Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 306
Artyku³ przegl¹dowy Review
W dobie nadmiernego wykorzystywania chemiotera-peutyków, zw³aszcza antybiotyków i narastania oporno-ci szczepów bakteryjnych, badania dotycz¹ce stymula-cji uk³adu odpornociowego i oceny jego aktywnoci wydaj¹ siê szczególnie wa¿ne. Organizm powinien byæ stymulowany do samodzielnej obrony przed czynnika-mi infekcyjnyczynnika-mi. Ogromn¹ rolê w mobilizacji uk³adu odpornociowego, zw³aszcza m³odych zwierz¹t, odgry-waj¹, jak wiadomo, szczepionki. Aby kompleksowo oce-niæ wp³yw szczepionki na organizm zwierzêcia, nale¿y zbadaæ nie tylko humoraln¹, ale i komórkow¹ odpowied immunologiczn¹ powstaj¹c¹ po aplikacji biopreparatu. ledz¹c pimiennictwo z minionych lat, dotycz¹ce oce-ny odpowiedzi immunologicznej u zwierz¹t, w ogrom-nej wiêkszoci mo¿na spotkaæ siê z ocen¹ jedynie odpo-wiedzi humoralnej (8, 14). W du¿ej mierze wynika to zapewne z faktu ³atwoci przeprowadzenia tego rodzaju badañ. Poziom przeciwcia³ mo¿e byæ oceniony m.in. przy u¿yciu komercyjnych zestawów ELISA, testu sero-neutralizacji czy zahamowania hemaglutynacji. Dobór testu zale¿y przede wszystkim od w³aciwoci antygenu oraz sprawnoci laboratorium. Szczególnie czêsto z tak¹ niepe³n¹ ocen¹ odpowiedzi uk³adu immunologicznego mo¿na siê spotkaæ w pracach oceniaj¹cych efektywnoæ szczepionek u zwierz¹t (8). Tak przeprowadzona ocena nie jest wystarczaj¹ca. Osi¹gniêcie wysokich mian prze-ciwcia³ nie zawsze zabezpieczy zwierzê przed
zaka¿e-niem, z drugiej strony, niskie miana nie s¹ jednoznaczne z brakiem odpornoci na antygen.
Ocena swoistej antygenowo odpornoci komórkowej mo¿e byæ prowadzona in vivo oraz in vitro. Przy¿ycio-wo mo¿emy wykonaæ skórny test nadreaktywnoci typu pónego (delayed-type hypersensitivity assay, DHT), na-tomiast in vitro test transformacji blastycznej limfo-cytów (TTBL), szereg testów z wykorzystaniem cyto-metrii przep³ywowej (np. dokonaæ oceny proliferacji limfocytów, oceny ekspresji markerów aktywacji, a tak-¿e analizy antygenowo-swoistej produkcji cytokin przez uczulone limfocyty T). Wydzielanie cytokin mo¿na oceniæ wykorzystuj¹c równie¿ testy ELISA oraz reakcjê ³añcuchow¹ polimerazy (PCR).
Skórny test nadreaktywnoci typu pónego to jed-na z jed-najstarszych technik do monitorowania swoistej od-powiedzi komórkowej. Test ten polega na ródskórnym wstrzykniêciu zwierzêciu antygenu, a nastêpnie ocenie odczynu, jaki powstaje w zwi¹zku z migracj¹ uczulo-nych limfocytów do miejsca iniekcji. Pozwala on na ocenê odpowiedzi komórkowej w stosunku do wielu czynników infekcyjnych. Jego zalet¹ jest prostota wy-konania i brak koniecznoci u¿ywania skomplikowanej aparatury, w zwi¹zku z czym jest on nadal wykorzysty-wany (16, 22). Omawiany test jest jednak nieprzydatny w sytuacji, kiedy chcemy oceniaæ odpowied komórko-w¹ u danego zwierzêcia kilkukrotnie w odstêpach cza-su, gdy¿ powoduje on naznaczenie limfocytów T, co w konsekwencji powoduje, ¿e przy prowadzeniu
kolej-Techniki u¿yteczne w ocenie
swoistej odpornoci komórkowej*
)
MA£GORZATA POMORSKA-MÓL, IWONA MARKOWSKA-DANIEL
Zak³ad Chorób wiñ Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Pomorska-Mól M., Markowska-Daniel I.
Methods useful in the evaluation of specific cell-mediated immunity
Summary
In the era of the excessive use of chemotherapeutics, especially antibiotics and an increase of bacterial strains resistance, studies concerning the stimulation of the immune system and evaluation of its activity seem to be particularly important.
This article presents a review of the methods useful in the evaluation of cellular immunity. The evaluation of specific cell-mediated immunity may be performed in vivo or in vitro. Delayed-type hypersensitivity assay is one that is possible to make in vivo, while the lymphocyte transformation test, cytometric proliferation assay, evaluation of activation marker expression and analysis of antigen-specific production of cytokines by sensitive lymphocytes T are methods performed in vitro.
The evaluation of cell-mediated immunity in immunological studies, especially concerning vaccinology, will be valuable or even essential elements of an experiment.
Keywords: cellular immunity, lymphocytes proliferation, cytokines
*) Praca finansowana ze rodków na naukê w latach 2008-2011 jako projekt
Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 307
nego badania odpowiedzi na ten sam antygen, u tego samego zwierzêcia, nie mamy pewnoci, czy uczulenie limfocytów nie pochodzi z wczeniejszego kontaktu zwierzêcia z badanym antygenem. Pomimo prostoty wykonania test ten jest jednak doæ k³opotliwy w inter-pretacji, zw³aszcza w ilociowym okreleniu wyników. Trudno te¿ okreliæ, które dok³adnie komórki bior¹ udzia³ w infiltracji tkanek.
Test transformacji blastycznej limfocytów (TTBL) jest czêsto wykorzystywany do oceny odpowiedzi im-munologicznej in vitro na znany antygen. Transforma-cja blastyczna jest sum¹ zmian, jak¹ przechodzi dany limfocyt po pobudzeniu antygenem. G³ównymi ró¿nica-mi, wzglêdem niepobudzonego limfocytu, s¹: sfa³dowa-nie powierzchni b³ony komórkowej, rozpoczêcie produk-cji i wydzielania cytokin oraz wydzielanie przeciwcia³ w przypadku aktywacji limfocytów B. Transformacji blastycznej towarzyszy równie¿ proliferacja. Wysoki sto-pieñ proliferacji w odpowiedzi na antygen in vitro kore-luje z rozplemem limfocytów specyficznych dla danego antygenu i wskazuje na silniejsz¹ wtórn¹ odpowied komórek pamiêci immunologicznej.
Po raz pierwszy zjawisko transformacji blastycznej opisa³ Nowell (12, 13). Zaobserwowa³ on, ¿e w hodowli limfocytów zawieraj¹cych du¿e i ma³e limfocyty pod wp³ywem fitohemaglutyniny (PHA) pojawiaj¹ siê ko-mórki, które morfologicznie odpowiada³y limfoblastom. Takim przemianom podlega³y wy³¹cznie limfocyty ma³e, w odró¿nieniu od du¿ych, które ginê³y w przeci¹gu 24 godzin inkubacji. Du¿e komórki, powsta³e po stymulo-waniu hodowli czynnikami transformuj¹cymi, ulega³y nastêpnie mitozie.
Czynniki indukuj¹ce transformacjê blastyczn¹ limfo-cytów mo¿na podzieliæ na nieswoiste i swoiste. Czynni-ki nieswoiste powoduj¹ transformacjê blastyczn¹ wszyst-kich limfocytów, zarówno uczulonych, jak i nieuczulo-nych na dany antygen. Do nieswoistych stymulatorów proliferacji limfocytów T mo¿emy zaliczyæ: fitohema-glutyninê (PHA) oraz konkanawalinê A (CoA). Po sty-mulacji PHA liczba komórek w hodowlach pocz¹tkowo zmniejsza siê w przeci¹gu pierwszych 24-48 godzin, a na-stêpnie wzrasta wskutek zintensyfikowanych podzia³ów komórkowych. Po zastosowaniu swoistych antygenów, silniejszej proliferacji powinny ulegaæ limfocyty pocho-dz¹ce od osobników uczulonych na badany antygen (wi-rusowy, bakteryjny, chemiczny).
Potrzebne do przeprowadzenia testu transformacji bla-stycznej limfocyty, a w zasadzie jednoj¹drzaste komór-ki krwi obwodowej (peripheral mononuclear blood cells PMBC) uzyskuje siê najczêciej poprzez wirowanie pe³nej krwi pobranej na antykoagulant w odpowiednim gradiencie gêstoci. Dostêpnych jest szereg komercyj-nych odczynników umo¿liwiaj¹cych uzyskanie PBMC z pe³nej krwi. Maj¹ one gêstoæ w³aciw¹ wy¿sz¹ ni¿ limfocyty, lecz ni¿sz¹ od erytrocytów i granulocytów. Po wirowaniu erytrocyty i granulocyty przechodz¹ przez roztwór s³u¿¹cy do izolacji limfocytów i tworz¹ osad na dnie probówki, natomiast limfocyty tworz¹ interfazê pomiêdzy osoczem a gradientem. Limfocyty uzyskane w ten sposób zawieraj¹ domieszkê monocytów i w
nie-wielkich ilociach granulocytów. Komórki fagocytuj¹ce mo¿na wyizolowaæ poprzez dodanie opi³ków ¿elaza, któ-re zostanie przez nie sfagocytowane, co umo¿liwi ich póniejsze usuniêcie w polu magnetycznym.
Hodowlê limfocytów in vitro, w celu oceny ich trans-formacji, przeprowadza siê najczêciej inkubuj¹c je w pod³o¿u hodowlanym, bez dalszej izolacji subpopu-lacji limfocytów T i B. Minusem tak przeprowadzonego testu jest brak informacji, która subpopulacja limfocy-tów odpowiada na stymulacjê.
Obecnie najczêciej stosowana metoda oceny stopnia proliferacji polega na analizie ilociowej inkorporacji znakowanej trytem tymidyny przez nowo powsta³e ko-mórki (18, 21, 22). W tecie tym egzogenna tymidyna jest wbudowywana podczas fazy S cyklu komórkowego do DNA komórek proliferuj¹cych. Metoda ta uwa¿ana jest za najbardziej czu³¹ (20). Ocenê radioaktywnoci przeprowadza siê najczêciej po 16-18 godzinach od dodania izotopu do hodowli. Radioaktywnoæ badanych próbek mierzy siê w liczniku scyntylacyjnym beta. Wy-niki pomiaru mog¹ byæ wyra¿one w postaci wartoci cpm (counts per minute) lub czêciej w postaci indeksu sty-mulacji (SI). Indeks stysty-mulacji oblicza siê dziel¹c war-toci cpm limfocytów stymulowanych przez odpowied-nie wartoci cpm limfocytów pochodz¹cych z kontroli (niestymulowanych). Wartoci wy¿sze ni¿ uzyskane w kontroli (zwykle w pimiennictwie wartoci¹ granicz-n¹ jest SI > 2) wskazuj¹, ¿e limfocyty uleg³y proliferacji w odpowiedzi na stymulacjê badanym antygenem (17, 19). Metoda ta, oprócz wysokiej czu³oci, co jest nie-w¹tpliwie jej zalet¹, posiada tak¿e szereg minusów, do których nale¿y zaliczyæ szkodliwy wp³yw na rodowi-sko w zwi¹zku z wykorzystaniem izotopów, koniecznoæ posiadania odpowiednich urz¹dzeñ oraz warunków do przeprowadzenia odczytu radioaktywnoci. W zwi¹zku z tym, ¿e jest to metoda wieloetapowa, prawdopodobieñ-stwo b³êdu jest wiêksze.
Innym sposobem oceny proliferacji komórek s¹ me-tody kolorymetryczne (9, 10, 20). Sam proces przygoto-wania hodowli limfocytów jest analogiczny do opisane-go wy¿ej, ró¿nica polega na dodaniu stosowneopisane-go indy-katora zachodz¹cych w hodowli zmian (izotop zast¹pio-no zwi¹zkami barwnymi). Po dodaniu odpowiednich indykatorów do hodowli, w wyniku zmian metabolicz-nych zachodz¹cych w proliferuj¹cych limfocytach, do-chodzi do zmiany barwy u¿ytych zwi¹zków, co nastêp-nie jest oceniane spektrofotometrycznastêp-nie. Przy interpre-tacji wyników tak przeprowadzonych badañ nale¿a³oby mieæ na uwadze fakt, ¿e barwniki stosowane do oceny proliferacji komórek wykazuj¹ czêsto dzia³anie toksycz-ne na komórki, co w konsekwencji wp³ywa na obni¿e-nie ich proliferacji i uzyskiwaobni¿e-nie wyników fa³szywych. Cytometryczna ocena proliferacji limfocytów. Jest to metoda coraz czêciej wykorzystywana w badaniach immunologicznych (3, 20, 22). Zasad¹ testu jest inkor-poracja markera przez komórki podczas ich hodowli, a nastêpnie bardzo precyzyjne okrelenie stopnia ich pro-liferacji po stymulacji okrelonymi antygenami b¹d mio-genami, poprzez zmiany natê¿enia fluorescencji u¿yte-go markera. Do teu¿yte-go celu u¿ywane s¹ m.in. barwniki
Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 308
z serii PHK, bromodeoksyurydyna (BrdU) czy ester bursztynylowy karboksyfuoresceiny (CFSE). Wszystkie te zwi¹zki by³y ju¿ z powodzeniem wykorzystywane w badaniach immunologicznych u wielu gatunków zwie-rz¹t (3, 6, 11, 20, 23). Bromodeoksyurydyna jest analo-giem nukleotydu, który zostaje wbudowany w DNA nowo powstaj¹cych komórek. Substancja ta jest doda-wana do hodowli badanych limfocytów po up³ywie pew-nego czasu od ekspozycji na antygen czy miogen (zwyk-le po up³ywie 48-72 h), podobnie jak ma to miejsce w przypadku testu proliferacji z zastosowaniem znako-wanej trytem tymidyny. Przed dodaniem BrdU do ho-dowli jest on wi¹zany z odpowiednim przeciwcia³em monoklonalnym znakowanym fluorochromem. Pozosta-³e barwniki s¹ dodawane od razu podczas zak³adania hodowli. Wnikaj¹ one do wnêtrza komórek i ³¹cz¹ siê kowalencyjnie z bia³kami cytoplazmy (CFSE) b¹d te¿ barwi¹ b³ony komórkowe (PHK). W obu przypadkach ka¿dy podzia³ komórek poci¹ga za sob¹ powstanie ko-mórek potomnych zawieraj¹cych po³owê wyjciowego poziomu barwnika zawartego w komórce macierzystej. Tak przeprowadzony test pozwala oznaczyæ liczbê ko-mórek podlegaj¹cych proliferacji z danej populacji oraz liczbê nowo powsta³ych generacji (6). Niew¹tpliwie dodatkowym atutem oceny proliferacji z wykorzystaniem cytometrii przep³ywowej jest mo¿liwoæ okrelenia fe-notypu populacji podlegaj¹cej transformacji, poprzez wykorzystanie odpowiednio dobranego panelu przeciw-cia³ monoklonalnych znakowanych fluorochromami.
Ocena ekspresji markerów aktywacji. Pod wp³y-wem stymulacji limfocytów in vitro odpowiednimi an-tygenami lub miogenami na ich powierzchni pojawiaj¹ siê tzw. markery aktywacji. Ich obecnoæ mo¿na uwi-doczniæ przy pomocy cytometru przep³ywowego, wyko-rzystuj¹c znakowane przeciwcia³a monoklonalne. Za markery aktywacji limfocytów uwa¿ane s¹: CD25 (re-ceptor dla IL-2), CD69, MHC klasy II (1, 5). Ocena eks-presji poszczególnych markerów aktywacji mo¿e byæ prowadzona równolegle z ocen¹ subpopulacji limfocy-tów, co daje dodatkow¹ informacjê na temat populacji, która w danym przypadku odpowiada na bodziec anty-genowy. Dostêpnych jest coraz wiêcej komercyjnych przeciwcia³ monoklonalnych przeciwko markerom aktywacji dla zwierz¹t. Poci¹ga to za sob¹ mo¿liwoæ coraz pe³niejszego wykorzystywania tej techniki w oce-nie odpornoci komórkowej zwierz¹t. Jak wynika z pi-miennictwa, w czêci przypadków mo¿e dojæ do eks-presji markerów aktywacji bez towarzysz¹cej temu pro-liferacji, co powoduje, ¿e odpowied takich limfocytów mog³aby zostaæ przeoczona w tecie transformacji blas-tycznej (2).
Ocena antygenowo-swoistej produkcji cytokin przez uczulone limfocyty T. Zdolnoæ limfocytów do produkcji cytokin w odpowiedzi na badany antygen mo¿e byæ oceniona ró¿nymi sposobami. Wiêkszoæ technik opiera siê na wczeniejszej inkubacji limfocytów in vi-tro w obecnoci antygenu. Do najczêciej ocenianych interleukin nale¿¹ IL-4 oraz INF-ã, jako dominuj¹ce pro-dukty, odpowiednio, limfocytów Th2 i Th1.
Test immunoenzymatyczny (ELISA). Jednym ze sposobów oceny swoistej produkcji cytokin przez lim-focyty jest oznaczenie poziomu cytokin obecnych w nad-s¹czu pochodz¹cym z hodowli stymulowanej badanym antygenem. Nads¹cz z hodowli jest kolekcjonowany po up³ywie okrelonego czasu kontaktu limfocytów z anty-genem, najczêciej po 24-72 godzinach, a nastêpnie oce-niany immunoenzymatycznie w kierunku zawartoci cytokin. Obecnie mamy do wyboru coraz wiêcej komer-cyjnych zestawów ELISA do ilociowych oznaczeñ cy-tokin u ró¿nych gatunków zwierz¹t. W przypadku braku komercyjnego zestawu mo¿na siê oczywicie pokusiæ o opracowanie zestawu in-house. Niew¹tpliw¹ zalet¹ oceny produkcji cytokin przy pomocy testów ELISA jest mo¿liwoæ przechowania próbek poprzez ich zamro¿e-nie, a nastêpnie poddania analizie du¿ej ich liczby jed-noczenie. Metoda ta pozwala na stosunkowo dok³adne okrelenie stê¿enia cytokin w badanym materiale, ale jest czasoch³onna oraz obarczona ryzykiem b³êdu. Po-nadto w czasie pomiaru mo¿na okreliæ poziom tylko jednej cytokiny, co ze wzglêdu na du¿e koszty wyko-nania badania nie jest bez znaczenia (7). Minusem tej metody jest tak¿e brak mo¿liwoci okrelenia populacji komórek produkuj¹cych badane cytokiny.
Cytometryczne oznaczanie produkcji cytokin. Pro-dukcja cytokin przez poszczególne populacje leukocy-tów (w tym limfocyleukocy-tów) mo¿e byæ tak¿e oznaczona z wy-korzystaniem zestawów przeciwcia³ do wewn¹trzkomór-kowego ich barwienia, a nastêpnie odczytana w cyto-metrze przep³ywowym. Do uwiêzienia cytokin we wnêtrzu badanych komórek stosuje siê inhibitory trans-portu bia³ek np. monenzynê. Tym sposobem mo¿emy oznaczaæ cytokiny produkowane przez ró¿ne populacje, jak równie¿ zestaw cytokin produkowanych przez jedn¹ komórkê (4). Ocena rodzaju produkowanych cytokin, z jednoczesn¹ analiz¹ fenotypu komórek, mo¿e byæ po-mocna w okreleniu polaryzacji odpowiedzi immunolo-gicznej w kierunku Th1 lub Th2, gdy¿ obecnie jestemy w stanie zró¿nicowaæ te populacje jedynie na podstawie profilu wydzielanych przez nie cytokin (4, 7).
W medycynie ludzkiej stosuje siê w ostatnich latach nowoczesn¹ technikê, zwan¹ cytometryczne macierze kulkowe (Cytometric Beads Array CBA). Wykorzy-stuje siê w niej mikrokulki sprzê¿one z fluorochromem oraz kowalencyjnie zwi¹zane z przeciwcia³em monoklo-nalnym swoistym dla badanej cytokiny. Dziêki zasto-sowaniu tej techniki mo¿emy w relatywnie krótkim cza-sie oceniæ stê¿enie kilku, a nawet kilkunastu cytokin w jednej próbce (krwi, p³ynie wysiêkowym, pop³uczy-nach oskrzelowych, lizatach komórkowych czy po¿yw-kach hodowlanych) (7). Technika CBA polega na po-miarze redniej wartoci fluorescencji znacznika sprzê-¿onego z dan¹ grup¹ mikrokulek oraz ró¿nicy intensyw-noci fluorescencji po inkubacji materia³u z przeciw-cytokinowymi swoistymi przeciwcia³ami sprzê¿onymi z fikoerytryn¹ (PE). Do zestawu testowego do³¹czone s¹ standardy badanej cytokiny umo¿liwiaj¹ce wyznaczenie krzywej standardowej, z której odczytywane jest stê¿e-nie badanej substancji. Iststê¿e-nieje ju¿ mo¿liwoæ indywi-dualnego doboru mikrokulek po³¹czonych z
przeciwcia-Medycyna Wet. 2009, 65 (5) 309
³ami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko cytoki-nom, co umo¿liwia tworzenie dowolnych paneli macie-rzy analitycznych oceniaj¹cych koncentracjê cytokin (7). Reakcja ³añcuchowa polimerazy (PCR). Ocena transkrypcji genów koduj¹cych badane cytokiny, zarów-no po namna¿aniu komórek in vitro, jak i bezporednio po pobraniu materia³u, mo¿e byæ przeprowadzona z za-stosowaniem techniki PCR. Dziêki dostêpnoci sekwen-cji genów koduj¹cych wiele cytokin zwierzêcych opra-cowanie odpowiednich zestawów starterów i sond nie powinno nastrêczaæ wiêkszych trudnoci (20). Technika ta umo¿liwia zbadanie aktywnoci transkrypcyjnej ge-nów cytokin, a tak¿e ilociowe okrelenie poziomu ich produkcji przez badane limfocyty w obecnoci antyge-nów. Informacyjny RNA mo¿e byæ wyizolowany z lim-focytów przy u¿yciu szeregu dostêpnych zestawów ko-mercyjnych, a nastêpnie przepisany na DNA przy po-mocy standardowych procedur. Stosuj¹c konwencjonal-ny PCR, powsta³e w procesie amplifikacji produkty s¹ poddawane procesowi elektroforezy w ¿elu agarozowym. Jest to jednak metoda jakociowa, nie daj¹ca informacji o stê¿eniu cytokin w badanym materiale. Intensywnoæ wiecenia pr¹¿ka mo¿e zostaæ wykorzystana jedynie do porównania ró¿nych próbek badanych i w ten sposób wnioskowania o ró¿nicach w koncentracji badanych cytokin pomiêdzy próbkami. Zdecydowanie bardziej u¿yteczna jest reakcja ³añcuchowa polimerazy DNA z analiz¹ iloci produktu w czasie rzeczywistym QPCR (quantitative PCR). Technika ta pozwala oznaczyæ iloæ transkryptów cytokin z zachowaniem wysokiej czu³oci oraz dok³adnoci. Odczyt nastêpuje na podstawie pomia-ru sygna³u fluorescencji, który koresponduje z iloci¹ zsyntetyzowanego produktu PCR. Real-time PCR po-zwala na monitorowanie iloci produktu reakcji w ka¿-dym cyklu prowadzonej reakcji PCR, dziêki czemu ca³a procedura analizy jest bardzo szybka i pozwala wyeli-minowaæ etap szacowania produktu po zakoñczeniu re-akcji. Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sek-wencji mo¿liwe jest dziêki znakowaniu starterów lub sond oligonukleotydowych fluorochromami. Przyrost fluorescencji jest wprost proporcjonalny do liczby kopii DNA znajduj¹cego siê w badanej próbce. Koncentracjê mRNA w badanej próbce odczytuje siê z krzywej kali-bracyjnej. Sporz¹dza siê w tym celu seriê rozcieñczeñ roztworu o znanej liczbie kopii RNA, wyznacza siê wg nich krzyw¹ kalibracyjn¹ i znaj¹c przyrost fluorescen-cji, na podstawie krzywej odczytuje siê liczbê cz¹ste-czek. Metoda ta jest stosowana dosyæ czêsto u zwierz¹t ze wzglêdu na ma³¹ dostêpnoæ przeciwcia³ monoklo-nalnych oraz zestawów ELISA do oznaczeñ cytokin zwierzêcych (15). Trzeba jednak pamiêtaæ, ¿e transkryp-cja genu nie zawsze koreluje z syntez¹ odpowiednich bia³ek. Ponadto technika wymaga posiadania przez la-boratorium specjalistycznej aparatury.
Podsumowuj¹c, istnieje szereg technik, które mog¹ zostaæ wykorzystane samodzielnie lub symultanicznie do oceny odpowiedzi komórkowej ustroju, zarówno swo-istej, jak i nieswoistej. Ich stosowanie w pracach badaw-czych z dziedziny immunologii, a zw³aszcza wakcyno-logii, bêdzie z pewnoci¹ cennym, a wrêcz niezbêdnym,
elementem dowiadczenia. Szczególnie kluczowa wy-daje siê ocena swoistej odpowiedzi komórkowej, obok odpowiedzi humoralnej, w badaniach oceniaj¹cych re-akcjê zwierzêcia na podany antygen szczepionkowy.
Pimiennictwo
1.Canals A., Dominquez J., Tomilla J., Babín M., Alonsoet F.: Inhibition of IL-2R and SLA class II expression on stimulated lymphocytes by a suppressor activity found in homogenates of African swine fever virus infected cultures. Arch. Virol. 1995, 140, 1075-1085.
2.Caruso A., Licenziati S., Corulli M., Canaris A. D., Francesco De M. A., Fiorentini S., Peroni L., Fallacara F., Dima F., Balsari A., Turano A.: Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry 1997, 27, 71-76.
3.Dorn A. T., Waters W. R., Byers V. M., Pesch B. A., Wannemuehler M. J.: Characterization of mitogen-stimulated porcine lymphocytes using a stable fluorescent dye (PHK2) and multicolor flow cytometry. Vet. Immunol. Immuno-pathol. 2002, 87, 1-10.
4.Drela N.: Wykrywanie wewn¹trzkomórkowych cytokin metod¹ cytometrii przep³ywowej zastosowanie i problemy. Post. Biol. Kom. 2001, 28, 129-146. 5.Fachinger V., Schlapp T., Strube W., Schmeer N., Saalmüller A.: Poxvirus--induced immunostimulating effects on porcine leukocytes. J. Virol. 2000, 74, 7943-7951.
6.Givan A. L., Fisher J. L., Waugh M., Ernstoff M. S., Wallace P. K.: A flow cytometric method to estimate the precursor frequencies of cells proliferating in response to specific antigens. J. Immunol. Methods 1999, 230, 99-112. 7.I¿ycki D.: Zastosowanie cytometrii przep³ywowej w klinicznej diagnostyce
laboratoryjnej. Voice 2006, 2, 8-17.
8.Kristensen C. S., Andreasen M., Ersbøll A. K., Nielsen J. P.: Antibody response in sows and piglets following vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae toxigenic Pasteurella multocida and Actinobacillus pleuropneumoniae. Can. J. Vet. Res. 2004, 68, 66-70.
9.Mojiova J., Hromada R., Paulik S., Ondraoviè M., Bajova V.: Immune response and immunomodulatory effect of levamisole in immunosuppressed dogs vaccinated against parvovirosis. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2004, 48, 93-97. 10.Mosmann T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
appli-cation to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 1983, 65, 55-63.
11.Motubu M., El-Abasy M., Na K., Hirota Y.: Detection of mitogen-induced lymphocyte by bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation in chicken. J. Vet. Med. Sci. 2002, 64, 377-379.
12.Nowell P. C.: Differentiation of human leukemic leukocytes in tissue culture. Exp. Cell Res. 1960, 19, 267-277.
13.Nowell P. C.: Phytohemagglutinin: an initiator of mitosis in cultures of normal human leukocytes. Cancer Res. 1960, 20, 462-466.
14.Pejsak Z., Markowska-Daniel I.: Randomised, placebo-controlled trial of a live vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome in sows on infected farms. Vet. Rec. 2006, 158, 475-478.
15.Raymond C. R., Wilkie B. N.: Th-1/Th-2 type cytokine profiles of pig T-cells cultured with antigen-treated monocyte-derived dendritic cells. Vaccine 2004, 22, 1016-1023.
16.Riber U., Jungersen G.: Cell-mediated immune responses differentiate infec-tions with Brucella suis from Yersinia enterocolitica serotype O:9 in pigs. Vet. Immunol. Immunopathol. 2007, 116, 13-25.
17.Rustemeyer T., De Ligter S., Von Blomberg B. M. E., Frosch P. J., Scheper R. J.: Human T lymphocyte priming in vitro by haptenated autologous dendritic cells. Clin. Exp. Immunol. 1999, 117, 209-216.
18.Saker K. E., Kalnitsky J., Gogal R. M., Ward D. L.: Evaluation of a nonradioac-tive colorimetric assay for analysis of lymphocyte proliferation in healthy cats. Am. J. Vet. Res. 2001, 62, 567-571.
19.Sanchez A., Maruta C., Sato M., Ribeiro R., Zomignan C., Nunes R., Reis V.: Study on lymphocyte proliferation in nickel sensitive patients. An. Bras. Der-matol. 2005, 80, 149-158.
20.Sathiyaseelan T., Baldwin C. L.: Evaluation of cell replication by bovine T cells in polyclonally activated cultures using carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) loading and flow cytometric analysis. Res. Vet. Sci. 2000, 69, 275-281. 21.Stec J., Rachubik J., Szczotka M., Kumak J.: Effects of penicillium myco-toxins: citrinin, ochratoxin a, and patulin on in vitro proliferation of bovine lymphocytes. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2008, 52, 163-167.
22.Waters W. R., Peschb B. A., Hontecillasa R., Saccoc R. E., Zuckermannd F. A., Wannemuehler M. J.: Cellular immune responses of pigs induced by vacci-nation with either a whole cell sonicate or pepsin-digested Brachyspira (Serpu-lina) hyodysenteriae bacterin. Vaccine 2000, 18, 711-719.
23.Waters W. R., Palmer M. V., Pesch B. A. Olsen S. C., Wannemuehler M. J., Whipple D. L.: Lymphocyte subset proliferation responses of Mycobacterium bovis-infected cattle to purified protein derivative. Vet. Immunol. Immuno-pathol. 2000, 77, 257-273.
Adres autora: dr Ma³gorzata Pomorska-Mól, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: mpomorska@piwet.pulawy.pl
