Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 905
Praca oryginalna Original paper
Nowotwory stanowi¹ jeden z najpowa¿niejszych problemów medycyny ludzkiej, a w ostatnich latach, w zwi¹zku ze stale podnosz¹ca siê jakoci¹ us³ug we-terynaryjnych, równie¿ weterynaryjnej (17, 26). U lu-dzi najliczniejsz¹ grup¹ s¹ nowotwory skóry, stano-wi¹ce oko³o 30% wszystkich zmian rozrostowych i w zwi¹zku z tym stanowi¹ przedmiot zainteresowania wielu badaczy w ró¿nych aspektach (8, 14. cyt. 17). W literaturze przewa¿a pogl¹d, ¿e równie¿ nowotwo-ry skónowotwo-ry u psów stanowi¹ równie¿ oko³o 1/3 wszyst-kich nowotworów (17, 26). Rozpoznanie nowotwo-rów skóry nastrêcza czêsto wielu problemów. Mimo ¿e anatomiczna lokalizacja pozwala na wnikliwe ba-danie kliniczne, trzeba jednak braæ pod uwagê fakt, i¿ wiele innych chorób skóry mo¿e wywo³ywaæ podob-ne zmiany. Metodami wspomagaj¹cymi ocenê histo-patologiczn¹ w badaniu zmian nowotworowych s¹ badania ich markerów. Mog¹ nimi byæ ró¿ne sk³adni-ki komórsk³adni-ki np.: bia³ka lub glikoproteiny b³ony komór-kowej, cytoplazmy i j¹dra komórkowego.
Przedmiotem szczególnego zainteresowania wród markerów nowotworowych jest telomeraza enzym odpowiedzialny za wyd³u¿anie telomerów (27) wy-specjalizowanych kompleksów, zbudowanych z kwa-su dezoksyrybonukleinowego i bia³ek towarzysz¹cych, chroni¹cych koñce chromosomów (1, 5). Najpo-wszechniej stosowana do oceny ekspresji telomerazy metoda wykorzystuje aktywnoæ telomerazy jako od-wrotnej transkryptazy i jest oparta na wykrywaniu jej
produktów fragmentów DNA o charakterystycznej sekwencji. Metoda zosta³a opracowana przez Kima i wsp. (15) i opublikowana pod nazw¹ TRAP (telome-ric repeat amplification protocol) w 1994 r. Od kilku lat dostêpne s¹ tak¿e gotowe komercyjne zestawy opar-te na metodzie TRAP. Maopar-teria³em do badania aktyw-noci telomerazy s¹ wycinki tkanek uzyskane metod¹ biopsji, ródoperacyjnie lub podczas sekcji wykona-nej natychmiast po mierci oraz p³yny zawieraj¹ce komórki, np. mocz i wyp³uczyny z pêcherza moczo-wego (9). TRAP jest bardzo czu³¹ metod¹, pozwalaj¹-c¹ na badanie próbek zawieraj¹cych tylko kilka ko-mórek (28). Od momentu opracowania i opublikowa-nia metody TRAP wyranie zaznacza siê w pimien-nictwie spore zainteresowanie telomeraz¹ (4, 11).
Opublikowano dotychczas szereg artyku³ów doty-cz¹cych pomiarów aktywnoci telomerazy w tkankach ró¿nych typów nowotworów u ludzi (12, 20, 29). W porównaniu z pracami dotycz¹cymi aktywnoci te-lomerazy u ludzi niewiele jest doniesieñ na temat tego zagadnienia u psów. ¯adne z opublikowanych do-tychczas badañ u psów nie mia³y charakteru metodycz-nego i tym samym jej oceny w wybranych zmianach nowotworowych skóry u psów.
Celem niniejszych badañ by³o okrelenie przydat-noci metody TRAP do pomiaru aktywprzydat-noci telome-razy w wycinkach zdrowej i nowotworowo zmienio-nej skóry psów.
Ocena przydatnoci metody TRAP do pomiaru
aktywnoci telomerazy w nowotworach skóry psów
MAGDALENA ¯MUDZKA, JACEK MICUÑ, ROMAN LECHOWSKI
Zak³ad Chorób Wewnêtrznych Katedry Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159c, 02-776 Warszawa
¯mudzka M., Micuñ J., Lechowski R.
Evaluating TRAP assay for telomerase activity measurement in canine skin neoplasms
Summary
The aim of the study was to evaluate the TRAP assay method of measuring telomerase activity in canine skin neoplasms. Telomerase activity was measured in 57 samples of tumor tissues from operated dogs. The samples were also subjected to histopathology investigations. Telomerase activity was measured using the Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA diagnostic kit as well as ROCHE photometric enzyme immunoassay for quantitative determination of telomerase activity, utilizing the telomere repeat amplification protocol (TRAP). The repetition, sensitivity and specificity of telomerase activity measurements were determined. TRAP assay performed in dogs has high repetition rate within high activity, and lower within small activity. This method is 100% sensitive and 34% specific.
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 906
Materia³ i metody
Materia³em do badañ by³o 57 wycinków odgraniczonych zmian skórnych stwierdzonych u psów pacjentów ambu-latoryjnych, usuniêtych chirurgicznie za zgod¹ w³acicieli. Próbki do badañ pobierane by³y natychmiast po wyciêciu zmiany z zachowaniem zasad aseptyki i dzielone na dwie czêci. Jeden fragment umieszczany by³ w buforowanej formalinie w celu póniejszego badania histopatologicz-nego przeprowadzohistopatologicz-nego w Zak³adzie Patologii Katedry Nauk Klinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej, drugi, wielkoci ziarna owsa, umieszczany by³ w ja³owej probówce okr¹g³odennej, natychmiast zamra¿any w ciek-³ym azocie (196°C).
Ka¿d¹ próbkê poddano badaniu w kierunku stê¿enia bia³-ka standardow¹ metod¹ z u¿yciem odczynnibia³-ka Mikropro-teina, firmy Pointe Scientific o nr. kat. P7582-120.
Pomiary aktywnoci telomerazy dokonywano testem Telo TAGGG telomerase PCR ELISA plus, firmy Roche. Zasada testu wykorzystuje schemat TRAP opracowany przez Kima i wsp. (15).
Badania obejmowa³y ocenê powtarzalnoci, reprezenta-tywnoci, czu³oci i swoistoci diagnostycznej oznaczeñ telomerazy w skórze psów.
Badanie powtarzalnoci oznaczania aktywnoci telome-razy w tkance. W celu ustalenia powtarzalnoci wyników oznaczeñ w próbkach o zró¿nicowanej aktywnoci telome-razy przeprowadzono dziesiêciokrotne oznaczenie aktyw-noci enzymu w ka¿dej z czterech wybranych próbek. Do badañ wybrano próbki o aktywnociach telomerazy: 581, 223, 47, 5 U/g bia³ka.
Badanie reprezentatywnoci pojedynczego oznaczenia. Do badañ reprezentatywnoci wykorzystano te same prób-ki, które s³u¿y³y w ocenie powtarzalnoci. W tym celu ob-liczono ró¿nice pomiêdzy wielkoci¹ wariancji dla par grup oraz oceniono jednoczesny brak ró¿nic miêdzy rednimi tych grup. Wyniki opracowano statystycznie testem anali-zy wariancji (23).
Badanie czu³oci diagnostycznej oznaczania aktyw-noci telomerazy w tkance. Czu³oæ diagnostyczn¹ metody okrelono jako odsetek chorych w grupie badanej, którzy za pomoc¹ zastosowanej metody pomiaru aktywnoci telo-merazy zostali poprawnie zidentyfikowani jako chorzy (7). Parametr ten oceniano na podstawie stosunku wyników prawdziwie dodatnich PD (podwy¿szona aktywnoæ telo-merazy w tkance nowotworowej) do sumy wyników praw-dziwie dodatnich i fa³szywie ujemnych FU (brak aktyw-noci telomerazy w tkance nowotworowej), uzyskane war-toci obliczono wg wzoru I wyra¿ono w procentach (7):
Czu³oæ (%) = PD/(PD + FU) × 100%, PD liczba wyników prawdziwie dodatnich, FU liczba wyników fa³szywie ujemnych.
Badanie swoistoci diagnostycznej oznaczania telome-razy w tkance. Swoistoæ diagnostyczn¹ metody okrelono jako odsetek pacjentów zdrowych w grupie badanej, u któ-rych za pomoc¹ metody oznaczania aktywnoci telomera-zy wykluczono chorobê (7). Swoistoæ diagnostyczn¹ oce-niano na podstawie stosunku wyników prawdziwie ujem-nych PU (brak aktywnoci telomerazy w tkance histopato-logicznie niezmienionej) do sumy wyników prawdziwie ujemnych i fa³szywie dodatnich FD (podwy¿szona
aktyw-noæ telomerazy w tkance histopatologicznie niezmienio-nej), uzyskane wartoci obliczono wg wzoru i wyra¿ono w procentach (7):
Swoistoæ (%) = PU/(PU + FD) × 100%, PU liczba wyników prawdziwie ujemnych, FD liczba wyników fa³szywie dodatnich.
W analizie statystycznej zastosowano test Levenea jed-norodnoci wariancji dla prób niezale¿nych, test Kruskala--Wallisa, test Manna-Whitneya, test Spearmana, test Chi--kwadrat oraz dok³adny test Fishera.
Wyniki i omówienie
Wyniki badania powtarzalnoci oznaczeñ aktywnoci telomerazy w badanej próbce przedstawiono w tab. 1. Uzyskane wartoci wspó³czynników zmiennoci wska-zuj¹, ¿e metoda jest wysoce powtarzalna w zakresie wysokich wartoci aktywnoci telomerazy, co kwali-fikuje j¹ jako przydatn¹ do oceny aktywnoci enzymu w zmianach nowotworowych skóry psów.
W celu potwierdzenia powtarzalnoci metody po-stanowiono obliczyæ ró¿nice pomiêdzy wielkoci¹ wariancji dla par grup oraz oceniæ jednoczesny brak ró¿nic miêdzy rednimi tych grup. Jedynie w przypad-ku zapaleñ stwierdzono istotn¹ ró¿nicê pomiêdzy red-nimi i bardzo du¿¹ ró¿nicê w wielkoci odchylenia standardowego. Pozwala to wnioskowaæ, ¿e metoda jest przydatna do badania zmian rozrostowych. Brak ró¿nicy miêdzy wariancjami w przypadku guzów pod-stawnokomórkowych mo¿e wynikaæ z ma³ej liczeb-noci grupy, lecz równie¿ w tym przypadku mo¿na uznaæ metodê za przydatn¹, poniewa¿ wartoæ istot-noci zbli¿a³a siê do granicy wartoci po¿¹danej.
W badaniach reprezentatywnoci pojedynczego oznaczenia (tab. 2) stwierdzono, ¿e jedynie w przy-padku zapaleñ wystêpuje istotna ró¿nica pomiêdzy rednimi wartociami w grupie i bardzo wysoka nica w wartoci odchylenia standardowego. Brak
ró¿-Tab. 1. Wyniki badania powtarzalnoci i wspó³czynniki zmien-noci pomiarów aktywzmien-noci telomerazy
a i n a d a b r e m u N 1próbka 2próbka 3próbka 4próbka 1 581 223 47 5 2 562 212 45 4 3 575 231 49 5 4 600 246 47 3 5 583 211 48 6 6 585 211 45 5 7 578 195 51 5 8 592 198 50 3 9 581 201 49 6 0 1 597 207 47 5 a n z c y t e m t y r a a i n d e r 583,4 213,5 47,8 4,7 D S ±11,09 ±15,81 ±1,99 ±1,06 % V i c o n n e i m z k i n n y z c ³ ó p s W 1,9 7,4 4,1 22
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 907
nicy miêdzy wariancjami w przypadku guzów pod-stawnokomórkowych mo¿e wynikaæ z ma³ej liczeb-noci grupy, lecz równie¿ w tym przypadku mo¿na uznaæ metodê za przydatn¹, gdy¿ wartoæ istotnoci zbli¿a³a siê do wartoci po¿¹danej.
Czu³oæ diagnostyczna metody pomiaru aktywno-ci telomerazy w tkance guzów z³oliwych wynios³a 100%. Wynika³o to z faktu, i¿ wszystkie badane no-wotwory z³oliwe wykazywa³y aktywnoæ telomerazy w tkance. W przypadku t³uszczaka, bêd¹cego nowo-tworem niez³oliwym, czu³oæ diagnostyczna wynios-³a 71,4%, co by³o zwi¹zane z brakiem aktywnoci te-lomerazy w dwóch jego przypadkach.
Swoistoæ diagnostyczna pomiaru aktywnoci telo-merazy w przypadku nowotworów z³oliwych wyno-si³a 34%. By³o to zwi¹zane z wystêpowaniem aktyw-noci telomerazy w zmianach niez³oliwych (zapale-nie) i 3 przypadkach skóry zdrowej.
W przeprowadzonych badaniach wykazano, ¿e czu-³oæ metody wynosi³a 100% w przypadku nowotwo-rów z³oliwych. W opinii wielu autonowotwo-rów (13, 22, 24, 29), wyniki pomiaru aktywnoci telomerazy w guzach skóry u ludzi s¹ podobne, jednak ró¿ni¹ siê w ocenie czu³oci metody. Istniej¹ doniesienia, ¿e czu³oæ me-tody uzale¿niona jest od rodzaju badanej tkanki i tak np. w odniesieniu do guzów sutka wynosi oko³o 40%, podczas gdy w nowotworach jajników siêga 100% (19). Chen i wsp. (6), którzy we wszystkich przypad-kach raków p³askonab³onkowych rogowaciej¹cych i raków podstawnokomórkowych wykazali u ludzi ak-tywnoæ telomerazy, czu³oæ metody okrelili na 100%. Villa i wsp. (31) okrelili czu³oæ metody w przypad-ku czerniaków z³oliwych u ludzi na 84,6%, za Mi-racco i wsp. (18) równie¿ u ludzi, wykazali aktyw-noæ telomerazy we wszystkich pierwotnych guzach skóry i tym samym wykazali 100% czu³oæ metody. Spangler i wsp. (28) badaj¹c czu³oæ metody oznacza-nia telomerazy w p³ynie wysiêkowym z op³ucnej u psów i kotów z nowotworami stwierdzili, ¿e bada-nie to bada-nie przewy¿sza czu³oci¹ badania cytologiczne-go (czu³oæ 50%) i jest mniej swoiste (83%). Na tej
podstawie autorzy wysunêli wniosek, ¿e u psów pomiar aktywnoci telomerazy w p³ynach ustrojowych, jako jedyny test w ocenie zmian nowotworowych, jest ma³o przydatny i nie pozwala na jednoznaczne postawienie rozpoznania. Biller i wsp. (3) wykazali wysok¹ korelacjê miêdzy aktywnoci¹ telome-razy w tkance a stopniem z³oliwoci guza. Cytowani autorzy obliczyli, ¿e zasto-sowana metoda pomiaru ak-tywnoci telomerazy cecho-wa³a siê 92% czu³oci¹. Do-tyczy³o to zarówno guzów skóry, jak i innych zmian nowotworowych zlokalizowanych w ró¿nych narz¹-dach. Próbki tkanki w¹trobowej nie wykazuj¹cej zmian nowotworowych, a wycinki nowotworu ³agodnego w¹trobiaka (hepatoma) nie wykazywa³y aktywnoci enzymu, podczas gdy w wycinkach z raka z komórek w¹troby stwierdzano jej wysok¹ aktywnoæ (3).
Swoistoæ metody w badaniach w³asnych wynosi³a 34%. S¹ to wyniki odmienne od uzyskanych przez Kima i wsp. (15). Autorzy ci wykazali aktywnoæ te-lomerazy w 90% komórek nowotworowych oraz w 98% komórek macierzystych. Swoistoæ opracowa-nej metody cytowani autorzy okrelili na 100%, nie wykazuj¹c w ¿adnej z próbek pobranych z niezmie-nionych klinicznie tkanek cz³owieka aktywnoci en-zymu. W póniejszych badaniach innych naukowców swoistoæ by³a ju¿ oceniana wyranie ni¿ej, w grani-cach 80-90% (3, 13, 24, 30). Mog³o to wynikaæ z udos-konalenia metody wykrywania aktywnoci telomera-zy w tkankach, co spowodowa³o obni¿enie progu wy-krywalnoci tego enzymu.
W badaniach w³asnych niska swoistoæ wynika³a z obecnoci telomerazy w zmianach nienowotworo-wych oraz skórze zdrowej. W 3 z 9 przypadków skóry klinicznie zdrowej wykazano aktywnoæ telomerazy powy¿ej zera, jednak wartoci te by³y bardzo niskie i pozostawa³y daleko poza zakresem wartoci stwier-dzanych w z³oliwych zmianach nowotworowych. Obecnoæ telomerazy w skórze zdrowej mog³a byæ zwi¹zana z obecnoci¹ komórek macierzystych lub, zachowuj¹cych siê w zakresie aktywnoci telomerazy podobnie, komórek mieszków w³osowych (25).
Analiza czu³oci i swoistoci wykaza³a, ¿e zastoso-wana metoda pomiaru aktywnoci telomerazy w tkan-ce objêtej protkan-cesem nowotworowym jest bardzo czu-³ym testem, co jest zgodne z doniesieniami innych autorów (3, 15), ale o niezbyt wysokiej swoistoci.
Powtarzalnoæ metody poddano ocenie, przeprowa-dzaj¹c po 10 pomiarów aktywnoci telomerazy w jed-nej próbce i porównuj¹c statystycznie z pomiarami aktywnoci telomerazy w grupie nowotworów, z
któ-Tab. 2. Ró¿nice pomiêdzy rednimi aktywnoci telomerazy w badanych grupach zmian skór-nych h c y n r ó k s n a i m z a p u r G n arytmreedtnyciazna staOnddacnhydlaerndioewe wIsatoirtanoncæij poImstoiêtndozyærreód¿nniicmi a k a i n r e z c i k b ó r p j e n a r b y w y r a i m o P 101 583,40 111,088 * * 0 0 0 , 0 0,238 i k a i n r e z C 9 536,00 111,125 a z u g i k b ó r p j e n a r b y w y r a i m o P o g e w o k r ó m o k o n w a t s d o p 101 213,50 15,806 0,086 0,234 y w o k r ó m o k o n w a t s d o p z u G 5 192,60 49,783 a k a z c z s u ³t i k b ó r p j e n a r b y w y r a i m o P 101 4,70 1,059 * 5 1 0 , 0 0,458 i k a z c z s u ³ T 7 7,29 8,597 a i n e l a p a z i k b ó r p j e n a r b y w y r a i m o P 101 47,80 11,989 * * 1 0 0 , 0 0,038* a i n e l a p a Z 7 25,57 22,112 Objanienie: * p £ 0,05; ** p £ 0,01; ni nieistotna
Medycyna Wet. 2006, 62 (8) 908
rych wybrano dan¹ próbkê. Do tego badania wybrano po jednej próbce raka podstawnokomórkowego, czer-niaka, t³uszczaka i zapalenia wykazuj¹cych zró¿nico-wane wartoci aktywnoci telomerazy. Rozrzut war-toci by³ najni¿szy w przypadku czerniaka reprezen-tuj¹cego najwy¿sze wartoci (V = 1,9%), za najwy¿-szy w przypadku zapalenia, bêd¹cego przyk³adem wartoci niskich (V = 22%). Taki wynik potwierdza wiêksz¹ przydatnoæ metody do analizowania warto-ci dotycz¹cych zmian z³oliwych. Porównanie miêdzy wariancjami w ka¿dej grupie 10 pomiarów i w gru-pach odpowiadaj¹cych im nowotworów oraz porów-nanie rednich wartoci w tych grupach wskazuje, ¿e metoda TRAP jest przydatna do badania aktywnoci telomerazy w wycinkach tkanek zmienionych nowo-tworowo. Potwierdzaj¹ to wyniki autorów wykorzy-stuj¹cych ju¿ wczeniej tê metodê u ludzi (2, 10, 16, 21).
Metoda TRAP jest powtarzalnym i reprezentatyw-nym badaniem w przypadku z³oliwych guzów skóry u psów. Charakteryzuje siê tak¿e wysok¹ czu³oci¹ i niewielk¹ swoistoci¹ diagnostyczn¹.
Pimiennictwo
1.Ahmed A., Tollefsbol T.: Telomeres and telomerase: basic science implica-tions for aging. J. Am. Geriatr. Soc. 2001, 49, 1105-1109.
2.Argyle D. J., McKevitt T. P., Paoloni M., Long S., Gault E. A., Nasir L.: Targeting telomerase in canine cancer. Genes, Dogs, and Cancer: 3rd Annual
Canine Cancer Conf. California 2003, s. 55-59.
3.Biller B., Kitchell B.: Evaluation of an assay for detecting telomerase activity in neoplastic tissues of dogs. Am. J. Vet. Res. 1998, 59, 234-237. 4.Blasco M. A.: Mouse models to study the role of telomeres in cancer, aging
and DNA repair. Europ. J. Cancer 2000, 38, 2222-2228.
5.Chan S., Blackburn E.: Telomeres and telomerase. Phil. Trans. R. Soc Lond. B. 2004, 359, 109-121.
6.Chen J., Greider C.: Telomerase RNA structure and function: implications for dyskeratosis congenital. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 183-192. 7.Dembiñska-Kieæ A., Naskalski J.: Diagnostyka laboratoryjna z elementami
biochemii klinicznej. Volumed, Wroc³aw 1998, s. 73-79.
8.Diepgen T. L., Mahler V.: The epidemiology of skin cancer. Bri. J. Dermatol. 2002, 146, 1-6.
9.Fedrige R., Gunelli R., Nanni O., Bacci F., Amadori D., Calistri D.: Telome-rase activity detected by quantitive assay in bladder carcinoma and exfolia-ted cells in urine. Neoplasia 2001, 3, 446-450.
10.Hahn W. C., Meyerson M.: Telomerase activation, cellular immortalisation and cancer. Ann Med. 2001, 33, 123-129.
11.Harley C. B., Villeponteau B.: Telomeres and telomerase in aging and can-cer. Curr. Biol. 1998, 8, 178-181.
12.Hiyama E., Gollahon L., Kataoka T.: Telomerase activity in human breast tumors. J. Natl Cancer 1996, 88, 1161-1172.
13.Hu S., Chan H.: Telomerase expression in bening and malignant skin neo-plasm: comparison of three major subunits. J. Formos. Med. Assoc. 2002, 101, 593-597.
14.Katalinic A., Kunze U., Schäfer T.: Epidemiology of cutaneous melanoma and non-melanoma skin cancer. Br. J. Dermatol. 2003, 149, 1200-1206. 15.Kim N. W., Piatyszek M. A., Prowse K. R., Harley C. B., West M. D., Ho P. L.,
Coviello G. M., Wright W. E., Weinrich S. L., Shay J. W.: Specific assocition of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994, 266, 2011-2015.
16.Kitchell B., Biller B. J., Cadile C. D., Balkin R. G.: Telomerase and canine cancer; genes, dogs, and cancer: Emerging concepts in molecular diagnosis and therapy. Conf. California 2002, s. 267-280.
17.Malicka E., Piusiñski W., Sendecka H., Bielecki W., Osiñska B., Lenarto-wicz-Kubrat Z.: Nowotwory psów stwierdzane w badaniach anatomopatolo-gicznych w latach 1985-1993. Medycyna Wet. 1996, 52, 103-106. 18.Miracco C.: Detection of telomerase activity and correlation with mitotic
and apoptic indices, Ki67 and expression of cyclin D1 and A in cutaneous melanoma. Int. J. Cancer 2000, 88, 411-416.
19.Murakami Y., Teteyama S., Rungsipipat A., Uchida K., Yamaguchi R.: Im-munohistochemical analysis of cyclin A, cyclin D1 and P53 in mammary tumors, sqamous cell carcinomas and basal cell tumors of dogs and cats. J. Vet. Med. Sci. 2000, 62, 743-750.
20.Nasir L., Devlin T., Mckevitt T., Rutteman G., Argyle D.: Telomer lenghs and telomerase activity in dig tissues: a potential model to study human telomer and telomerase biology. Neoplasia 2001, 3, 351-359.
21.Novak K. D.: Telomeres and telomerases in cancer. AACR Special Conf. San Francisco, 7-11.12.2002, s. 32-39.
22.Ogoshi M., Le T., Shay J. W., Taylor R. S.: In situ hybridization analysis of the expression of human telomease RNA in normal and pathologic condi-tions of the skin. J. Inv. Derm. 1998, 110, 818-823.
23.Olech W., Wieczorek M.: Zastosowanie metod statystyki w dowiadczalnic-twie zootechnicznym. Wyd. SGGW, Warszawa 2002, s. 47.
24.Parris C., Jezzard S.: Telomerase activity in melanoma and non-melanoma skin cancer. Br. J. Cancer 1999, 79, 47-53.
25.Ramirez R.: Telomerase activity concentrates in the mitotically active seg-ments of human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 1997, 108, 113-117. 26.Sendecka H., Malicka E., Piusiñski W., Bielecki W., Krawiec M., Osiñska B.,
Sobczak M.: Nowotwory u zwierz¹t w badaniach diagnostycznych Zak³adu Anatomii Patologicznej Wydzia³u Weterynaryjnego w Warszawie w latach 1987-1996. I Konf. Nauk.: Onkologia weterynaryjna. Postêpy w diagnostyce i terapii. Olsztyn 4-5.09.1997, s. 67-70.
27.Shay J. W., Zou Y., Hiyama E., Wright W. E.: Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet. 2001, 10, 677-685.
28.Spangler E., Rogers K., Thomas J., Pusteyovsky D., Boyd S., Shippen D.: Telomerase enzyme activity as a diagnostic tool to distinguish effusions of malignant and bening origin. J. Vet. Med. 2000, 14, 146-150.
29.Sulaimon S., Kitchell B., Ehrhart E.: Immunohistochemical detection of melanoma-specific antigens in spontaneous canine melanoma. J. Comp. Pa-thol. 2002, 127, 162-168.
30.Ueda M., Bito T.: Telomerase activity in human skin and skin tumor. J. Der-mat. Sci. 2000, 13, 345-349.
31.Villa R.: Telomerase activity by transcription and alternative splicing of telo-merase reverse transcriptase in human melanoma. J. Invest. Dermat. 2001, 116, 867-873.
Adres autora: dr Magdalena ¯mudzka, ul. Niemirowska 1 m. 27, 02-921 Warszawa; e-mail: madzia.zuk@wp.pl
