Artyku³ przegl¹dowy Review
Pryszczyca (foot-and-mouth disease, FMD) uwa-żana jest za jedną z najbardziej zakaźnych i ekono-micznie niszczących chorób. Pozostaje ciągle aktywna w krajach Azji, Afryki i Ameryki Południowej, ata-kując zwierzęta parzystokopytne. Charakteryzuje się gorączką, pęcherzykami w jamie ustnej, na języku, kończynach oraz kulawizną i niską śmiertelnością wśród zwierząt dorosłych, która może być wysoka u zwierząt młodych z powodu zapalenia mięśnia serco-wego. Pierwszą informację o jej występowaniu podał włoski lekarz Hieronim Fracastorius w 1546 r. Wiele lat później, w 1897 r. Loeffler i Frosch wykazali, że prysz-czyca jest wywoływana przez zarazek przesączalny, czyli przenikający przez filtry zatrzymujące bakterie. Był to pierwszy udokumentowany przypadek choroby zwierząt, której czynnikiem etiologicznym jest wirus. W ten sposób zarazek pryszczycy stał się pierwszym odkrytym wirusem chorobotwórczym ssaków (16).
Od początku XX wieku wzrosło zainteresowanie pryszczycą spowodowane występowaniem w wielu krajach ognisk choroby lub też obawą przed ich po-jawieniem się, które przyczyniło się do powołania instytucji zobowiązanych do poszukiwania metod zwalczania FMD oraz prowadzenia badań naukowych nad zakażeniem i zarazkiem. W 1910 r. na wyspie Reims w Niemczech został zbudowany w tym celu pierwszy instytut badawczy, a następnie kolejne,
w 1925 r. w Pirbright w Wielkiej Brytanii, w 1926 r. na wyspie Lindholm w Danii. Ponadto w 1951 r. powstało w Brazylii Centro Panamericano de Fiebre Aftosa (PanAftosa) oraz w 1953 r. Plum Island Animal Disease Center w Stanach Zjednoczonych.
Wirus pryszczycy (FMDV) zaliczony został do rodziny Picornaviridae, rodzaj Aphthovirus. Genom FMDV stanowi pojedyncza nić RNA o dodatniej polar-ności. Patogen występuje w siedmiu serotypach (O, A, C, Asia 1, SAT 1, SAT 2, SAT 3) i ponad 60 podtypach, które odzwierciedlają jego różnorodność genetyczną i antygenową. Zmienność wirusa i brak odporności krzyżowej na poszczególne serotypy utrudnia zwal-czanie choroby (30). Ważnym elementem zwalczania i zapobiegania pryszczycy pozostają nadal konwen-cjonalne szczepionki inaktywowane. Ponadto wiele grup badawczych pracuje nad uzyskaniem nowych, doskonalszych biopreparatów.
Szczepionki inaktywowane
Pierwsza inaktywowana szczepionka przeciwko pryszczycy została opracowana w Niemczech przez zespół Waldmanna w latach 30. XX w. Sporządzono ją uzyskując wirus przez zakażanie bydła w rzeźni, od którego następnie pobierano nabłonek oraz płyn suro-wiczy z pęcherzy. Do inaktywacji żywego wirusa za-stosowano formalinę, natomiast jako adiuwantu użyto
Szczepionki przeciwko pryszczycy
Grażyna PaProcka
Zakład Pryszczycy, Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach, ul. Wodna 7, 98-220 Zduńska Wola
Paprocka G.
Foot-and-mouth disease vaccines Summary
Foot-and-mouth disease (FMD) is considered one of the most contagious and economically devastating diseases affecting cloven-hoofed livestock worldwide. The etiologic agent, FMD virus (FMDV), has a positive-sense, single-stranded RNA genome, and belongs to the genus Aphthovirus in the family Picornaviridae. FMDV is antigenically variable and consists of seven serotypes (A, O, C, Asia 1, SAT 1, SAT 2, SAT 3) and more than 60 subtypes.
Antigenic diversity of FMDV is a major concern for FMD control. An important part of controlling and prevention of foot and mouth disease are still conventional inactivated vaccines. Vaccines against FMD are of major importance in endemic regions for controlling the disease, they are also important as emergency vaccines to limit the spread of outbreaks in FMD-free countries. Inactivated FMD preparations have been used successfully as part of eradication programs. However there are many problems and limitations associated with their use. In order to solve them a new generation vaccines is being developed.
The article presents various types of FMD vaccines such as inactivated vaccines, subunit vaccines, live vector vaccines, DNA vaccines and live attenuated vaccines.
wodorotlenku glinu, jednak ilość szczepionki możliwa do uzyskania tą metodą była niewystarczająca i ogra-niczała zwalczanie FMD w Europie. Przemysłowa produkcja szczepionki na dużą skalę rozpoczęła się w 1950 r. po opracowaniu przez Frenkla metody namnażania FMDV in vitro w nabłonku zbieranym z języków bydlęcych po uboju zdrowych zwierząt i utrzymywanym w odpowiedniej pożywce. Kolejny, istotny przełom w uzyskiwaniu antygenu związany był z rozwojem hodowli komórkowych. Początkowo do namnażania FMDV używano pierwotnych hodowli komórek nerek bydła, cieląt i świń, jednak niedo-godnością tej metody było stałe zapotrzebowanie na świeży materiał tkankowy. Znacznie korzystniejsze okazały się ciągłe linie komórkowe. W 1962 r. Mowat i Chapman (32) użyli po raz pierwszy do namnażania wirusa pryszczycy jednowarstwowej hodowli komórek linii ciągłej BHK-21 wyprowadzonej z nerki nowo-rodka chomika złocistego. Natomiast od czasu, kiedy Capstick i wsp. (7) wykazali, że FMDV namnaża się również w hodowli komórek BHK-21 w zawiesinie, produkcja antygenu odbywa się głównie tą metodą. Ta technologia zdolna jest dostarczyć wirus w ilościach wystarczających do produkcji setek milionów dawek szczepionki rocznie. Otrzymaną zawiesinę wirusową oczyszcza się metodą ultrafiltracji, precypitacji lub poddaje chromatografii w celu uzyskania oczyszczo-nych antygenów. Przypadki niecałkowitej inaktywacji wirusa pryszczycy przy użyciu formaliny spowodo-wały poszukiwanie innych środków inaktywujących, doskonalszymi okazały się pochodne azyrydyny, takie jak acetyletylenoimina (AEI) i binarna etylenoimina (BEI). Powszechnie zaakceptowanymi adiuwantami do produkcji szczepionek dla bydła są wodorotlenek glinu i saponina oraz adiuwanty olejowe. Wykorzystanie adiuwantów olejowych w szczepionkach przeciw-ko pryszczycy poprawiło ich skuteczność dla świń. Szczepionki z adiuwantem olejowym w postaci emulsji woda w oleju lub jako podwójna emulsja olejowa są aktualnie najczęściej używane. Interesująca historia wytwarzania szczepionek inaktywowanych przeciwko pryszczycy została szczegółowo opisana przez Doel (16).
Szczepionki przeciwko pryszczycy mają istotne znaczenie w zwalczaniu choroby w regionach ende-micznych, ale są również ważne w sytuacjach awa-ryjnych w krajach wolnych od FMD, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się choroby. Zdecydowaną więk-szość komercyjnych szczepionek inaktywowanych stanowią aktualnie trzy preparaty. Należą do nich szczepionki o wysokiej mocy używane interwencyjnie w awaryjnej sytuacji w krajach, w których nie prowa-dzi się szczepień, następne to stosowane rutynowo szczepionki z adiuwantem olejowym oraz szczepionki z dodatkiem wodorotlenku glinu. Szczepionki przezna-czone do szczepień interwencyjnych są magazynowane w bankach szczepionek i przechowywane w ciekłym azocie, najczęściej w postaci skoncentrowanego
an-tygenu, który dłużej zachowuje odpowiedni potencjał immunogenny niż gotowa do użycia szczepionka. Europejskie banki szczepionek znajdują się w Anglii (Pirbright), Francji (Lyon), Niemczech (Kolonia) i Włoszech (Brescia). Niektóre kraje organizują wspól-ne banki szczepiowspól-nek. Udział w banku zlokalizowanym w USA (Plum Island Animal Disease Center) mają także Meksyk i Kanada. Szczepionki przygotowane z odmrożonych koncentratów wirusa posiadają dobre właściwości immunogennne, ich wysoka skuteczność (około 95%) jest rezultatem większej ilości antygenu w dawce wynoszącej co najmniej 6 PD50 (PD – dawka ochronna). Działanie ochronne następuje już po 4-7 dniach (częściowe od 2. dnia) po immunizacji bydła, świń i owiec. Dla utrzymania odporności wymagane jest powtórne szczepienie zwierząt po 6 miesiącach. Gotowe do użycia szczepionki konwencjonalne z ad-iuwantem olejowym o mocy przynajmniej 3PD50 za-pewniają po 7 dniach ochronę u bydła, świń i owiec. Włączenie do składu tych szczepionek saponiny spo- wodowało poprawę odpowiedzi immunologicznej. Niezbędne są rewakcynacje po 6 miesiącach, u zwie-rząt starszych, wielokrotnie immunizowanych ich częstotliwość może być zmniejszona do jednej na rok. Najwcześniej opracowane, proste w produkcji szcze-pionki z dodatkiem wodorotlenku glinu i saponiny są również nadal produkowane, głównie dla przeżuwaczy. W regionach, w których choroba występuje endemicz-nie (Azja, Afryka i Ameryka Południowa), szczepionki są powszechnie stosowane. Historia eradykacji FMD w Europie zakończona wycofaniem szczepień profi-laktycznych w 1992 r. powinna być zachętą i wzorem dla krajów, w których choroba nadal występuje, utrudniając ich rozwój ekonomiczny (24). Szczepionki używane na obszarach endemicznych mogą posia-dać więcej niż jeden serotyp wirusa w zależności od sytuacji epizootycznej. Południowoazjatyckie są trójwalentne, zawierają wybrane z tego regionu izo-laty serotypów O, A i Azja 1. Ze składu szczepionki produkowanej w Indiach został ostatnio wyłączony serotyp C, który nie był notowany na subkontynencie indyjskim od 1996 r. Należy dodać, że ten serotyp nie jest zgłaszany od 2004 r., od czasu, kiedy występował w Brazylii w rejonie Amazonii, jednak w trójwalent-nych szczepionkach południowoamerykańskich znaj-duje się nadal łącznie z serotypami O i A. Na terenie Azji Południowo-Wschodniej najczęściej stosowane są szczepionki monowalentne, zawierające serotyp O, czasami nawet kilka szczepów, podczas gdy w Ameryce Południowej głównie O Campos. Natomiast szczepy A22 Iraq, A Iran 1996 i A Iran 1999 są powszechnie wykorzystywane na Środkowym Wschodzie, z kolei A24 Cruzeiro – w Ameryce Południowej. Szczepionki SAT, używane w Afryce, są głównie biwalentne (SAT 1 i SAT 2) lub trójwalentne (SAT 1, SAT 2 i SAT 3). Stosowane są również preparaty zawierające serotypy O i A oraz odpowiedni serotyp SAT. Monowalentne
szczepionki SAT są w Afryce rzadko wykorzystywane, chociaż są dostępne w bankach szczepionki (35).
Szczepionki inaktywowane przyczyniły się w znacz-nym stopniu do ograniczenia transmisji wirusa i za-hamowania szerzenia się choroby oraz do eradykacjii FMD w wielu regionach świata, m.in. w Europie, Urugwaju i Argentynie, istnieje jednak szereg ograni-czeń i kwestii budzących niepokój związanych z ich stosowaniem, szczególnie w programach postępowania awaryjnego:
– mimo obowiązujących zabezpieczeń namnażany w dużych ilościach zjadliwy wirus może wydostać się poza obiekty produkcyjne;
– nie można wykluczyć ryzyka wystąpienia prysz-czycy po szczepieniu, w wyniku niepełnej inaktywacji wirusa;
– szczepione zwierzęta po kontakcie z wirusem mogą być jego nosicielami;
– niektóre obecne szczepionki, w zależności od procesu produkcji, posiadają śladowe ilości białek nie-strukturalnych, co utrudnia serologiczne odróżnianie zwierząt zakażonych od szczepionych, szczególnie immunizowanych wielokrotnie.
Nowoczesne szczepionki inaktywowane, zawiera-jące wysoce oczyszczone antygeny, wolne od białek niestrukturalnych, umożliwiają stosowanie strategii DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals). Zastosowanie takich szczepionek określo-nych jako markerowe oraz kompatybilokreślo-nych testów diagnostycznych, zwłaszcza ELISA, do wykrywania przeciwciał dla białek niestrukturalnych, których obec-ność świadczy o aktualnym lub przebytym zakażeniu, pozwala odróżnić zwierzęta zakażone od szczepio-nych i identyfikować zwierzęta zakażone w populacji zwierząt szczepionych (14). Możliwość realizowania strategii DIVA świadczy o znacznej poprawie w za-kresie stosowania szczepionek konwencjonalnych. Ograniczenie strat spowodowanych FMD uzależnione jest od szybkiego wprowadzenia skutecznych me-tod zwalczania choroby. Stosowanie strategii DIVA stwarza szansę na zmniejszenie strat ekonomicznych, ponieważ zwierzęta szczepione, lecz nie zakażone, nie stanowiące zagrożenia nie muszą być eliminowane.
Z uwagi na zastrzeżenia dotyczące szczepionek inaktywowanych w wielu laboratoriach na świecie trwają badania nad otrzymaniem biopreparatów nowej generacji.
Szczepionki podjednostkowe
Na podstawie wiedzy dotyczącej budowy kapsydu wirusa pryszczycy, w tym o istotnym powierzchnio-wym białku VP1 i ważnej immunologicznie pętli G-H VP1, w której zlokalizowane jest główne miejsce anty-genowe, badacze starali się opracować szczepionki nie wymagające zakaźnego wirusa. Przyjęto szereg strate-gii badań, w których wykorzystywano VP1 uzyskane metodą chemicznej ekstrakcji albo techniką
rekombi-nacji DNA, używano także peptydów pochodzenia VP1 lub otrzymanych drogą syntezy chemicznej. W 1975 r. Bachrach i wsp. (2) po raz pierwszy wyizolowali białko VP1 zdolne do indukcji przeciwciał neutralizujących u świń. Następnie Kleid i wsp. (21) wykazali, że immu-nizacja świń i bydła VP1 sklonowanym w E. coli za-pewniała ochronę zwierząt przed zakażeniem. Ponadto Bittle i wsp. (5) uzyskali metodą syntezy chemicznej peptydy, które stymulowały produkcję przeciwciał u bydła i zapewniały ochronę przed zakażeniem świnek morskich. Podobne doświadczenia wykonał DiMarchi i wsp. (15), którzy immunizując bydło syntetycznymi peptydami reprezentującymi regiony VP1, stwierdzili ochronę dwóch z trzech zwierząt zakażonych kon-trolnie. Badania doświadczalne obejmowały także wykorzystanie roślin transgenicznych do wytwarzania antygenu FMDV. Wielu autorów udokumentowało obecność przeciwciał neutralizujących u myszy im-munizowanych VP1 otrzymanym z użytkowych roślin transgenicznych, takich jak na przykład ziemniak czy lucerna (9). Badania przeprowadzono również na mo-delowej roślinie Arabidopsis thaliana, uzyskując VP1, które podane myszom wywoływało ochronę przed zakażeniem (8). Żadna z tych szczepionek nie została jednak dotąd oceniona pod względem skuteczności dla bydła lub świń. Wymienione strategie oferują immuno-geny, które u szczepionych zwierząt domowych często stymulowały przeciwciała neutralizujące o wysokich mianach, ale nie zawsze zapewniały ochronę przed zakażeniem. Immunogenność szczepionek wykorzy-stujących podjednostki wynika z obecności w nich sekwencyjnych epitopów zlokalizowanych zazwyczaj w pętli G-H białka VP1, w pozycjach 140-160. Chociaż te epitopy są, jak się wydaje, immunodominującymi w wielu analizowanych systemach, to jednak nie są jedynymi epitopami na wirionie odpowiednimi do neutralizacji wirusa ani nie są powszechnie rozpozna-wane u gospodarza wszystkich gatunków. Przy znanej tendencji do szybkiej zmienności i quasi-gatunkowej naturze genomu FMDV zastosowanie ograniczonego zestawu epitopów może umożliwić selekcję warian-tów antygenowych, a następnie spowodować wybuch choroby wśród szczepionych zwierząt (28). Taboga i wsp. (38) przeprowadzili badania na szeroką skalę, immunizując bydło przy użyciu czterech syntetycz-nych peptydów zawierających pętlę G-H FMDV serotypu C. Badacze stwierdzili częściową ochronę przed zakażeniem u około 40% zwierząt. Ponadto wyizolowali od szczepionego bydła kilka mutantów wirusa, co sugeruje, że szczepienie zastosowanymi peptydami indukowało szybkie generowanie i selekcję wariantów antygenowych FMDV in vivo. Niedawno zaobserwowano poprawę skuteczności szczepionek peptydowych poprzez zastosowanie dendrymerów, nowej klasy polimerycznych cząsteczek o precyzyjnie zdefiniowanej, rozgałęzionej strukturze, które mogą być nośnikami wielu kopii antygenu FMDV. Wstępne badania wykazały, że aplikacja świniom
dendryme-rycznego peptydu wywołała ochronę przed zakażeniem kontrolnym (13).
Celem kolejnych badań były puste kapsydy, w któ-rych brakuje kwasu nukleinowego. Te struktury powstają w naturalny sposób w hodowlach komórek zakażonych FMDV, są antygenowo podobne i tak samo immunogenne dla zwierząt, jak wiriony. Strategia ich otrzymywania polega na molekularnym klonowaniu regionów genomu wirusa niezbędnych do syntezy, przetwarzania i montażu strukturalnych białek wirusa w puste kapsydy (regiony kodujące P1-2A- i 3Cpro). Proteaza 3C jest konieczna do przetwarzania prekur-sora białek kapsydu w białka strukturalne VP0, VP3 i VP1 (20). Szereg zespołów badawczych uzyskało puste kapsydy przy użyciu różnych rekombinowanych systemów ekspresyjnych, zarówno prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Na początku były syntetyzo-wane, montowane i zbierane w hodowli komórkowej. Następnie do ich dostarczania wykorzystano E. coli (39), Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae (3) oraz rekombinowane bakulowirusy (37) lub stosowa-no bezpośrednie domięśniowe szczepienie zwierząt rekombinowanymi żywymi wektorami.
Żywe szczepionki wektorowe
Wektory wirusowe zostały z powodzeniem zastoso-wane w celu dostarczania zwierzętom sekwencji kodu-jących białka kapsydu FMDV. Najlepiej udokumento-wana i najbardziej skuteczna platforma wykorzystuje ludzki defektywny adenowirus typu 5 (Ad5). Wektory Ad5 posiadają zdolność do włączenia 5-8 kb obcego DNA, mogą namnażać się w specjalnych komórkach, które posiadają ulegające ekspresji geny usunięte z wirusa (18). Ponadto dodatkową ich zaletą jest to, że wiążą się z komórkami różnych gatunków zwierząt, w tym bydła i świń, po czym zostają internalizowane na drodze endocytozy, zapewniając ekspresję pożądanych genów (36). W ciągu ostatnich lat przeprowadzono sze-reg doświadczeń, głównie w Stanach Zjednoczonych, przy użyciu wektora Ad5 do ekspresji białek kapsydu FMDV, które zaowocowały wieloma ciekawymi pu-blikacjami. W jednym z pierwszych badań wykazano, że wektor Ad5, posiadający regiony kodowania kap-sydu i 3Cpro laboratoryjnego szczepu A12, jest zdolny do indukcji przeciwciał u świń oraz do wywołania ochrony przed zakażeniem kontrolnym po dwukrotnej immunizacji zwierząt w odstępie 4 tygodni. Z badań tych wynikało ponadto, że do tworzenia kapsydu i uzyskania zadowalającej ochrony niezbędne było białko 3Cpro (26). Następnie skonstruowano podobny wektor Ad5, ale zawierający region kodowania kap-sydu szczepu terenowego A24 Cruzeiro (Ad5-A24), który po jednokrotnym podaniu zapewniał świniom ochronę przed zakażeniem zarówno po 7, jak i po 42 dniach od szczepienia (31). W kolejnych badaniach stwierdzono, że również bydło immunizowane jedną dawką Ad5-A24 zostało po 7 dniach zabezpieczone przed zakażeniem (34). Interesujące okazało się
kom-binowane szczepienie świń wektorem Ad5 z genem kodującym interferon alfa świni (Ad5-pIFN-α) oraz Ad5-A24. Zwierzęta zakażone pięć dni później były całkowicie chronione przed zakażeniem, obserwowano również odpowiedź humoralną w postaci przeciwciał neutralizujących. Natomiast grupa zwierząt immuni-zowanych samym Ad5-pIFN-α była chroniona przed zakażeniem po 1-3 dniach od podania preparatu. Autorzy pracy uważają, że w przypadku pojawienia się ogniska pryszczycy takie postępowanie pozwoli niezwłocznie zabezpieczyć zwierzęta, ograniczyć wi-remię oraz rozsiewanie i rozprzestrzenianie wirusa do momentu uzyskania pełnej swoistej odporności (29). Szczepionki Ad5-FMD zostały dokładnie przetestowa-ne i okazały się tak samo skuteczprzetestowa-ne, jak inaktywowa-ne, posiadając potencjał do indukowania odporności humoralnej i komórkowej. Zarówno u świń, jak i u bydła wykazano całkowitą ochronę przed zakażeniem po otrzymaniu jednej dawki szczepionki. Szczepionka Ad5-FMD serotypu A jest dotychczas najbardziej udanym, zaawansowanym w rozwoju produktem. Do tej pory została przetestowana na ponad 150 sztukach bydła. Jednokrotne szczepienie zwierząt zapewniało po 7 lub 21 dniach od immunizacji ochronę przed uogólnieniem procesu chorobowego i wiremią, po kontrolnym zakażeniu kontaktowym lub śródskórnym w śluzówkę języka. Te nowe, molekularne biopre-paraty są obecnie produkowane w partiach ekspery-mentalnych w Stanach Zjednoczonych i testowane na bydle w ramach procesu licencyjnego (19). Należy dodać, że podjęto również badania z udziałem seroty-pu O, który jest obecnie dominującym pod względem występowania na świecie, świadczą o tym niedawne ogniska choroby w wielu krajach Azji, w tym w Korei Południowej, Japonii, Chinach, na Tajwanie, a także w Europie Wschodniej, w Bułgarii. Postępując podob-nie jak w przypadku szczepionki Ad5-FMD serotypu A, do genomu wektora Ad-5 włączono geny kodują-ce kapsyd serotypu O1 Campos. Aplikacja świniom szczepionki Ad5-O1C zapewniała zwierzętom po 21 dniach częściową ochronę. Natomiast dodane do konstruktu regionu kodującego niestrukturalne biał-ko 2B wpłynęło biał-korzystnie na poprawę skuteczności preparatu i indukcję swoistej odpowiedzi ze strony limfocytów T CD4+ i CD8+ skorelowanej z ochroną (30). Wykonano również wiele badań, w których jako wektorów do ekspresji genów kodujących białka kap-sydu FMDV użyto wirusów krowianki, ospy ptasiej, choroby Aujeszky’ego. Opracowane rekombinanty indukowały u świń powstawanie swoistych przeciwciał neutralizujących oraz wywołały zróżnicowany poziom ochrony przed zakażeniem (4, 22, 25). Niektóre z tych systemów ekspresyjnych wydają się obiecujące, ale znajdują się dopiero na początkowym etapie testo-wania, w porównaniu do kandydata na szczepionkę Ad5-FMD. Szczepionki Ad5-FMD są obecnie atrak-cyjną alternatywą dla szczepionek konwencjonalnych, chociaż wymagają dalszych badań.
Szczepionki DNA
Pierwsze szczepionki oparte na wykorzystaniu pla-zmidów przenoszących geny kodujące immunogenne białka FMDV opisano w latach 80. Szczepienie przy użyciu plazmidowego DNA zawierającego sekwencje FMDV powodujące ekspresję białek kapsydu i two-rzenie pustych kapsydów odnotowano jako skuteczny sposób indukowania odporności ochronnej na modelu myszy (11), jednak uzyskanie ochrony u zwierząt ho-dowlanych, takich jak bydło, świnie, owce, okazało się trudniejsze. Po zastosowaniu większości szczepionek DNA odpowiedź humoralna w postaci przeciwciał neu-tralizujących wirus, która ma zasadnicze znaczenie dla ochrony przed zakażeniem FMDV, była ograniczona i krótkotrwała. Do wywołania tylko częściowej lub w niektórych przypadkach pełnej ochrony konieczne było użycie wielu dawek szczepionki. Publikacje z ostatnich lat wskazują na ciągłe doskonalenie tech-nologii produkcji tych szczepionek. Wykazano, że plazmid DNA (pCDNA3.1/P1-2A3C3D), do którego inkorporowano geny kodujące prekursor (P1) pustego kapsydu i niestrukturalne białka 2A, 3C i 3D FMDV, podany jednocześnie z plazmidem powodującym ekspresję czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) jako adiu-wantem, indukował silną odpowiedź immunologiczną i ochronę świń przed zakażeniem (10). Następnie stwierdzono, że opłaszczenie tego plazmidu mikroczą-steczkami polimeru PLG (poly-d,l-lactide-glycolide)
spowodowało u owiec zwiększenie poziomu przeciw-ciał i komórkowej odpowiedzi immunologicznej, jak również całkowitą ochronę przed wiremią oraz lokalną replikacją wirusa w jamie ustnej i gardle po 28 dniach od zakażenia (33). Jeszcze silniejszą odpowiedź im-munologiczną i, co ciekawe, odporność krzyżową na różne serotypy obserwowano u świń doszczepionych szczepionką inaktywowaną oraz rekombinowanym białkiem 3D (prime protein boost) (23). Wykorzystanie tej strategii u bydła spowodowało również uzyskanie wyższej odporności, zwłaszcza gdy plazmidy dostar-czano domięśniowo przez elektroporację. Ta bezigłowa metoda podawania DNA polega na poddaniu komórek działaniu krótkotrwałego impulsu elektrycznego o wy-sokim napięciu, co prowadzi do tworzenia się w plaz- molemmie porów do przenikania DNA, które zanikają spontanicznie. Materiał genetyczny może wnikać do komórek w czasie, gdy pory są otwarte albo na skutek przemieszczania się składników błony komórkowej przy ich zamykaniu (17). Badania nad opracowaniem szczepionek DNA są na pewno wartościowe i będą nadal kontynuowane. Obecnie, w wieku genomiki, DNA może być sekwencjonowane i tworzone dokład-niej, szybciej oraz taniej niż kiedykolwiek wcześniej.
Żywe szczepionki atenuowane
Wiele informacji dotyczących szczepionek zawiera-jących szczepy FMDV atenuowane metodą klasyczną,
poprzez adaptację i pasaże przez niepodatne na natural-ne zakażenie FMDV gatunki zwierząt lub hodowle ko-mórkowe, dostarczają prace Bachrach (1) i Brooksby (6). Badania terenowe z udziałem tych szczepionek przeprowadzono w Afryce, na Środkowym Wschodzie i w Ameryce Południowej. Chociaż w niektórych przypadkach uzyskano pewien poziom odporności, obserwowano również szczepy wirusa atenuowane dla jednych gatunków, które były zjadliwe dla innych gatunków zwierząt. Ponadto najpoważniejszym pro-blemem okazała się możliwość rewersji szczepów atenuowanych do postaci zjadliwej.
Za wiązanie się wirusa z komórką odpowiada kon-serwatywna sekwencja reszt aminokwasowych RGD (Arg-Gly-Asp) zlokalizowana na pętli G-H białka VP1. Receptory powierzchniowe komórki należące do integryn wiążą sekwencję RGD FMDV. Dzięki wykorzystaniu metod inżynierii genetycznej możliwe było otrzymanie atenuowanej szczepionki delecyjnej. Poprzez eliminację z genomu FMDV genu dla recep-tora RGD uzyskano wirus niezdolny do wiązania się z komórką gospodarza i wywołania choroby u świń i 7-10-dniowych myszy. Również bydło zaszczepione tym wirusem z dodatkiem emulsji olejowej wytwarza-ło neutralizujące wirus przeciwciała, a po zakażeniu kontrolnym było całkowicie chronione przed kliniczną postacią choroby (27). Problemem okazała się jednak możliwość selekcji wariantów wirusa, którym udało się wniknąć do komórki przy wykorzystaniu nieinte-grynowych receptorów (38).
Kamieniem milowym w zrozumieniu patogenezy FMD było odkrycie, że niestrukturalne białko Lpro jest czynnikiem determinującym zjadliwość. Ta wiedza została wykorzystana do racjonalnego zaprojektowa-nia atenuowanej szczepionki przeciwko pryszczycy. Skonstruowano wirus serotypu A12 (A12-LLV2) pozbawiony regionu kodującego białko Lpro, który indukował powstawanie przeciwciał neutralizujących u bydła i świń. U obu gatunków po zakażeniu homolo-gicznym wirusem obserwowano słabo wyrażone obja-wy kliniczne i łagodny przebieg choroby. Stwierdzono również, że zmodyfikowany wirus A12 jest użyteczny jako źródło antygenu dla tradycyjnych szczepionek in-aktywowanych. Świnie, którym podano inaktywowaną szczepionkę zawierającą A12-LLV2 z dodatkiem adiu-wantu olejowego, reagowały wytworzeniem znaczne-go poziomu przeciwciał neutralizujących i wykazały pełną ochronę przed zakażeniem zjadliwym wirusem, podobnie jak zwierzęta immunizowane szczepionką z wirusem A12 typu dzikiego. Zdaniem autorów, wykorzystanie atenuowanych wirusów jako źródła antygenu do produkcji tradycyjnych szczepionek może zmniejszyć ryzyko związane z niepełną inaktywacją wirusa lub ucieczką z wytwórni szczepionek (12). Niewiele wiadomo o innych czynnikach warunkują-cych zjadliwość FMDV, ale kiedy zostaną zidentyfiko-wane, zapewne pojawią się nowe możliwości dalszego doskonalenia szczepionek atenuowanych.
Przedstawione różne rodzaje szczepionek moleku-larnych umożliwiają wraz z odpowiednimi testami diagnostycznymi stosowanie strategii DIVA, jednak pomimo intensywnych badań na razie brak jest komer-cyjnej szczepionki nowej generacji przeznaczonej do zwalczania i likwidacji pryszczycy w skali globalnej, uwzględniającej również potrzeby krajów wolnych od choroby. Dzięki zaangażowaniu wielu światowych grup badawczych i konsekwencji w kontynuowaniu badań należy oczekiwać, że taka szczepionka będzie dostępna w niedalekiej przyszłości.
Piśmiennictwo
1. Bachrach H. L.: Foot-and-mouth disease. Annu. Rev. Microbiol. 1968, 22, 201-244.
2. Bachrach H. L., Moore D. M., McKercher P. D., Polatnick J.: Immune and antibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus. J. Immunol. 1975, 115, 1636-1641.
3. Balamurugan V., Renji R., Saha S. N., Reddy G. R., Gopalakrishna S.,
Suryanarayana V. V.: Protective immune response of the capsid precursor
polypeptide (P1) of foot-and-mouth disease virus type „O” produced in Pichia pastoris. Virus Res. 2003, 92, 141-149.
4. Berinstein A., Tami C., Taboga O., Smitsaart E., Carrillo E.: Protective immunity against foot-and-mouth disease virus induced by a recombinant vaccinia virus. Vaccine 2000, 18, 2231-2238.
5. Bittle J. L., Houghten R. A., Alexander H., Shinnick T. M., Sutcliffe J. G.,
Lerner R. A., Rowlands D. J., Brown F.: Protection against foot-and-mouth
disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence. Nature 1982, 298, 30-33.
6. Brooksby J. B.: Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Inter- virology 1982, 18, 1-23.
7. Capstick P. B., Telling R. C., Chapman W. G., Stewart D. L.: Growth of a cloned strain of hamster kidney cells in suspended culture and their suscep-tibility to the virus of foot-and-mouth disease. Nature 1962, 195, 1163-1164. 8. Carrillo C., Wigdorovitz A., Oliveros J. C., Zamorano P. I., Sadir A. M.,
Gómez N., Salinas J., Escribano J. M., Borca M. V.: Protective immune
response to foot-and-mouth disease virus with VP1 expressed in transgenic plants. J. Virol. 1998, 72, 1688-1690.
9. Carrillo C., Wigdorovitz A., Trono K., Dus Santos M. J., Castañón S.,
Sadir A. M., Ordas R., Escribano J. M., Borca M. V.: Induction of a
virus--specific antibody response to foot-and-mouth disease virus using the structural proteinVP1 expressed in transgenic potato plants. Viral Immunol. 2001, 14, 49-57.
10. Cedillo-Barron L., Foster-Cuevas M., Belsham G. J., Lefevre F., Parkhouse
R. M. E.: Induction of a protective response in swine vaccinated with DNA
encoding foot-and-mouth disease virus empty capsid proteins and the 3D polymerase. J. Gen. Virol. 2001, 82, 1713-1724.
11. Chinsangaram J., Beard C., Mason P. W., Zellner M. K., Ward G., Grubman
M. J.: Antibody response in mice inoculated with DNA expressing
foot-and--mouth disease virus capsid proteins. J. Virol. 1998, 72, 4454-4457. 12. Chinsangaram J., Mason P. W., Grubman M. J.: Protection of swine by live
and inactivated vaccines prepared from a leader proteinase-deficient serotype A12 foot-and-mouth disease virus. Vaccine 1998, 16, 1516-1522.
13. Cubillos C., de la Torre B. G., Jakab A., Clementi G., Borras E., Barcena J.,
Andreu D., Sobrino F., Blanco E.: Enhanced mucosal immunoglobulin A
response and solid protection against foot-and-mouth disease virus challenge inducted by a novel dendrimeric peptide. J. Virol. 2008, 82, 7223-7230. 14. DeClerq K., Goris N., Barnett P. V., MacKay D. K.: The importance of quality
assurance/quality control of diagnostics to increase the confidence in global foot-and-mouth disease control. Transbound Emerg. Dis. 2008, 55, 35-45. 15. DiMarchi R., Brooke G., Gale C., Cracknell V., Doel T., Mowat N.: Protection
of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide. Science 1986, 232, 639-641.
16. Doel T. R.: FMD vaccines. Virus Res. 2003, 91, 81-99.
17. Fowler V., Robinson L., Bankowski B., Cox S., Parida S., Lawlor C., Gibson
D., O’Brien F., Ellefsen B., Hannaman D., Takamatsu H. H., Barnett P. V.:
A DNA vaccination regime including protein boost and electroporation protects cattle against foot-and-mouth disease. Antiviral Res. 2012, 94, 25-34. 18. Graham F. L., Smiley J., Russel W. C., Nairn R.: Characteristics of a human
cell line transformed by DNA from human adenovirus 5. J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-74.
19. Grubman M. J., Moraes M. P., Schutta C., Barrera J., Neilan J., Ettyreddy D.,
Butman B. T., Brough D. E., Brake D. A.: Adenovirus serotype 5-vectored
foot-and-mouth disease subunit vaccines: the first decade. Future Virol. 2010, 5, 51-64.
20. Grubman M. J., Zellner M., Bablanian G., Mason P. W., Piccone M. E.: Identification of the active-site residues of the 3C proteinase of foot-and-mouth disease virus. Virology 1995, 213, 581-589.
21. Kleid D. G., Yansura D., Small B., Dowbenko D., Moore D. M., Grubman
M. J., McKercher P. D., Morgan D. O., Robertson B. H., Bachrach H. L.:
Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease: responses in cattle and swine. Science 1981, 214, 1125-1129.
22. Li X., Liu R., Tang H., Jin M., Chen H., Qian P.: Induction of protective immu-nity in swine by immunization with live attenuated recombinant pseudorabies virus expressing the capsid precursor encoding regions of foot-and-mouth disease virus. Vaccine 2008, 26, 2714-2722.
23. Li Y., Stirling C., Denyer M., Hamblin P., Hutchins G., Takamatsu H.,
Bar-nett P.: Dramatic improvement in FMD DNA vaccine efficacy and cross-
-serotype antibody induction in pigs following a protein boost. Vaccine 2008, 26, 2647-2656.
24. Lombard M., Pastoret P. P., Moulin A. M.: A brief history of vaccines and vaccination. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 2007, 26, 29-48.
25. Ma M., Jin N., Shen G., Zhu G., Liu H. J., Zheng M., Lu H., Huo X., Jin M.,
Yin G., Ma H., Li X., Ji Y., Jin K.: Immune responses of swine inoculated with
a recombinant fowlpox virus co-expressing P12A and 3C of FMDV and swine IL-18. Vet. Immunol. Immunopathol. 2008, 121, 1-7.
26. Mayr G. A., O’Donnell V., Chinsangaram J., Mason P. W., Grubman M. J.: Immune responses and protection against foot-and-mouth disease virus (FMDV) challenge in swine vaccinated with adenovirus-FMDV constructs. Vaccine 2001, 19, 2152-2162.
27. McKenna T. S., Lubroth J., Rieder E., Baxt B., Mason P. W.: Receptor binding site-deleted foot-and-mouth disease (FMD) virus protects cattle from FMD. J. Virol. 1995, 69, 5787-5790.
28. Meloen R. H., Casal J. I., Dalsgaard K., Langeveld J. P.: Synthetic peptide vaccines: success at last. Vaccine 1995, 13, 885-886.
29. Moraes M. P., Chinsangaram J., Brum M. C., Grubman M. J.: Immediate protection of swine from foot-and-mouth disease: a combination of adenovi-ruses expressing interferon alpha and a foot-and-mouth disease virus subunit vaccine. Vaccine 2003, 22, 268-279.
30. Moraes M. P., Diaz-San Segundo F., Dias C. C., Pena L., Grubman M. J.: Increased efficacy of an adenovirus-vectored foot-and-mouth disease capsid subunit vaccine expressing nonstructural protein 2B is associated with a spe-cific T cell response. Vaccine 2011, 29, 9431-9440.
31. Moraes M. P., Mayr G. A., Mason P. W., Grubman M. J.: Early protection against homologous challenge after a single dose of replication-defective human adenovirus type 5 expressing capsid proteins of foot-and-mouth disease virus (FMDV) strain A24. Vaccine 2002, 20, 1631-1639.
32. Mowat G. N., Chapman W. G.: Growth of foot-and-mouth disease virus in a fibroblastic cell line derived from hamster kidneys. Nature 1962, 194, 253- -255.
33. Niborski V., Li Y., Brennan F., Lane M., Torché A. M., Remond M., Bonneau M.,
Riffault S., Stirling C., Hurchings G., Takamatsu H., Barnett P., Charley B., Schwartz-Cornil I.: Efficacy of particle-based DNA delivery for vaccination
of sheep against FMDV. Vaccine 2006, 24, 7204-7213.
34. Pacheco J. M., Brum M. C., Moraes M. P., Golde W. T., Grubman M. J.: Rapid protection of cattle from direct challenge with foot-and-mouth disease virus (FMDV) by a single inoculation with an adenovirus-vectored FMDV subunit vaccine. Virology 2005, 337, 205-209.
35. Parida S.: Vaccination against foot-and-mouth disease virus: strategies and effectiveness. Expert Rev. Vaccines 2009, 8, 347-365.
36. Prevec L., Schneider M., Rosenthal K. L., Belbeck L. W., Derbyshire J. B.,
Graham F. L.: Use of human adenovirus-based vectors for antigen expression
in animals. J. Gen. Virol. 1989, 70, 429-434.
37. Roosien J., Belsham G. J., Ryan M. D., King A. M., Vlak J. M.: Synthesis of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in insect cells using baculovirus expression vectors. J. Gen. Virol. 1990, 71, 1703-1711.
38. Taboga O., Tami C., Carrillo E., Núñez J. I., Rodriguez A., Saiz J. C., Blanco E.,
Valero M. L., Roig X., Camarero J. A., Andreu D., Mateu M. G., Giralt E., Domingo E., Sobrino F., Palma E. L.: A large-scale evaluation of peptide
vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants. J. Virol. 1997, 71, 2606-2614.
39. Vidal M., Cairo J., Mateu M. G., Villaverde A.: Molecular cloning and expres-sion of the VP1 gene of foot-and-mouth disease virus C1 in E. coli: effect on bacterial cell viability. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991, 35, 788-792.
Adres autora: dr hab. Grażyna Paprocka prof. nadzw. ul. Wodna 7, 98-220 Zduńska Wola; e-mail: grazyna.paprocka@piwzp.pl
