy genów z mo¿liwoci¹ obserwowania podzia³ów ko-mórek pod mikroskopem, podlegaj¹cych zmianom pod wp³ywem aktywnych zwi¹zków rolinnych mo¿e przy-czyniæ siê do okrelenia zakresu zmian wywo³ywanych przez stosowane czynniki na poziomie ca³ego orga-nizmu, linii komórkowych i poszczególnych komórek. Tak¿e w tym przypadku C. elegans spe³nia wszystkie warunki do przeprowadzenia badañ z zastosowaniem saponin rolin leczniczych.
Apoptoza
Procesem reguluj¹cym rozwój C. elegans, podob-nie jak u innych organizmów jest apoptoza. W wyni-ku tego mechanizmu usuwane s¹ komórki zgodnie z programem rozwoju nicienia. Zahamowanie lub nad-mierna indukcja programowanej mierci komórki mo¿e prowadziæ do deformacji organizmu. Zabu-rzenia rozwoju embrionalnego skutkuj¹ wypadaniem linii komórkowych i powstawaniem dysfunkcji kry-tycznych dla prze¿ycia organizmu (26).
Regulacja apoptozy jest z³o¿onym procesem. Bod-ce hamuj¹Bod-ce apoptozê to czynniki odpowiedzialne za prze¿ywanie komórek, takie jak: hormony, cz¹steczki sygna³owe s¹siednich komórek czy te¿ czynniki wzro-stu. Apoptoza mo¿e byæ indukowana zarówno przy niedoborze czynników wzrostowych, jak i w obec-noci specyficznych j¹ wywo³uj¹cych. Wi¹¿e siê to z ekspresj¹ odpowiednich receptorów na powierzchni b³ony komórkowej, co rozpoczyna kaskadê reakcji prowadz¹cych do programowanej mierci komórki. Apoptoza mo¿e byæ tak¿e wzbudzona przez czynniki wewn¹trzkomórkowe, poprzez tzw. szlak mitochon-drialny (17, 29, 31).
Proces apoptozy dzieli siê na 3 fazy: indukcji, wy-konawcz¹ i degradacji (37). W fazie indukcji komór-ka otrzymuje sygna³ do eliminacji, w fazie wykonaw-czej aktywowane s¹ enzymy proteolityczne, w fazie degradacji komórka rozpada siê na cia³ka apoptotycz-ne. Fazom tym towarzysz¹ zmiany biochemiczne i morfologiczne, m.in.: zmniejszenie objêtoci w wy-niku utraty wody, kondensacja chromatyny, fragmen-tacja j¹drowego DNA poprzedzaj¹ oddzielanie otoczo-nych b³on¹ komórkow¹ fragmentów komórek, które s¹ fagocytowane np. przez makrofagi (22, 23). Apop-toza u C. elegans jest regulowana przez produkty genów ced-3 i ced-4 (ced, cell-deathabnormal). Oba geny s¹ niezbêdne do wejcia komórki w apoptozê i z tego powodu s¹ one nazywane genami mierci. Genem hamuj¹cym apoptozê jest gen ced-9 (2, 14, 15).
Po wzbudzeniu apoptozy jako pierwszy ulega eks-presji gen ced-4, który aktywuje gen ced-3, indukuj¹-cy kaspazy fazy wykonawczej. Podczas hamowania apoptozy produkt genu ced-9 inaktywuje gen ced-4, blokuj¹c tym samym gen ced-3. Mutacje genu ced-9 powoduj¹, ¿e niefunkcjonalne bia³ko CED-9 s³abiej wi¹¿e siê z CED-4. Niski poziom lub brak kompleksu
CED-9/CED-4 mo¿e zatem porednio hamowaæ apop-tozê (19, 34, 42). Poziom bia³ka CED-9 jest tak¿e regu-lowany poprzez bia³ko EGL-1 (egg-layingdefective), produkt genu egl-1. Bia³ko to posiada domeny wi¹¿¹-ce zarówno bia³ka proapoptotyczne, jak i antyapop-totyczne; tworz¹c kompleks z CED-9 blokuje jego aktywnoæ antyapoptotyczn¹, co skutkuje wejciem komórki w apoptozê. Dodatkowo kompleks EGL-1/ CED-9 mo¿e porednio wp³ywaæ na zwiêkszenie eks-presji CED-4 i aktywacjê CED-3 (19, 42). Analiza genomu C. elegans doprowadzi³a do zidentyfikowa-nia 2 genów: ces-1 i ces-2 (celldeathspecification) od-powiedzialnych za indukcjê ekspresji EGL-1 w 131 ko-mórkach przeznaczonych do eliminacji. Transkrypcja genów ces zatem porednio prowadzi do indukcji apop-tozy: gdy aktywne bia³ko EGL-1 ³¹czy siê z CED-9, apoptoza zostaje wzbudzona. Mechanizm wybiórcze-go w³¹czania transkrypcji genów ces nie jest poznany i przypuszcza siê, ¿e indukcja genów ces zwi¹zana jest z sygna³ami zewn¹trzkomórkowymi, a tak¿e z genem egl-1, który porednio odpowiedzialny jest za deter-minacjê p³ci nicienia (10).
W fazie wykonawczej apoptozy zarówno u C. ele-gans, jak i ssaków aktywowany jest uk³ad proteaz z ro-dziny kaspaz (caspase cysteineasparticacid-specifi-cenzyme). Uk³ad ten tworzy ponad 10 czynników, które dzia³aj¹ na zasadzie reakcji ³añcuchowej: aktywowa-nie jednej kaspazy prowadzi do uruchomienia innych i nieodwracalnego wprowadzenia komórki na drogê apoptozy. Substratami tej proteolitycznej kaskady s¹ zarówno bia³ka strukturalne, jak i enzymy istotne w przemianach metabolicznych komórki: bia³ka szkie-letu komórki, bia³ka wycielaj¹ce wewnêtrzn¹ po-wierzchniê otoczki j¹drowej w tym laminy, aktyna i fodryna. Ponadto kaspazy trawi¹ szereg bia³ek uczest-nicz¹cych w procesach molekularnych zwi¹zanych z cyklem komórkowym (17, 22, 31).
W fazie degradacji u C. elegans zidentyfikowano 6 genów: geny ced-1, ced-6 i ced-7 reguluj¹ce fagocy-tozê i geny ced-2, ced-5, ced-10, które odpowiedzial-ne s¹ równie¿ za proces usuwania komórek. Mutacje w 2 genach pochodz¹cych z 2 ró¿nych grup powoduj¹ taki sam efekt, jak mutacja w obrêbie jednej z grup. Mutacje te powoduj¹ czêciowe zahamowanie fago-cytozy. Sugeruje to, ¿e obie grupy genów dzia³aj¹ wy-miennie. Wybiórczy mechanizm ekspresji genów nie jest poznany i nie wiadomo, jakie czynniki wp³ywaj¹ na aktywowanie grup genów odpowiedzialnych za fa-gocytozê (41).
Najnowsze badania pozwoli³y wstêpnie oceniæ funk-cje bia³ek szlaku apopototycznego. Bia³ko CED-1 (na-le¿¹ce do I grupy) jest ródb³onowym receptorem i po-jawia siê przed sfagocytowaniem cia³ek apoptotycz-nych. Po zwi¹zaniu siê ligandu CED-6 z receptorem CED-1 proces fagocytowania tych cia³ek wzmaga siê, ale nie jest to niezbêdne do rozpoczêcia fagocytozy. Ostatnim bia³kiem nale¿¹cym do I grupy jest bia³ko CED-7 (homolog bia³ka ABCA1/2 u ssaków). Bia³ko
ABCA1/2 u ssaków pe³ni funkcjê znacznika, odpo-wiedzialne jest za ekspozycjê cholesterolu w b³onach komórek apoptotycznych. Funkcja tego bia³ka w szla-ku apoptotycznym nicienia nie jest do koñca wyjanio-na i prawdopodobnie wzmacnia ono funkcje bia³ka CED-1 (21).
Druga grupa bia³ek odpowiedzialnych za fagocyto-zê C. elegans to: CED-5, CED-2, CED-12. Bia³ka te s¹ w³¹czone w polimeryzacjê filamentów aktynowych i prawdopodobnie pe³ni¹ funkcjê analogiczn¹ do bia-³ek aktywuj¹cych cie¿kê Rac u ssaków. Bia³ka Rac nale¿¹ do rodziny bia³ek Rho odpowiedzialnych za uk³ad cytoszkieletu aktynowego w komórkach fago-cytuj¹cych (24). Du¿¹ grupê wewn¹trzkomórkowych regulatorów apoptozy szlaku mitochondrialnego u ssa-ków stanowi rodzina bia³ek Bcl-2. Rodzina Bcl-2 sk³a-da siê z kilku bia³ek, które tworz¹ homo- lub hetero-dimery. Efekt biologiczny tych kompleksów mo¿e byæ odmienny. Bcl-x1 i Bfl-1 hamuj¹ apoptozê poprzez blokadê kaskady kaspaz. Pozosta³e bia³ka wchodz¹ce w sk³ad tej rodziny, tj. Bax, Bak, Bad i Bid, aktywuj¹ apoptozê. Równowaga pomiêdzy bia³kami regulato-rowymi nale¿¹cymi do rodziny Bcl-2 determinuje los komórki (17, 23, 31). Poza rodzin¹ bia³ek Bcl-2 regu-latorami s¹ bia³ka okrelane jako IAP (inhibitors of apoptosis), hamuj¹ce apoptozê.
Geny apoptotyczne C. elegans s¹ wysoce konser-watywne ewolucyjnie, dziêki czemu mo¿liwe by³o wyznaczenie homologicznych genów oraz bia³ek ni-cienia i ssaka. S¹ to: CED-3 (homolog kasapazy wy-konawczej), CED-4 (homolog ludzkiego Apaf-1), EGL-1 (homolog ludzkiego Bad) oraz g³ówne bia³ko antyapoptotyczne CED-9 (homolog ludzkiego Bcl-2). Hamowanie ekspresji genu bcl-2 w ch³oniaku grud-kowym (choroba Brilla i Symmersa) powoduje wej-cie komórek w apoptozê (16, 25). Podobne zjawisko obserwuje siê u C. elegans. Sugeruje to, ¿e u nicieni i krêgowców jest ten sam molekularny mechanizm ha-mowania apoptozy, za który odpowiedzialne s¹ geny nicienia ced-9 i ludzkie bcl-2.
Szczegó³owe badania wykaza³y, i¿ wystêpuje wy-soka homologia miêdzy produktem genu ced-3 nicie-nia a asparaginow¹ proteinaz¹ cysteinow¹ u ssaków. Proteinaza ta u ssaków aktywuje szlak kaspaz, co do-prowadza do kondensacji chromatyny i degradacji DNA. Podobn¹ funkcjê pe³ni bia³ko CED-3 u C. ele-gans (21). Podobieñstwo funkcjonalne dotyczy tak¿e bia³ek CED-4 C. elegans i Apaf-1 ssaków. Obie cz¹steczki w swojej budowie zawieraj¹ domeny wi¹-¿¹ce ATP, który jest niezbêdny do aktywacji katali-tycznej tych bia³ek. Ponadto u ssaków komórki prze-znaczone do usuniêcia prezentuj¹ fosfatydyloserynê Phosphatydyloserine (PC) na zewnêtrznej warstwie b³ony komórkowej. Wprawdzie u C. elegans uda³o siê zidentyfikowaæ homologiczne enzymy uczestnicz¹ce w tym procesie, ale jednak nie dochodzi do ekspono-wania PC na komórkach apoptotycznych przeznaczo-nych do fagocytozy (9, 39).
Biochemicznym wskanikiem apoptozy jest frag-mentacja DNA odbywaj¹ca siê w okrelonych miej-scach ³añcucha DNA. Proces ten zachodzi w dwóch etapach, regulowanych przez aktywowane kaspazy, które trawi¹ bia³ko odpowiedzialne za utrzymywanie enzymów degraduj¹cych DNA w nieaktywnej formie. W pierwszym etapie wiêksze fragmenty o d³ugoci 300 i 50 kb s¹ odszczepiane, najprawdopodobniej przy udziale topoizomerazy II (DNA-za zale¿na od Mg++),
w drugim etapie mniejsze oligonukleosomowe frag-menty odszczepiane s¹ przez endonukleazê zale¿n¹ od jonów wapnia. Fragmentacja DNA jest wykorzysty-wana w praktyce w badaniach morfologicznych nad apoptoz¹. Znakowanie specyficznych fragmentów j¹d-rowego DNA w miejscach jego pêkniêæ umo¿liwia obrazowanie komórek w fazach apoptozy. Wiele ba-dañ nad apoptoz¹ opiera siê w³anie na metodzie ozna-czania powsta³ych w wyniku dzia³ania terminalnej transferazy zakoñczonych dUTP fragmentów DNA (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling TUNEL) (26).
Z przedstawionych powy¿ej danych wynika, ¿e apoptoza u C. elegans mo¿e byæ rozpoznawana na podstawie poziomu ekspresji bia³ek reguluj¹cych jej przebieg na wszystkich etapach. W przypadku nicieni paso¿ytniczych zjawisko apoptozy nie jest opisane. Wydaje siê jednak, ¿e regulacja zachodz¹ca podczas ich rozwoju bêdzie mia³a podobne cechy jak u C. ele-gans. Formy wolno ¿yj¹ce paso¿ytów, rozwijaj¹ce siê w rodowisku zewnêtrznym stanowi¹ dogodny i ³atwy materia³ do przeprowadzenia badañ porównawczych. Z dotychczas przeprowadzonych badañ w Zak³adzie Parazytologii UW wynika, ¿e jaja i larwy nicienia Heligmosomoides bakeri s¹ wra¿liwe na saponiny triterpenoidowe lub steroidowe. Zwi¹zki te w ró¿ny sposób dzia³aj¹ toksycznie na nicienie (7), w tym tak¿e naruszaj¹ przebieg apoptozy (dane niepublikowane).
Nicienie to grone szkodniki i paso¿yty. Nowe me-tody kontrolowania inwazji odrzucaj¹ wybiórcze sto-sowanie antyhelmintyków z powodu coraz szerszej lekoopornoci paso¿ytów. Zidentyfikowanie avermek-tyny i milbemycyny wzbudzi³o szerokie zainteresowa-nie produktami naturalnego pochodzenia, metabolitów mikroorganizmów lub rolin (9). Obecnie zmierza siê do wprowadzenia upraw rolin transgenicznych z ge-nami opornoci na patogeny obok innych biologicz-nych strategii (35) np. opartych o zastosowanie sub-stancji, zawieraj¹cych naturalne czynniki przeciwpa-so¿ytnicze. Przyk³adem mog¹ byæ saponiny triterpe-noidowe izolowane z ró¿nych rolin.
Aktywne produkty rolinne
Saponiny s¹ zwi¹zkami powszechnie wystêpuj¹cy-mi przede wszystkim w królestwie rolin (zarówno w rolinach jadalnych, jak i zio³ach). Ju¿ od wieków znane by³y ze swoich licznych w³aciwoci leczni-czych. Wynikaj¹ one z tego, ¿e substancje te, uwa¿ane dotychczas za wtórne metabolity rolin, s¹
niejedno-rodn¹ grup¹ zwi¹zków chemicznych. Zbudowane s¹ z czêci cukrowej (glikonu) i czêci niecukrowej (agli-konu). Podstawowym kryterium podzia³u saponin jest rodzaj aglikonu. S¹ to przede wszystkim glikozydy triterpenoidów lub steroli. Czeæ niecukrow¹ stanowi najczêciej od 4 do 6 piercieni wêglowych, do któ-rych przy³¹czone s¹ wi¹zaniem eterowym lub estro-wym ³añcuchy cukrowe. Najpowszechniej wystêpuj¹-ce monosacharydy to: D-glukoza, D-galaktoza, L-fu-koza i L-arabinoza. Pentacykliczne triterpenoidy to metabolity rolin powszechnie wystêpuj¹ce w nasio-nach, liciach, ³odygach. Szczególnie triterpenoidy kwasu oleanolowego i ursolowego wykazuj¹ ró¿no-rodne farmakologiczne w³aciwoci, bez toksycznego dzia³ania ubocznego. Z tego powodu mog¹ byæ ród-³em wielu czynników o szerokim spektrum dzia³ania (9, 30).
Mechanizm dzia³ania saponin triterpenoidowych na komórkê nie jest do koñca poznany. Wiadomo, ¿e dziê-ki swojej ró¿norodnej budowie mogê wp³ywaæ zarów-no na szlaki przekanictwa w komórce, jak i na sam¹ strukturê komórek (9). Stosunkowo dobrze scharakte-ryzowan¹ grup¹ zwi¹zków s¹ saponiny steroidowe. Maj¹ zdolnoæ uszkadzania b³on komórkowych. Zwi¹zki te ³¹cz¹ siê ze sterolami buduj¹cymi b³ony komórkowe g³ównie z cholesterolem. Po³¹czenia te powoduj¹ powstawanie porów w b³onach, a zatem zmieniaj¹ przepuszczalnoæ b³on, co zaburza selektyw-noæ transportu. Wykazano, ¿e przy³¹czenie saponiny do b³ony jest procesem nieodwracalnym. Dodatkow¹ w³aciwoci¹ saponin steroidowych jest zdolnoæ do hemolizy b³on erytrocytów. W mniejszym stopniu ak-tywnoæ hemolityczn¹ wykazuj¹ saponiny triterpeno-idowe, g³ównie pochodne kwasu oleanolowego. Po-wszechnie wystêpuj¹cymi w królestwie rolin saponi-nami triterpenoidowymi s¹ glikozydowe pochodne kwasu oleanolowego. Wykazuj¹ one liczne w³aciwo-ci immunomodulacyjne, przeciwwirusowe, cytotok-syczne oraz przeciwnowotworowe (9, 30). Ponadto mog¹ hamowaæ wzrost bakterii, wp³ywaæ na ich morfo-logiê, a tak¿e wzmagaæ ich autolizê (27). Kwas urso-lowy (UA), izomer kwasu oleanolowego obecny w ro-linach uprawnych i zio³ach, wykazuje w³aciwoci przeciwzapalne, oksydacyjne oraz cytotoksyczne. Wzrost zainteresowania aktywnymi substancjami rolin, a szczególnie saponinami triterpenoidowymi, wynika z faktu, i¿ charakteryzuj¹ siê one szerokim spektrum dzia³ania. Obecnie prowadzone s¹ badania aktywnoci tych zwi¹zków wobec mikroorganizmów (wirusy, bakterie, grzyby), paso¿ytów, jak i linii ko-mórek nowotworowych.
Naturalne triterpenoidy ze wzglêdu na swoj¹ struk-turê mog¹ byæ rozwa¿ane jako czynniki przeciwno-wotworowe (12). Saponiny triterpenoidowe Acacia victoriae hamowa³y wzrost komórek nowotworowych linii Jurkat poprzez bezporednie indukowanie mito-chondrialnego szlaku apoptozy (13). Stê¿enie saponin toksyczne dla tych komórek by³o znacznie ni¿sze ni¿
wymagane do hemolizy, co mo¿e oznaczaæ, ¿e za efekt cytotoksyczny odpowiada inny mechanizm ni¿ suge-rowana dotychczas perforacja b³ony komórkowej (11). Saponiny tworz¹ nierozpuszczalne kompleksy z cho-lesterolem tak¿e w b³onach komórkowych Toxoplas-ma gondii (28). Triterpenoidy kwasu oleanolowego Liquidambar formosana hamuj¹ aktywnoæ czynnika transkrypcyjnego NFAT (6).
Mechanizm uszkadzania komórek nowotworowych wymaga szczegó³owych badañ ze wzglêdu na zaha-mowany w nich proces apoptozy. Kwas oleanolowy (OA) i ursolowy (UA) hamuj¹ wzrost komórek HuH7, w których nastêpuje wzrost ekspresji bia³ka antyapop-totycznego Bcl-2. OA i UA indukuj¹c apoptozê, po-woduj¹ uwalnianie cytochromu c z mitochondrium do cytoplazmy, aktywuj¹c kaspazê 9 i kaspazê-3. Tak¿e aktywnoæ NF-kB jest zahamowana w tych komórkach pod wp³ywem saponin (33). Badanie wybranych linii komórek nowotworowych in vitro jest przydatne, jednak nie obejmuje tych zjawisk, które maj¹ miejsce w funkcjonuj¹cym organizmie. Alternatyw¹ mog¹ byæ badania C. elegans. Wyniki badañ tego nicienia mo¿-na równie¿ bezporednio przenieæ mo¿-na nicienie paso-¿ytnicze, a cilej mówi¹c na ich formy wolno ¿yj¹-ce, dyspersyjne i inwazyjne. Oznaczenie aktywnoci pro- lub antyapoptotycznej saponin mo¿e stanowiæ pierwszy krok w identyfikacji substancji nicieniobój-czej. W naszych dotychczasowych badaniach (36) wykazano antybakteryjne i przeciwpaso¿ytnicze dzia-³anie wolnego kwasu oleanolowego i jego glikozydów oraz glukuronozydów izolowanych z nagietka C. offi-cinalis. Glikozydy kwasu oleanolowego hamowa³y rozwój, obni¿a³y ¿ywotnoæ larw stadium L3 nicienia jelitowego myszy Heligmosomoides bakeri. Aktywne substancje rolinne mog¹ równie¿ modyfikowaæ pro-cesy towarzysz¹ce prawid³owemu rozwojowi organi-zmów, prowadz¹c do patologicznych zmian. Ekstrak-ty z Lawsonia inermis (lawsonia bezbronna) i Cheno-podium ambrosioides (komosa pi¿mowa) posiadaj¹ silne w³aciwoci hamuj¹ce rozwój jaja nicienia Hae-monchus contortus. Podawanie odpowiednio sprepa-rowanych lici C. ambrosioides owcom redukowa³o zara¿enie paso¿ytem nawet o 36% (8). Dzia³anie ha-muj¹ce rozwój paso¿ytów zidentyfikowano równie¿ w wyci¹gach z Allium sativum (czosnek pospolity), które znacz¹co hamowa³y wykluwanie siê larw Asca-ris suum. Mechanizm dzia³ania tych zwi¹zków na jaja paso¿yta nie jest poznany (38). Wykazano równie¿, ¿e saponiny triterpenoidowe wyizolowane z nagietka le-karskiego (Calendula officinalis) hamuj¹ namna¿anie siê wirusa opryszczki Herpes simplex 1 i 2 oraz wiru-sa grypy (9). Frakcja z lici Rosmarinum officinalis (rozmaryn lekarski) zawieraj¹ca 3 kwasy triterpeno-idowe eliminuje paso¿ytniczego pierwotniaka Trypa-nosoma cruzi (1). Saponiny triterpenoidowe wykazuj¹ równie¿ dzia³anie przeciwgrzybicze. Hedryna wyizo-lowana z lici bluszczu (Hedera helix) oraz primulo-saponina A z korzeni Primula officinalis
(pierwiosn-ka zwyczajnego) tworzy kompleksy z cholesterolami w cianach grzybów, prowadz¹c do ich uszkodzenia (29). Obecnie prowadzi siê intensywne badania nad otrzymaniem frakcji zawieraj¹cej substancje aktywne. Frakcje saponin triterpenoidowych, glikozydy i glu-kuronoidy kwasu oleanoloewgo z nagietka lekarskie-go (Calendula officinalis) oraz buraka zwyk³elekarskie-go (Beta vulgaris) wp³ywaj¹ na wykluwanie siê i prze¿ywal-noæ larw inwazyjnych H. bakeri (7). Po zahamo-waniu aktywnoci pompy glikoproteinowej przez te zwi¹zki ¿ywotnoæ nicienia uleg³a znacznemu obni-¿eniu. Wykazano tak¿e, ¿e frakcja glukuronozydów z nagietka mo¿e wp³ywaæ na zaburzenia procesu apop-tozy u tego nicienia, zmieniaj¹c poziom regulacji bia-³ek proapototycznych, g³ównie bia³ka CED-3 (dane niepublikowane).
Podsumowanie
Aktywne substancje rolinne, g³ównie pochodne pentacyklicznych triterpenoidów, dziêki swoim w³a-ciwociom stanowi¹ potencjalne ród³o substancji przeciwnowotworowych, cytotoksycznych i przeciw-paso¿ytniczych nowej generacji. Mog¹ one wp³ywaæ na rozwój paso¿yta, reguluj¹c apoptozê komórek. Pro-wadziæ to mo¿e do pojawiania siê dysfunkcji fizjolo-gicznych prowadz¹cych do zaburzenia cyklu ¿yciowe-go paso¿ytów. Podawane równie¿ w odpowiednich dawkach zwierzêtom mog¹ spe³niaæ funkcjê rodka terapeutycznego.
Wskazuj¹c na potencjalne w³aciwoci przeciwni-cieniowe saponin triterpenoidowych, nale¿y uwzglêd-niæ ich toksyczny wp³yw na organizmy, zahamowanie podzia³ów komórkowych poprzez zatrzymanie cyklu komórkowego, indukowanie procesu apoptozy, szla-ku zewn¹trz- i wewn¹trzkomórkowego oraz zdolnoæ perforowania b³ony komórkowej.
Pimiennictwo
1.Aballay, Ausubel M. F.: Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditiselegans from Salmonella typimurium media-ted killing. PNAS 2001, 5, 2735-2739.
2.Abe F., Yamauchi T., Nagao T., Kinjo J., Okabe H., Higo H., Akahane H.: Ursolic acid as a trypanocidal constituent in rosemary. Biol. Pharm. Bull. 2002, 25, 1485-1487.
3.Barton D.: Antibiotic use in animal feed and its impact on human health. Nutr. Res. Rev. 2000, 13, 279-299.
4.Bose J., Gruber A., Helming L., Schiebe S., Wegener I., Hafner M., Beales M., Kontgen F., Lengeling A.: The phosphatidylserine receptor has essential func-tions during embryogenesis but not in apoptotic cell removal. J. Biol. 2004, 3, 15.
5.Cellerino A., Bahr M., Isenmann S.: Apoptosis in the developing visual sys-tem. Cell Tissue Res. 2000, 301, 53-69.
6.Dat T., Lee S., Cai F., Shen G., Kim H.: Oleananetriterpenoids with inhibi-tory activity against NFAT transcription factor from Liquidambar formosana. Biol. Pharm. Bull. 2004, 27, 426-428.
7.Doligalska M., Jówicka K., Kiersnowska M., Mroczek A., Paczkowski C., Janiszowska W.: Triterpenoidsaponins affect the function of P-glycoprotein and reduce the survival of the free-living stages of Heligmosomoidesbakeri. Vet. Parasitol. 2011, 179, 144-151.
8.Eguale T., Giday M.: In vitro anthelmintic activity of three medicinal plants agains Haemonchuscontortus. Int. J. Green Pharm. 2009, 3, 29-34. 9.Francis G., Kerem Z., Makkar S. P. H., Becker K.: The biological action of
10.Fraser A. G.: Programmed cell death in C. elegans. Cancer Metastasis Rev. 1999, 18, 285-294.
11.Haddad M., Laurens V., Lacaille-Dubois M.: Induction of apoptosis in a leukemia cell line by triterpenesaponins from Albiziaadianthifolia. Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, 4725-4734.
12.Han T., Li J., Huang F., Yu G., Fang B.: Tritrpenoidsaponins from Anemone flaccida induce apoptosis activity in HeLa cells. J. Asian. Nat. Prod. Res. 2009, 11, 122-127.
13.Haridas V., Higuchi M., Jayatilake G., Bailey D., Mujoo K., Blake M., Arntzen Ch., Gutterman J.: Avicins: triterpenoidsaponins from Acacia victo-riae (Bentham) induce apoptosis by mitochondrial perturbation. PNAS 2001, 98, 5821-5826.
14.Hengartner M. O., Ellis R. E., Horvitz H. R.: Caenorhabditiselegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature 1992, 356, 494--499.
15.Horvitz H. R., Shaham S., Hengartner M. O.: The genetics of programmed cell death in the nematode Caenorhabditiselegans. Nature 1994, 385, 653--656.
16.Igaki T., Miura M.: Role of Bcl-2 family members in invertebrates. Biochim. Biophys. Acta. 2004, 1644, 73-81.
17.Jacobson M.: Programed cell death: a missing link is found. Cell Biol. 1997, 12, 467-469.
18.Jacobson M., Weil M., Raff C. M.: Programmed cell death in animal develop-ment. Cell 1997, 88, 347-354.
19.Kanuka H., Hisahara S., Sawamoto K., Shoji S., Okano S., Miura M.: Pro-apoptotic activity of Caenorhabditiselegans CED-4 protein in Drosophila: Implicated mechanisms for caspase activation. Cell Biol. 1999, 96, 145-150. 20.Kerboeuf D., Blackhall W., Kaminskyc T., von Samson-Himmelstjerna G.: P-glycoprotein in helminthes: function and perspectives for anthelmintic treatment and reversal of resistance. Int. J. Antimicrob. Agents. 2003, 22, 332-334.
21.Kinchen J.: A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis 2010, 15, 998-1006.
22.Kinchen M., Ravichandran S.: Journey to the grave: signaling events regula-ting removal of apoptotic cells. J. Cell Sci. 2007, 120, 2143-2149. 23.Li P., Nijhawan D., Wang X.: Mitochondrial activation of apoptosis. Cell.
2004, 116, S57-S61.
24.Mangahas M., Yu X., Miller G., Zhou Z.: The small GTPase Rab2 functions in the removal of apoptotic cells in Caenorhabditiselegans. J. Cell Biol. 2008, 180, 357-373.
25.Maliñska D.: Programowana mieræ komórki (apoptoza) w procesie zapal-nym. Nowa Med. 1999, 4, 12-17.
26.Meier P., Finch A., Evan G.: Apoptosis in development. Nature 2000, 407, 796-801.
27.Muley B., Khadabadi S., Banarase N.: Phytochemical constituents and phar-macological activities of Calendula officinalis Linn (Asteraceae): A Review. Trop. J. Pharm. Res. 2009, 8, 455-465.
28.Pacheco-Soares C., de Souza W.: Localization of saponin-sterol complexes and lectin-binding sites during interaction of Toxoplasma gondii with host cell. Parasitol. Res. 2000, 86, 529-536.
29.Petit P.: Fengreek steroid saponins, food intake and plasma lipids. Steroids. 1995, 60, 674-680.
30.Rochfort S., Parker A., Dunshea F.: Plant bioactives for ruminant health and productivity. Phytochemistry 2008, 69, 299-322.
31.Savill J., Gregory Ch., Haslett Ch.: Eat me or die. Science 2003, 302, 1516--1517.
32.Schierenberg E.: Developmental strategies during early embriogenesis of Caenorhabditis elegans. J. Embryol. 1986, 97, 31-44.
33.Shyu M., Kao T., Yen G.: Oleanolic acid and ursolic acid induce apoptosis in HuH7 Human hepatocellular Carcinoma cells through a mitochondrial depended pathway and downregulation of XIAP. J. Argic. Food Chem. 2010, 58, 6110-6118.
34.Spector M., Desnoyers S., Hoeppner D., Hengartner M.: Interaction between the C. elegans cell-death regulators CED-9 and CED-4. Nature 1997, 385, 653-656.
35.Stear M., Doligalska M., Donskow-Schmelter K.: Alternatives to anthelmin-tics for control of nematodes in livestock. Parasitology 2007, 134, 139-151. 36.Szakiel A., Ruszkowski D., Grudniak A., Kurek A., Wolska I. K., Doligal-ska M., Janiszowska W.: Antibacterial and antiparasiticactivaty activity of oleanolic acid and its glycosides isolated from marigold (Calendula officina-lis). Planta Med. 2008, 74, 1709-1715.
37.Twomey C., McCarthy J.: Pathways of apoptosis and importance in develop-ment. J. Cell. Mol. Med. 2005, 9, 345-359.
38.Urban J., Kokoska L., Matejkova J.: In vitro anthelmintic effets of medicinal plants used in Czech Republic. Pharm. Biol. 2008, 46, 808-813.
39.Voronov A. D., Panchin V. Y.: Cell lineage in marine nematode Enoplus brevis. Development 1998, 125, 143-150.
40.Wiegner O., Schierenberg E.: Regulative development in nematode embryo: a hierarchy of cell fate trasformations. Dev. Biol. 1999, 215, 1-12. 41.Wu C., Horvitz R.: The C. elegans cell corpse engulfment gene CED-7
enco-des a protein similar to ABC transporters. Cell 1998, 93, 951-960. 42.Yan N., Gu L., Kokel D., Chai J., Wenyu H., Aidong C., Lin X.: Structural,
Biochemical, and Functional Analyses of CED-9 Recognition by the Pro-apoptotic Proteins EGL-1 and CED-4. Mol. Cell. 2004, 15, 999-1006.
Adres autora: mgr Kinga Jówicka, ul. Miecznikowa 1, 02-96 Warszawa; e-mail: kingajozw@biol.uw.edu.pl
