Artyku³ przegl¹dowy Review
Diagnostyka mikrobiologiczna jest podstawowym narzêdziem umo¿liwiaj¹cym wykrycie i identyfikacjê czynnika etiologicznego zaka¿enia oraz dokonanie wyboru w³aciwego leczenia. Do podstawowych me-tod diagnostyki bakteriologicznej nale¿¹: hodowla i izolacja drobnoustrojów, okrelanie profili bioche-micznych, oznaczenie lekoopornoci oraz badania se-rologiczne (4). Klasyczne metody diagnostyczne nie utraci³y do dzisiaj swojej dominuj¹cej roli, pomimo rozwoju innych metod i pomimo cile zwi¹zanej z nimi koniecznoci utrzymywania bakterii przy ¿yciu. W rutynowej diagnostyce pa³eczek Salmonella zasto-sowanie maj¹ przede wszystkim metody konwencjo-nalne, bakteriologiczne, zmierzaj¹ce do izolacji i iden-tyfikacji bakterii w metodach hodowlanych (23, 43).
W codziennej praktyce laboratoryjnej nieznane szczepy, izolowane z próbek materia³ów klinicznych, produktów spo¿ywczych, od zwierz¹t, z materia³ów odzwierzêcych, z pasz i innych, identyfikowane s¹ wstêpnie do rodzaju Salmonella na podstawie ich w³aciwoci biochemicznych i w dalszej kolejnoci na podstawie reakcji serologicznych z antygenami so-matycznymi (O) i rzêskowymi (H). Typowanie
sero-logiczne (serotypowanie) jest wa¿nym etapem postê-powania diagnostycznego.
O ró¿nicach w wykrywalnoci pa³eczek Salmonella decyduje wiele parametrów: rodzaj i wielkoæ bada-nej próbki, ród³o jej pochodzenia, rodzaj i sk³ad zastosowanych po¿ywek, czas i temperatura namna-¿ania selektywnego czy liczba kolonii pobranych do badania. A zatem zastosowanie odpowiednio dobra-nej procedury oraz wybór w³aciwej metody i odpo-wiednich po¿ywek decyduje o skutecznoci wykrywa-nia bakterii Salmonella (43). Stosowane s¹: p³ynne po¿ywki nieselektywne, p³ynne i pó³p³ynne po¿ywki namna¿aj¹ce, sta³e po¿ywki wybiórczo--ró¿nicuj¹ce oraz po¿ywki (tzw. szeregi biochemicz-ne) pozwalaj¹ce na okrelenie cech biochemicznych izolowanych drobnoustrojów, czyli zdolnoci do me-tabolizowania ró¿nych substancji lub wytwarzania okrelonych enzymów (8).
Z ka¿dej po¿ywki wybiórczo-ró¿nicuj¹cej izoluje siê co najmniej po dwie kolonie, uwzglêdniaj¹c kolonie podejrzane i w¹tpliwe. Wybrane kolonie poddaje siê badaniom za pomoc¹ testów biochemicznych. W³a-ciwe odczytanie cech biochemicznych jest mo¿liwe
Metody typowania bakterii Salmonella
BO¯ENA DERA-TOMASZEWSKA
Zak³ad Mikrobiologii Molekularnej i Serologii, Krajowy Orodek Salmonella Wydzia³ Lekarski Gdañskiego Uniwersytetu Medycznego, ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdañsk
Dera-Tomaszewska B.
Salmonella common typing methods
Summary
Serotyping is a traditional method of Salmonella typing that makes it possible to classify these bacteria by the White-Kauffmann-Le Minor scheme (formerly known as Kauffmann-White scheme) on the basis of variation in the Salmonella somatic (O) and flagellar (H) antigens. It is still the primary method by which Salmonella are identified immediately after the initial isolation of these microorganisms. It is a convenient way to categorize isolates, but surface antigens alone cannot provide information about overall genetic relatedness of strains. It is also, in most cases, not sufficient to simply carry out a successful serotyping in order to gain insights into the epidemiology and source of infection. Phage typing, based on the susceptibility to a panel of standard bacteriophages, is a historically important epidemiological tool for the categorization of Salmonella, but like serotyping, it does not reflect the overall bacterial genotype. Therefore, numerous typing methods have been developed to further analyse the origin of Salmonella isolates. They may broadly be considered as phenotypic, genotypic and DNA sequence-based. Different techniques are useful in different circumstances, depending on the reason for the investigations. In laboratory practice a combination of these methods is often used. They are used in outbreak investigations or for tracking epidemiology and resistance. Although serotyping and phage typing are very important stages of the routine Salmonella investigation pro-cedure, they are often combined with other techniques. Those that are most commonly used for Salmonella typing are discussed in detail in this paper. Brief description as well as advantages and disadvantages of these common typing methods are given.
tylko w przypadku czystych hodowli bakteryjnych. Ka¿dy izolat, podejrzany o przynale¿noæ do rodzaju Salmonella na podstawie prezentowanych w³aciwo-ci biochemicznych, potwierdza siê serologicznie me-tod¹ aglutynacji szkie³kowej. Rozpoznanie serologicz-ne wyosobnioserologicz-nego izolatu polega na okreleniu jego struktury antygenowej. Identyfikacja wszystkich wa-riantów serologicznych pa³eczek z rodzaju Salmonel-la odbywa siê przy pomocy surowic diagnostycznych. W celu oznaczenia grupy serologicznej mo¿na rów-nie¿ pos³u¿yæ siê testem lateksowym. Umo¿liwia on wykrycie i identyfikacjê grupowych antygenów pa³e-czek Salmonella w pierwotnych hodowlach bakteryj-nych (uzyskabakteryj-nych w wyniku namna¿ania w p³ynnej po¿ywce seleninowo-fosforanowej) ju¿ w ci¹gu jed-nej doby od przyjêcia materia³u diagnostycznego do badania. Postêpowanie s³u¿¹ce pe³nej identyfikacji serowarów z u¿yciem zestawów surowic zawieraj¹-cych przeciwcia³a dla okrelonych antygenów soma-tycznych i rzêskowych wyznacza schemat Whitea--Kauffmanna-Le Minora (18), znany dawniej jako schemat Kauffmanna-Whitea. Ró¿nicowanie to obej-muje aglutynacjê z surowicami grupowo-swoistymi, a nastêpnie w obrêbie grupy z surowicami typowo--swoistymi. Efektem koñcowym badania jest uzyska-nie przy pomocy surowic diagnostycznych okrelone-go typu serologiczneokrelone-go pa³eczek z rodzaju Salmonel-la (ryc. 1).
Czasami oznaczenie dok³adnej budowy antygeno-wej pa³eczek Salmonella jest niewystarczaj¹ce do ich ostatecznego zidentyfikowania i zachodzi potrzeba dodatkowego ró¿nicowania biochemicznego. Na przy-k³ad w grupie O:7 sytuacja taka dotyczy szczepów S. Paratyphi C (Vi-ujemnych), S. Choleraesuis i S. Ty-phisuis. Dodatkowe ró¿nicowanie biochemiczne wy-magane jest równie¿ w przypadku koniecznoci okre-lenia przynale¿noci do gatunku lub podgatunku ba-danych pa³eczek Salmonella, w sytuacji gdy okrele-nie pe³nego wzoru antygenowego (który jest taki sam np. dla 2 lub 3 serowarów w obrêbie danej grupy sero-logicznej) nie definiuje jednoznacznie ich statusu tak-sonomicznego.
Przedstawiony cykl postêpowania diagnostycznego stanowi optymaln¹ metodê pozwalaj¹c¹ na szybkie uzyskiwanie wyników w przypadku tego typu badañ. Zaprezentowana metodyka ze wzglêdu na odpowied-ni dobór po¿ywek do namna¿aodpowied-nia i izolacji uwzglêd-nia na ka¿dym etapie badañ mo¿liwoæ wyhodowauwzglêd-nia bakterii Salmonella z badanej próbki. Stwarza rów-nie¿ mo¿liwoæ okrelenia pewnych cech maj¹cych istotne znaczenie przy rozpoznawaniu tych drobno-ustrojów. Czêæ etapów diagnostyki bakteriologicznej, oczywicie poza koniecznoci¹ uzyskania czystej ho-dowli, mo¿na zautomatyzowaæ. Obecnie coraz wiêcej laboratoriów wprowadza automatyczne metody diag-nostyczne (34).
Zarówno bezporedni¹ identyfikacjê bakterii Salmo-nella obecnych w badanym materiale, jak i poredni¹
ich identyfikacjê, prowadzon¹ w oparciu o czyst¹ ho-dowlê, a tak¿e wykazywanie charakterystycznych ty-pów opornoci na leki (R-type) mo¿na prowadziæ rów-nie¿ metodami molekularnymi (1, 4, 35, 37). Wybór metody molekularnej nale¿y dostosowaæ do problemu, który zamierza siê rozwi¹zaæ: wykrywanie, identyfi-kacja, ró¿nicowanie czy badania taksonomiczne (6, 20, 26, 31-33, 39, 42). Istotne s¹ równie¿ aspekty tech-niczne, tj.: stopieñ trudnoci wykonania, zaplecze ba-dawcze, ³atwoæ interpretacji wyników, czas wyma-gany do analizy, ca³kowite koszty stosowanej metody oraz koszty pojedynczej próby. Wybrana metoda po-winna byæ wystarczaj¹co czu³a, powtarzalna i powin-na posiadaæ du¿y potencja³ ró¿nicuj¹cy. Porówpowin-nanie najczêciej stosowanych metod ró¿nicowania drobno-ustrojów z uwzglêdnieniem powy¿szych parametrów opisano w opracowaniu Krawczyk (26). Na przyk³ad, dziêki czu³oci i selektywnoci metod wykorzystuj¹-cych technikê ³añcuchowej reakcji polimerazy (PCR), mo¿liwe jest bezporednie wykazanie obecnoci pa-³eczek Salmonella w materiale pobranym od pacjenta poprzez wykrycie specyficznej dla tego drobnoustro-ju sekwencji DNA (2, 24, 29). Przy zastosowaniu metod molekularnych mo¿liwa jest równie¿ identyfi-kacja serowarów Salmonella. Mo¿na dokonaæ rozpo-znania a¿ ponad stu ró¿nych serowarów z wykorzy-staniem techniki hybrydyzacji na mikromacierzach w odmianie ArrayTube, w której ca³a reakcja hybrydy-zacji zachodzi w odpowiednio przygotowanej probów-ce Eppendorfa (45, 46). Metoda ta pozwala równie¿ na pe³n¹ identyfikacjê serowarów nawet w przypadku defektywnych szczepów Salmonella (30), których nie mo¿na okreliæ w tradycyjny sposób, czyli szcze-pów szorstkich, nieurzêsionych czy szczeszcze-pów dwu-fazowych, które utraci³y zdolnoæ wytwarzania jednej z faz antygenu rzêskowego. Technika mikromacierzy umo¿liwia tak¿e wykrywanie obecnoci genów wa-runkuj¹cych lekoopornoæ pa³eczek Gram-ujemnych, w tym bakterii Salmonella (7).
W diagnostyce zaka¿eñ pa³eczkami z rodzaju Sal-monella zastosowanie praktyczne ma równie¿ okre-lanie poziomu przeciwcia³ we krwi czy w ¿ó³tkach jaj kurzych (5, 12, 22, 47). Niekiedy badanie takie sta-nowi jedynie dostêpn¹ metodê diagnostyczn¹ (9). Tech-niki immunologiczne obejmuj¹ obszern¹ grupê metod, dostêpnych równie¿ w postaci ró¿nych testów szyb-kiego wykrywania bakterii Salmonella, bazuj¹cych na immunodyfuzji, immunoaglutynacji, immunoprecypi-tacji i technikach immunoenzymatycznych. W przy-padku niektórych zaka¿eñ Salmonella obecnoæ swo-istych przeciwcia³ dla antygenów czynnika etiologicz-nego mo¿e byæ wykazana równolegle z izolacj¹ bak-terii w metodach hodowlanych.
W typowaniu prowadzonym na u¿ytek dochodzeñ epidemiologicznych wykorzystywane jest znaczne zró¿nicowanie (zarówno fenotypowe, jak i genotypo-we) istniej¹ce w obrêbie populacji drobnoustrojów poszczególnych gatunków (15, 21, 28, 38, 40), w tym
równie¿ Salmonella enterica czy Salmonella bongori. Typowanie oparte na poszukiwaniu markerów, które pojawiaj¹ siê fenotypowo (phenotypic typing), polega zwykle na: ocenie wzrostu bakterii na po¿ywkach mi-krobiologicznych, analizie morfologii komórek i ko-lonii bakteryjnych (mikro- i makromorfologia), okre-laniu profili biochemicznych, analizie lekoopornoci,
typowaniu bakteriofagowym, typowaniu bakteriocy-nowym, serotypowaniu, elektroforetycznej ocenie profili bia³kowych (czêsto uzupe³nianych równie¿ technik¹ immunoblotingu) czy elektroforetycznej analizie izoenzymów, polegaj¹cej na porównywaniu aktywnoci natywnych enzymów. Wiele metod feno-typowych charakteryzuje siê du¿¹ czu³oci¹ i
specy-Ryc. 1. Schemat typowania serologicznego izolatów bakteryjnych podejrzanych o przynale¿noæ do rodzaju Salmonella
Badany izolat
(24-h hodowla na agarze od¿ywczym)
aglutynacja z 0,85% NaCl (lub z 3% NaCl) (wykluczenie izolatów zdolnych do autoaglutynacji)
(–)
izolat w formie g³adkiej „S” (do dalszego badania) (+)
izolat w formie szorstkiej „R” (zdolny do aglutynacji – nie nadaje siê do dalszego badania;
próba „wyg³adzenia” izolatu)
aglutynacja z surowic¹ HM
(–)
gdy prawid³owy biochemizm – sprawdziæ ponownie z po¿ywki Garda
(izolat do dalszego badania)
(+)
okreœlanie antygenów somatycznych [i antygenu Vi] (aglutynacja z surowicami grupowymi AO, BO, CO, DO i EO oraz w zale¿noœci od potrzeby, z surowicami anty-O: 4; 6,7; 7; 8; 20; 9; 46; 10; 15; 19 i surowic¹ Vi)
(–)
aglutynacja z pozosta³ymi surowicami anty-O
(+)
przesiaæ na po¿ywkê Garda 37°C/24 h
przesiaæ na po¿ywkê Garda 37°C/24 h
okreœlanie antygenów rzêskowych 1 i 2 fazy (aglutynacja z surowicami anty-H)
ponowne okreœlanie antygenów rzêskowych 1 i 2 fazy (aglutynacja z surowicami anty-H)
(+)
ostateczne rozpoznanie serowaru
(ewentualne dodatkowe ró¿nicowanie biochemiczne)
(+)
ostateczne rozpoznanie serowaru
(ewentualne dodatkowe ró¿nicowanie biochemiczne) (–)
ujawnienie antygenów rzêskowych („urzêsianie” izolatu – hodowla na po¿ywce Edwards Motility Medium
(EMM); hodowla w U-rurce)
(–) izolat nieurzêsiony
ficznoci¹ w zakresie uzyskiwanych wyników, co czyni je cennym narzêdziem w rêku mikrobiologa i epide-miologa. Chocia¿ metody te spe³niaj¹ swoje zadanie, to jednak wiêkszoæ z nich obarczona jest cech¹ nie-pe³nej stabilnoci klonalnej ekspresji markerów. Wad¹ czêci metod fenotypowych jest wp³yw zmieniaj¹ce-go siê w czasie stanu fizjologicznezmieniaj¹ce-go badanych ko-mórek na uzyskiwane wyniki oraz ograniczenie mo¿-liwoci ich stosowania tylko do niektórych grup tak-sonomicznych. St¹d czêsto konieczne jest tworzenie odrêbnego i wyspecjalizowanego warsztatu na potrze-by analizy izolatów okrelonego taksonu. Najlepiej oceniane s¹ metody immunologiczne i elektroforetycz-na aelektroforetycz-naliza izoenzymów.
Metody molekularne wykorzystuj¹ce genetyczn¹ analizê kwasów nukleinowych (genotypic typing) siêgaj¹ po wiele technik (17), z których powszechne zastosowanie znalaz³a zarówno analiza chromosomo-wego, jak i plazmidowego DNA. W wiêkszoci stoso-wanych metod porównuje siê otrzymane (w wyniku zastosowanych procedur i rozdzia³u elektroforetycz-nego) wzory pr¹¿ków fragmentów badanego DNA, sta-nowi¹ce swoistego rodzaju odciski genetyczne, które poprzez analogiê do wyj¹tkowoci charakteryzuj¹cej odcisk ludzkiego palca nazywa siê fingerprints. Ogromne mo¿liwoci, jakie daje biologia molekular-na, sprawi³y, ¿e techniki te szybko siê rozwijaj¹ i ulep-szaj¹. Zosta³y uproszczone i upowszechnione techni-ki izolacji i powielania DNA oraz ustalania jego sek-wencji w stopniu, który pozwala na ich rutynowe wy-korzystywanie w laboratoriach mikrobiologicznych. Obecnie za najlepsze dla potrzeb epidemiologii uwa-¿a siê: technikê PFGE elektroforezê w zmiennym polu elektrycznym (pulsed field gel electrophoresis), rybotypowanie oraz sekwencjonowanie fragmentów DNA (sequence-based typing). Do celów dochodzeñ epidemiologicznych stosowana jest równie¿ metoda z u¿yciem mikromacierzy DNA (DNA microarrays), pozwalaj¹ca na jednoczesn¹ ekspresjê wielu tysiêcy genów (3, 16, 36, 45, 46). Sondy przydatne w tej dzie-dzinie znajduj¹ ju¿ zastosowanie w badaniach we-wn¹trzgatunkowego polimorfizmu genów u niektórych gatunków bakterii, w tym równie¿ u pa³eczek Salmo-nella.
Dla poszczególnych drobnoustrojów metody wyko-rzystywane do identyfikacji i dochodzeñ epidemiolo-gicznych mog¹ wykazywaæ ró¿n¹ skutecznoæ i dlate-go zazwyczaj rekomendowane s¹ techniki i metody wypróbowane dla okrelonego rodzaju czy gatunku. Metody najczêciej stosowane do typowania bakterii z rodzaju Salmonella przedstawiono w tab. 1, z uwz-glêdnieniem ich pozytywnych i negatywnych aspek-tów w diagnostyce tych drobnoustrojów.
W rutynowej diagnostyce laboratoryjnej bakterii z rodzaju Salmonella, zarówno dla celów sanitarno--epidemiologicznych, jak i leczniczych, ci¹gle jeszcze dominuj¹cymi metodami s¹: typowanie serologiczne i typowanie bakteriofagowe. Chocia¿ typowanie
bak-teriofagowe jest mo¿liwe do wykonania wy³¹cznie w laboratoriach referencyjnych, to jest ono niezwykle wa¿ne. Pozwala na przeprowadzenie wnikliwych ob-serwacji nad ustaleniem zwi¹zku pomiêdzy ród³em zaka¿enia i przypadkiem chorobowym oraz podjêcie skutecznych rodków w zwalczaniu róde³ i dróg szerzenia siê zaka¿eñ. Chocia¿ ró¿ne, nowe metody typowania molekularnego szczepów Salmonella (ry-botypowanie, typowanie IS200, analiza profilu plaz-midowego i analiza mikrorestrykcyjna plazmidów) wydaj¹ siê przydatne w badaniach epidemiologicznych, ci¹gle jeszcze szczególne us³ugi epidemiologii oddaje lizotypia (11, 13, 14, 25, 27, 41, 44). Pozwala ona na wyró¿nienie, w obrêbie jednego serowaru, szeregu ty-pów bakteriofagowych, ró¿ni¹cych siê miêdzy sob¹ intensywnoci¹ lub brakiem wra¿liwoci na dzia³anie pewnych bakteriofagów uznanych za standardowe. Ró¿ne zestawy fagów wykorzystywane s¹ do typowa-nia ró¿nych serowarów (19, 23). Te powszechnie sto-sowane s³u¿¹ przede wszystkim do ró¿nicowania pa-³eczek S. Enteritidis, S. Typhimurium i S. Typhi, ale istnieje równie¿ mo¿liwoæ subtypowania w obrêbie takich serowarów, jak: S. Abortusovis, S. Adelaide, S. Agona, S. Anatum, S. Bareilly, S. Blockley, S. Bovi-smorbificans, S. Braenderup, S. Choleraesuis, S. Du-blin, S. Gallinarum, S. Good, S. Hadar, S. Infantis, S. Minnesota, S. Montevideo, S. Newport, S. Oranien-burg, S. Panama, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B, S. Paratyphi C, S. Potsdam, S. Thompson, S. Virchow, S. Waycross i S. Weltevreden. Typowanie bakteriofa-gowe wed³ug okrelonych schematów mo¿e byæ na-dal polecane jako standardowa, szybka i tania metoda do prowadzenia badañ epidemiologicznych zaka¿eñ wywo³anych przez pa³eczki Salmonella. Umiejêtnie wykorzystane wyniki typowania bakteriofagowego przynosz¹ du¿y postêp w pracach epidemiologicznych i epizoocjologicznych zwiêkszaj¹ znacznie prawdo-podobieñstwo rozpoznania ród³a zaka¿enia, pozwa-laj¹ oceniæ jednorodnoæ ognisk zatruæ pokarmowych i poznaæ mechanizmy szerzenia siê zaka¿enia.
Jednak najlepsze wyniki w rozpoznawaniu zarazka uzyskuje siê stosuj¹c metody kompleksowe. Chocia¿ typowanie serologiczne i bakteriofagowe bakterii Sal-monella stanowi nadal bardzo wa¿ny etap postêpowa-nia diagnostycznego, to jednak coraz czêciej ³¹czy siê je z innymi metodami typowania, wykorzystuj¹cymi g³ównie techniki analizy DNA, z których wiêkszoæ, dziêki rozwojowi biologii molekularnej, mo¿e byæ ju¿ rutynowo wykorzystywana w laboratoriach mikro-biologicznych. Doceniaj¹c ogromne mo¿liwoci tech-nik molekularnych, nale¿y jednak zgodziæ siê raczej z tymi, którzy uwa¿aj¹, ¿e metody te nie mog¹ jeszcze w pe³ni zast¹piæ klasycznej diagnostyki mikrobiolo-gicznej. Diagnostyka mikrobiologiczna jest dziedzin¹ bardzo rozleg³¹ i powa¿ne laboratoria nie mog¹ zawê-ziæ swej aktywnoci jedynie do tak zwanych szybkich testów, nawet tych opieraj¹cych siê na metodach bio-logii molekularnej.
Tab. 1. Metody najczêciej stosowane do typowania bakterii z rodzaju Salmonella (11)
Objanienia: 1 RAPD = Random Amplification of Polymorphic DNA; 2 PCR = Polimerase Chain Reaction; 3 PFGE = Pulsed Field Gel
Electrophoresis; 4 AFLP = Amplified Fragment Length Polymorphism; 5 FAFLP = Fluorescent Amplified Fragment Length
Polymor-phism; 6 VNTR = Variable Number of Tandem Repeats; 7 MLVA = Multilocus Variable Number of Tandem Repeats Analysis; 8 IS200
= Insertion Sequence 200; 9 MLEE = Multilocus Enzyme Electrophoresis; 10 MLST = Multilocus Sequence Typing
a k i n h c e T Krótkacharakterystyka Zalety Wady a w o p y t o n e F e n z c i g o l o r e s e i n a w o p y T ) e i n a w o p y t o r e s ( iArgzlêustkynoawcyjcahaHnt.yWgeynmówagsaozmmaiatyncyznfayzchdOo ij c a k if y t n e d i j e n ³ e p -a r o b a l w a i n a w o s o t s a z o d a w t a ³ ; a n d o g y W ¹ n a n z e j u t n e z e r p e R . h c y n z c y t s o n g a i d h c a ir o t o k a j a n a w o s o t s æ y b e ¿ o M . ê d o t e m i c o n c e b o a i n a w y r k y w o d a w o g n i n ir k s k e z c e ³ a p Salmonella,jakidoserotypowania æ a r b y w a n ¿ o m e r ó t k , h c a r e k r a m a n a tr a p O e i n o g e t a l d i ) s r e k r a m e l b a t c e l e s ( ; a g o r D .i j c a k if y s a l k j e w iz d w a r p a l d e i c r e i w z d o c i w o r u s m u rt k e p s e i k o r e z s t s e j e n a g a m y w h c y n z c y t s o n g a i d e w o g a f o ir e t k a b e i n a w o p y T Wra¿ilwoæbakteryjnych ziolatówna w ó g a f o ir e t k a b h c y n a r b y w e i n a ³ a iz d e w o d r a d n a t s a z h c y n a n z u a l d a n a w o t n u r g u e z r b o D S.Typh,i a z c r a t s o D . h c y n n i i m u ir u m i h p y T , s i d it ir e t n E h c y n z c e t y ¿ u e i n z c i g o l o i b , h c y n t a d y z r p h c y n z c i g o l o i m e d i p e h c y n a d e i n a w o s o t s ; a n p ê t s o d e i n h c e z s w o p t s e j e i N e z h c y n j y c n e r e f e r w ó ir o t a r o b a l o d e n o z c i n a r g o ij c k e l o k a i n a w y m y z rt u æ o n z c e i n o k a n u d ê l g z w e i n e w o g a f o ir e t k a b e i n a w o p y T . w ó g a f t s e j e i N .i j c a k if y s a l k j e w iz d w a r p a l d e i c r e i w z d o w ó r a w o r e s h c i k t s y z s w a l d e w il ¿ o m Salmonella ) e p y t-R ( æ o n r o p o o k e L Wra¿ilwoænaró¿neantybiotyki Taniai³atwadoprzeprowadzenia.Dostarcza i k t s o n d e j e i m o iz o p a n ij c a m r o f n i h c y n z c e t y ¿ u ij c a l u p o p e i m o iz o p i e ¿ o m i c o n r o p o c e z r o z w y w o p y t o n e f m a s n e T w ó m zi n a h c e m h c y n ¿ ó r d o y n ¿ e l a z æ y b c e l u e ¿ o m æ o n r o p O . h c y n z c y t e n e g a iz d ê z r a n i w o n a t s e i N . e i n a i m z j e n w o t³ a w g ij c a k if y s a l k j e w i c a ³ w a w o p y t o n e G a j c a k if il p m a a w o s o L w ó t n e m g a rf h c y n z c if r o m il o p D P A R ( A N D 1) m e i n a t s y z r o k y w z a j c a k if il p m A w ó r e tr a t s h c y w o s o l o£gantwisakdowykonania.U¿ytecznadobadania Mpoiêródwzynlyawboarlanteoryjnewynikibadañnies¹ y z a r e m il o p a j c k a e r a w o h c u c ñ a £ R C P ( 2)dlawybranychgenów p s y w b u l ,i c o n r o p o o k e l w ó n e g a l d R C P w ó r e k r a m b u l i c o n n e g o t a p w ó k i n n y z c h c y n z c il o b a t e m w ó t a l o zi o d a i n a w o s o t s a z e i n d e r o p z e B h c y n z c y t e n e g h c a c i n ¿ ó r h c y n a n z o Irdóe¿nnitcyoifwkaacnjiaagwenoóbwrêjbeisetsrteurdownaa.róSwto;sojewszacnzaedo w ó r a w o r e s a i n a l e r k o o d a n p ê t s o d t s e j e i n y w o d i m z a l p li f o r P Analziaplazmidówzawatrych e i c a l o zi w Dobradobadaniaognisk Prtoascziæczpelgaózmlneidyzi.oNlaiteysmtaongo¹w³iantwarozêndabizaywaælub ij c a k if y s a l k j e w iz d w a r p w ó d i m z a l p a n j y c k y rt s e r a zi l a n A TrawienieplazmidowegoDNA i m y n j y c k y rt s e r i m a m y z n e Usi¿êytoepcoznrnaodociowpispyowpuanlaicajarcohzpbrzaekstertrzyejnnyiacnhia Mzaow¿eierbayjæ¹up¿oydwoabnnaetpyllakzomdildays.zNcizeepmóóww,ikntóicre u z r a d o p s o g m y n j y r e t k a b o u l o p m y n n e i m z w a z e r o f o rt k e l E E G F P ( m y n z c y rt k e l e 3) RDeNsArtiykrocyzdjneiza³rtanwai¿eenliueaggeanroomzoowwyemgo a l o p o g e n n e i m z u i c y ¿ u y z r p o g e n z c y rt k e l e h c y z c w a n w ó r o p w ó l e c o d a n a w o zi l a m r o n Z i m a ir o t a r o b a l i m y n ¿ ó r y z d ê i m o p Pwoiertdzenbieneopkroosgrtzaomwonweawnyipeodsoa¿peonrióewinoydwpaon-ia o d e n o z c i n a r g o e i n a w o s o t S . w ó k i n y w a l D . h c y w o k u a n / h c y n j y c n e r e f e r w ó ir o t a r o b a l w ó m o n e g Salmonellazmiennoæsekwencyjna % 1 j e ¿i n o p b ó r p h c y n a d a b i c o g u ³ d m zi fr o m il o P w ó t n e m g a rf h c y n a w o k if il p m a z P L F A ( A N D 4/FALFP5) a j c a k if y d o m R C P a n a tr a p O u l o p m y n n e i m z w y z e r o f o rt k e l e y r e k r a M .) E G F P ( m y n z c y rt k e l e c i n ¿ ó r a i n a z a k y w o d e n j y c n e c s e r o u lf i m a t n e m g a rf y z d ê i m o p y z s ¿ y w a i n w e p a z i E G F P ¿i n a n li b a t s j e iz d r a B e i n a w o p u r G . a i n a w o c i n ¿ ó r m o iz o p w ó r a w o r e s w ó ³ o p s e z o d e n a w o s o t s o d a i n a d a b o d ; e i n e ¿ a s o p y w e n w o tz s o K e j c k a rf e ³ a m e c ¹ i w o n a t s i k b ó r p e i n z c ¹ ³ y w a i c ê i c a c s j e i m z e z r p o p e n a z c a n z y w u m o n e g i m y n j y c k y rt s e r i m a m y z n e h c y w o m e d n a t a b z c il a n n e i m Z R T N V ( ñ e z r ó t w o p 6/MLVA7) WilcizeblêkokoæppiirkordóutkkticóhwsPeCkwRewncskijazuje h c y n w y t y t e p e r æ y b e ¿ o m , a n l a z r a t w o p i a n li b a t S o d o n a w o s o t s a Z . a n a w o z y t a m o t u a z a i n a w o p y t S.TyphiiS.Typhimuirum e i n c e b o o g e d ¿ a k a l d a i n a w o i n if e d z a g a m y W k a t æ a w o c i n ¿ ó r e i n e ¿ o m , u r a w o r e s o g e n a n z E G F P k a j e z r b o d S I e i n a w o p y T 2008lub e i n a w o p y t o b y r iAnnsaelrcziyajnwyicehloISkr2o0tn0olucbiegleenmóewntrRówNA i m a m y z n e e i n e i w a rt o u i c r a p o w ij c a z y d y r b y h ê j c k a e r i i m y n j y c k y rt s e r n r e h t u o S u p y t S I y t n e m e l E 200s¹dosyæsta³ymi h c a j c a l u p o p h c y n l a r u t a n w i m a t n e m e l e a i n a w o p y t o d o n a w o s o t s a Z . h c y n j y r e t k a b w ó r a w o r e s u k li k a n i m a p e z c z s y z d ê i m o p e i n a i n ¿ ó r z o R e i m o iz o p m i k o s y w e i n a zi l a n a a n z c y t e r o f o rt k e l E E E L M ( w ó m y z n e o zi 9) ozIcoelonwaaicnhieawktyybwrnanoyccihiepnuzynkmtuów, o g e n z c y rt k e l e o zi ii g o l o i m e d i p e e n l ó g o y b e z rt o p a n a n z c e t y ¿ U Bardzo rtudnatechnika,któraniemo¿ebyæ a n a w o z y t a m o t u a z ij c n e w k e s a n a tr a p O h c y n o l e r k o e i n a w o n o j c n e w k e S h c y n a r b y w u k li k w ó t n e m g a rf ê i s h c y c ¹ j a z c a n z d o w ó n e g u m zi fr o m il o p m e i n p o t s m y n w e p T S L M ( 10) w ó n e g 7 ij c n e w k e s e i n a n w ó r o P u m zi l o b a t e m y m y z n e h c y c ¹ j u d o k g n i p e e k -e s u o h . w zt ( o g e w o w a t s d o p ) s e n e g y p y t d o p a l e r k O Salmonellapoprzez o g e n j y c u l o w e / o g e n z c y t e n e g o li f e i n a z a k y w ,j e w o rf y c i c a t s o p w e n a D . a w t s ñ e i w e r k o p e n l a z r a t w o p e i n d a ³ k o d a zi l a n A . u r a w o r e s e i b ê r b o w e j u c i n ¿ ó r e i N e i n a w o s o t s ; a n w o tz s o k e i n c e b o t s e j ij c n e w k e s / h c y w o k u a n w ó ir o t a r o b a l o d e n o z c i n a r g o h c y n j y c n e r e f e r e z r e i c a m o r k i M HybrydyzacjaDNA-DNAca³egogenomu . A N D i m a j c n e w k e s i m y n a n z e z h c y n o l e r k o i c o n c e b o e i n a w y z a k y W A N D h c a t n e m g a rf h c y n a d a b w w ó n e g e ¿ o m w ó n e g h c y n o l e r k o k a r b b u l æ o n c e b O u k li k w ó m o n e g h c y ³ a c a l d a n a w y z a k y w æ y b a i n a l e r k o o d a ³ a n o k s o D . w ó t a l o zi a i n a w o c i n ¿ ó r z o g e n z c y t e n e g ij c a t u m e i c y r k y W . a n w o tz s o k o z d r a B e i n y d e j æ a w y r k y w e ¿ o M . e n d u rt h c y w o t k n u p e ¿ o m e i n , h c a k t y ³ p a n e n a w o t n e z e r p e r y h c e c ij c r e s n i ê i s h c y c ¹ j a i w a j o p o w o n æ a w a n z o p z o r
Pimiennictwo
1.Aissa R. B., Al-Galla N.: Molecular typing of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Corvallis, Anatum and Typhimurium from food and human stool samples in Tunisia, 2001-2004. Epidemiol. Infect. 2008, 136, 468-475. 2.Alvarez J., Sota M., Vivanco A. B., Perales I., Cisterna R., Rementeira A.,
Garaizar J.: Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of Salmonella in human clinical samples. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 1734-1748.
3.Anjum M. F.: Revealing the mosaic nature of Salmonella genomes using mi-croarrays, [w:] Rhen M., Maskell D., Mastroeni P., Threlfall J.: Salmonella. Molecular Biology and Pathogenesis. Horizon Bioscience, Norfolk 2007, 169-190.
4.Bannister B., Gillespie S., Jones J.: Gastrointestinal infections and food poisoning, [w:] Bannister B., Gillespie S., Janes J.: Infection. Microbiology and Management. Blackwell Publishing, Oxford 2006, 167-193.
5.Barrow P. A.: Serological diagnosis of Salmonella by ELISA and other tests, [w:] Wray C., Wray A.: Salmonella in Domestic Animals. CABI Publishing, New York 2000, 407-427.
6.Bartkowiak J.: Badania molekularne w rozpoznawaniu i ró¿nicowaniu cho-rób zakanych. Przegl. Epidemiol. 2003, 57, 381-389.
7.Batchelor M., Hopkins K. L., Liebana E., Slickers P., Ehricht R., Mafura M., Aerostrup F., Mevius D., Clifton-Hadley F. A., Woodward M. J., Davies R. H., Threlfall E. J., Anjum M. F.: Development of a miniaturized microarray--based assay for the rapid identification of antimicrobial resistance genes in Gram-negative bacteria. Int. J. Antimicrob. Agents 2008, 31, 440-451. 8.Chapin K. C., Lauderdale T.-L.: Reagents, stains, and media: Bacteriology,
[w:] Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yolken R. H.: Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington DC 2003, 354--383.
9.Constantine N. T., Lana D.: Immunoassays for the diagnosis of infectious diseases, [w:] Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yol-ken R. H.: Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington DC 2003, 218-233.
10.Cooke F. J., Threlfall E. J., Wain J.: Current trends in the spread and occur-rence of human salmonellosis: molecular typing and emerging antibiotic resistance, [w:] Rhen M., Maskell D., Mastroeni P., Threlfall J.: Salmonella. Molecular Biology and Pathogenesis. Horizon Bioscience, Norfolk 2007, 1-27.
11.Dera-Tomaszewska B., G³onicka R.: Typy bakteriofagowe Salmonella En-teritidis wystêpuj¹ce w Polsce w latach 1986-1995. Med. Dow. Mikrobiol. 1999, 51, 73-79.
12.Dera-Tomaszewska B., G³onicka R.: Zastosowanie immunoblottingu do diag-nostyki duru brzusznego. Med. Dow. Mikrobiol. 2007, 59, 241-250. 13.Dera-Tomaszewska B., G³onicka R.: Zastosowanie schematu Ward i wsp.
do typowania bakteriofagowego szczepów Salmonella Enteritidis wystêpu-j¹cych w Polsce. Med. Dow. Mikrobiol. 1999, 5, 281-288.
14.Duijkeren E. van, Wannet W. J. B., Houvers D. J., van Pelt W.: Serotype and phage type distribution of Salmonella strains isolated from humans, cattle, pigs, and chickens in The Netherlands from 1984 to 2001. J. Clin. Micro-biol. 2001, 11, 3980-3985.
15.Fiett J., Gniadkowski M.: Analiza genetyczna w bakteriologii i epidemiolo-gii zaka¿eñ bakteryjnych, [w:] Bala J. (red.): Biologia molekularna w medy-cynie. PWN, Warszawa 2006, 528-549.
16.Garaizar J., Porwollik S., Echeita A., Rementeria A., Herrera S., Wong R. M.-Y., Frye M., Usera M. A., McClelland M.: DNA microarray-based typing of an atypical monophasic Salmonella enterica serovar. J. Clin. Microbiol. 2002, 40, 2074-2078.
17.Goldman B. S., Halling C.: Genomics and the use of genomic tools to study pathogenic bacteria, [w:] Nickerson C. A., Schurr M. J.: Molecular Para-digms of Infectious Diseases. A bacterial perspective. Springer, New York 2006, 78-114.
18.Grimont P. A. D., Weill F.-X.: Antigenic formulae of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France 2007.
19.Guinée P. A. M., Leeuwen W. J.: Phage typing of Salmonella, [w:] Bergen T., Norris J. R.: Methods in Microbiology. Academic Press Inc., New York 1978, 157-191.
20.Gurtler V., Mayall B. C.: Genomic approaches to typing, taxonomy and evolution of bacterial isolates. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51, 3-16. 21.Hollinger K.: Epidemiology and salmonellosis, [w:] Wray C., Wray A.:
Salmo-nella in Domestic Animals. CABI Publishing, New York 2000, 341-353. 22.Jagielski M., Ka³u¿ewski S.: Serodiagnostyka duru brzusznego i durów
rze-komych. Wyd. Medyczne PZH, Warszawa 2001.
23.Jones Y. E., McLaren I. M., Wray C.: Laboratory aspects of Salmonella, [w:] Wray C., Wray A.: Salmonella in Domestic Animals. CABI Publishing, New York 2000, 393-405.
processing methods for detection of Salmonella serogroups B, C2, and D by PCR. J. Clin. Microbiol. 1994, 32, 3072-3074.
25.Kowalczyk-Pecka D., Wernicki A., Puchalski A.: Lekowra¿liwoæ oraz typy bakteriofagowe szczepów Salmonella Enteritidis izolowanych na terenie mikroregionu lubelskiego. Przegl. Epidemiol. 2003, 57, 201-209. 26.Krawczyk B.: Diagnostyka molekularna w zaka¿eniach szpitalnych. Post.
Mikrobiol. 2007, 46, 367-378.
27.Lalko J.: Salmonella enteritidis bacteriophage typing. Bull. Inst. Mar. Trop. Med. Gdynia 1977, 28, 187-194.
28.Landeras E., GonzálezHevia M. A., Mendoza M. C.: Molecular epidemio-logy of Salmonella serotype Enteritidis. Relationship between food, water and pathogenic strains. Int. J. Food Microbiol. 1998, 43, 81-90.
29.Lin J. S., Tsen H. Y.: Development and use of polymerase chain reaction for the detection of Salmonella Typhimurium in stool and food samples. J. Food Prot. 1999, 62, 1103-1110.
30.Madajczak G., Szych J.: Ocena testu Premi®Test Salmonella do identyfika-cji nietypuj¹cych siê pa³eczek Salmonella. Med. Dow. Mikrobiol. 2010, 62, 29-36.
31.Ma³ek W., Wdowiak S.: Wspó³czesna systematyka bakterii. Post. Mikrobiol. 1996, 35, 119-137.
32.Ma³ek W., Wdowiak-Wróbel S., Kalita M., Szlachetka M.: Dylematy z kon-cepcj¹ i definicj¹ gatunku bakteryjnego. Post. Mikrobiol. 2008, 47, 177--182.
33.Nolte F. S., Caliendo A. M.: Molecular detection and identification of micro-organisms, [w:] Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yolken R. H.: Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington DC 2003, 234-266.
34.OHara C. M., Weinstein M. P., Miller J. M.: Manual and automated systems for detection and identification of microorganisms, [w:] Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yolken R. H.: Manual of Clinical Micro-biology. ASM Press, Washington DC 2003, 185-217.
35.Olsen J. E.: Molecular typing of Salmonella, [w:] Wray C., Wray A.: Salmo-nella in Domestic Animals. CABI Publishing, New York 2000, 429-446. 36.Pawliczak R., Kowalski M. L.: Badanie ekspresji genów metod¹ microarray
perspektywy wykorzystania w medycynie. Alerg. Astma Immun. 2001, 6, 77-85.
37.Pieni¹¿ek N. J.: Podstawy diagnostyki molekularnej, [w:] Bala J.: Biologia molekularna w medycynie. PWN, Warszawa 2006, 506-519.
38.Rushdy A. A., Wall R., Seng C., Wall P. G., Stuart J. M., Ridley A. M., Threl-fall E. J., Ward L. R.: Application of molecular methods to a nosocomial outbreak of Salmonella enteritidis phage type 4. J. Hosp. Infect. 1997, 36, 123-131.
39.Schoolnik G. K.: Functional and comparative genomics of pathogenic bacte-ria. Curr. Opin. Microbiol. 2002, 5, 20-26.
40.Sool D. R., Lockhart S. R., Pujol C.: Laboratory procedure for the epidemio-logical analysis of microorganisms, [w:] Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yolken R. H.: Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington DC 2003, 139-161.
41.Tokarska-Pietrzak E., Kunikowska D., Dera-Tomaszewska B., G³onicka R.: Typowanie bakteriofagowe w diagnostyce Salmonella Enteritidis. Mat. Konf. Pomorskie Spotkania z Mikrobiologi¹, 5-6 padziernika 2007, Gdañsk--Sobieszewo, P-17, s. 54.
42.Vandame P.: Taxonomy and classification of bacteria, [w:] Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Pfaller M. A., Yolken R. H.: Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington DC 2003, 271-285.
43.Waltman W. D.: Methods for the cultural isolation of Salmonella, [w:] Wray C., Wray A.: Salmonella in Domestic Animals. CABI Publishing, New York 2000, 255-372.
44.Ward L. R., de Sa J. D., Rowe B.: A phage-typing scheme for Salmonella enteritidis. Epidemiol. Infect. 1987, 106, 291-294.
45.Wattiau P., Van Hesche M., Schlicker C., Vander Veken H., Imberechts H.: Comparison of classical serotyping and PremiTest assay for routine identifi-cation of common Salmonella enterica serovars. J. Clin. Microbiol. 2008, 12, 4037-4040.
46.Wattiau P., Weijers T., Andreoliu P., Schilker C., Vander Veken H., Maas H. M. E., Verbruggen A. J., Heck M. E. O. C., Wannet W. J., Imberechts H., Vos P.: Evaluation of the PremiâTest Salmonella, a commercial low-density DNA microarray system intended for routine identification and typing of Salmonella enterica. Int. J. Food Microbiol. 2008, 123, 293-298.
47.Wysocki J., Dera-Tomaszewska B., Tokarska-Pietrzak E., Strza³kowski L., G³onicka R.: Agglutination assays and ELISA for detecting egg yolk anti-bodies in flocks naturally infected with Salmonella Enteritidis. Vet. Rec. 2002, 151, 304-305.
Adres autora: dr Bo¿ena Dera-Tomaszewska, ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdañsk; e-mail: bodeto@gumed.edu.pl
