Het ontwerpen van een schema voor de bereiding van Penicilline G.

'-I I ~ I

~

I I

r

Het ontwerpen van een achema voor de bereiding van Penicilline G.

door E.J.de Boer

en

S.Lont

· INHOUD

blz. 1 inleiding

blz. ₃ de fermentatie als standaard-proces

0; "- blz. 3 het micro-organisme blz. 4- de TOedingsbodem blz. 6 precursors blz. 6 de sterilisatie blz.

a

anti-schuimmiddelen blz.

a

luchtverdelers blz. 8 de roerder blz. 9 kranen blz. ₉ meet- en regelapparatuur blz. ₉ enttank blz. 9 fermentor

blz. 10 toelichting op het ontworpen schema

..

blz. 12 berekening van de meest economische isolatiedikte Voor de fermentor

I

~

I

I ..

I

..

.-•

Gebruikte Literatuur

1. C1arke H.T. The Chemistry of Penicillin 1949. 2.

3.

4 •

5·

6.

7.

8. Science ~ 627 (1945)

Pederal Register November 1946 Chapter 1 Food and Drug.Admin.Part 146 Seience 106

_-

504 (1947) voor andere eenheden.

Brown W.E. and Peterson W.H. Ind.Eng.Chem. 42 1769 (1950) R.W.Stone Science 104 445 (1946)

W.E.Brown Abstracts 18 A 116th meeting Am.Chem.Soc. Atlantic City

(Sept 1949).

R.A.Steinberg Agr. Research

21

413 (1935) Stefaniak ;. J. Ind. Eng. Chem. .2.§. 666 (1946)

9.S.B.Lee

& Mc.Daniel presented before the Division of Agricultura1 and

Food Chemistry 116th meeting;Am.Chem.Soc.At1antic City. 10. Vander Brook

& Savage

U.S.P. 2.488.248

11. Ind.Eng.Chem. (1950) Janr. 191 42

12. S.B.Lee

& H.E.Si1cox Ind.Eng.Chem.(1948) 1602

40

13. J.J.Stefaniak,C.S.Brown & M.J.Johnson Ind.Eng.Chem. (1946) ~ 666 14. W.E.Brown

& W.H.Peterson

Ind.Eng.Chem.(1950) 42 1769.

15. W.Moyer

& D.Coghi11

J.Bact.

2h

57 (1946).

16. ibid p. 59.

17. W.J.Fotster,H.B.Woodruff e.a. J.Bact.

21

695 (1946). 18. D.Per1man Bull.Torrey Botan.Club

22

79 (1949).

19. K. Higuchi,F.C.Jarvis e.a. J.Am. Chem. Soc. 68 1969 (1946).

20. C.E.Lankford & H.Lacy presented before the meeting of Soc.of American Bacterio1ogists Cincinnatie Ohio (May 1949). 21. W.D.Grabam Science 110 217 (1949).

22. W.D.Graham, P.T. Rsu Poultry Science

gz

668 (1~8).

23. Lee

& Mc.Danie1

presented before the Division of Agr.& Food Chemistry 116th meeting Am.Chem.Soc. At1antic City.

24. J.Bact.

22

231 (1947)

25. H.G.Johnson U.S.P. 2.443.825

26. Bisae11 Chem. Eng. Prog. ~ 649 (1947) 27. T.R.01ive Chem.Eng.lnd.

22

107,172 (1949)

28. W.E.Brown & W.H.Peterson Ind.Eng.Chem. 42 1769 (1950). 29. J.E.Breeze Proc.Natl.Electronics Conf.

i

451 (1948.)

.30.

T.R.01ive Chem.Eng.

22

107,172 (1949) •

I

~

.. 1t.; ... #--t.+-}

I ~ I I ~ I I . I I.. DE BEREIDING VAN PENICILLINE

Penicilline is een verbinding,die door de inwerking van bepaalde schimmels op hun voedingsbode.,wordt afgescheiden.

D~ algemene formule luidt:

R_CO_NH-GH-d1IS\c/CH3

. J 1

I

'

CH3

(1 )

CQ-N - C-COOH

Deze stof gaat door de inwerking van zwak alkali over in:

.-S\. /CH3 R-GO-NH-GH-- CH C

I

I

I

CH3

COOR N----CH - COOR

Het Na-,K-,of Ca-zout hiervan,wordt in meer of minder zuivere vorm, als z. g. ttantibiotic~~ .. _K~bruikt.

Men-~eidt diverse penicillinen,Lotgeen men aangeeft door

toevoeging van één of meer letters.

Zo heeft men o.a.Penicilline A, Penicilline K, Penicilline X, Penicilline G. Het verschil tussen deze stoffen bestaat alleen uit verschil in de alkylgroep R.

De meest toegepaste penicilline is de Penicilline G. Hierin stelt R de benzylgroep( C&H5- CH2 -) voor.

W~ zullen ons schema opzetten voor de productie van Penicilline G.

In verband met de toepassing als ttantibiotic",drukt men de gebruikte hoeveelheid penicilline in het algemeen niet uit in grammen,doch in een bepaalde eenheid,die verband houdt met de sterkte van zijn werking als "antibiotic ft.

De eenheid wordt gedefinieerd,als de activiteit,aanwezig in 0,6 microgram van de penicilline standaard-eenheid,bestaande uit kristallijn Na-penicillinaat,vastgesteld door de U.S.Food and Drug Administration.(2)

Eén mg vap het kristallijne penicillinaat komt overeen met 1667 Oxford-eenheden.(3)

Eén Oxford-eenheid • de hoeveelheid penicilline die,wanneer opge-lost in 50 mI oplossing(ttmeat extract brothtt),juist de groei van

STAPHYLOCOCCUS AU REUS voorkomt.

Het fermentatieproces voor de bereiding van penicilline is t~dens de Tweede Wereldoorlog tot ontwikkeling gebracht en op grote schaal toegepast.

B~ de fermentatie maakt men gebruik van diverse schimmels o.a. Penicilliam notatum en Penicillium chrysogenum. Door vele selecties en mutaties is men er in geslaagd afstammelingen te verkr~gen,die een veel

grotere productie-capaciteit van penicilline hebben,dan de eerst ontdekte soorten.De soort Penicillium chrysogenum Q-l76 is tegenwoordig de meest gebruikte.

Het fermentatièproces kan op verschillende w~zen worden uitgevoerd. Een viertal methoden zijn de volgende:

l.Oppervlakte-cultures in schalen met een vloeibaar medium van 1

à

2 cm diepte.

2.0ppervlakte-cultures in schalen op vaste media. 3. tt Submerged cul turett in liquid media.

) \ -1 :.., v u v v \. , " l \'

-V (

.

:..-VJ .J... (_ ~ 0 '-1. J L: 1: L .L. ( . r u v

I

I L V t v ) • j (' \ V J " .l-.L i:,_ .• J _,-' ::. ., -. ~

I _

I

L

I

2

De apparaten zijn voorzien van een inrichting om lucht door het medium te persen en continu te roeren.

4. Cultures in vloeibare media, die gecirculeerd worden over houten spaanders

of ander dergeli~ materiaal.

Op technische schaal is voor penicilline alleen methode 3 van belangtdaar

alleen door dit proces gemakkelijk is te voldoen aan de eisen van contina-bedrljf,grote hoeveelheden,en steriele werking.

In ons schema zullen we deze methode toepassen.

De penicilline wordt van de verdunde oplossing gescheiuen door diverse bewerkingen, zoals filtratie,extractie,concentratie en kristallisatie.

De opbrengst aam penicilline wordt bepaald door het type schimmel en de

kweekomatandigheden.Ook is gerichte katalyse mogeli~ door toevoeging van

geringe hoeveelheden van bepaalde stoffen z.g. "precursers".

Door toevoeging van een "precurserft _{is men er in geslaagd,de vorming van}

Penicilline G te laten overheersen tot>

97%

(4).

De productie van penicilline is sedert de eerste ontdekking, door

perfecti-onêring van het proces zeer sterk toegenomen. Men kr~gt hiervan een indruk

door de totale jaarproductie van penicilline in de V.S. over de jaren 1947 - 1948 - 1949 met elkaar te vergelijken.

Penicilline-Eroductie 1~47 1948 1~4~ milliarden eenheden 41.426 95.855 133.464 ~ 24.856.000 57.513.000 80.078.000 grammen pounds 55.000 126.700 176.400

We zien,dat in drie jaar de productie van penicilline meer dan

verdrie-voudigd is. Gezien bovenstaande ontwikkeling is het niet vreemd, dat de

kostprijs van penicilline zeer sterk-tg--gedaald.

Deze is van '20.- per 100.000 eenheden,gekomen op

4i

dollarcent per

100.000 eenheden.

Door de grote kosten, verbonden aan de opwerking van de uiterst verdunde oplossing( ",,0.03% penicilline) tot penicilline,de sterilisatie ,verwarming,

koeling,extra~ie,hoog vacuum e.d.,is de bereiding van penicilline alleen

dan lonend, wanneer deze in grote hoeveelheden plaats vindt.

We dienen dus met deze omstandigheden rekening te houden bij het opzetten

Van ons schema.

De meest toegepaste fermentoren zijn die van 10.000

à

15.000 gallon

inhoud. \ ,

Wij hebben een schema ontworpentdat gebaseerd is op de productie van een

fermentor van 10.000 gallon per dag.

Di t geeft bij onze concentratie aan penicilline een jaarproductie., die

1/16 van de Amerikaanse jaarproductie aan penicilline is. Dit schema is in twee delen gesplitst.

De fermentatie zal door ondergetekende worden besproken en de isolatie door de heer S.Lont.

I

I

-I

I •

I

DE FERMENTATIE ALS STANDAARD-PROCES

Een studie van het fermenteren als standaard-proces is aan beperkin-gen gebonden.Men kan over "het algemeen niet verder gaan,dan kwalitatieve ,beschouwingen.Echter,hoe kwantitatiever de principes van het fermenteren worden begrepen,hoe gemakkelijker nieuwe processen tot ontwikkeling kunnen worden gebracht.

Voor het fermenteren zijn van belang de volgende factoren:

Het miero-organisme,de voedingsbodem,sporen katalysatoren, sterilisatie en het fermenteren zelf.

We zullen deze factoren achtereenvolgens nader beschouwen. Het Micro-organisme.

Het fermentatieproces moet aan twee eisen voldoen:

Het groeien van het micro-organisme,dat de enzymen of katalysatoren voort .

moet brengen,die nodig zijn voor de tweede eis,het vormen van het product. Het micro-organisme moet op bevredigende w~ze aan deze eisen voldoen. Het moet stabiel zijn, een snelle en een sterke groei hebben en constante opbrengsten geven op een economisch verantwoorde voedingsbodem,onder standaard-condities.

Het moet bestand zijn tegen hoge concentratie van het gjormde product. Deze laatste eigenschap is gemakkelijk aan te kweken door selectie van cultures en geschiedt in eerste instantie op het laboratorium.

De volgende stap in het proces is het bereiden van actief groeiende cultures,op kleine schaal in het laboratorium en daarna op grotere schaal in de fabriek voor de uiteindelljke productie( de bereiding van het z.g.

ttinoculumtt ) •

Bij herhaalde selectie of mutatie bestaat het gevaar,dat de afstammelingen hun activiteit v~rliezen en daardoor lagere opbrengsten geven bij de fermen-tatie.Ook is aanpassing mogelijk met grotere opbrengsten tot gevolg.

In 't algemeen is echter aan te nemen: houdt het aantal trappen van laboratoriumgrootte af, tot fermentatie,zo klein mogelijk.

De meest gunsiige condities voor de ouderdom en de hoeveelheid van het ttinoculumtt _{vari::êren sterk voor de diverse fermentatieprocess.en.}

Lee én Mc.Daniel (9) hebben gevonden,dat 10 volume-procenten van een jong "inoeulum" accepteerbare resultaten geven bij de penicillinefermentatie.

Vander Brook en Sav.age (10) patenteerden,dat de hoeveelheid t.~g.vo gd "inoculumtt _{van de schimmel Penicillium Chrysogenum,door het} tOèpa"~sen _van

hogeroersnelheden geringer kon zijn en tevens hogere opbrengsten aan penicilline gaf.

We zien hieruit dat het gewenst is,een jong "inoculumtl te gebruiken en de hoeveelheid hiervah wordt bepaald door het proces. .

De ontwikkeling van de schimmel tot de gewenste hoeveelheidlfinoculumtl

gaat op het laboratorium in flessen van steeds groter wordende inhoud en daarna in de fabriek in steeds groter wordende tanks,de z.g. enttanks ("seedtanksft

.--~--- -

-I I '"

4.

De ontwikkeling van de schimmel voor de penicillinebereiding vanaf het eerste stadium van gebruik,tot op heden,wordt weergegeven door het onder-staande overzicht: Penicillium chrysogenum:

~

Penicillium cbrysogenum:

I

Penicillium chrysogenum: peniCilliumlChrysOgenum,

~

. Penicillium chrysogenum:

geisoleerd in Juli 194~ en bekend als Penicillium chrysogenum N.R.R.L. 1951 N.R.R.L 1951-B. Deze is ontwikkeld onder natuurlijke omstandigheden in de kolonie van

Pen.chrys. N.R.R.L.l951.

N.R.R.L.l95l-B 25: natuurlijke ontwikkeling in de kolonie van Pen.chrys.N.R.R.L.1951 B.

Q -

176: een mutatie van Pen.chrys. N.R.R.L.195l- B25

X - 1612 : een mutatie met behulp van ultra-violet licht uit pen.chrys.Q-176. penicillium chrysogenum Q-176 wordt op grote schaal algemeen

toegepast·Penicillium chrysogenum X-1612 ia een nieuwe variëteittw~rvan de toepassing zich nog in een beginstadium bevindt(U.S.P. 2.458.495).

In de komende jaren zal deze variëteit zeer zeker sterk in betekenis toenemen. Een vergelijking van beide soorten geeft de volgende tabel:

X-1612 Q- 176 Penicillineproductie Eenh./ml 5 dagen 1235 990 6 dagen 2400 1~20 7 dagen 3050 1105 8 dagen 1670

We zien hieruit,dat X-l612 een belangrijk grotere capaciteit heeft,

dan de Q-176. Ook een proef op grote schaal met beide soorten,elk gedurende één maand,gaf een grotere productie van penicilline voor X-16l2.

Nadere gegevens over X-1612 ontbreken ons echter,zodat wij in ons schema voor de fermentatie gebruik maken van de soort Q-176.

Wij nemen,op grond van de gegevens uit de literatuur,als basis voor onze productie aan: 1000 Eenh./ml (ll),(12),(1~),(l4).

De Voedingsbodem.

Het medium is van evengroot belang voor de fermentatie op grote sChaal,als het micro-organisme.

Het medium heeft bij dit proces twee functies,het moet in staat zijn de groei van het micro-organisme te bewerkstelligen en de synthese van het gewenste product mogelijk maken,met behulp van de gevormde enzymen.

Voor penicilline is glucose het koolhydraat,dat nodig is voor de celgroei en de lactose is nodig voor maximum productie.

De z.g. "Oorn steep liquor" is de bron voor stikstof (6).

In de enttanks,waar de groei primair is,wordt glucose gebruikt,doch in de fermentor,waar zowel groei als productie plaats moet vinden,zal naar een compromis moeten worden gezocht.

Een typische samenstelling is: 1% glucose, ?f%, lactose en ~ "Com steep liquor". Voldoende CaC83 wordt toegevoegd om de pH bij het begin op 6.8t te brengen.

ûft

.

Itt •• _ 1-,' rA! 11' )

Een bezwaar tegen ~ebruik van natuurproducten voor het samen-stellen van de voedingsbodem,is het niet-constant zijn van de opbrengst, bij verandering van grondstof.

J 'v ,

.

\ -( - v , / I .J. \' v t ' 1 ~

.

. '/ -/ , ) : v

1

"\

.

.

I ~ i

I

:

I .

5

onderstaande grondstoffen.

"Cornsteep liquortt _{(15),(16). Katoenzaadmeel (17). Lijnzaadmeel,meel van} cocosnoten,meel van sardinen,meel van aardnoten en meel van sojabonen (18).

Naast Ct Nt Mg, P en S etc.zijn sporen van zekere stoffen nodig voor de ontwikkeling van de schimmel.l op milliard werkt soms stimulerend(7).

Deze sporen moeten in ae gronds~fren aanwezig z~n of anders worden toegevoegd. Het is ook mogelijk, dat sporen

van

sommige metalen als vergiften werken,zodat men hiermede rekening dient te houden b~ de constructie van de apparatuur·Stefaniak(8) heeft gevonden dat Fe,boven een bepaalde concentratie verlies aan opbrengst van penicilline veroorzaakt. Dit Fe was dan afkomstig van de fermentor.

Beha! ve het gebruik van natuurlijke grondstoffen voor de bereiding van

de voedingsbodem,kan men ook gebruik maken van chemische producten.

h Men spreekt dan van voedingsbodems op synthetische basis. Hierbij mist

men echter de sporen van de onbekende stoffen uit de hatuurlijke grondstoffen, die het proces zeer sterk kunnen activeren.

Het is dus begrijpelljk,dat de opbrengst aan penicilline bij de laatst-genoemde voedingsbodems lager is,dan bij de eerstlaatst-genoemde.

Een indruk van de orde van grootte van dit ve'rschil,geven de volgende cijfers: synthetiSChe voedingsbodem: 300 à 500 eenh./ml

natuurlijke grondstof in voedingsbodem: 1000 à 2000 eenh./ml

Uit deze cijfers volgt onmiddellijk,dat toepassing van synthetische voedingsbodems op grote schaal nog niet plaats vindt.

Wij baseren ons schema daarom op voedingsbodems,samengesteld met natuurlijke grondstoffen.

De voedingsbodem voor de enttanks bruine suiker natrium nitraat

hebben de volgende samenstelling: 11-

J '

_KH2.P04

I h.t

h~ .. i MgS04. ?aq \;. V' \ '_ ZnS04.7aq

Corn steep liquor

C_-O°3

H20 tot 20 g

3

g

1.5

g 0.5 g 10 mg 30 ml 10 g I L

Aan iedere 600 gallon van dit medium wordt 10 liter sojabonenolie toegevoegd.

De voedingsbodem voor de fermentor lactose

corn steep liquor CaC03 phenylaceetamide sojabonenolie water tot heeft 20 g

50g

10 g 2 g 10 ml 1 L de volgende samenstelling:

~ • \ _'" v 0 v v v J _"' -/ ').

\tl

"

-7

/wh.., . ( "

.

"

.

\ '

..

I . I I I . I 6 Precursors.

Dit zijn stoffen die een gerichte katalytische werking uitoefenen op de vorming van een bepaalde penici1ine.

Zo is phenylazijnzuur als afbraakproduct in de penicilline aangetroffen. Men neemt aan,dat deze stof voor de vorming van Penicilline G van belang ls. Proeven(19) hebben uitgewezen,dat toevoeging van kleine hoeveelheden van

deze stof de vorming van Penicilline G stimuleerde.

Een stijging van 12% tot meer dan

97%

van de productie van Pen. G heeft men waargenomen.

De concentratie aan "precursoatt _{bedraagt in het algemeen 0.3 -}

o.?

_g

per liter.

De toevoeging aan de fermentor geschiedt zowel continu als intermitterenG Met behulp van steriele lucht wordt de "precursor" naar binnen geperst.

Sterilisatie.

Om goede opbrengsten aan zuiver prOduct te verkrijgen ls het noodzakelijk aan de sterilisatie de uiterste zorg te besteden;alleen dan blijft men gevrijwaard van ongewenste infecties.

We kunnen de sterilisatie in drie delen verdelen: Ie de sterilisatie van het medium.

2e ft ft van de gebruikte apparatuur met toebehoren.

3e " ft van de benodigde lucht. 1.De sterilisatie van de media.

Di meest gebruikte methode is verwarmen. Dit geschiedt met stoom van een druk van

15

pounds per square inch/en een temperatuur van 1200 - 1300

c.

Men kan twee methoden toepassen: l fh&,.MJ

a) Een kortS ve rhittingsduur bijv. 3- 10 min\lten en een vrij hoge temperatuur bijv. 135

c.

b) Een lange verhittingsduur bijv. 60 - 120 minuten en een lagere tempera-tuur bijv.l150

c.

Na sterilisatie wordt het medium gekoeld tot fermentatie-tempera-tuur en dadel~K gebruikt.

De langdurige verhitting heeft het nadeel dat ontleding van belangr~Ke

voedingsstoffen plaatsvindt,waardoor de prOductie daalt.

Niet met verhitting al1een,maar in combinatie met de aanwezigheid van andere stoffen,kan de ontleding in de hand worden gewerkt.

Zo hebben Lankford en Lacy (20) aangetoond,dat de ontleding van cysteIne en andere aminozuren,die belangrijk zijn voor de groei van het micro-organisme, bij sterilisatie in een medium dat glucose bevat,zeer groot is.

Ook bijv.de ontleding van methionine is groot bij aanwezigheid van

glucose,maar niet in tegenwoordigheid van zetmeel of dextrinen (21,22). , j

We zien hieruit dat de verhitting ongewenste reacties veroorzaakt \ I

tussen koolhydraten en vrije aminozuren of vrije aminogroepen in proteInen. Hieruit volgt,dat bij fermentaties op grote sChaal,waarbij media suikers en proteInen bevatten,de beste resultaten worden verkregen door korte

sterilisatie-duur of door de suikers en proteïnen gescheiden te steriliseren. Wij zullen daarom steriliseren bij 1300 _{C gedurende 3 minuten.}

" 1 " / ' " , i \...; . • v u 1 '-v 'v'

,- - - -- -- - - ' - -- - - ,

..

..

I • I

I

-I -?

2. De sterilisatie van de apparatuur en toebehoren.

De fermentoren,enttanks,andere tanks en de pijpleidingen worden gesteriliseerd met stoom.

Lee en Mc.Daniel(23) toonden de noodzakelijkheid aan,van stoomaanslui-tingen op alle pijpleidingentdie van en naar de fermentoren en alle andere apparatuur leiden.

Bovendien moeten alle leidingen voor"inoculwn" grondstoffen en

gefermenteerde vloeistoffen op de sterilisatiete~peratuur gehouden worden gedurende de tijd,dat deze leidingen niet gebruikt worden voor transport van het bovengenoemde.

Vele fabrieken voor fermentatieprocessen hebben thermometers op kritieke plaatsen.om zeker te zijn,dat de sterilisatietemperatuur daar gehandhaafd blijft. De steriele pijpleidingen moeten een minimum aan pompen, kranen of andere,moeilijk te steriliseren appendages bevatten.

3. De sterilisatie van de benodigde lucht.

Voor de bereiding van penicilline zijn zeer grote hoeveelheden lucht nOdig,om de schimmels hun activiteit te doen behouden.

In de literatuur zijn weinig ~gevens over sterilisatie van lucht

bekend. Hier volgen enkele op meer of minder grote schaal toegepaste methoden 1. Het samenpersen van lucht en daarna adiabatische expansie.

De hierdoor verkregen hoge temperatuur geeft een goede sterilisatie. 2. Het blazen van lucht door een netwerk van buizen,die op hoge

tempe-ratuur worden gehouden met behulp van olie- of gasbranders.

Een temperatuur van 50000 is hiervoor zeer geschikt.De kosten voor

d~ze verhitting zijn zeer hoog en voor toepassing op grote schaal is

het proces verre van economisch.

3.

Het leiden van de lucht door een sterk electrisch veld of be·t behande-len met ultra-violet licht.

4. Het wassen met loogoplossingen,zuren e%f sterk desinfecterende vloeistoffen.

5.

De filtratie van de lucht door kolommen, die gevuld zijn met katoen-pakking,geactiveerde kool,slakkenwol of glaswol.·

Deze laatste methode is de meest gebruikte,al of niet in combinatie met de derde methode.

Actieve kool en glaswol zijn de meest gebruikte materialen voor dit

\

doel(24).Hierbij is gebleken,dat bij redelijke snelheden een pakking-hoogte van 4 feet voldoende is,om lucht voor 100 uur te steriliseren. Deze eenheden zijn relatief goedkoop en behoeven niet voortdurend

hervuld te worden.

Het is gewenst veelvuldig te steriliseren en voor iedere tank afzonderlijk. Vele kleine eenheden zijn te prefereren bove~nén te centrale sterilisatie eenheid. In ons schema hebben wij derhalve dit toegepast.

Op deze wijze vermijdt men grote transporten . lucht over lange afstanden met kans op infectie.

.) _.I

.-..

J v c, \. v

".

I I

I

.

I

-l

I

I

8 Anti-schuimmiddelen.

Door het roeren en het doorleiden van lucht ontstaat een schuimen van de vloeistof,dat zeer hinderlijk is voor een goed functionneren van de fermentatie.

Om dit schuimen binnen redel~Ke grenzen te houden moet men gebruik maken van anti-schuimmiddelen.Door verlaging van de oppervlaktespanning kan men

het schuimen tegengaan. Verschillende stoffen zijn hiervoor in gebruik.

Vroeger werd een

3%

oplossing van octadecanol in gesmolten reuzel gebru~

Tegenwoordig vinden synthetische prOducten steeds meer toepassing.

We noemen het gebruik van oxazolen met de algemene formule:

~3 _{Hierin kunnen Rlen R2zijn: H, alkyl of hydroxylmethyl}

/ C ,

o

f

ft R3 is een alkylradicaal van 7 - 17 C-atomen. H

O---O(

1

2 R

2

Men bereidt het anti-schuimmiddel door menging van 1 deel oxazool en

1 deel minerale olie (25).

Het anti-schuimmiddel wordt gesteriliseerd in een tank,welke boven de

fermentor is opgesteld, door verhitting met stoom. Electrische contacten zore gen voor een automatische toevoeging,welke intermitterend is .Het verloop kan door een kijkglas worden gevolgd.

De anti-schuimtaDk staat onder overdruk van steriele lucht,om de vloei-stof in de fermentor te persen.

Luchtverdelers.

Een juiste verdeling van de toegevoerde lucht door de gehele vloeistof',_

is een zeer moeilijk op te lossen probleem. In het algemeen voert men de lucht via een geperforeerde pijp in de vloeistof. Een intensief roeren moet nu voor een goede verdeling zorgen. Vele verschillende uitvoeringen zijn hiervoor gemaakt1 het effect van alle combinaties is nagenoeg gelijk.

In ons schema hebben w~ de Pfaudler diffusor toegepast,waarvan in de praktijk is gebleken,dat deze zeer goed voldoet.

De toegevoerde hoeveelheden lucht bedragen voor een fermtntor van

10.000 gallon 360 - 400 cft/min, in het algemeen 0,5 - 1 vol. lucht/ vol.

vloeistof per minuut. De roerder.

Dit is een zeer belangrijk onderdeel van de fermentor.

De roerder moet zorgen voor een uniforme verdeling van de schimmels en v~

de toegevoerde lucht in het medium om een "aerobic·t _{groeiconditie te}

verze-keren.Het is niet mogelijk een extrapolatie van laboratoriumschaal naar fabrieksschaal te maken.

Door proberen heeft men een oplossing moeten zoeken.

De verbruikte energie varieert van 0.3 - 2 pk per 100 gallon lading.

De propellorvorm kan niet worden toegepast,daar de~niet de gewenste verde~

ling vast - vloeistof geeft. Daardoor zijn verschillende andere vormen ont-wikkeld; één hiervan is in ons schema gebruikt.

Ook de toepassing van weerstandsplaten(baffles) is gewenst,om de

juiste verdeling te verkr~gen(26). Het aantal omwentelingen varieert sterk, in het algemeen ligt dit tussen 100 - 500 omw/min.

"

.

.

."

".

9

Kranen.

Deze moeten aan vele eisen voldoen,waarvan de belangr~te zijn:

:~) gemakkelijk te reinigen, eenvoudige bediening,gemakkel~k te steriliseren en steriel te houden,geringe mogelijkheid voor lekkage.

D.

meest gebruikte typen zijn de plugkraan en de diafragma afsluiter. Meet- en Regelapparatuur.

Deze nemen bij het proces een zeer belangrijke plaats in.

Een punt van groot belang b~ het fermentatieproces,is de handhaving van de juiste temperatuur.

Om constante opbrengsten aan penicill!neote verkrljgen is het noodzakelijk dat de temperatuur gehouden wordt op

0,5

a l e binnen de gewenste tempera-tuur. Voor de penicillinebereiding bedraagt deze 24°0.

Ook een constante luchttoevoer is van belang en deze dient gecontroleerd te worden. Men laat een afwijking toe van 5 à 10% van de vastgestelde hoeveel-heden·Automatische pH-controle is van groot belang. Olive(27) beschrijft een automatische pH-controle vOQr een semitechnische installatie.

De penicillineoplossing wordt continu door een Oliver diafragmapomp via een pH-meter rond gepompt. Bij afwijking van de juiste pH-grenzen wordt de juiste waarde weer ingesteld door toevoeging van loog of zuur.

Ook Brown en Peterson en Breeze beschr~ven een automatische pH-contröle apparatuur (28),(29).

De optimum pH voor de penicillineproductie is

7,15.

Hierb~ verkr~gt

men met de

Q-176

opbrengsten aan penicilline van 1900 - 2100 eenh/ml in een medium,dat lactose,glucose,corn steep liqu'Or,calcium-carbonaat enphenyl-acetaat bevat.

Ook w~ hebben deze regelapparatuur in ons schema toegepast en aangegeven bij eèn fermentor.

Enttank (Seedtank)

In deze tank vindt de groei van de schimmel plaats,totdat de juiste hoeveelheid schimmel voor de fermentatie is verkregen.

De cultures worden op het laboratorium gekweekt en voortdurend ver-menigvuldiga. Zo verkr~gt men steeds grotere hoeveelheden van de gewenste schimmel en tenslotte is de hoeveelheid zo groot,dat men over moet gaan op de enttanks.In dezen is alleen de groei van belang en bet spreekt vanzelf dat ttP..r~.sorstt in de enttank geen toepaSSing vinden •

..--

5

à

'lOV-olumeprocenten van een jong ninoculum" is in het algemeen de

~gewenste hoeveelheid.

De_overgang van laboratoriumschaal naar de enttanks vereist een aantal

speciaIé- v~zorgen.die alleen tot doel hebben infecties te voorkomen.

Enkele beschr~vingen van Petty en Olive geven een indruk biervaneo)(3~)

Het is daarom gewenst om de eerste enttanks op te stellen in een speciale ruimte,die geisoleerd is van de fabriek en die in speciale steriele conditie wordt gehouden •

..Fermentor

-

Dit

is een tank,waarvan de diameter en de hoogte zich verhouden als 1 : l!à2. Het materiaal is meestal koolstofstaal of roestvrlj staal.

Dit laatste is voor de penicillinebereiding het meest toegepast,daar het ~makkelijker is schoon te houden.Ook Inconel,een nikkel-chroomleger~ing

is een enkele maal toegepast.

In de fermentor vindt het eigenlijke productieproces plaats.

Hierin ontwikkelt zich de schimmel en vindt tevens de vorming van het product plaats.

•

'.

I

-;,

10

Toelichting op het ontworpen schema.

De voedingsbodem wordt samen~esteld in de voedingvoorraadtank.

W~ maken hierin per fermento~an 10.000 gallon,;.ooO gallon voedingsbodem •

Dez~ 3.000 gallon worden doo; een sterilisator geperst en hierin verhit tot

1;5 C. Een buffervat van 2 m inhoud zorgt er voor,dat deze temperatuur enige minuten gehandhaafd blijft.

Daarna wordt snel gekoeld tot 24oC,de fermentatietemperatuur.

In de fermentor wordt nu aan de ;000 gallon voedingsbodem,nog ;000, gallon

gesteriliseerd water toegevoegd. Door roeren wordt een goede menging verkrege~

Voor "n vulling van een fermentor is nodig: corn steep li~uor 600 kg

lactose 240 kg

CaCo; 120 kg

phenyl ace etami de 24 kg sojabonenolie 120 1

water tot 6000 gallon

Aan deze vulling wordt nu de gehele inhoud van de enttank 2 toegevoegd.

Men drukt deze vulling met behulp van steriele lucht in de fermentor. De vulling van enttank 2,het z.g."inoculum",bedraagt 666 gallon.

In

totaal bevindt zich dan~Da een lading, i~e~ermento~6666 gallon. De duur van de fermentatie in de fermentor is 4 dagen, in enttank 2 slechts 2 dagen,zodat deze laatste dus twee fermentoren van "inoculum" kan voorzien. .

Voor de productie in ons schema z~n vier fermentoren,elk van 10.000 gallon,nodig en twee enttanks 2 van 750 gallon.

De

vulling voor ent tank 2 bestaat uit: bruine suiker 48 kg NaNO; 7.4 kg KH 2P04 3.7 kg MgS04

·7

aq ZnS°4·7a_q

corn steep liquor CaCO; sojabonenolie 1.2 kg 24 g 72 1 24 kg 10 1

water tot GOO ~llon

Hieraan wordt toegevoegd 66 gallon"inoculum" uit enttank 1.

Dit wordt met behulp van steriele lucht overgeperst.ln totaal best~t

ru

vulling dus uit 666 gallon.

De grootte van enttank 1 is 75 gallon en de vulling heeft dezelfde samenstelling als die voor enttSnk 2. De hoeveelheid"inoculum." bedraagt 66 gallon.

- . _ - - -

-11

De vulling voor ent tank 1 bestaat dan uit: bruine suiker 4.8 kg

NaN°3

0.74 kg

KH2P04 0.37 kg

MgS°4·7aq 0.12 kg

ZnS04·7aq 2.4 g

"corn steep liquor 11 7.2 1

CaC0

3 2.4 kg

sojabonenolie 1 1

water tot 60 gallon

Hieraan wordt toegevoegd 6 gallon"inoculum" uit de laboratorium-entflessen.Deze laboratorium-voorbereiding is in het schema buiten beschouwing gelaten.

De hoeveelheid gebruikte lucht bedraagt: 360

à

400 cft/min. voor de fermentor

36

à

40 cft/min. voor de enttank 2 3.6 à 4 cft/min. voor de enttank 1

Het anti-schtiimmiddel wordt bereid in de anti-schuimtank van 1000 l!~eD

De sterilisatie vindt plaats met stoom in de anti-schuimtanks,waarin het anti-schuimmiddel door een pomp wordt geperst uit de eerstgenoemde tank van 1000 liter.Het anti-schuimmiddel wordt met behulp van steriele lucht in de enttanks en fermentoren geperst.

De grootte van de verschillende anti-schuimtanks bedraagt resp. 6.5 liter,65 liter,en 650 li~er.

Na de fermentatie wordt de fermentor leeg gepompt in een voorraad-tank.Van hieruit wordt de oplossing(broth) via een filter door een koeler geperst naar de extractoren.

Het filter kan zijn een roterend vacuumfilter of een filterpers. W~ hebben bet veel toegepaste Bird-Young vacuumfilter gebruikt,met een capaciteit van 1000 gallon per uur.

De oplossing wordt nu gekoeld tot 1000 en naar een tank geperst

in de raffinage-afdeling.

.---~---

-I

•

I I ... I .

I

I

-We zullen aan de hand van een berekening nagaan ot het aanbrengen van de meest economische isolatiedikte op een fermentor noodzakelijk is.

De warmte overdracht kan op drie manieren plaatsvinden: door strallng,door geleiding en door stramiKg •

In onl geval kan de overdracht door straling buiten beschouwing worden

gela~n.d::~eZ

1

e pa

~

.:oger: temperatuur een rol gaat spelen.

I '

I

i

I

i

I :

I '

Wanneer we bovenstaande figuur beschouwen,dan zien we,dat er een temperatuursval plaats heett van tI ,de temperatuur van de verwarmings-vloeistot (hier water) ,naar t ,de temperatuur in de fabrieksruimte.De verwarmingsmantel staat dus w~rmte at aan .de omgeving.Di t warmtetransport vindt plaats door geleiding,zowel in de stalenwand als in de isolatielaag, door convectie van de isolatielaag naar de omgeving.

We zien tevens,dat zich drie temperatuursprongen voordoen:

~tl: _{t l - t 2} in de stalen verwarmingsmantelwand ~t2: t_{2 -} t ₃ .6t 3- t3 ... t4 in de isolatielaag in de luchttilm

tl:~ de temperatuur van de verwarmingsvloe1stot,deze bedraagt

2500.

t₂ en t

3 moeten worden berekend.

t

_4•

de temperatuur van de lucht in de fabr1eksruimte,deze bedraagt

1500.

Ik heb aangenomen dat in de rabr1eksrulmte geen lagere temperaturen zullen voorkomen dan l5!C,tijdenS het koudste jaargetijde.Ik heb mijn berekening op de oDgunstigste toestand gebaseerd.

In de meeste gevallen mag men zich voor.hettherm1scJisoleren van

~ oppervlakken van technische installaties de toestand aldus ~nkentdat de

. isolerende laag ot lagen moeten worden aangebracht tussen twee gebieden

I

van constante te~rat~ Tl en T₂.Versterken we de isolatie door het aanbrengen van een zeer dun laagje ~ ,dan is de vraag te stellen o~ het aanbrengen van dit laagje al dan niet economisch is.BliJkt dit het @ ••• 1 geval te zijn,dan zal men doorgaan mBt het versterken der isolatie,totdat

\

men de limietwaarde heert bereikt.Di t is het geVal,Wanneer. de kosten van de hoeveelheid warmte,die bespaar. wordt door het aanbrengen van het laagje 11 op het oppervlak.& ' ~ Nu-,# ~ .--M~~

We stellen het aantal kcal,dat oorspronkelijk door het te isoleren oppervlak wegstroomt op: 2

Ió

q kcal/~ ,uur ~

De warmte weerstand w van een st óombuis door een oppervlakte eenheid van het beschouwde oppervlak is dan:

.t . . ~. r . , _ .t

=

( I .t t ' 1 '

•

1 .t 1 r I

/3

w •

Na het aanbrengen van het isolatielaagje ~ ,1s de warmteweerstand verhoogd

tot -I ,zodanig dat

~.

' Li

w 1-

w.{.::;:-de warmtegeleid1ngscoëff1eient van het isolatiemateriaal in kcal/m',OQ,uur,m

Het aantal calorieën. dat wegstroomt door het oppervlak, waarop het laagje is aangebracht,is nu: De warmtebesparing 1s dus: 2 kcal/m ,uur q - ql- q { 1 - ~--~---1 ' ~--~---1 - ~--~---1 ' 2 ) · .... 1-~·2 f-

!f-

kcal/m2,uur {: Tl:T2 } 2 ot q 1 • !!-:~~~~r-- .z.e gld/m ,jaar

hierin 1s:

Z.-

het aantal bedrljfsuren per jaar

e ~ de warmtekosten in gld. per kcal.

Tegenover de door warmteverlies ontstane kosten,staan de kosten van

het isolatiemateriaal,welke voor een dikte ~ bedragen:

f.~r gld/m2 ,jaar

hierin is f=de kostprijs van het isolatiemateriaal in guldens per m' in aangebrachten toestand ter plaatse.

~=de

dikte van het aan te brengen lsolerendlaagje in meters/m2

r

=

een factor voor de jaarlijks. rente en afschrijvingskosten van het

isolerend materiaal,welke in algemenen vorm luidt:

( 1

t-.e..

)n

r ;:;;

~eo-fï:-~.)ii:i-/00

h1erin is p de rentevoet en n het aantal Jaren,waarin de gehele amortisatie zal plaatsvinden.

Wil het aanbrengen van het laatste laagje ~ nog economisch geschieden,dan

moet voldaan worden aan de' voorwaarde ,dat de besparing van de kosten,welke

door warmteverlies worden veroorzaakt/gelijk zijn aan de kosten van het isolatiemateriaal.

= .. ~ 1 1 ,IJ 1 j ' _J 1 c 1 .. .l. 1 .t 1 .t J , I

.

-i 1 1 i ( .L ,1 1 , 1 1.J: ,1.

I "

I ~

/4

h1eru1 t volgt bi j overgang tot de limiet

A

=0

/

q.

V

}~!!:!_

(I

::

-3;)

_

z.e kcal/m2,uur,~ (1)

waarb1j q het meest economisch w_rmteverlies

1 Ll6

In het a gemeen 1s q= __ ~_

In ons geval bestaat w uit drie factoren. Ll 1

---

+ ----_h.A

3

k • de warmte gele1dbaarhe1dscoätt1cient A = het oppervlak L .: de wanddikte 1s. Ll

... - - - - := de weerstand van de metalen wand

kl·Alav

---~---

_k

=

de weerstmld van het isolatie materiaal

2A2av

--_!_--

:

de weerstand van de luchtt1lm

hA3

Om nu de meest economische isolatie dikte te kunnen bepalen,moeten we de temperaturen t

2 en t

₃

weten.

De hoeveelheid warmte q,d1e verloren gaat is te berekenen met behulp vaD de formule (1).

De tact or Ll

ii

1_ïav is te berekenen uit de materiaal gegevens.

iJ

t_l q. --t ... • .. 1

-.--

_klA1av wand oppervlak .d t _l q .:: ----.,.- ... Ll

-i--1 ( 2)

.J

t_l = t_l-t₂ waaru1 t t

2 berekend kan woeden.

L 2

De tactor

x-l---

bevat de gevraagde lsolatied1kte 2 2av

,--- --- ---~~

s

- - -

-...

eveneens q per m2 isolat1eoppervlak,dus:

L1

t ₂ q ::: --

--t---

(

3) 2 -Jë--2 waarin j t₂ :; t 2 - t

₃

De formule (3) bevat dus 2 onbekenden •

Evenzo geldt voor de luchtfilm per më _oppervlak:

iJt

q

= .. -- __

2_____

(

4)

1

-Iï

waar in

Ll

t~ =-t~ - t 4

h ~de warmte transmissiecoëtficient van de luchttilm.

Deze moet nu berekend worden met behulp van het Nusseltgetal

N u

=

à.D

-lë--Hierin is: D.: de diameter van de cilinderwand

k:: de thermische geleidbaarheidscoätticient.

Nu bestaat er een verband tussen het Nusseltgetal,het Prandtlgetal en het Greshotgetal .In het algemeen wordt dit verband weer gegeven door de formule: Nu .:: C( Pr • Gr ) n Het Prandtlgetal ,Pr::

T

Het Grashotgetal GR _

15(j

~

j.J./~

J

I-, - 7 ~.l

-

/

waarib: ~~de dichtheid ~-de viscositeit

e=de soortelijke warmte

~ ~de versnelling van de zwaartekracht

~=de cubieke uitzettingscoëtticient

/J'i

=het temperatuursverschtl

)?1

We kri jgen dus:

!!~!?

-

=

f

($,/,I

.

/;2>:

~f

~

LJ

t:,

./,

~

_

F(~

'

".11

,

j/2

,

0~

LJrf

(5)

of

_/l

_-

try

,

_ft

₃₎

I

DE vergeli jkingen (4) en (5) bevatten beide de onbekende factoren A t

3 en h

;oJai deztte berekenen zi jn.

Opgemerkt zij: D:: de diameter van de fermentor + de isolatie .We zullen dus

I ~ een schatting moeten maken van D en de berekening eventueel opnieuw uit-voeren.

Ui t L\ t

3

=

tJ - t4 ,valt t3 te berekenen.

Met behulp van (3) berekenen we nu de isolatiedikte. Voor de cillinderwand geldt:

..

..

16

l I

-Beschouwen we nu een dun laagje dx,dan is de hoeveelheid warmte q, die door dit cilinderoppervlak stroomt:

dt

q =' k.A __

-ai

-

(algemeen,de wet van Four1er)

q:: k_27T •• l._:~_

gelntegreerd wordt dit: ln-Ru k27T."l

A

1)

Ri

: __

q___ •

(.

t ~ - ç/ stel t 2 .. ( 6) Ook 1s (7) Uit (6) en (7) volgt: ot waaru1t:

~ ~7T

/

.

LJI

=

~,4~

LJ~

~

-&

~ - ~. ~. _t

A

~

_

~7T/

(~-~'2

~~

~. Au - Ai A = ---m

AU

. ln-I--i

per m2 cilinderwand is de hoeveelheid doorgestroomde warmte:

q := _-A~

__ --

(

8)

Ru - Ri

"--lë---I

~

I

t

We zullen nu: leerst het meest economisch warmteverlies ui trekenen.

q=

~~r~!~l_!_:_:gl

2

z.e kcal/m ,uur,m

Volgen. bijsaan e grafiek,overgenomen uit:

O.en8-Corni~' Fiberglas A.I.A. fiber ~37 August ~49

•

is kisolatie 0,25 Btu/in,hr,sq tt,OF

1 kcal/m,uur"m2,

°c

-=8,063 Btu/1n,hr,sq ft,OF

dus k

=

,,'2 ..

'5__

/

2 0

• isolatie

0,063

-0,031 kcal m,uur,m , C

De kostprijs van isolatiemateriaal,opgegeven door de Firma Spanjaard teDeltt,bedraagt:

GlaS~Ol tO,90 / per ke 1 m glaswol weegt 50 kg

Slakkenwol t .0.45 per kg

1

m'

slakkenwol weegt 300 kg ,À = 0.05 - 0.07

2

Magnesiablokken f.O.40 per mm,m

>.

=0.06

De kostprijs van 1 m3 glaswol bedraagt f.72.- .

Het aantal bedrijfsuren is 24 x 365 is 8760 uren,o~_~~

De factor r wordt bij p::. 4% en n=5Jaar 0.224. (/

We hebben aangenomen,dat de afschrijving van de isolatie in 5 Jaar

plaatsvindt,biJ een rentepercentage van 4%.

Ter orientatie van de kostprijs voor 1 k cal.dient het volgende:

1 m3 gas voor huishouddoeleinden kost f .0.14 en hee.ft een

ch~ waarde van 4000 k cal. waaruit volgt dat 1 cal kost

-( gulden.

de ijeer Oosterwegel werd opgegeven als kostprijs

al.

85

x 10-'(~

We zien uit de orfenterende berekening dat dit redeliJk i8.

q =//0.031 •

Z2 •

(25-15) • 0.224 kcal/m2 .. uur lllll

V

87 0 • 0.0000085 ' ,-.

q :: 8.2 kcal/m2 .uur,m -= 8.2 • 0.672 Btu/sq ft.hr, ft

Nu zullen we Ll t

3 en h berekenen.

Volgens Max Jacob Heat Transfer blz.530 geldt voor een verticale

•

•

18

Voor lucht is,volgens de tabel op blz.213 uit Introduction to Heat Transf~

by A.J.Brown and S.M.Marco,b~ een temperatuur van 590 _{F :}

6 6

a • 10 • 1.84 • 10

waarb~ 6 2

a • 10 c c~.~.~

(5) gaat dan over ,in:

{Q •

0.726 ( 1.84 • 106•

n3

.Llt, )0.25

6 _'S ,,U"

h •

o.

7~ • k • (1.84 • 10 • IJ'. L1 t ₃₎

k • 0.0136 voor lucht van 59°F. D • de diameter van de fermentor + isolatie.

De diameter~van de fermentor is 3.252 m; dit moet worden vermeerderd

met 2 x ~e isolatiedikte.Ik schat de isolatiedikte op 0.5 cm op grond van de gegeven voorbeelden in het t~dschrift Warmte Techniek 2 31 (1946)

DAN WORDT D. 3.262 m of 10.7 ft ingevuld wordt dit:

h _

o.

2OLLlt

3 o. 2~

Nu is ook: q • 5.51 Btu/ sq ft,hr,ft of

waaruit h - 0.386

fde temperatuur van de isolatiewand t

3 is dus 59 + 14.' • 73.,oF Het Nu-getal bedraagt nu hD : 0.386. 10.7

~

0.0136

Nu - 304

Uit nevenstaande grafiek,overgenomen van bladz.529 volgt , dat de gebruikte formule (5) dan overgaat in~

1; Nu • 0.129 (Gr.Pr) Passen we deze formule toe,dan viaden we:

• _{'h • o.129.k (a.lO • A t}6 _'S 1/ 3 ~

j • IJ')

D

h

wordt nu onafhankel~ van

D

h - 0.48

Het Nusseltgetal wordt

nu~

-

0.4~.Ól~·7

_{- 367}

We zien uit de grafiek,dat de gebruikte formule nu wel toepasbaar is. We vinden nu~t3. ~:i~

-

11.50F ,wat een isolatietemperatuur

J J •

..

• • v

•

•

19

Llt_{l berekenen we uit:}

k .~tl kroestvrlj staal • 15,1 Btu/hr, sq ft, °F,ft

q •

Ll volgens de grafiek op bladz.12 in Brown

& Marco.

In overleg met de Heer Oosterwegel is de wanddikte van de fermentor op 13 mm of 0,0433 ft gesteld.

Ingevuld geeft dit:

5,51 • _1 .... 5-.. ... 1_ •

At

l

0,0433

Ll tI • 0,016 OF

Uit deze berekening volgt, dat we de wandtemperatuur gelijk kunnsn stellen aan de temperatuur van de verwarmingsvloeistof,dus

77

F.

De dikte van de isolatie wordt dan:

d •

Ru -

Ri • 0.0208

(77 -

70.5)

5,51 d . 0.74

cm.

• 0,0245 ft.

k • 0,25 Bta/sq ft,hr,oF,in • 0,0208 Btu/sq ft,br,oF,ft •

\\

DQ minimum isolatiedikte,die door de firma kan worden geleverd,

I bedraagt i",waaruit volgt,dat het isoleren van de fermentoren niet economisch is.We laten dit dus achterwege.

Delft, 12 Maart 1951.

~~

---/~

~

e

/