Artyku³ przegl¹dowy Review
Nanotechnologia zajmuje siê projektowaniem, syn-tez¹ i manipulowaniem materia³ami o rozmiarach poni¿ej 100 nm. W zwi¹zku z ogromn¹ powierzchni¹ nanocz¹stek w stosunku do objêtoci ich w³aciwoci fizyczne, chemiczne i biologiczne ró¿ni¹ siê znacz¹co od w³aciwoci materia³ów tradycyjnych, za rozmia-ry zbli¿one do bia³ek lub sk³adników komórki umo¿-liwiaj¹ im penetrowanie naturalnych barier, jak b³ony biologiczne. Po ogólnoustrojowym wprowadzeniu na-nocz¹stki mog¹ dotrzeæ do najdrobniejszych kapilar organizmu i dowolnych typów komórek, znalaz³y wiêc zastosowanie jako narzêdzia analityczne w biotechno-logii i naukach przyrodniczych. Najnowsze badania wskazuj¹ jednak na ich niekorzystne oddzia³ywanie na organizmy ¿ywe. Ten niezamierzony wp³yw spro-wokowa³ powstanie nowej dziedziny nauki nanotok-sykologii. Srebro jest obecnie najczêciej u¿ywanym nanomateria³em, g³ównie dla swoich w³aciwoci prze-ciwbakteryjnych i dezynfekuj¹cych, a ³atwoæ wbudo-wywania go w inne substancje czy powlekania ich powierzchni sprawia, ¿e iloæ jego zastosowañ ronie w szybkim tempie. U¿ywane jest w medycynie, po wbudowaniu w antybakteryjne opatrunki, narzêdzia
chirurgiczne i implanty, jak równie¿ zosta³o dopusz-czone, jako czynnik biobójczy, w oczyszczaniu i uzdat-nianiu wody. O ile w powy¿szych przypadkach korzy-ci stosowania wydaj¹ siê przewa¿aæ nad potencjalnym ryzykiem skutków ubocznych, o tyle niepokoj¹ca jest masowa ju¿ produkcja artyku³ów codziennego u¿yt-ku, zawieraj¹cych nanosrebro tkanin, bielizny, kos-metyków, a nawet butelek i smoczków dla niemowl¹t, dziêki której wzrasta codzienna ekspozycja ludzkiego organizmu na oddzia³ywanie tego nowego materia³u (5, 10, 14, 15, 20, 21, 24).
Potencjalny mechanizm cytotoksycznego dzia³ania nanocz¹stek srebra, mimo badañ prowadzonych przez liczne laboratoria, wci¹¿ pozostaje nie w pe³ni wyja-niony. Przez d³ugi czas przypuszczano, ¿e jedyn¹
tok-syczn¹ form¹ srebra s¹ jony Ag+, wysoce reaktywne
w zwi¹zku z posiadanym ³adunkiem. Nanocz¹stki srebra, skonstruowane przez cz³owieka z wielu ato-mów srebra metalicznego, jonów srebra lub zwi¹zków tego pierwiastka, maj¹ zdolnoæ uwalniania jonów w roztworach. Dla tej w³aciwoci zosta³y zreszt¹ skon-struowane ich zadaniem jest dostarczenie jonów do rodowiska komórek docelowych, czyli
drobnoustro-Cytotoksycznoæ nanocz¹steczek srebra
JOANNA MA£ACZEWSKAKatedra Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 13, 10-719 Olsztyn
Ma³aczewska J.
Cytotoxicity of silver nanoparticles
Summary
Nanotechnology concerns the study, creation and manipulation of structures, devices, and systems at a nanoscale level. Such materials exhibit unique biological, physical and chemical properties compared to bulk materials, and are readily utilized in modern medicine and industry.
Currently silver nanoparticles (SNP) are among the most commonly used nanomaterials due to their antimicrobial properties. Nanosilver can be found in medical devices, filters for water purification and in many consumer products as well. However, some recent studies indicate that nanosilver formulations may be cytotoxic to various types of both animal and human cells. Because their size is similar to cellular components they are able to bypass cell membranes, which results in cytotoxicity, although the exact mechanism of such an interaction is yet to be established. Several studies have reported the accumulation of SNP inside cells and their impact on cell morphology, while many of them claim that nanosilver induces cell necrosis or apoptosis due to decreasing function of mitochondria and catalyzes the production of reactive oxygen species, which leads to oxidative stress. Some reports indicate NPS can affect the physiology of immune competence and even of stem cells, which is of great importance for such crucial biological phenomena as the immunity and fertility of organisms.
Taking into consideration all of the above and the fact of growing exposure of human bodies to increasing doses of nanoparticles, there is a real need for evaluating the potential risks of using nanosilver in our every-day lives.
jów, w celu szybkiego i skutecznego dzia³ania biobój-czego. Okaza³o siê jednak, i¿ niekorzystne dzia³anie nanosrebra mo¿e byæ znacznie silniej wyra¿one ni¿ dzia³anie samych jonów, uwalnianych z nanomateria-³u. Wysnuto wiêc wniosek, ¿e równie¿ same nanocz¹st-ki wp³ywaj¹ na komórkê. Jeden z przypuszczalnych mechanizmów takiego dzia³ania wi¹¿e siê z bezpored-nim kontaktem nanocz¹stek z powierzchni¹ komórki i zaburzaniem jej czynnoci poprzez dzia³anie na b³o-nê komórkow¹ i procesy z ni¹ zwi¹zane, za drugi, okrelany jako mechanizm konia trojañskiego, po-lega na przedostawaniu siê srebra w postaci nanocz¹-steczek do wnêtrza komórki i uwalnianiu wysoce re-aktywnych jonów dopiero wewn¹trz, w s¹siedztwie niezwykle wra¿liwych organelli. Ponadto cz¹steczki srebra, które same nie wniknê³y do komórki, mog¹ uwalniaæ jony w bezporednim s¹siedztwie b³ony cy-toplazmatycznej, co zwiêksza iloæ Ag+ dostaj¹cych
siê do komórki niezale¿nie od procesu dyfuzji przez kana³y jonowe. Mechanizm wnikania nanosrebra do wnêtrza komórki jest zreszt¹ ró¿ny od
kontrolowane-go poboru jonów Ag+ przez komórkê (naladowanie
jonów sodowych). Zasadnicz¹ rolê w przypadku na-nocz¹stek odgrywa proces endocytozy, w rezultacie którego wnikaj¹ one do komórki zamkniête w endoso-mie, a ich dalsze losy mog¹ byæ ró¿ne. Zwykle, aby dosz³o do dzia³ania cytotoksycznego, cz¹stki musz¹ kumulowaæ siê w obrêbie komórki, a zjawisko takie w przypadku nanosrebra potwierdzaj¹ niektóre z prze-prowadzonych badañ (6, 13, 14).
Do tej pory opisanych zosta³o kilka efektów cyto-toksycznego dzia³ania nanosrebra, choæ wyniki po-szczególnych badañ nie zawsze s¹ zgodne. Przyczyn tego stanu rzeczy jest kilka. Pierwsza to brak standa-ryzacji metod i mo¿liwoæ doboru ró¿nych testów, któ-rych wyniki nie musz¹ siê idealnie pokrywaæ. Drugim powodem jest stosowanie ró¿nych typów pod³ó¿ bio-logicznych. Niektórzy badacze preferuj¹ pierwotne ho-dowle komórkowe, inni linie ci¹g³e. Te pierwsze, ze wzglêdu na dobre reprezentowanie tkanek, s¹ lepszym narzêdziem do badañ toksykologicznych in vitro, z dru-giej strony jednak, linie komórkowe s¹ ³atwiejsze w utrzymaniu i zapewniaj¹ powtarzalnoæ wyników, st¹d stosowane s¹ czêciej (2). Ponadto w u¿yciu s¹ komórki pozyskane z ró¿nych tkanek, od ró¿nych ga-tunków, a nawet rodzajów krêgowców, co przek³ada siê na istotne ró¿nice ich wra¿liwoci. Wreszcie trze-cim powodem rozbie¿noci s¹, niemo¿liwe do zbaga-telizowania, ró¿nice dotycz¹ce u¿ywanych w badaniach nanocz¹steczek (ró¿ni producenci, cz¹steczki o ró¿-nym stopniu jednorodnoci, rozmiarze, kszta³cie i sk³onnoci do agregacji, rozpuszczane przed u¿yciem w ró¿nych mediach, czy wreszcie rozbie¿ne zakresy badanych stê¿eñ). Z drugiej jednak strony, opisana ró¿-norodnoæ umo¿liwia szersz¹ i bardziej kompleksow¹ ocenê problemu. Do tej pory zaobserwowano nastê-puj¹ce typy zmian w komórkach poddanych dzia³aniu nanocz¹steczek srebra:
Odk³adanie srebra w komórce
Badania dotycz¹ce tego zagadnienia nale¿¹ do sto-sunkowo rzadkich w dostêpnej literaturze (3, 9, 10, 17, 24). Gromadzenie cz¹steczek srebra przy wy¿szych stê¿eniach (do 50 µg/ml) obserwowano w liniach szczurzych hepatocytów (BRL3A) i fibroblastów my-sich (NIH3T3). W hepatocytach cz¹stki gromadzi³y siê g³ównie na powierzchni b³on komórkowych i tylko czêæ przedostawa³a siê do wnêtrza komórek, za w przypadku fibroblastów kumulacja cz¹stek zacho-dzi³a wewn¹trzkomórkowo, choæ w obu przypadkach autorzy nie okrelili precyzyjnie ich lokalizacji (9, 10). Hsin i wsp. (9) wykazali ponadto ró¿nice w czasie gro-madzenia srebra w komórce w zale¿noci od badane-go ród³a nanocz¹stek. Bardziej toksyczny preparat powodowa³ kumulacjê cz¹steczek w komórce ju¿ po 1 minucie, za mniej toksyczny dopiero po 8 godzi-nach inkubacji. Arora i wsp. (3) poszli w swoich ob-serwacjach o krok dalej, ustalaj¹c przy u¿yciu trans-misyjnego mikroskopu elektronowego lokalizacjê na-nocz¹stek srebra w pierwotnych fibroblastach i hepa-tocytach mysich (30 i 225 µg/ml). Agregaty cz¹stek gromadzi³y siê w mitochondriach i cytoplazmie obu typów komórek oraz w wakuolach hepatocytów. Lo-kalizacja srebra w mitochondriach mog³a, wed³ug au-torów, prowadziæ do zaburzeñ w systemie enzymów antyoksydacyjnych i wzmo¿onej generacji reaktyw-nych form tlenu, toksyczreaktyw-nych dla komórki.
Innym typem komórek, ³atwo kumuluj¹cym w swym wnêtrzu nanocz¹stki, w zwi¹zku ze swoj¹ naturaln¹ zdolnoci¹ do ich aktywnego poch³aniania, s¹ komór-ki ¿erne. Yen i wsp. (24) wykazali obecnoæ cz¹stek srebra we wnêtrzu makrofagów mysich po 3 h ekspo-zycji komórek na ich dzia³anie. Pozostawa³y one za-mkniête w pêcherzykach cytoplazmatycznych, gdzie tworzy³y zlepy i nie dociera³y do organelli komórko-wych. Natomiast najnowsze badania na mysich ma-krofagach potwierdzi³y mechanizm konia trojañskie-go w cytotoksycznoci nanosrebra. Obecnoæ cz¹stek obserwowano bowiem w cytozolu aktywowanych ma-krofagów, nie stwierdzono natomiast ich wystêpowa-nia w komórkach martwych, co wskazuje na proces jonizacji cz¹stek wewn¹trz komórek i nastêpuj¹ce po nim uwolnienie jonów z komórek uszkodzonych do pod³o¿a hodowlanego. Fagocytoza nanosrebra aktywo-wa³a w tym przypadku odpowied zapaln¹ i stymulo-wa³a wydzielanie przez makrofagi TNF-á, co prowa-dzi³o do uszkodzenia b³ony komórkowej i apoptozy, a wszystkie te zdarzenia, wed³ug autorów, by³y bezpo-rednim nastêpstwem wewn¹trzkomórkowej jonizacji srebra (17).
Zmiana morfologii komórek
Ten efekt toksycznego dzia³ania nanosrebra, zale¿-ny od u¿ytego stê¿enia cz¹stek i manifestuj¹cy siê zmian¹ typowego kszta³tu komórek, by³ obserwowa-ny czêsto. Zakresy dawek powoduj¹cych takie zmiaobserwowa-ny osi¹ga³y jednak znaczn¹ rozpiêtoæ, zale¿nie od typu
komórek, a linie ci¹g³e, zgodnie z przewidywaniami, by³y bardziej wra¿liwe od hodowli pierwotnych. Pier-wotne fibroblasty i hepatocyty mysie po 24 h ekspozy-cji na wysokie stê¿enia nanosrebra (odpowiednio: 25 i 100 µg/ml) nie zmienia³y swojego wygl¹du, choæ do-chodzi³o do nieznacznego naruszenia ci¹g³oci hodow-li. Dopiero dawki 50 i powy¿ej 200 µg/ml wywo³ywa-³y widoczne zmiany (3). W przypadku nowotworowych linii ci¹g³ych HT-1080 (komórki ludzkiego w³óknia-komiêsaka) i A431 (ludzkie komórki raka skóry) tyl-ko niskie stê¿enia nie zaburza³y morfologii tyl-komórek, nieco wy¿sze, 6,25-50 µg/ml, powodowa³y ju¿ istotne zmiany w obu liniach (2). Podobne obserwacje, przy zbli¿onym zakresie stê¿eñ, poczyniono w stosunku do linii szczurzych hepatocytów, mysich komórek macie-rzystych plemników czy bydlêcych komórek endote-lium siatkówki (5, 10, 11). Natomiast zmiana kszta³tu i wielkoci mysich makrofagów pod wp³ywem nano-srebra (10 ppm), obserwowana przez Yen i wsp. (24), prócz dzia³ania cytotoksycznego wskazywa³a dodat-kowo równie¿ na aktywacjê komórek.
Obni¿enie ¿ywotnoci komórek
Obni¿enie ¿ywotnoci lub aktywnoci proliferacyj-nej to kolejny efekt niekorzystnego oddzia³ywania nanosrebra na wiêkszoæ badanych typów komórek, o nasileniu zwykle wprost proporcjonalnym do u¿ytej dawki cz¹stek i czasu ekspozycji. Ponownie obserwo-wano szerok¹ rozpiêtoæ dawek LC50/IC50/EC50 (lethal/ inhibitory/effective concentration 50%), w zale¿noci od u¿ytej hodowli i testu, za pomoc¹ którego tê war-toæ wyznaczano. Wspomniana dawka dla komórek linii nowotworowych wynosi³a od 10,6 µg/ml (linia HT-1080), przez 11,6 µg/ml (A431), 27 µg/ml (HT29 ludzkie komórki gruczolakoraka okrê¿nicy), po a¿ 92 µg/ml (HeLa ludzkie komórki raka szyjki maci-cy) (2, 8, 15). Dla komórek linii nienowotworowych rozpiêtoæ powy¿szych dawek by³a równie du¿a. Stê-¿enia 1-10 µg/ml hamowa³y proliferacjê komórek en-dotelium wieñcowego (CEC), dla rybiej linii OLHNI2 dawka LC50 wynosi³a 0,33 µg/cm2, dla mysich
komó-rek macierzystych plemników (C18-4) 8,75 µg/ml, dla hepatocytów szczurzych (BRL3A) waha³a siê miêdzy 19 i 24 µg/ml, w zale¿noci od rozmiarów cz¹stek, dla komórek endotelium siatkówki bydlêcej (BRECs) wynosi³a 500 nM (ok. 25 µg/ml), dla komó-rek nerki chomika (BHK21) 27 µg/ml, za dla my-sich fibroblastów (NIH3T3) i szczurzych komórek aorty (A10) by³a zbli¿ona do 50 µg/ml (5, 8-11, 19, 22). Ponownie, wy¿sze stê¿enia nanosrebra by³y po-trzebne dla wywo³ania efektu w komórkach hodowli pierwotnych ssaków: 50% spadek ¿ywotnoci fibro-blastów i hepatocytów mysich zanotowano dopiero przy dawkach 61 (fibroblasty) i 449 µg/ml (hepatocy-ty) (3). Analogicznej zale¿noci nie odnotowano
jed-nak w przypadku rybich hodowli pierwotnych: LC50
dla hepatocytów pstr¹ga têczowego wynosi³a zaled-wie 1,9 µg/ml (6).
Pewne rozbie¿noci wyników dotycz¹ te¿ wp³ywu nanosrebra na aktywnoæ proliferacyjn¹ komórek im-munokompetentnych. Wed³ug Shin i wsp. (21), stê¿e-nia powy¿ej 15 ppm znacz¹co obni¿a³y ¿ywotnoæ jed-noj¹drzastych komórek krwi obwodowej cz³owieka, za stê¿enia od 10 ppm ich zdolnoæ do proliferacji. Podobnie w badaniach Yen i wsp. (24) na mysich ma-krofagach, stê¿enie 10 ppm drastycznie obni¿a³o pro-liferacjê komórek, podczas gdy dawka 1 ppm nie wp³y-wa³a na ten parametr. Z drugiej jednak strony, Park i wsp. (17) donosz¹ o toksycznym dzia³aniu na mysie makrofagi otrzewnowe nanosrebra w dawce zaledwie 1,6 ppm.
Niektórzy autorzy wzmiankowali o problemach tech-nicznych z testowaniem wysokich stê¿eñ nanosrebra, w zwi¹zku z tendencj¹ do koagulacji i precypitacji cz¹s-teczek w pod³o¿u hodowlanym (5, 8). Rutynowo prob-lem ten niwelowano przez dodawanie ró¿nych stabili-zatorów chemicznych do roztworu cz¹steczek przed wprowadzeniem go do pod³o¿a hodowlanego, jednak bezpieczniejsz¹ metod¹ zapobiegaj¹c¹ aglomeryzacji nanocz¹stek jest powlekanie ich powierzchni ju¿ na etapie produkcji. Toksycznoæ takich cz¹stek równie¿ oznaczano. Nanocz¹stki srebra pokryte PVP charak-teryzowa³a wysoka toksycznoæ dla linii ludzkich mo-nocytów (THP-1), z EC50 na poziomie 2,4 µg/ml (7), natomiast Murawala i wsp. (16) wykazali nietoksycz-noæ nanocz¹stek srebra pokrytych albumin¹ bydlêc¹ (stê¿enia 104107) w stosunku do fibroblastów
my-sich (NIH-3T3), wysnuwaj¹c wniosek o ich zgodnoci biologicznej, wynikaj¹cej w³anie z zastosowania bio-kompatybilnego czynnika powlekaj¹cego (9).
Szkodliwe dawki nanosrebra, wyznaczane w bada-niu ostrej cytotoksycznoci, zwykle wielokrotnie prze-kracza³y jego stê¿enia dodawane do komercyjnych pro-duktów farmaceutycznych. Arora i wsp. (2) wykazali przy u¿yciu linii HT-1080 i A431, ¿e stê¿enie prze-ciwbakteryjne nanosrebra (1,56-6,25 µg/ml), stosowa-ne w opatrunkach na rany jest bezpieczstosowa-ne dla komó-rek. Podobnie dawka 20 µg/g, któr¹ wzbogacono ¿el antybakteryjny na rany i oparzenia, nie dzia³a³a cyto-toksycznie na pierwotne fibroblasty i hepatocyty mysie (3). W zwi¹zku z powy¿szym, zgo³a inaczej planowa-no dowiadczenia dotycz¹ce dzia³ania in vitro dostêp-nych na rynku produktów zawieraj¹cych nanosrebro. Ich zadaniem by³o okrelenie ryzyka toksycznoci prze-wlek³ej, zwi¹zanej z d³ugotrwa³¹ ekspozycj¹ tkanek na dzia³anie niskich, progowych dawek cz¹stek. Ba-dania takie s¹ jak najbardziej zasadne, co dobitnie wykazali Wataha i wsp. (23), poddaj¹c ludzkie mono-cyty (THP-1) d³ugotrwa³emu dzia³aniu (do 4 tygodni) niskich stê¿eñ jonów srebra, odpowiadaj¹cych 1-10% dawki wywo³uj¹cej ostre dzia³anie cytotoksyczne.
Okaza³o siê, ¿e ró¿nice miêdzy stê¿eniem Ag+
wy-wo³uj¹cym minimalny efekt biologiczny a stê¿eniem letalnym by³y bardzo ma³e (8 i 12 µmol/l). Celem podobnego eksperymentu, przeprowadzonego przez Santoro i wsp. (20) by³o sprawdzenie u¿ytecznoci
na-nosrebra jako czynnika antybakteryjnego w produkcji soczewek kontaktowych. Po 3 tygodniach ekspozycji ludzkich komórek nab³onka rogówki i makrofagów na dzia³anie niskich koncentracji nanocz¹stek (2, 4, 6 µM), zwykle wykazuj¹cych dzia³anie przeciwbakteryj-ne, autorzy nie uzyskali obni¿enia ¿ywotnoci komó-rek, choæ jednoczenie badane stê¿enia okaza³y siê nie-wystarczaj¹ce dla uzyskania oczekiwanego efektu biologicznego w stosunku do Pseudomonas aeruginosa. Z kolei Poon i Burd (18) zbadali wp³yw komercyj-nego opatrunku na rany pooparzeniowe, zawieraj¹ce-go nanocz¹steczki srebra (Acticoat), na komórki za-anga¿owane w proces gojenia keratynocyty i fibro-blasty. Ku zaskoczeniu badaczy, Acticoat okaza³ siê wysoce toksyczny dla obu typów komórek. Dawka LD50 dla keratynocytów wynosi³a 12,5 × 104%, za
koncentracja 78 × 104% ca³kowicie hamowa³a ich
aktywnoæ metaboliczn¹ i proliferacyjn¹. W przypad-ku fibroblastów 90% redukcjê aktywnoci wykazano
przy stê¿eniu 33,3 × 104%. Dawki toksyczne dla
komórek by³y zbli¿one do uznawanych za skuteczne w zwalczaniu bakterii, co nasunê³o autorom wniosek o koniecznoci stosowania badanego produktu z nale-¿yt¹ ostro¿noci¹, bowiem uwalniane z niego jony Ag+
nie wywieraj¹ wybiórczego dzia³ania na same bakte-rie, lecz z podobn¹ si³¹ uderzaj¹ w komórki zaanga¿o-wane w proces gojenia. Co prawda, po okreleniu wp³ywu opatrunku na komórki jednowarstwowych hodowli, cytowani badacze, dla lepszego oddania wa-runków in vivo, przeprowadzili dalsze dowiadczenia na modelu hodowli tkankowej, wykazuj¹c jej mniej-sz¹ wra¿liwoæ, uznali jednak, ¿e efekt ten wynika³ z ograniczonej biodostêpnoci nanosrebra, zwi¹zanej z du¿¹ koncentracj¹ bia³ek w pod³o¿u hodowlanym, wi¹¿¹cych srebro i redukuj¹cych jego stê¿enie efek-tywne (EC).
W zwi¹zku z w¹tpliwociami dotycz¹cymi bezpie-czeñstwa stosowania opatrunku Acticoat, Agarwal i wsp. (1) podjêli próbê opracowania podobnego, mniej toksycznego produktu. Po przygotowaniu cienkich fil-mów zawieraj¹cych ustalone stê¿enia nanosrebra (0,4--23,6 µg/cm2) badali ich aktywnoæ
przeciwbakteryj-n¹ i wp³yw na mysie fibroblasty (NIH-3T3). Stê¿enie cz¹stek na poziomie 5 µg/cm2 by³o ju¿ cytotoksyczne,
jednak najni¿sza z testowanych dawek (0,4 µg/cm2),
wykazuj¹ca nadal silne dzia³anie bakteriobójcze w sto-sunku do Staphylococcus epidermidis, nie tylko nie by³a toksyczna, lecz wrêcz wspomaga³a adhezjê i pro-liferacjê komórek. Jest to jedno z zaledwie dwóch do-niesieñ na temat proliferacyjnego efektu dzia³ania na-nosrebra. Drugie dotyczy jego wp³ywu na komórki endotelium wieñcowego (CEC), gdzie, co prawda, rów-nie¿ zanotowano dwojaki efekt dzia³ania w zale¿no-ci od stê¿enia cz¹stek, jednak w tym przypadku niskie stê¿enia (1-10 µg/ml) hamowa³y proliferacjê komórek, za wysokie (50-100 µg/ml) stymulowa³y, a wp³yw ten by³ odwrotnie proporcjonalny do dzia³ania cytotok-sycznego (19).
Apoptoza/nekroza
Niekorzystny wp³yw nanosrebra na ¿ywotnoæ ko-mórek wi¹za³ siê z wprowadzaniem ich na drogê ne-krozy lub apoptozy, zale¿nie od u¿ytego stê¿enia. Pro-gowa dawka powoduj¹ca apoptozê by³a zwykle znacz-nie ni¿sza od wywo³uj¹cej nekrozê, tak w przypadku komórek prawid³owych, jak i nowotworowych. Arora i wsp. (2) wyznaczyli stê¿enie apoptotyczne dla linii nowotworowych HT-1080 i A431 na, odpowiednio: 0,78 µg/ml i 1,56 µg/ml, podczas gdy nekrozê obu ty-pów komórek wywo³ywa³o dopiero stê¿enie 12,5 µg/ ml. W przypadku pierwotnych fibroblastów i hepato-cytów mysich stê¿enie inicjuj¹ce apoptozê (3,12 i 12,5 µg/ml) by³o równie¿ wielokrotnie ni¿sze od powodu-j¹cego nekrozê (100 i 500 µg/ml) (3). Du¿o mniejsza rozpiêtoæ odpowiednich stê¿eñ srebra dotyczy³a na-tomiast ludzkich monocytów (stê¿enia 2,5 i 5 µg/ml), komórek macierzystych plemników mysich (5 i 10 µg/ ml), komórek linii HeLa (poni¿ej 60 i powy¿ej 120 µg/ml), a tak¿e linii nowotworowej HT29 i komórek nerki chomika BHK21 (11 i powy¿ej 44 µg/ml) (5, 7, 8, 15).
W cytowanych pracach, potwierdzaj¹cych proapop-totyczne dzia³anie ni¿szych stê¿eñ nanosrebra, auto-rzy wykazywali fragmentacjê DNA w komórkach, cha-rakterystyczny dla komórek apoptotycznych sposób wi¹zania barwników fluorescencyjnych i aktywacjê kaspazy-3, która uwa¿ana jest za punkt bez powrotu w zjawisku programowanej mierci komórki (2, 3, 7-9, 11, 15). Ponadto Park i wsp. (17), po inkubacji z nanosrebrem mysich makrofagów otrzewnowych (RAW264.7), stwierdzili zwiêkszenie liczby komórek w fazie G1, a nastêpnie ca³kowit¹ blokadê cyklu ko-mórkowego w fazie S, równie¿ wskazuj¹ce na apopto-zê. Pojawia³y siê tak¿e doniesienia o wp³ywie nano-srebra na ekspresjê regulatorów apoptozy (zwiêkszo-na fosforylacja proapoptotycznego bia³ka p53 i ki(zwiêkszo-nazy JNK, blokowanie szlaku antyapoptotycznej kinazy PI3K/Akt), prowadz¹c¹ do uwalniania cytochromu c z mitochondriów do cytozolu, translokacji Bax z cyto-zolu do mitochondriów i aktywacji kaskady kaspazo-wej, uruchamiaj¹cej cykl zjawisk prowadz¹cych do zniszczenia komórki. Taki schemat oddzia³ywania na-nocz¹stek wiadczy, zdaniem autorów, o istotnej roli stresu oksydacyjnego w cytotoksycznoci srebra i in-dukcji apoptozy na drodze mitochondrialnego szlaku mierci komórki (2, 7, 9, 11).
W praktyce natomiast stymulacja apoptozy bywa zjawiskiem wielce po¿¹danym w przypadku leków an-tyangiogenetycznych, preparatów hamuj¹cych nad-miern¹ odpowied immunologiczn¹, a zw³aszcza w te-rapii nowotworów. Gopinath i wsp. (8) oprócz dzia³a-nia proapoptotycznego nanosrebra w stosunku do ko-mórek nowotworowych HT29 stwierdzili równie¿, ¿e uwra¿liwia³o ono komórki na dzia³anie przeciwnowo-tworowego 5-fluorouracylu, a dzia³anie synergistycz-ne obu czynników znacz¹co nasila³o apoptozê komó-rek w porównaniu do efektu dzia³ania pojedynczych
substancji, co w praktyce klinicznej mog³oby pozwo-liæ na zminimalizowanie skutków ubocznych terapii. Z drugiej jednak strony, w dostêpnej literaturze jest te¿ doniesienie dotycz¹ce antyapoptotycznego efektu dzia-³ania nanosrebra na komórki nowotworowe HCT 116 (ludzkie komórki raka okrê¿nicy), polegaj¹cego na wzmo¿onej ekspresji antyapoptotycznego bia³ka Bcl, co mo¿e wiadczyæ o zmiennej aktywnoci nanosrebra w zale¿noci od rodzaju komórek nowotworowych (9).
Stres oksydacyjny/generacja ROS
Wiêkszoæ znanych nanocz¹stek po wnikniêciu do komórki dostaje siê do mitochondriów, powoduj¹c ich prze³adowanie lub interferuj¹c z obron¹ antyoksyda-cyjn¹, co prowadzi do wzmo¿onej generacji reaktyw-nych form tlenu (ROS), której rezultatem jest brak rów-nowagi, okrelany jako stres oksydacyjny. Konsekwen-cje tego stanu s¹ wielokierunkowe i obejmuj¹ procesy takie, jak peroksydacja lipidów (zmiana w³aciwoci b³on biologicznych), modyfikacja lipoprotein czy wreszcie uszkodzenie bia³ek (utrata aktywnoci enzy-matycznej) i kwasów nukleinowych. Te zmiany przy-czyniaj¹ siê do rozwoju schorzeñ zapalnych i degene-racyjnych, natomiast na poziomie samej komórki mog¹ skutkowaæ apoptoz¹ lub nekroz¹ na drodze mitochon-drialnego szlaku mierci komórki (4).
Wzrost poziomu ROS, zale¿ny od stê¿enia nanosre-bra, zanotowano w liniach szczurzych hepatocytów BRL3A i ludzkich monocytów THP-1, a najwy¿sze jego nasilenie w obu przypadkach wystêpowa³o po 6 godzinach ekspozycji komórek na dzia³anie srebra (7, 10). Równie¿ Rosas-Hernandez i wsp. (19) w do-wiadczeniu na komórkach endotelium naczyñ wieñ-cowych i izolowanym piercieniu aorty uzyskali sty-mulacjê wytwarzania NO przez endotelium pod wp³y-wem wysokich stê¿eñ srebra, za podniesiony poziom tego wolnego rodnika dzia³a³ rozkurczaj¹co na pier-cieñ aorty. Dzia³ania takiego nie potwierdzili natomiast Farkas i wsp. (6) w pierwotnej hodowli hepatocytów pstr¹ga têczowego.
Pojawienie siê zwiêkszonego poziomu reaktywnych form tlenu w komórce pocz¹tkowo skutkuje urucho-mieniem komórkowej obrony antyoksydacyjnej, któ-rej wa¿nymi sk³adowymi s¹: dysmutaza ponadtlen-kowa (SOD) i wewn¹trzkomórkowy glutation (GSH). Badania Arora i wsp. (3) na pierwotnych hodowlach fibroblastów i hepatocytów albinotycznych myszy typu Swiss wskazuj¹ na sprawne uruchomienie tej obrony, wystarczaj¹ce, w przypadku badanych komórek, dla powstrzymania rozwoju stresu oksydacyjnego pod wp³ywem nanosrebra. Autorzy wykazali wzrost pozio-mu GSH i obni¿enie peroksydacji lipidów w fibrobla-stach, za w komórkach w¹troby wzrost poziomu SOD i GSH. Co prawda, dawka nanosrebra, przy której uzy-skali taki efekt, by³a stosunkowo niewysoka (1/2 IC50), jednak podobna dawka w liniach HT-1080 i A431 wywo³a³a ju¿ powa¿ne objawy stresu oksydacyjnego (2). Dopiero po wyczerpaniu mo¿liwoci systemu
ochronnego dochodzi do uruchomienia kaskady kaspaz i apoptozy komórki. Na taki z kolei scenariusz wska-zuje wyrane obni¿enie poziomu SOD i GSH pod wp³ywem nanosrebra w linii mysich makrofagów i li-niach nowotworowych HT-1080 i A431, zwiêkszona peroksydacja lipidów w liniach HT-1080 i A431, spa-dek poziomu GSH w linii szczurzych hepatocytów, zwiêkszony poziom metaloproteinaz, uczestnicz¹cych w degradacji komórek pod wp³ywem stresu oksyda-cyjnego w mysich makrofagach, czy wreszcie wzrost ekspresji genów stresu oksydacyjnego mt-2A i ho-1 w linii nowotworowej HeLa (2, 10, 15, 17).
Zaburzenia metabolizmu
i naruszenie integralnoci b³on komórkowych
Te dwa zjawiska s¹ bezporednim nastêpstwem stre-su oksydacyjnego, a standardowe testy szacuj¹ce ¿y-wotnoæ komórek MTT i LDH opieraj¹ siê w³anie na okreleniu nasilenia metabolizmu na poziomie mito-chondriów (MTT) i stopnia integralnoci b³on komór-kowych (LDH). Autorzy wiêkszoci cytowanych prac pos³ugiwali siê tymi testami przy szacowaniu ¿ywot-noci komórek, choæ stosunkowo nieliczni wspomi-nali o ich bezporednim znaczeniu. Znacz¹cy spadek funkcji mitochondriów wypunktowany zosta³ w przy-padku hepatocytów szczurzych (BRL3A), pierwotnej hodowli hepatocytów pstr¹ga têczowego, keratynocy-tów, fibroblastów i mysich komórek macierzystych plemników (C18-4), za znacz¹cy wyciek LDH z ko-mórek, wiadcz¹cy o uszkodzeniu b³on komórkowych tylko w przypadku linii BRL3A i hepatocytów pstr¹ga têczowego (5, 6, 10, 18). Ostatnie zjawisko zaobser-wowali tak¿e Braydich-Stolle i wsp. (5) w linii C18-4, jednak niewielki stopieñ jego nasilenia wskazywa³ ra-czej, ich zdaniem, na oddzia³ywanie nanocz¹steczek na metabolizm komórek, nie za na b³onê cytoplazma-tyczn¹.
Wp³yw na produkcjê cytokin (dzia³anie pro/przeciwzapalne)
Najmniej zgodne s¹ natomiast wyniki badañ wp³y-wu nanosrebra na odpowied komórek immunokom-petentnych in vitro. Shin i wsp. (21), badaj¹c wp³yw nietoksycznych stê¿eñ srebra na jednoj¹drzaste leuko-cyty cz³owieka, stymulowane PHA, stwierdzili jego dzia³anie przeciwzapalne, manifestuj¹ce siê hamowa-niem produkcji IL-5, IFN-ã i TNF-á, co, zdahamowa-niem au-torów, mo¿e pozwoliæ na jego u¿ycie w terapii scho-rzeñ immunologicznych i zapalnych. Tego korzystne-go dzia³ania nie potwierdzi³y jednak inne dowiadcze-nia. Yen i wsp. (24) wykazali, co prawda, aktywacjê mysich makrofagów pod wp³ywem nanosrebra, nie wp³ywa³o ono jednak na ekspresjê genów cytokin pro-zapalnych: IL-1, IL-6 i TNF-á. Z kolei brak statystycz-nie istotnego wp³ywu na wytwarzastatystycz-nie IL-1â, IL-4, IL-6 i IL-8 przez ludzkie komórki rogówki i mysie mo-nocyty/makrofagi wi¹za³ siê ju¿ z pewnym wzrostem poziomu cytokin prozapalnych (20), a jednoznaczne
dzia³anie prozapalne nanosrebra wykazali Park i wsp. (17) w linii mysich makrofagów, notuj¹c wzmo¿on¹ produkcjê NO, zwiêkszony poziom TNF-á oraz nasi-lon¹ ekspresjê genów TNF-á.
Dzia³anie genotoksyczne
Ten ostatni rodzaj oddzia³ywania nale¿y do najbar-dziej niepokoj¹cych, gdy¿ mo¿e stanowiæ zagro¿enie dla samoodnawialnoci organizmów, byæ przyczyn¹ zaburzeñ p³odnoci, muta-, kancero- lub teratogenezy. Co wiêcej, zjawisko to dotyczy nie tylko komórek zwie-rzêcych. Kumari i wsp. (12), badaj¹c wp³yw nanosreb-ra (50-100 ppm) na komórki sto¿ka wzrostu korzenia cebuli zwyczajnej (Allium cepa), stwierdzili obni¿enie indeksu mitotycznego, pojawienie siê aberracji chro-mosomowych i zaburzenie metafazy. Obserwowane zmiany, zdaniem autorów, wynikaæ mog³y z degrada-cji lub depolimeryzadegrada-cji chromosomowego DNA i praw-dopodobnie by³y nieodwracalne. Ponadto najwy¿sza dawka cz¹stek powodowa³a dezintegracjê ciany ko-mórkowej w wiêkszoci komórek. Wyniki te jedno-znacznie wskazuj¹ na zdolnoæ nanocz¹stek srebra do penetrowania, wchodzenia w interakcje ze sk³adnika-mi komórek rolinnych i zaburzania ich podzia³ów, co pozwala dodatkowo domniemywaæ o ich ekotoksycz-noci. Podobny efekt oddzia³ywania nanosrebra na ko-mórki zwierzêce, polegaj¹cy na zaburzeniu metafazy, powstawaniu aberracji chromosomowych i aneuplo-idalnoci komórek, zanotowali Wise i wsp. (22) w sto-sunku do rybiej linii komórkowej OLHNI2. Ry¿ówka japoñska, której komórek u¿yto w dowiadczeniu, jest organizmem modelowym w badaniach maj¹cych od-niesienie do organizmu cz³owieka, st¹d uzyskane wy-niki nie dotycz¹ wy³¹cznie wra¿liwoci organizmów wodnych. Równie¿ komórki ssaków nie by³y obojêtne na oddzia³ywanie nanosrebra w opisywanym zakresie Park i wsp. (17) po inkubacji mysich makrofagów ze srebrem stwierdzili zwiêkszenie liczby komórek w fa-zie G1cyklu komórkowego, a nastêpnie ca³kowit¹ blo-kadê cyklu w fazie S, co jest, zdaniem autorów, typo-we dla czynników hamuj¹cych syntezê DNA.
Reasumuj¹c, coraz chêtniej wykorzystywane w ¿y-ciu codziennym nanosrebro mo¿e nie byæ tak dobrot-liw¹ i obojêtn¹ dla organizmu cz³owieka substancj¹, jak do tej pory przypuszczano. Trudno oczekiwaæ pe³-nego prze³o¿enia wyników badañ przeprowadzonych in vitro na skomplikowany uk³ad biologiczny, jakim jest ¿ywy organizm, powinny one jednak wzbudziæ pewn¹ ostro¿noæ. Szybki rozwój nanotechnologii wi¹-¿e siê ze sta³¹ ekspozycj¹ konsumentów na wzrastaj¹-ce dawki nanocz¹stek. Bior¹c za pod uwagê zdolnoæ nanosrebra do penetrowania b³on biologicznych, wp³y-wania na sprawne funkcjonowanie mitochondriów i zwi¹zan¹ z nimi ochronê antyoksydacyjn¹ komórki, a tak¿e jego potencjalne dzia³anie genotoksyczne, przy jednoczesnej zdolnoci do kumulowania siê w komór-ce, mo¿na spodziewaæ siê niekorzystnych, d³ugofa-lowych efektów tej ekspozycji. Rozwa¿ny bilans
zysków i strat przed u¿yciem modnych i intensywnie promowanych nanoproduktów w ¿yciu codziennym wydaje siê odpowiednim wyborem.
Pimiennictwo
1.Agarwal A., Weis T. L., Schurr M. J., Faith N. G., Czuprynski C. J., McAnulty J. F., Murphy C. J., Abbott N. L.: Surfaces modified with nanometr-thick silver--impregnated polymeric films that kill bacteria but support growth of mamma-lian cells. Biomaterials 2010, 31, 680-690.
2.Arora S., Jain J., Rajwade J. M., Paknikar K. M.: Cellular responses induced by silver nanoparticles: In vitro studies. Toxicol. Lett. 2008, 179, 93-100. 3.Arora S., Jain J., Rajwade J. M., Paknikar K. M.: Interactions of silver
nanopar-ticles with primary mouse fibroblasts and liver cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009, 236, 310-318.
4.Bogacka A., Kucharska E.: Wp³yw hemodializy na produkcjê wolnych rodni-ków i nasilenie stresu oksydacyjnego. Immunologia kliniczna: wybrane aspek-ty. EDYCJA s.c., Olsztyn 2010, 193-202.
5.Braydich-Stolle L., Hussain S., Schlager J. J., Hofmann M. C.: In vitro cyto-toxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells. Toxicol. Sci. 2005, 2, 412-419.
6.Farkas J., Christian P., Gallego Urea J. A., Roos N., Hassellöv M., Tollefsen K. E., Thomas K. V.: Effects of silver and gold nanoparticles on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes. Aquat. Toxicol. 2010, 96, 44-52. 7.Foldbjerg R., Olsen P., Hougaard M., Dang D. A., Hoffmann H. J., Autrup H.:
PVP-coated silver nanoparticles and silver ions induced reactive oxygen species, apoptosis and necrosis in THP-1 monocytes. Toxicol. Lett. 2009, 190, 156-162.
8.Gopinath P., Gogoi S. K., Chattopadhyay A., Ghosh S. S.: Implications of silver nanoparticle induced cell apoptosis for in vitro gene therapy. Nanotechnology 2008, 19, 1-10.
9.Hsin Y. H., Chen C. F., Huang S., Shih T. S., Lai P. S., Chueh P. J.: The apoptotic effect of nanosilver is mediated by a ROS- and JNK-dependent mechanism involving the mitochondrial pathway in NIH3T3 cells. Toxicol. Lett. 2008, 179, 130-139.
10.Hussain S. M., Hess K. L., Gearhart J. M., Geiss K. T., Schlager J. J.: In vitro toxicity of nanoparticles in BRL3A rat liver cells. Toxicol. in Vitro 2005, 19, 975-983.
11.Kalishwaralal K., Banumathi E., Ram Kumar Pandian S., Deepak V., Muni-yandi J., Eom S. H., Gurunathan S.: Silver nanoparticles inhibit VEGF induced cell proliferation and migration in bovine retinal endothelial cells. Colloids Surf. B 2009, 73, 51-57.
12.Kumari M., Mukherjee A., Chandrasekaran N.: Genotoxicity of silver nano-particles in Allium cepa. Sci. Total Environ. 2009, 407, 5243-5246.
13.Lubick N.: Nanosilver toxicity: ions, nanoparticles or both? Environ. Sci. Tech-nol. 2008, 42, 8617.
14.Luoma S. N.: Silver nanotechnologies and the environment: old problems or new challenges? PEN 15, september 2008 (report by Project on Emerging Nanotechnologies; http://www.nanotechproject.org/publications/).
15.Miura N., Shinohara Y.: Cytotoxic effect and apoptosis induction by silver nanoparticles in HeLa cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009, 390, 733-737.
16.Murawala P., Phadnis S. M., Bhonde R. R., Prasad B. L.: In situ synthesis of water dispersible bovine serum albumin capped gold and silver nanoparticles and their cytocompatibility studies. Colloids Surf. B 2009, 73, 224-228. 17.Park E. J., Yi J., Kim Y., Choi K., Park K.: Silver nanoparticles induce
cytotoxi-city by a Trojan-horse type mechanism. Toxicol. in Vitro 2010, 24, 872-878. 18.Poon V. K., Burd A.: In vitro cytotoxicity of silver: implication for clinical
wound care. Burns 2004, 30, 140-147.
19.Rosas-Hernandez H., Jimenez-Badillo S., Martinez-Cuevas P. P., Gracia--Espino E., Terrones H., Terrones M., Hussain S. M., Ali S. F., Gonzalez C.: Effects of 45-nm silver nanoparticles on coronary endothelial cells and isolated rat aortic rings. Toxicol. Lett. 2009, 191, 305-313.
20.Santoro C. M., Duchsherer N. L., Grainger D. W.: Minimal in vitro antimicro-bial efficacy and ocular cell toxicity from silver nanoparticles. Nanobiotechnol. 2007, 3, 55-65.
21.Shin S. H., Ye M. K., Kim H. S., Kang H. S.: The effects of nano-silver on the proliferation and cytokine expression by peripheral blood mononuclear cells. Int. Immunopharmacol. 2007, 7, 1813-1818.
22.Sir Wise J. P., Goodale B. C., Wise S. S., Craig G. A., Pongan A. F., Walter R. B., Thompson W. D., Ng A.-K., Aboueissa A. M., Mitani H., Spalding M. J., Mason M. D.: Silver nanospheres are cytotoxic and genotoxic to fish cells. Aquat. Toxicol. 2010, 97, 34-41.
23.Wataha J. C., Lockwood P. E., Schedle A., Noda M.: Ag, Cu, Hg and Ni ions alter the metabolizm of human monocytes during extender low-dose exposures. J. Oral Rehabil. 2002, 29, 133-139.
24.Yen H. J., Hsu S. H., Tsai C. L.: Cytotoxicity and immunological response of gold and silver nanoparticles of different sizes. Small 2009, 5, 1553-1561.
Adres autora: dr Joanna Ma³aczewska, ul. Oczapowskiego 13, 10-957 Olsztyn; e-mail: j.malaczewska7@wp.pl
