Artyku³ przegl¹dowy Review
Budowa wirusa
Wirus grypy nale¿y do rodziny Orthomyxoviridae, ro-dzaju Influenzavirus (IV) (8). Jego materia³em genetycz-nym jest jednoniciowy, negatywnie spolaryzowany RNA, podzielony na 8 segmentów koduj¹cych polipeptydy strukturalne i niestrukturalne (10). Nukleokapsyd, sta-nowi¹cy rdzeñ wirusa, sk³ada siê z RNA po³¹czonego z nukleoprotein¹ i 3 bia³kami polimerazy: PB1, PB2 oraz PA, inicjuj¹cymi replikacjê i odpowiedzialnymi za trans-krypcjê RNA. Wirus posiada otoczkê z³o¿on¹ od we-wn¹trz z bia³ka matrycowego M1, które jest g³ównym bia³kiem strukturalnym, od zewn¹trz za znajduje siê warstwa lipidowa oraz wypustki bia³kowe (ryc. 1). Opie-raj¹c siê na antygenowej odmiennoci nukleoprotein oraz bia³ka M wyodrêbniono trzy typy wirusa grypy: A, B i C. W etiologii choroby najwiêksze praktyczne znacze-nie maj¹ szczepy nale¿¹ce do typu A. Wywo³uj¹ one za-ka¿enia notowane zarówno u ludzi, jak i u zwierz¹t ho-dowlanych wiñ, koni, a tak¿e ssaków wodnych oraz ptaków. Niekiedy maj¹ one ciê¿ki przebieg, z towarzy-sz¹c¹ im znaczn¹ miertelnoci¹. Infekcje te zaliczane s¹ do zoonoz.
Typ A wirusa grypy zosta³ dalej podzielony na podty-py, na podstawie budowy bia³ek powierzchniowych otoczki: hemaglutyniny (H), wystêpuj¹cej w 16
nach, oraz neuraminidazy (N), wystêpuj¹cej w 9 odmia-nach. Hemaglutynina jest g³ównym antygenem po-wierzchniowym, miejscem istotnych determinant anty-genowych. Jej zmiennoæ jest najwa¿niejszym czynni-kiem umo¿liwiaj¹cym wirusowi efektywne unikanie
neu-Wp³yw zmiennoci na miêdzygatunkow¹
transmisjê zaka¿eñ wirusem grypy
IWONA MARKOWSKA-DANIEL, ANDRZEJ KOWALCZYKZak³ad Chorób wiñ Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Markowska-Daniel I., Kowalczyk A.
Influence of evolution on interspecies transmission of the influenza virus
Summary
The main purpose of the paper was to review information about the most important mechanisms of influenza virus evolution and their consequences for immunoprophylaxis and the elaboration of diagnostic tests.
The influenza virus is the pathogen that indicates tropism on the epithelial cells of respiratory tract, responsible for frequent seasonal epidemics, caused by the rapid evolution of the viral genome. There are two main mechanisms of evolution: antigenic shift and genetic or antigenic drift. Hemagglutinnin, the protein of the virus envelope, is the main place of these variations.
The study concerning receptor binding site structure and the specificity of human and animal influenza viruses have brought information about the mechanisms of interspecies spread of infections. It was confirmed that human influenza A viruses do not spread in birds while the species barrier between human and pigs is relatively low. Therefore pigs might functions as mixing vessels for the creation of new pandemic reassortants. The variability of the influenza virus is very complex process. Antigenic drift and shift still cause the origin of immunologically distinct strains of influenza viruses. The rapid antigenic drift of new forming viruses explain why there is a need for regular monitoring of that process. Antigenic and genetic characteristics of currently circulating strains of influenza virus could be beneficial in evaluating new diagnostic methods as well as for vaccine composition, which have to be updated annually.
Keywords: influenza virus, interspecies infections
PB2 1 PB1 2 PA 3 HA 4 NP 5 NA 6 M 7 NS 8 NS1 i NS2 PB1 PB2 PA NP Bia³ka Bia³ko M2 (kana³ jonowy) Bia³ko M1 Otoczka lipidowa Hemaglutynina Neuraminidaza
tralizacji przez komórki odpornociowe organizmu, co utrudnia skuteczne kontrolowanie epidemii grypy drog¹ szczepieñ ochronnych. Na podkrelenie zas³uguje fakt, ¿e w przyrodzie odnotowano wystêpowanie niemal wszystkich mo¿liwych kombinacji podtypów H i N, szczególnie w populacji ptactwa wodnego, które stano-wi g³ówny rezerwuar stano-wirusa grypy.
W³aciwoci wirusa
Wirus grypy jest wyj¹tkowo plastyczny, tzn. z jed-nej strony ma bardzo du¿¹ zdolnoæ adaptacji do ró¿-nych gospodarzy, z drugiej za zdolnoæ unikania ich uk³adu odpornociowego (6). Pozwala to na zaka¿anie wielu ró¿nych gospodarzy, niezale¿nie od szerokoci geograficznej i pory roku. Szczepy typu A, zw³aszcza izolowane od ludzi, cechuj¹ siê znaczn¹ zmiennoci¹ antygenow¹. W sposób nierozerwalny zwi¹zana jest ona z segmentow¹ budow¹ RNA. Zmiennoæ wirusa grypy jest jego najbardziej charakterystyczn¹ cech¹, wyró¿nia-j¹c¹ go sporód wszystkich znanych wirusów, a poja-wianie siê nowych odmian antygenowych jest przyczy-n¹ niepowodzeñ w walce z t¹ groprzyczy-n¹ chorob¹.
Szyft antygenowy
Istniej¹ dwa g³ówne mechanizmy, za pomoc¹ których wirus grypy potrafi ewoluowaæ. Pierwszy z nich, okre-lany szyftem genetycznym (antigenic shift) lub skokiem antygenowym, wystêpuje na ró¿nych szerokociach geo-graficznych. Polega on na reasortacji genów miêdzy ró¿-nymi szczepami w czasie infekcji mieszanych. Podczas zaka¿enia komórki przynajmniej dwoma ró¿nymi typa-mi wirusa, 16 segmentów wirusowych mo¿e przetaso-waæ siê miêdzy sob¹, co w konsekwencji mo¿e daæ 256 wirusów potomnych, z których ka¿dy determinuje od-mienne cechy biologiczne. Warto dodaæ, ¿e wymiana seg-mentów genomu mo¿liwa jest pomiêdzy szczepami po-chodz¹cymi od ró¿nych gatunków. Reasortacjê antyge-now¹ stwierdzano pomiêdzy wirusami ludzkimi, wiñ-skimi oraz ptasimi. Nowo powsta³e warianty wirusa, izo-lowane od pierwotnych gospodarzy, zwykle ró¿ni³y siê budow¹ antygenow¹ (32). Je¿eli reasortacja dotyczy seg-mentów koduj¹cych antygeny H lub N, powsta³e szcze-py wykazuj¹ znaczn¹ patogennoæ, poniewa¿ napotyka-j¹ wra¿liw¹, nie uodpornion¹ populacjê. Istnienapotyka-j¹ce prze-ciwcia³a nie s¹ zdolne do neutralizacji wirusa, gdy¿ nie rozpoznaj¹ receptorów specyficznych dla nowego pod-typu. Reasortanty mog¹ byæ przyczyn¹ epidemii lub pan-demii lub te¿ przez kilka lat mog¹ ukrywaæ siê w rezer-wuarze zwierzêcym. Dowodem tego by³y pandemie w la-tach 1957 i 1968 (18). Badania serologiczne wskazuj¹, ¿e od 1889 r. wyst¹pi³o 6 skoków antygenowych (6). In-fekcje zwierz¹t zmodyfikowanymi genetycznie typami wirusa grypy stanowi¹ znacz¹cy element w ewolucji ludzkiej odmiany wirusa (33).
Proces reasortacji genów wi¹¿ê siê cile z prze³ama-niem bariery gatunkowej, g³ównie ptakiwiniecz³o-wiek, przy czym zaznaczyæ nale¿y, ¿e winie stanowi¹ ogniwo porednie w miêdzygatunkowej transmisji za-ka¿eñ (29). Dotychczasowe pandemie grypy bra³y po-cz¹tek w Po³udniowej Azji, z uwagi na fakt, ¿e na tym
obszarze winie ¿yj¹ w bliskim s¹siedztwie zarówno z cz³owiekiem, jak z ptactwem wodnym (6).
Przyk³adem opisanych zjawisk mog¹ byæ epidemie grypy wiñ o ciê¿kim przebiegu, rejestrowane we W³o-szech w latach 80. oraz w Wielkiej Brytanii w latach 1990-1992, spowodowane transmisj¹ wirusa od ptactwa do wiñ (4). Nowo utworzony wariant wirusa okrelony zosta³ jako podtyp H1N2, z uwagi na fakt, ¿e powsta³ on w wyniku wymiany genu H z ptasiego szczepu wirusa o wzorze antygenowym H1N1 (avian like) oraz genu koduj¹cego neuraminidazê z ludzkiego szczepu o wzo-rze antygenowym H3N2 (human-like) (7). Szczegó-³owe analizy serologiczne statusu zdrowotnego stad wiñ w Anglii, prowadzone po 1993 roku, ujawni³y zwi¹zek kolejnych wybuchów grypy wiñ ze szczepem podtypu H1N2 (4). Stwierdzono wówczas serologiczn¹ zbie¿noæ wspomnianych infekcji z zaka¿eniami powodowanymi podtypem izolowanym we wczeniejszym okresie, w fer-mach nie utrzymuj¹cych ¿adnych kontaktów miêdzy sob¹. Sugerowa³o to ustabilizowanie siê nowych reasor-tantów w tym kraju i ich niezale¿ne, szerokie rozprze-strzenienie. Pochodzenie tego wirusa przypisywano rów-nie¿ ludzkiemu wariantowi H1N1 (kr¹¿¹cemu wród ludzi w 1980 roku) oraz szczepowi human-like o wzo-rze antygenowym H3N2 izolowanemu od wiñ. W ta-kim uk³adzie winie pozostawa³yby niew¹tpliwym re-zerwuarem szczepu, który móg³by zainfekowaæ wra¿li-w¹ czêæ ludzkiej populacji w Anglii i poza jej obsza-rem (5). Szczep H1N2 rozprzestrzeni³ siê w kolejnych latach w pozosta³ych krajach europejskich. W badaniach z 1999 roku Van Reeth i wsp. (25) odnotowali wysoki poziom serokonwersji wobec szczepu H1N2, serologicz-nie zbli¿onego do kr¹¿¹cego w 1994 r. w Szkocji. Szczep ten ró¿ni³ siê istotnie od innego typu reasortanta H1N2, kr¹¿¹cego w Japonii w 1978 roku i we Francji na prze-³omie lat 1987/1988. W badaniu filogenetycznym wy-kazywa³ on odleg³e pokrewieñstwo w obrêbie genu ko-duj¹cego H, do klasycznych odmian wiñskiej i pta-siej podtypu H1N1.
Proces reasortacji materia³u genetycznego wirusa gry-py mo¿e byæ bardziej z³o¿ony. W badaniach nad izola-tem H3N2 w USA stwierdzono, ¿e jest on potrójnym reasortantem, zawieraj¹cym komponenty wirusa typu ludzkiego (H, N oraz PB1), wiñskiego (M, NP, oraz NS), a tak¿e ptasiego (PA i PB2) (37). Na podstawie analizy sekwencji bia³ka H3 izolatów terenowych wirusa stwier-dzono dodatkowe rozbie¿noci i ustalono ich przynale¿-noæ do dwóch, z co najmniej trzech, ró¿ni¹cych siê od siebie filogenetycznych klasterów bia³ka H, wystêpuj¹-cych w USA. Wszystkie izolaty nale¿¹ce do okrelonych w ten sposób odmian H3 wykazywa³y zdolnoæ do indu-kowania klinicznych objawów grypy, jednak¿e objawy chorobowe obserwowane u zainfekowanych wiñ ró¿-ni³y siê w zale¿noci od danej grupy antygenowej (27). W nawi¹zaniu do powy¿szych informacji warto wspom-nieæ o szczepach wirusa grypy typu A izolowanych pod-czas wybuchów choroby u wiñ w Irlandii w latach 1991--1998. Lin i wsp. (17) przeprowadzili porównawcze ba-danie filogenetyczne tych wirusów ze szczepami kr¹¿¹-cymi równolegle na wiecie. Analiza sekwencji
nukleo-tydowych H i N podtypu H1N1 pokaza³a du¿¹ ich zbie¿-noæ z izolatami azjatyckimi pochodzenia ptasiego: A/swine/HongKong/168/93 (H1N1 podobieñstwo 91%) oraz A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1 podobieñ-stwo 90%). Mniejsze podobieñpodobieñ-stwo filogenetyczne stwierdzono ze szczepami izolowanymi wówczas od wiñ w Europie. Równie¿ w tym przypadku stwierdzo-no wprowadzenie szczepu H1N1 ptasiego pochodzenia do populacji wiñ. Przekroczenie bariery gatunkowej by³o konsekwencj¹ substytucji aminokwasowej, a mia-nowicie leucyna w pozycji 226 ³añcucha hemaglutyniny uleg³a wymianie na glutaminê, za kwas glutaminowy (typowy dla ptasiej odmiany wirusa) zamieniony zosta³ w pozycji 190 na kwas asparaginowy (wystêpuj¹cy w od-mianie ludzkiej i wiñskiej). Izolowane w Irlandii w tym samym okresie wirusy H3N2 wykaza³y cilejsze kore-lacje nukleotydowe genu H ze szczepami izolowanymi w Wielkiej Brytanii ni¿ ze szczepami pochodz¹cymi z Europy kontynentalnej, m.in. z Belgii z 1992 roku (25). Gen koduj¹cy neuraminidazê drug¹ równie¿ okaza³ siê filogenetycznie odleg³y od szczepów europejskich i po-dobnie jak hemaglutynina ewoluowa³ niezale¿nie. Ana-liza porównawcza genów koduj¹cych bia³ka wewnêtrz-nej czêci genomu wirusa, jak np. genu bia³ka M izola-tów pochodz¹cych z 1993 roku, wykaza³a bliskie ich po-krewieñstwo ze szczepami izolowanymi od ludzi, co zosta³o potwierdzone w dalszych badaniach, maj¹cych na celu ustalenie pochodzenia tych szczepów. Z kolei wykazano, ¿e izolaty omawianego wirusa z roku 1998 zawiera³y szeæ genów bli¿ej spokrewnionych z podty-pem H1N1, co wskazywa³oby na reasortacjê pomiêdzy wirusami H3N2 a H1N1, wspó³kr¹¿¹cymi w populacji wiñ w Irlandii po 1993 roku.
Guan i wsp. (12) opublikowali dane na temat po-dobieñstwa genetycznego europejskiego szczepu (A/Netherlands/5/93) wirusa grypy wiñ ze szczepami pochodz¹cymi z Chin, izolowanymi od tego gatunku na pocz¹tku lat dziewiêædziesi¹tych. Takie pokrewieñstwo, oprócz Irlandii, stwierdzono równie¿ w Holandii, W³o-szech i Belgii. Wi¹¿e siê je z wprowadzeniem wirusa wraz eksportem wiñ z Europy do po³udniowej czêci Chin w latach 90. (25). Na podkrelenie zas³uguje fakt zaka¿enia ludzi tymi szczepami, zarówno w Holandii, jak i w Chinach, co stanowi kolejny dowód na miêdzy-gatunkow¹ transmisjê szczepów pochodzenia wiñskie-go do populacji ludzkiej (11).
Selekcja wysokopatogennych szczepów wirusów gry-py ma miejsce równie¿ poza naturalnymi warunkami bytowania. Dla przyk³adu, wirus grypy typu A zosta³ wyizolowany od martwych fok w 1979 roku i wskazy-wa³ na wysokie pokrewieñstwo z reasortantem ptasim (29). Kolejny przyk³ad to izolacja wirusa grypy od cho-rych wielb³¹dów podczas kilku epizoocji tej choroby w Mongolii, obserwowanych od 1979 roku. Na prze-³omie lat 1978/1979 inaktywowane szczepy ludzkie A/PR/8/34 oraz A/USSR/90/77 zosta³y wykorzystane do przygotowania szczepionki rozpowszechnianej w Mon-golii (1). Nale¿y tu dodaæ, ¿e jej zastosowanie powodo-wa³o lekkie stany chorobowe u dzieci. Wirusy szczepion-kowe dosta³y siê do populacji wielb³¹dów, nabieraj¹c
cech wysoce zjadliwych. Tak powsta³y mutant utrzymy-wa³ siê w Mongolii do 1996 roku (1).
Dryft antygenowy
Drugi mechanizm zmiennoci wirusa grypy polega na powolnej ewolucji, maj¹cej charakter stopniowo utrwa-laj¹cych siê mutacji punktowych w segmentach RNA koduj¹cych antygeny powierzchniowe, okrelonej jako przesuniêcie lub dryft genetyczny (antigenic drift). Zmia-ny te maj¹ charakter ci¹g³y. Powoduje to powstawanie wariantów, z których ka¿dy kolejny tylko nieznacznie ró¿ni siê od poprzedniego, jednak na tyle, ¿e staje siê niewra¿liwy na indukowane przez niego przeciwcia³a. Zmiany tego typu s¹ mniej grone, w porównaniu do szyftu antygenowego, gdy¿ zwykle zachowana jest czê-ciowa kompetencja immunologiczna organizmu. Podob-nie jak wszystkie RNA-wirusy, tak¿e wirus grypy cha-rakteryzuje siê wysokim wskanikiem mutacji, który osi¹ga stopieñ 105 podstawieñ na jedno miejsce
pod-czas jednego cyklu replikacji (22). Zjawisko to wystê-puje w przypadku wszystkich 3 typów wirusów. Pod pre-sj¹ selekcji w postaci przeciwcia³ monoklonalnych lub naturalnej odpowiedzi immunologicznej wirusy z now¹ cech¹ ewoluuj¹ gwa³townie. Antygenowa ucieczka no-wych mutantów zwi¹zana jest najbardziej z zamian¹ aminokwasów w ³añcuchu bia³kowym epitopu hemaglu-tyniny. Innym miejscem powstawania wariantów na dro-dze dryftu genetycznego wirusa grypy jest dobrze po-znany gen koduj¹cy nukleoproteinê (NP), bia³ko wi¹¿¹-ce i stabilizuj¹wi¹¿¹-ce RNA wirusa, uznawane za g³ówny czyn-nik determinuj¹cy specyficznoæ gatunkow¹ (30). Ana-liza filogenetyczna na podstawie sekwencji nukleotydo-wej NP szczepów wirusa grypy pochodz¹cych z ró¿nych lat i zak¹tków wiata, przedstawia drzewo powi¹zañ, na którym zaznaczaj¹ siê dwie g³ówne ga³êzie (29). Jedna o rodowodzie ptasim, druga stworzona na podstawie izo-latów od ludzi, wiñ oraz koni. Wraz z izolatami ptasimi i ludzkimi rozrzucone s¹ niektóre izolaty wiñskie, co wskazuje na stosunkowo du¿¹ ³atwoæ prze³amywania bariery gatunkowej przez wirusa grypy i zdolnoæ infe-kowania ró¿nych gatunków. Ga³êzie pokrewieñstwa na poziomie informacji genetycznej wykazuj¹ du¿¹ hetero-gennoæ wszystkich porównywanych grup zwierz¹t. Na poziomie fenotypowym, czyli budowy ³añcucha amino-kwasowego, tylko wród wirusów izolowanych od ptac-twa wystêpuje bliskie pokrewieñstwo, zobrazowane wielkim rozrzutem linii filogenetycznych oraz ich nie-zale¿n¹ drog¹ ewolucyjn¹. Wskazuje to, ¿e wiêkszoæ mutacji nukleotydowych u tej grupy zwierz¹t jest ci-cha oraz ¿e presja selekcyjna nie utrwali³a nowych zmian w ptasich odmianach wirusa.
Stopieñ pokrewieñstwa poszczególnych linii filoge-netycznych zwi¹zany ze zmiennoci¹ definiowany jest w znacznym stopniu przez selekcyjn¹ presjê rodowis-ka, co kojarzone jest z drog¹ zaka¿enia (29). U ptactwa jest ni¹ przewód pokarmowy (39). Wirus ptasi potrze-buje wydzielanej przez trzustkê trypsyny do aktywacji hemaglutyniny, dlatego te¿ nie rozprzestrzenia siê do krwi, czego konsekwencj¹ jest s³aba odpowied humo-ralna, która z pewnoci¹ nie jest czynnikiem
utrwalaj¹-cym zmiennoæ (28). Znajduje to po-twierdzenie tak¿e w zmianach ewolu-cyjnych obrazuj¹cych relacje miêdzy szczepami ludzkimi i wiñskimi. Ze-stawienia aminokwasowe NP wiadcz¹ o znacznym zró¿nicowaniu w tych gru-pach. Presjê selekcyjn¹ u tych gatun-ków wi¹¿ê siê z wystêpowaniem od-powiedzi immunologicznej na wyso-kim poziomie (29).
Antygenowa zmiennoæ wirusa gry-py, wynikaj¹ca ze zmiany aminokwa-sów w ³añcuchu bia³kowym epitopu H, wp³ywa w bezporedni sposób na mo¿-liwoæ ³¹czenia siê z receptorami okre-lonych gospodarzy. Miejsce rozpozna-nia H przez receptor gospodarza zde-terminowane jest przez kwas sialowy (sialic acid SA) (8). Ptasi oraz koñ-ski wirus influenzy wykazuje
powino-wactwo do sialooligosacharydów po³¹czonych wi¹za-niem 2,3a miêdzy kwasem N-acetyloneuraminowym (NA) a galaktoz¹ (NA2,3aGal), podczas gdy ludzki jego podtyp ³¹czy siê z receptorami zakoñczonymi kwasem NA2,6aGal (34). Wirusy grypy wykazuj¹ równie¿ od-rêbnoæ w rozpoznawaniu receptorów zakoñczonych ró¿nymi podstawnikami, m.in. NeuAc oraz NeuGc. Byd-lêce, wiñskie oraz koñska tkanka eksponuj¹ na po-wierzchni obydwa typy kwasów: NeuAc oraz NeuGc, podczas gdy u ludzi spotykamy w w¹skim zakresie po-staæ NeuGc (mniej ni¿ 0,1% ca³kowitego SA). U wiñ, ze wzglêdu na ekspresjê na powierzchni nab³onka typu receptora NA2,3aGal oraz NA2,6aGal, spotykamy siê z mo¿liwoci¹ miêdzygatunkowego zaka¿enia ró¿nymi typami wirusa. Z tego w³anie powodu winia uwa¿ana jest za gospodarza bêd¹cego naczyniem mieszaj¹cym (mixing vessel) odpowiedzialnym za proces reasortacji genów wirusa (3) (ryc. 2).
Do niedawna uwa¿ano, ¿e wirus grypy nie jest w sta-nie przekroczyæ bariery gatunkowej pomiêdzy cz³owie-kiem i ptactwem. Niestety, infekcje ludzi zwi¹zane z pta-si¹ odmian¹ wirusa H5N1 i H9N2 w po³udniowej Azji, pojawiaj¹ce siê od 1997 r., oraz wydarzenia w Europie z 2003 roku, gdzie wród ludzi odnotowano zaka¿enia ptasi¹ odmian¹ wirusa H7N7, jak równie¿ wczeniejsze przypadki subkliniczne, jednoznacznie demonstruj¹ mo¿-liwoæ bezporedniej transmisji wirusa od ptaków do lu-dzi (38). Niemniej jednak zwykle ptasi wirus grypy re-plikuje w typowy sposób u ssaków naczelnych w nie-wielkim stopniu, a wirus odmiany ludzkiej nie namna¿a siê wydajnie u ptaków (35).
Analiza porównawcza sekwencji aminokwasowej he-maglutynin, w czêci odpowiadaj¹cej za wi¹zanie siê z receptorem (receptor binding side RBS), zwróci³a uwagê na szeæ wysoce konserwatywnych aminokwa-sów wród ptasiej odmiany wirusa grypy (138A, 190E, 194L, 225G, 226Q i 228G), lecz wykazuj¹cych podsta-wienie w odmianie ludzkiej (20). Sugeruje to, ¿e tego rodzaje mutacje w opisanych pozycjach by³y wynikiem adaptacji ptasiego podtypu do ludzkiego gospodarza.
Obydwie hemaglutyniny ludzkie H2 i H3 posiadaj¹ te same zmiany: 226Q®L oraz 228G®S, zgodnie z pier-wotnie istniej¹cym zapisem w sekwencji ptasiego wariantu. Pojedyncza mutacja 226L®O w podtypie H3 zmienia specyficznoæ wi¹zania H z preferencj¹ dla receptora nab³onkowego, zakoñczonego kwasem Neua2,6-Gal, za mutacja w miejscu 228 ³añcucha umo¿-liwia wi¹zanie siê bia³ka H do erytrocytów ludzkich. Znane s¹ jednak¿e pewne odstêpstwa w mutagenezie he-maglutyniny. Niektóre szczepy o wzorze antygenowym H2N2 izolowane od ludzi na pocz¹tku pandemii w 1957 roku zawiera³y w swojej strukturze 228G, podobnie jak wiêkszoæ ptasich wirusów, natomiast nieliczne ptasie wirusy posiada³y ludzki wariant H3 228S. Szczep wi-rusa grypy ludzkiej z roku 1960 roku, pomimo obec-noci mutacji 226L/228S wykazywa³ zdolnoæ wi¹zania siê wed³ug schematu wirusów ptasich. Trzy podstawie-nia w regionie RBS (137R®Q, 158G®E oraz 186N®I), które wyodrêbniaj¹ ten szczep sporód typowych wiru-sów ludzkich, uwa¿ane s¹ za przyczynê odmiennoci w schemacie wi¹zania. Trudno jest zdefiniowaæ deter-minanty okrelaj¹ce powinowactwo bia³ka powierzch-niowego H wirusa grypy okrelonego pochodzenia do tkanki danego gospodarza ze wzglêdu na mnogoæ mu-tacji w genomie wirusa zaistnia³ych od czasu jego trans-misji z populacji ptaków. Mo¿na jednak przypuszczaæ, ¿e zdolnoæ rozpoznawania receptora zakoñczonego Neua2,6-Gal jest cech¹ nabyt¹ nied³ugo po wejciu wi-rusa ptasiego do populacji ludzi i wiñ (19).
W dalszych analizach mutacji 226Q®L oraz 228G®S porównywano wp³yw pojedynczej zmiany oraz obydwu podstawieñ na funkcje bia³ka H. Okaza³o siê, ¿e poje-dyncza mutacja 228G®S, a wiêc mutageneza od postaci ptasiej wirusa grypy do postaci ludzkiej w szczepie ludzkim Undorn/72 nie powoduje zwiêkszenia si³y aso-cjacji dla receptora Neua2,6-Gal, lecz redukujê o po³o-wê powinowactwo dla jego postaci Neua2,3-Gal. Dla kontrastu, podstawienie 226Q®L, wystêpuj¹ce obok 228G®S podnosi powinowactwo dla receptora zakoñ-czonego Neua2,6-Gal szeciokrotnie, a zmniejsza
omio-szczep ludzki szczep œwiñski pneumocyty rekombinant wirusowe RNA P³uca
krotnie si³ê asocjacji dla receptora typu Neua2,3-Gal. Badania te dowodz¹ zale¿noci miêdzy mutacj¹ w miej-scu 226 a dryftem miêdzygatunkowym oraz wp³ywu pod-stawienia glicyny w miejscu 288, na granicê rozpozna-wania dwóch ró¿nych wariantów receptorów b³onowych (20). Warto przy tym zaznaczyæ, ¿e nie wszystkie muta-cje wp³ywaj¹ istotnie na si³ê wi¹zania siê wirusa ze swo-istym receptorem, dla przyk³adu: mutacje 228G®R oraz 227S®P nie powoduj¹ zmian w zakresie wi¹zania z re-ceptorem Neua2,3-Gal.
Konsekwencje zmiennoci wirusów grypy w immunoprofilaktyce
Efektywnoæ szczepieñ przeciwko grypie mo¿e zostaæ znacz¹co obni¿ona w wyniku rozdwiêku antygenowe-go miêdzy szczepami wytypowanymi do produkcji szcze-pionki, a szczepami aktualnie kr¹¿¹cymi w populacji. Dla przyk³adu, w Niemczech tylko niewielka liczba wszystkich szczepów H3N2 izolowanych w roku 1995 by³a antygenowo podobna do komponentów szczepion-ki u¿ytej w sezonie 1996/1997, wiêkszoæ z nich by³a zbli¿ona do innego wariantu szczepu referencyjnego A/Sydney/5/97, uznanego za efekt dryftu genetycznego (31). Rok póniej, w okresie 1998/1999 odnotowano ciê¿kie przypadki chorobowe i zejcia miertelne ludzi zwi¹zane z wybuchem epidemii, spowodowanej wyso-ce zjadliwym szczepem H3N2. Potwierdza to tezê o za-le¿noci miêdzy zmianami antygenowymi a pojawie-niem siê nowych szczepów odpowiedzialnych za kilku-krotne wybuchy epidemii niekoniecznie podczas pierwszego pojawienia siê reasortanta w otoczeniu. Zo-sta³o to równie¿ stwierdzone podczas wybuchów epide-mii grypy w sezonie 1993/1994 w Finlandii (23) oraz w Anglii (9).
W badaniach filogenetycznych polegaj¹cych na ana-lizie sekwencji aminokwasów bia³ka H wirusów pocho-dz¹cych od europejskich wiñ stwierdzono relatywnie ma³¹ homologiê, kszta³tuj¹c¹ siê na poziomie 70,4--71,9%, pomiêdzy podtypem H1N2 a podtypem H1N1 szczepu szczepionkowego, zastosowanego w profilak-tyce choroby (26). W badaniach szczegó³owych wyod-rêbniono oko³o 40 mutacji. Wyjania³oby to niski po-ziom przeciwcia³ dla podtypu H1N2 u wiñ po uprzed-niej immunizacji szczepem H1N1. Jednak¿e nie zawsze du¿a ró¿nica genetyczna jest jednoznaczna z brakiem krzy¿owej reakcji immunologicznej b¹d krzy¿owej odpornoci. Dla przyk³adu, Van Reeth i wsp. (24) wyko-rzysta³a dwa szczepy podtypu H1N1 New Jersey oraz sw/Belgium/1/98, pomiêdzy którymi wystêpowa³o 28 ró¿nic aminokwasowych w piêciu miejscach antygeno-wych hemaglutyniny. Stwierdzi³a indukcjê odpowiedzi immunologicznej na wysokim poziomie przeciwko szczepowi sw/Belgium/1/98 u wiñ uodpornianych szczepem New Jersey. Niestety, analizy genetyczne wi-rusa grypy s¹ rzadko przeprowadzane kompleksowo, w po³¹czeniu z badaniem odpornoci poszczepiennej i wci¹¿ istnieje brak wystarczaj¹cych danych dotycz¹-cych wp³ywu dryftu genetycznego na skutecznoæ szcze-pionek przeciwgrypowych.
W przeciwieñstwie do glikoprotein powierzchniowych domena bia³kowa M2, bêd¹ca integraln¹ czêci¹ otocz-ki i jednoczenie kana³em jonowym, zachowuje wy¿sz¹ konserwatywnoæ (21). W badaniach nad immunogen-noci¹ wykorzystano jako szczepionkê rekombinant DNA wykazuj¹cy ekspresjê dwóch bia³ek: M2 wirusa grypy i bia³ka korowego wirusa ¿ó³taczki typu B, oraz dodatkowo dokonano fuzji miêdzy bia³kiem M2 a nu-kleoprotein¹ wirusa grypy (M2eNP), celem stymulacji komórek Th oraz Tc (13). Wszystkie szczepionki do-wiadczalne indukowa³y odpowied humoraln¹ przeciw-ko antygenom M2 i M2eNP oraz induprzeciw-kowa³y specyficz-n¹ dla wirusa grypy proliferacjê limfocytów. Jednak¿e opracowane biopreparaty nie posiada³y wartoci ochron-nej, bowiem po zaka¿eniu dowiadczalnym immunizo-wanych zwierz¹t szczepem H1N1 uodpornione winie wykazywa³y gwa³towniejsze objawy chorobowe ni¿ zwierzêta z grupy kontrolnej, a 50% stawki pad³a po dwóch dniach po zaka¿eniu. Kolejne próby modyfikacji szczepionek przeciwko grypie polega³y m.in. na zasto-sowaniu innych wektorów, opartych o ma³o konserwa-tywne bia³ko H, wprowadzanych z adjuwantem, który stanowi³a interleukina 6 (15). W tym przypadku zwie-rzêta immunizowano DNA koduj¹cym hemaglutyninê pierwsz¹ i do zaka¿enia kontrolnego wykorzystano rów-nie¿ szczep podtypu H1N1. Poziom przeciwcia³ anty H1 by³ wy¿szy po immunizacji, za okres siewstwa wirusa u wiñ immunizowanych by³ o jeden dzieñ krótszy ni¿ u zwierz¹t kontrolnych. Jednak¿e nie zaobserwowano istotnego wp³ywu dodatku interleukiny 6 na poziom od-pornoci.
Konsekwencje zmiennoci wirusa grypy w diagnostyce molekularnej
Jak ju¿ wspomniano, genom IV stanowi niæ RNA po-dzielona na osiem segmentów, z których ka¿dy koduje syntezê bia³ek strukturalnych wirusa. Segmenty zakoñ-czone s¹ regionami nie podlegaj¹cymi translacji (UTRs untranslated regions) na koñcach 5 i 3 (36). Odpo-wiadaj¹ one za regulacjê ekspresji materia³u genetycz-nego wirusa. Wród nich wymieniæ nale¿y przede wszyst-kim: miejsce promotorowe, sygna³ poliadenylacji dla ter-minacji transkrypcji, miejsce wi¹zania polimerazy oraz miejsce odpowiedzialne za upakowanie wirusowego RNA w cz¹steczce nukleoproteiny. D³ugoæ tych odcin-ków zosta³a okrelona na 12-13 nukleotydów w koñcu 3 oraz 15-16 w koñcu 5. Po uformowaniu struktury II-rzêdowej tworz¹ one z ca³ej nici RNA segment o kszta³cie korkoci¹gu. Struktura taka jest uznawana za sygna³ rozpoczynaj¹cy reakcje enzymatyczne (2). For-mowanie tego uk³adu mo¿liwe jest dziêki sekwencjom komplementarnym znajduj¹cym siê wewn¹trz odcinka UTRs. Ze wzglêdu na swoj¹ sta³¹ funkcjê inicjatora eks-presji informacji genetycznej wirusa sekwencje te s¹ uznawane za wysoce konserwatywne (14). Oprócz tego w zakoñczeniach nici RNA wokó³ otwartych ramek od-czytu koñca 5 i 3 znajduj¹ siê sekwencje wysoce zmien-ne, ulokowane pomiêdzy struktur¹ II-rzêdow¹ korko-ci¹gu a stop kodonem koñca 3 oraz miêdzy ci¹giem urydynowym a stop kodonem na koñcu 5 (16).
Znajo-moæ sekwencji konserwatywnych i zmiennych u³atwia opracowywanie testów diagnostycznych. Konserwatyw-ne miejsca genomu wykorzystywaKonserwatyw-ne s¹ najczêciej jako matryca przy projektowaniu starterów do reakcji PCR, g³ównie do amplifikacji materia³u genetycznego w celu dalszego wykorzystania go do okrelenia sekwencji nukleotydów w genomie. Takie postêpowanie stosuje siê w analizie genomowej szczepów s³abo zdefiniowanych. Uniwersalne startery mog¹ natomiast byæ pomocne w ge-nerowaniu sekwencji unikalnych, zdeterminowanych tylko dla okrelonego szczepu lub podtypu. Dla przy-k³adu, Hoffman i wsp. (14) amplifikowali genom wiru-sa grypy typu A izolowany od ró¿nych gatunków przy u¿yciu starterów opracowanych dla wszystkich segmen-tów RNA. Sekwencje starterów ró¿ni³y siê tylko dwo-ma lub trzedwo-ma pozycjami w koñcu 3 i okaza³y siê spe-cyficznym narzêdziem diagnostycznym.
Podsumowanie
Zmiennoæ wirusa grypy jest niezwykle z³o¿onym pro-cesem. Jej konsekwencj¹ jest czêsto obserwowany brak jednoznacznoci uzyskiwanych wyników badañ. Anty-genowy dryft i szyft wci¹¿ powoduj¹ powstawanie im-munologicznie odleg³ych szczepów wirusa grypy. Ujaw-nienie siê nowych wariantów wirusa grypy, formuj¹cych siê razem z ucieczk¹ antygenow¹, uzasadnia potrzebê sta³ego kontrolowania tego procesu. Analiza mutacji zachodz¹cych w genomie wirusa rozszerza wiedzê na temat mechanizmów ewoluowania omawianego drob-noustroju. Z tego powodu antygenowa oraz genomowa charakterystyka aktualnie kr¹¿¹cych szczepów wirusa grypy jest niezbêdna zarówno do opracowywania nowych metod diagnostycznych jak i przy wyborze szczepów do aktualizowanych szczepionek, przygotowywanych na dany sezon epidemiologiczny.
Pimiennictwo
1.Anchlan D., Ludwig S., Nymadawa P., Mendsaikhan J., Scholtissek C.: Previous H1N1 influenza A viruses circulating in the Mongolian population. Arch. Virol. 1996, 141, 1553-1569.
2.Azzeh M., Flick R., Hobom G.: Functional analysis of the influenza A virus cRNA promoter and construction of an ambisense transcription system. Viro-logy 2001, 289, 400-410.
3.Brown I. H.: The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs. Vet. Microbiol. 2000, 74, 29-46.
4.Brown I. H., Chakraverty P., Harris P. A., Alexander D. J.: Disease outbreaks in pigs in Great Britain due to an influenza A virus of H1N2 subtype. Vet. Rec. 1995, 36, 328-329.
5.Brown I. H., Harris P. A., Alexander D. J.: Serological studies of influenza viruses in pigs in Great Britain 1991-1992. Epidemiol. Infect. 1995, 114, 511-520.
6.Brydak L. B.: Grypa i jej profilaktyka, Springer PWN, Warszawa 1998. 7.Castrucci M. R., Donatelli I., Sidoli L., Barigazzi G., Kawaoka Y., Webster R. G.:
Genetic reassortment between avian and human influenza A viruses in Italian pigs. Virology 1993, 193, 503-506.
8.Easterday B. C., Van Reeth K.: Swine influenza, [w:] Disease of swine. Straw B. E., DAllaire S., Mengeling W. L., Taylor D. J. (wyd.). The Iowa State University Press, USA 1999, 277-290.
9.Ellis J. S., Chakraverty P., Clewley J. P.: Genetic and antigenic variation in the haemagglutinin of recently circulating human influenza A (H3N2) viruses in the United Kingdom. Arch. Virol. 1995, 140, 1889-1904.
10.Fujii K., Fujii Y., Noda T., Muramoto Y., Watanabe T., Takada A., Goto H., Horimoto T., Kawaoka Y.: Importance of both the coding and the segment--specific noncoding regions of the influenza A virus NS segment for its efficient incorporation into virions. J. Virol. 2005, 79, 3766-3774.
11.Gregory V., Lim W., Cameron K., Bennett M., Marozin S., Klimov A., Hall H., Cox N., Hay A., Lin Y. P.: Infection of a child in Hong Kong by an influenza A H3N2 virus closely related to viruses circulating in European pigs. J. Gen. Virol. 2001, 82, 1397-1406.
12.Guan Y., Shortridge K. F., Krauss S., Li P. H., Kawaoka Y., Webster R. G.: Emergence of avian H1N1 influenza viruses in pigs in China. J. Virol. 1996 70, 8041-8046.
13.Heinen P. P., Rijsewijk F. A., de Boer-Luijtze E. A., Bianchi A. T.: Vaccination of pigs with a DNA construct expressing an influenza virus M2-nucleoprotein fusion protein exacerbates disease after challenge with influenza A virus. J. Gen. Virol. 2002, 83, 1851-1859.
14.Hoffmann E., Stech J., Guan Y., Webster R. G., Perez D. R.: Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch. Virol. 2001, 146, 2275-2289.
15.Larsen D. L., Olsen C. W.: Effects of DNA dose, route of vaccination, and co-administration of porcine interleukin-6 DNA on results of DNA vaccination against influenza virus infection in pigs. Am. J. Vet. Res. 2002 63, 653-659. 16.Leahy M. B., Dobbyn H. C., Brownlee G. G.: Hairpin loop structure in the 3
arm of the influenza A virus virion RNA promoter is required for endonuclease activity. J. Virol. 2001, 75, 7042-7049.
17.Lin Y. P., Bennett M., Greorgy V., Grambas S., Ragazzoli V., Lenihan P., Hay A.: Emergence of distinct avian-like influenza A H1N1 viruses in pigs in Ireland and their reassortment with cocirculating H3N2 viruses. Intern. Congr. Series 2004, 1263, 209-213.
18.Lipatov A. S., Govorkova E. A., Webby R. J., Ozaki H., Peiris M., Guan Y., Poon L., Webster R. G.: Influenza: emergence and control. J. Virol. 2004, 78, 8951-8959.
19.Matrosovich M. N., Matrosovich T. Y., Gray T., Roberts N. A., Klenk H. D.: Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 4620-4624. 20.Matrosovich M., Tuzikov A., Bovin N., Gambaryan A., Klimov A., Castrucci M. R.,
Donatelli I., Kawaoka Y.: Early alterations of the receptor-binding properties of H1, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals. J. Virol. 2000, 74, 8502-8512.
21.Olsen C. W.: DNA vaccination against influenza viruses: a review with empha-sis on equine and swine influenza. J. Virol. 2005, 79, 3766-3774.
22.Parvin J. D., Moscona A., Pan W. T., Leider J. M., Palese P.: Measurement of the mutation rates of animal viruses: influenza A virus and poliovirus type 1. J. Virol. 1986, 59, 3377-3383.
23.Pyhala R., Ikonen N., Haanpaa M., Kinnunen L.: HA1 domain of influenza A (H3N2) viruses in Finland in 1989-1995: evolution, egg-adaptation and relationship to vaccine strains. Arch. Virol. 1996, 141, 1033-1046.
24.Van Reeth K., Brown I. H., Essen S., Pensaert M.: Genetic relationships, serolo-gical cross-reaction and cross-protection between H1N2 and other influenza A virus subtypes endemic in European pigs. Virus Res. 2004, 103, 115-124. 25.Van Reeth K., Brown I. H., Pensaert M.: Isolations of H1N2 influenza A virus
from pigs in Belgium. Vet. Rec. 2000, 146, 588-589.
26.Van Reeth K., Labarque G., De Clercq S., Pensaert M.: Efficacy of vaccination of pigs with different H1N1 swine influenza viruses using a recent challenge strain and different parameters of protection. Vaccine 2001, 19, 4479-4486. 27.Richt J. A., Lager K. M., Janke B. H., Woods R. D., Webster R. G., Webby R. J.:
Pathogenic and antigenic properties of phylogenetically distinct reassortant H3N2 swine influenza viruses cocirculating in the United States. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 3198-3205.
28.Scholtissek C.: Stability of infectious influenza A viruses at low pH and at elevated temperature. Vaccine 1985, 3, 215-218.
29.Scholtissek C.: Molecular evolution of influenza viruses. Virus Genes 1995, 11, 209-215.
30.Scholtissek C., Burger H., Kistner O., Shortridge K. F.: The nucleoprotein as a possible major factor in determining host specificity of influenza H3N2 viruses. Virology 1985, 147, 287-294.
31.Schweiger B.: Nationale und globale Influenzasurveilllance als Basis der järlischen Impfsotffempfehling. Bundesgesundheitsblatt. 2001, 44, 1153-1161. 32.Schweiger B., Zadow I., Heckler R.: Antigenic drift and variability of influenza
viruses. Med. Microbiol. Immunol. 2002, 191, 133-138.
33.Shortridge K. F., Stuart-Harris C. H.: An influenza epicentre? Lancet 1982, 2, 812-813.
34.Suzuki Y., Ito T., Suzuki T., Holland R. E. Jr, Chambers T. M., Kiso M., Ishida H., Kawaoka Y.: Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses. J. Virol. 2000, 74, 11825-11831.
35.Suzuki Y.: Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range varia-tion of influenza viruses. Biol. Pharm. Bull. 2005, 28, 399-408.
36.Szymkowiak C., Kwan W. S., Su Q., Toner T. J., Shaw A. R., Youil R.: Rapid method for the characterization of 3 and 5 UTRs of influenza viruses. J. Virol. Methods. 2003, 107, 15-20.
37.Webby R. J., Swenson S. L., Krauss S. L., Gerrish P. J., Goyal S. M., Webster R. G.: Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States. J. Virol. 2000, 74, 8243-8251.
38.Webster R. G., Hulse D. J.: Microbial adaptation and change: avian influenza. Rev. Sci. Tech. 2004, 23, 453-465.
39.Webster R. G., Yakhno M., Hinshaw V. S., Bean W. J., Murti K. G.: Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks. Viro-logy 1978, 84, 268-278.
Adres autora: doc. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: [email protected]
