Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 62 (1), 85-88, 2006

Medycyna Wet. 2006, 62 (1) 85

Praca oryginalna Original paper

Chimer¹ jest osobnik posiadaj¹cy przynajmniej dwie populacje genetycznie odmiennych komórek, wywo-dz¹ce siê z dwóch ró¿nych zygot (1). Mo¿e on po-wstawaæ naturalnie, np. w wyniku po³¹czenia dwóch zygot, jak ma to niekiedy miejsce u ssaków, we wczes-nym okresie rozwoju zarodków. Organizm taki zawiera w niektórych tkankach lub ca³ych narz¹dach ró¿ne komplety chromosomów. Chimery tworzy siê równie¿ w wyniku wprowadzenia do zarodka bêd¹cego w bar-dzo wczesnym stadium rozwoju pluripotentnych ko-mórek pochodz¹cych od genetycznie ró¿nych osobni-ków (7, 12, 13).

Zainteresowanie tworzeniem chimer ptaków wzros-³o w ostatniej dekadzie, po tym jak wykazano (11) mo¿liwoœæ u¿ycia komórek blastodermalnych kury (BCs) do produkcji nie tylko chimer fenotypowych, ale tak¿e chimer p³ciowych. Jest to mo¿liwe, ponie-wa¿, z jednej strony, BCs pochodz¹ce od 24 godz. za-rodków zachowuj¹ w³aœciwoœci pluripotentne/totipo-tentne, z drugiej zaœ – zawieraj¹ pewn¹ liczbê pre-kursorów pierwotnych komórek p³ciowych (PGCs), które daj¹ pocz¹tek linii komórek rozrodczych (6).

Z uwagi na powy¿sze wskazuje siê (2) na mo¿li-woœci praktycznego wykorzystania w³aœcimo¿li-woœci BCs. Dotycz¹ one dwóch podstawowych kierunków: pro-dukcji ptaków transgenicznych (10) oraz biokonser-wacji genotypów (4).

Z biologicznego punktu widzenia interesuj¹ca jest natomiast mo¿liwoœæ interakcji pomiêdzy ró¿nymi genotypami komórek dawców i biorców w organizmie chimery. Tym bardziej, ¿e udowodniono mo¿liwoœæ ró¿nicowania siê PGCs w gonadach biorców (8), na-wet odmiennej p³ci i produkcjê t¹ drog¹ funkcjonal-nych gamet. Opracowanie efektywnej, powtarzalnej metody produkcji genotypowych i p³ciowych chimer kur (3) oraz opracowanie niezawodnych metod ich identyfikacji (4) pozwoli³o na uzyskanie licznej grupy tych ptaków, mog¹cych stanowiæ podstawê rozwo-ju ró¿norodnych, czêsto potencjalnych do tej pory kierunków badawczych, np. nad sterowaniem p³ci¹ ptaków.

Interesuj¹ce wydaj¹ siê zw³aszcza interakcje pomiê-dzy komórkami o ró¿nym genotypie i ich wp³yw na wskaŸniki fizjologiczne i cechy u¿ytkowe ptaków. Niezmiernie interesuj¹ca jest rola i oddzia³ywanie ¿eñ-skich (nosicieli chromosomu W) i mê¿eñ-skich (nosicieli chromosomu Z) PGCs, identyfikowanych w gonadach

Wp³yw chimeryzmu na wybrane

cechy reprodukcyjne kogutów*

)

PRZEMYS£AW CZEKALSKI, MAREK BEDNARCZYK*

Dzia³ Biotechnologii i Rozrodu Zwierz¹t Instytutu Zootechniki, ul Krakowska 1, 32-083 Balice k. Krakowa *Katedra Biotechnologii Zwierz¹t ATR, ul. Mazowiecka 28, 85-084 Bydgoszcz

Czekalski P., Bednarczyk M.

Influence of chimerism on selected cock reproductive traits Summary

Our objective was the identification of chimerism on the basis of some traits and the estimation of their effect on reproductive features. The investigation was conducted on 11 cocks of Zk (donor) breed, 10 WI cocks (blastoderm cells recipient) and 10 chimeric (Ch) cocks, raised and housed in the same environmental conditions. Chimerism was identified on the basis of different criteria: down color, germline chimerism (back-crossing), and blood chromosome W identification (PCR). Using the MultiScan software the concentration of spermatozoa in sperm from cocks of 23, 28 and 34-weeks-of-age was determined. From the data presented in this manuscript, it is evident that the production of the chicken chimeras using the blastodermal cells is not a one-off event. On the contrary 90% (9/10) of investigated cocks were identified as chimera. Three chimeras produced the low spermatozoa sperm concentration (from 653.000 to 772.000 /ml), and two chimeras did not produce sperm. Among the above-mentioned cocks, some had underdeveloped testis and others showed chromosome W in their blood. On the other hand, three chimeras produced a high number of spermatozoa (from 2. 289.000 to 2. 681.000 / ml) and two of them were characterized by the highest spermatozoa production in comparison with all 31 investigated Wl, Zk and Ch cocks.

Keywords: cocks, chimeras

*) _{Badania finansowane przez KBN, projekt nr 6 P06D 008 21 oraz}

Medycyna Wet. 2006, 62 (1) 86

ptaków chimer, niezale¿nie od ich p³ci (8). Celem ba-dañ by³a identyfikacja chimeryzmu w oparciu o wy-brane cechy oraz ocena jego wp³ywu na cechy repro-dukcyjne kogutów.

Materia³ i metody

Materia³ badawczy stanowi³y koguty rasy zielononó¿ka kuropatwiana (Zn – 11 szt.), white leghorn (Wl – 10 szt.) oraz chimery (Ch – 10 szt.) powsta³e po iniekcji komórek blastodermalnych Zn do zarodków Wl, znajduj¹cych siê w X stadium rozwoju embrionalnego, zgodnie z wczeœniej opisan¹ metod¹ (3). Ptaki oznaczono numerami skrzyd³o-wymi i odchowano oraz utrzymywano w identycznych warunkach œrodowiskowych, w tym samym kurniku.

Nasienie kogutów pobierano metod¹ masa¿u grzbieto-wo-brzusznego, w 23., 28. i 34. tygodniu ¿ycia. Pobranie ejakulatu do sterylnych probówek z podzia³k¹ pozwala³o na szybkie okreœlenie jego objêtoœci. Liczbê plemników okreœlano w komorze Bürkera, pod mikroskopem, wy-korzystuj¹c do tego celu oprogramowanie MultiScan, po wczeœniejszym zarchiwizowaniu obrazów.

Chimery poddano testowi krzy¿owania wstecznego, polegaj¹cego na krzy¿owaniu koguta chimery z kur¹ Zk. Celem stosowania tego testu by³o wykrycie wystêpowania chimeryzmu p³ciowego u kogutów Ch. Uzyskanie wœród wylê¿onych piskl¹t osobników o fenotypie dawcy BCs (Zk) by³o dowodem, i¿ komórki blastodermalne, iniekowane do zarodków biorców uleg³y wbudowaniu w gonadach i pro-dukowa³y gamety Zk. Krzy¿owane ptaki (1 : 1 ) umiesz-czano indywidualnie w klatkach, co umo¿liwia³o pe³n¹ kontrolê pochodzenia potomstwa. Testy prowadzono przez okres 20 tygodni wykonuj¹c po 10 lêgów testowych dla ka¿dej chimery.

Zawart¹ w chromosomie W charakterystyczn¹, rozpro-szon¹ sekwencjê powtórzon¹ EcoRI, licz¹ca 1211 pz iden-tyfikowano metod¹ amplifikacji w reakcji PCR, charakte-rystycznego fragmentu DNA licz¹cego 447 pz (14), na matrycy DNA izolowanego z krwi kogutów chimer. DNA izolowane z krwi kur i kogutów stanowi³o odpowiednio pozytywn¹ i negatywn¹ grupê kontroln¹. Amplifikacji DNA dokonano wg ustalonych wczeœniej warunków (denatura-cja wstêpna – 94°C 5 min., 35 cykli: 94°C 30 s, 48-55°C 45 s, 72°C 90 s; wyd³u¿anie koñcowe – 72°C 10 min., sch³o-dzenie do 4°C) z zastosowaniem nastêpuj¹cych starterów (EMBL/P Gen bank Nr X57344): 5’-GCCTTTCTACCG-CAAATAC-3’ oraz 5’-AGGTGCT TTTT TTCTGGG-3’. Produkty amplifikacji rozdzielano metod¹ elektroforetyczn¹ w 1,8% ¿elu agarozowym.

W celu porównania wartoœci œredniej liczby plemników w nasieniu kogutów z badanych grup przeprowadzono ana-lizê wariancji z zastosowaniem testu T-Studenta.

Wyniki i omówienie

Barwa upierzenia by³a w wiêkszoœci badaniach nad chimeryzmem ptaków (3, 5, 11, 15) pierwszym (i czês-to jedynym) wskaŸnikiem, na którego podstawie oce-niano wystêpowanie chimeryzmu lub jego brak. Ma to przede wszystkim zwi¹zek z mo¿liwoœci¹ jedno-znacznej i natychmiastowej oceny chimeryzmu wœród

jednodniowych piskl¹t. W tym celu dobierano odpo-wiednie genotypy dawcy i biorcy komórek, ró¿ni¹ce siê zestawem genów w jednym locus (II ii), odpowie-dzialnym za ekspresjê dominuj¹cej bia³ej barwy upie-rzenia. Biorc¹ komórek najczêœciej by³y kury rasy white leghorn (II), natomiast dawc¹ komórek ró¿ne rasy kur barwnych (ii), w tym Zk (3).

Siedem spoœród dziesiêciu ocenianych kogutów – chimer charakteryzowa³ chimeryzm fenotypowy (tab. 1), okreœlony na podstawie ciemnych plam upie-rzenia. Nale¿y jednak podkreœliæ, ¿e marker ten œwiad-czy jedynie o wbudowaniu siê komórek dawców do melanocytów biorców. W badaniach w³asnych pos³u-¿ono siê tak¿e innymi markerami chimeryzmu: opar-tym na ró¿nicy w budowie chromosomów W i Z (ko-guty nr 9 i 10) oraz chimeryzmie p³ciowym, identyfi-kowanym w wyniku krzy¿owania wstecznego (kogut nr 15).

Jak wiadomo, p³eæ mêska u ptaków jest homogame-tyczna, uwarunkowana przez dwa takie same chromo-somy ZZ, p³eæ ¿eñska jest natomiast heterogenetycz-na, uwarunkowana przez dwa ró¿ne chromosomy ZW.

a t u g o k r N _fC_eh_ni_om_tye_pr_oyz_wm_y Ch_pi_³m_cie_or_wy_yzm _chId_roe_mnt_oy_sif_ok_mac_uja_W 1 + – – 3 + – – 4 + – – 7 + – – 9 – – + 0 1 + – + 2 1 – – – 3 1 + – – 4 1 + – – 5 1 – + –

Tab. 1. Wyniki identyfikacji chimeryzmu w oparciu o ró¿ne kryteria

Tab. 2. Wyniki zap³odnienia i wylêgu uzyskane w wyniku krzy-¿owania wstecznego r N a t u g o k nLai³coz¿boanyjacjh zapP³roodcneinentia j a j z u g ê l y w t n e c o r P h c y n o ¿ o ³ a n zap³odnionych 1 30 90,0 83,3 92,6 3 28 0 0 0 4 24 62,5 58,3 93,3 7 28 100 96,4 96,4 9 20 0 0 0 0 1 18 66,7 55,6 83,3 2 1 20 70,0 70,0 100 3 1 24 83,3 83,3 100 4 1 30 13,3 0 0 5 1 20 70,0 70,0 100

Medycyna Wet. 2006, 62 (1) 87 Chimery powsta³y w wyniku iniekcji do

za-rodka biorcy (okreœlonej p³ci: ZZ lub ZW) ko-mórek BCs, pochodz¹cych od oko³o 20 loso-wo dobranych zarodków dawców. Jest wiêc oczywiste, ¿e dokonano iniekcji komórki obu genotypów p³ciowych (ZZ i ZW). W przypad-ku biorcy samicy trudno jest stwierdziæ, bez u¿ycia specjalnych metod znakowania komó-rek, które z chromosomów s¹ pochodzenia en-dogennego lub egzogennego. Odmienna sytu-acja istnieje w odniesieniu do biorcy – samca, poniewa¿ jest bezsporne, ¿e w ka¿dym przy-padku chromosom W jest wy³¹cznie pocho-dzenia egzogennego.

Wœród badanych, zdolnych do rozp³odu ko-gutów (7 szt.) stwierdzono jedn¹ chimerê p³ciow¹, co stanowi³o 14,3% w stosunku do potencjalnych chimer. Stwierdzany we wczeœ-niejszych pracach odsetek chimer p³ciowych waha³ siê w szerokim zakresie, od 0-5,8% (15), 1,9% (11), poprzez 28,9% (5), 30,0% (4), a na-wet 56,0% (9). Krzy¿owanie wsteczne umo¿-liwia identyfikacjê chimeryzmu gonad, ponad-to porównanie czêsponad-totliwoœci wylêgu piskl¹t o fenotypie dawcy i biorcy, wœród ogó³em wy-lê¿onych, pozwala na oszacowanie procentu gonad (7,1%) skolonizowanych przez komór-ki endo- i egzogenne. Powy¿szy szacunek na-le¿y jednak traktowaæ jako przybli¿ony, zwa-¿ywszy na fakt identyfikacji wœród potomstwa koguta p³ciowej chimery jedynie jednego osob-nika o fenotypie Zk. Ocena chimeryzmu ko-gutów, przeprowadzona w omawianych bada-niach w oparciu o rozk³ad trzech cech udo-wodni³a, ¿e produkcja chimer ptaków z wy-korzystaniem komórek blastodermalnych nie jest zjawiskiem incydentalnym, przeciwnie, 90% (9/10) ocenianych kogutów okaza³o siê chimerami.

W wyniku krzy¿owania wstecznego stwier-dzono niep³odnoœæ dwóch kogutów chimer, nr 2 i 9 (tab. 2). Procent zap³odnienia jaj pocho-dz¹cych od kur krytych kogutami chimerami, waha³ siê w zakresie od 13,3% (kogut nr 14) do nawet 100% (kogut nr 7). Po kogucie nr 14 nie uzyskano jednak potomstwa, poniewa¿ we wszystkich zap³odnionych przez niego jajach stwierdzono zarodki zamar³e. Procent wylêgu z jaj na³o¿onych waha³ siê od 55,6% (kogut nr 10), do 83,3% (koguty nr 1 i 13). W przy-padku trzech kogutów (nr 12, 13 i 15) uzyska-no 100% wylêgu z jaj zap³odnionych.

Œredni¹ liczbê plemników w nasieniu, oce-nion¹ w 23, 28 i 34 tygodniu ¿ycia chimer oraz

losowo wybranych kogutów Wl i Zk przedstawiono w tab. 3. Ocenie poddano 10 kogutów chimer, jednak w nasieniu trzech osobników (nr: 3, 9 i 14) nie stwier-dzono lub stwierstwier-dzono œladowe iloœci plemników,

tote¿ charakteryzuj¹c grupê Ch przedstawiono dwie wartoœci œrednie: 10Ch i 7Ch, obliczone odpowiednio dla wszystkich osobników w grupie i dla kogutów w których nasieniu identyfikowano plemniki.

Tab. 3. Liczba plemników (w tys./ml) w nasieniu badanych kogutów (–x ± s) a p u r G Obserwacja a t u g o k r N 1 2 3 Razem k Z 1 1263±293 1145±183 1155±228 1188±241 2 1243±160 1030±128 1155±219 1143±192 3 1333±232 1190 ±297 1135±190 1219±254 4 1768±215 1560±246 1895±214 1741±262 5 1505±407 1200±400 1547±288 1418±395 6 1218±191 1300±240 1377±193 1298±216 7 1173±232 1285±267 1437±269 1298±275 8 1918±200 1900±174 1310±274 1043±289 9 1400±315 1427±293 1453±319 1427±304 0 1 1393±333 1208±323 1275±308 1292±325 1 1 1238±349 1045±248 1095±236 1126±289 s ± x 1223a_{±339 1117}a_{±342 1258}a_{±306 1199}a_±334 l W 1 1550±299 1855±538 1880±581 1762±503 2 1448±335 1490±374 1485±361 1474±351 3 1907,5±497 2005±629 1933±522 1948±544 4 2518±550 2248±492 2113±493 2293±532 5 1720±336 1870±455 2015±379 1868±405 6 1248±306 1303±376 1523±319 1358±351 7 2383±581 1795±507 1623±408,9 1933±594 8 1810±401 1498±301 1968±426 1758±422 9 1695±270 2023±427 1835±271 1851±352 0 1 1568±272 1675±236 2253±454 1832±447 s ± x 1784a_{±544 1776}b_{±516 1863}b_{±484 1808}b_±516 h C 1 2365±340 2250±386 2252,5±370 2289±363 3 0 0 0 0 4 820±128 753±123 745±131 772±130 7 2720±421 2423±378 2703±414 2615±421 9 0 0 0 0 0 1 578±177 698±166 707±179 661±181 2 1 1725±272 1615±301 1993±353 1778±344 3 1 2953±561 2775±414 2315±460 2681±546 4 1 0 0 0 0 5 1 623±200 640±102 698±124 653±149 h C 0 1 s ± x 1178±1140 1115±1043 1141±1046 1145±1076 h C 7 s ± x 1683a_{±1002 1593}b_{±890 1630}c_{±875 1636}b_±923

Objaœnienia: a, b, c – œrednie oznaczone ró¿nymi literami ró¿ni¹ siê istotne w kolumnach (p < 0,05). Obserwacja: pobór nasienia w kolejnych tygod-niach ¿ycia kogutów (23., 28. i 34. tydz. ¿ycia); –x ± s 10 Ch – œrednia wszyst-kich chimer; –x ± s 7 Ch – œrednia chimer, które produkowa³y nasienie

_ _

_ _

Medycyna Wet. 2006, 62 (1) 88

Wiek kogutów, niezale¿nie od ich pochodzenia, nie mia³ istotnego wp³ywu na wartoœæ badanej cechy. Naj-mniejsz¹ œredni¹ liczbê plemników (1199 ± 334 tys./ /ml) stwierdzono w nasieniu kogutów Zk; ró¿ni³a siê ona statystycznie istotnie (p < 0,05) od uzyskanej w grupie kogutów Wl (1808 ± 516 tys./ml) i kogutów 7CH (1636 ± 923 tys./ml). Œrednia wyliczona dla wszystkich chimer (10Ch) by³a znacznie mniejsza i wynios³a 1145 ± 1076 tys. plemników w ml nasie-nia. Trzy chimery (nr 4, 10 i 15) produkowa³y nasienie o najmniejszej liczbie plemników, a dalsze trzy (nr 3, 9, 14) nie produkowa³y nasienia. Trzeba jednak za-znaczyæ, ¿e w jednym z ejakulatów od koguta nr 14 stwierdzano œladowe, na granicy policzalnoœci iloœci plemników, st¹d zapewne 13% zap³odnienie (tab. 2). Spoœród wymienionych kogutów, u dwóch (nr 9 i 10) stwierdzono obecnoœæ ¿eñskiego chromosomu W we krwi (tab. 1), mo¿na wiêc przypuszczaæ, ¿e czêœæ za-burzeñ funkcji p³ciowych i produkcji gamet mo¿e mieæ zwi¹zek z proliferacj¹ i integracj¹ komórek dawców o ¿eñskim genotypie (WZ) w organizmie kogutów – biorców komórek.

Z drugiej strony interesuj¹ce jest, ¿e wœród siedmiu kogutów Ch zdolnych do produkcji nasienia zidenty-fikowano trzy osobniki (nr 1, 7 i 13) o bardzo wyso-kiej liczbie plemników, odpowiednio 2289, 2615 i 2681 tys./ml, przy czym chimery nr 7 i 13 charakteryzowa³a najwiêksza liczba plemników spoœród wszystkich 31 ocenianych kogutów z grup Wl, Zk i Ch. Wœród kogu-tów z pozosta³ych grup jedynie jeden z grupy Wl by³ zdolny do produkcji nasienia o podobnej koncentracji plemników (2293 ± 532 tys./ml). Interpretacja tego faktu wymaga dalszych szczegó³owych badañ, mo¿na jedynie sugerowaæ, ¿e stwierdzona nadprodukcja plem-ników w nasieniu chimer mo¿e byæ efektem wzajem-nej, korzystnej interakcji komórek dawcy i biorcy o mêskim genotypie (ZZ).

Piœmiennictwo

1.Abercombie M., Hickman M., Johnson M. L., Thain M.: Dictionary of Biolo-gy. Pengium Books Ltd, London 1992.

2.Bednarczyk M.: Manipulacje komórkami embrionalnymi ptaków. Biotech-nologia 2003, 60, 36-47.

3.Bednarczyk M., £akota P., Siwek M.: Improvement of hatchability of chic-ken eggs injected by blastoderm cells. Poultry Sci. 2000, 79, 1823-1828. 4.Bednarczyk M., £akota P., S³omski R., P³awski A., Lipinski D.,

Siemienia-ko D., Lisowski M., Czekalski P., Grajewski B., D³u¿niewska P.: Reconstitu-tion of a chicken breed by inter se mating of germline chimeric birds. Poultry Sci. 2002, 81, 1347-1353.

5.Carsience R. S., Clark M. E., Gibbins V. A. M., Etches R. J.: Germline chi-meric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development 1993, 117, 669-675.

6.Ginsburg M.: Primordial germ cell development in avians. Poultry Sci. 1997, 76, 91-95.

7.Jaszczak K., Parada R., Guszkiewicz A.: Cytogenetic study of some tissues and age-related changes in cell proportions in a goat-sheep chimera. Cyt. Cell Gen. 1999, 84, 55-57.

8.Kagami H., Tagami T., Matsubara Y., Harami T., Hanada H., Maruyama K., Sakurai M., Kuwana T., Naito M.: The developmental origin of primordial germ cells and the transmission of the donor-derived gametes in mixed-sex germline chimeras to the offspring in the chicken. Mol. Reprod. Dev. 1997, 48, 501-510.

9.Kino K. B., Pain B., Leibo M., Cochrans M., Clark M. E., Etches R. J.: Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastoder-mal cells. Poultry Sci. 1997, 76, 753-760.

10.Mozdziak P. E., Petitte J. N.: Status of transgenic chicken models for deve-lopmental biology. Dev. Dynamics 2004, 229, 414-421.

11.Petitte J., Clark M. E., Liu G., Gibbins V. A. M., Etches R. J.: Production of somatic or germline chimeras in the chicken by transfer of early blastoder-mal cells. Development 1990, 108, 185-189.

12.Petitte J., Liu G., Yang Z.: Avian pluripotent stem cells. Mechanisms Dev. 2004, 121, 1159-1168.

13.Rui R., Shim H., Moyer A. L., Anderson D. L., Penedo C. T., Rowe J. D., BonDurant R. H., Anderson G. B.: Attempts to enhance production of porci-ne chimeras from germ cells and preimplantation embryos. Theriogenology 2004, 61, 1225-1235.

14.Simkiss K., Luke G., Behnam J.: Female chromosomes in cockerel ejacula-tes. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1996, 263, 1245-1249.

15.Thoraval P., Lasserre L., Coudert F., Dambrine G.: Production of germline chimeras obtained from Brown and White Leghorns by transfer of early blastodermal cells. Poultry Sci. 1994, 73, 1897-1905.

Adres autora: dr in¿. Przemys³aw Czekalski, ul. D³uga 64, 62-070 Zakrzewo