Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 450
Praca oryginalna Original paper
Wzrost infekcji grzybiczych na przestrzeni ostatnich lat powoduje znaczne zainteresowanie lekami prze-ciwgrzybiczymi stosowanymi w infekcjach skórnych. Obserwowany zarówno w Polsce, jak i na ca³ym wie-cie wyrany wzrost grzybic skórnych wymaga poszu-kiwania leków coraz bardziej skutecznych. Leki sto-sowane w terapii miejscowej oraz ogólnej charak-teryzuj¹ siê szerokim spektrum dzia³ania, wysok¹ skutecznoci¹ i du¿ym bezpieczeñstwem stosowania. Decyzja o stosowaniu leczenia doustnego u zwierz¹t powinna uwzglêdniaæ dok³adn¹ analizê procesu cho-robowego, charakter zmian oraz jego nasilenie. Istot-n¹ kwesti¹ jest mo¿liwoæ penetracji leku w g³¹b skó-ry do miejsca ogniska chorobowego. Wady i zalety wynikaj¹ce ze stosowania leków miejscowych oraz doustnych zosta³y opisane przez Degreef (4). Zalety w stosowaniu leków doustnych nie tylko u zwierz¹t dowiadczalnych wi¹¿¹ siê z rozleg³ym przenikaniem przez skórê, która jest niemal zawsze nieod³¹czn¹ prze-szkod¹ w stosowaniu leków miejscowych w przypad-ku uszkodzeñ o du¿ym nasileniu (6). Czynnikiem de-cyduj¹cym o wyborze pomiêdzy miejscowym a do-ustnym leczeniem pozostaje zawsze skutecznoæ w sto-sowaniu zaplanowanego leczenia, a to z kolei zale¿y od rodzaju u¿ytego leku oraz jego biodostêpnoci.
Celem badañ by³a ocena zmian patomorfologicznych skóry u winek morskich zaka¿onych grzybem Tricho-phyton mentagrophytes i poddanych leczeniu Itrako-nazolem (Orungal prod. Janssen Pharmaceutica N.V., Belgia).
Materia³ i metody
Dowiadczenie wykonano u 51 winek morskich o ma-sie cia³a 300-350 g. Poddano je depilacji w okolicy prawe-go podudzia. Inokulacji w grupie L (zwierzêta przeznaczo-ne do leczenia, 21 szt.) dokonano zawiesin¹ grzyba Tri-chophyton mentagrophytes var. 58 w dawce 8 × 106 ml1
(cfu) i w iloci 0,3 ml w okolicê prawego podudzia na pole o powierzchni 2 cm × 2 cm. Grupa zwierz¹t zaka¿onych oznaczona jako Z i licz¹ca 21 winek morskich obejmowa-³a zwierzêta zaka¿ane tym samym szczepem grzyba, w tej samej dawce i w identyczny sposób. Grupa kontrolna (K) zwierz¹t zdrowych obejmowa³a 9 winek morskich. Po uprzednio dokonanej depilacji w okolicy prawego podudzia wcierano roztwór p³ynu fizjologicznego w iloci 0,3 ml. Zwierzêta ze wszystkich 3 grup usypiane by³y w narkozie eterowej w odstêpach 4-dniowych.
Zwierzêtom z grupy L podawano doustnie (podjêzyko-wo) lek azolowy Itrakonazol (Orungal prod. Janssen Phar-maceutica N.V., Belgia) w dawce 1,5 mg/kg masy cia³a,
Ocena zmian patomorfologicznych skóry
winek morskich leczonych itrakonazolem
po zaka¿eniu grzybem Trichophyton mentagrophytes
JACEK PIÓRKOWSKI
Katedra Anatomii Patologicznej Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej AR, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
Piórkowski J.
Estimation of pathomorphological skin changes in guinea pigs after itraconazole treatment during infection with Trichophyton mentagrophytes
Summary
The aim of the research was to investigate the possibility of using oral medicines for the treatment of animals with skin mycoses. The administration of oral azole antifungal Itraconazole was conducted on guinea pigs. In the light microscopy investigation during treatment of guinea pigs with Itraconazole, mycelium were not observed 4 days after the time of the administration of the drug, both in the stratum corneum of the epidermis and in hair sheaths. Neither was mycelium confirmed in the subcutaneous layer. Only parakeratose, hyperkeratose was observed, as well as a small degree of akantose. The investigation with the use scanning microscope made it possible to additionally affirm the presence on the top of scraps of spherical forms the accumulations of drops of fat which is characteristic for azole antifungals. The administration of oral azole antifungal causes the rapid regression of pathological changes in the deep layers of the skin. Therapy of this type can be useful in veterinary medicine.
Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 451 tzn. w iloci oko³o 0,5 mg na jedn¹ winkê morsk¹. Lek
podawano raz dziennie trzeciego dnia od momentu zaka¿e-nia i terapiê prowadzono przez okres kolejnych 14 dni.
Do badañ w mikroskopie wietlnym i skaningowym po-bierano wycinki skóry o wymiarach 2 cm × 2 cm. Z mate-ria³u utrwalonego w 10% obojêtnym formolu sporz¹dzono skrawki metod¹ parafinow¹, z których wykonywano pre-paraty mikroskopowe. Dla oceny morfologicznej pobrane-go materia³u w mikroskopie wietlnym skrawki barwiono hematoksylin¹ i eozyn¹ oraz metod¹ PAS wg Mc Manusa, co pozwoli³o na okrelenie obecnoci grzyba w tkance. Wykonano równie¿ barwienie orcein¹ celem okrelenia stopnia dzia³alnoci elastolitycznej grzyba i ewentualnej penetracji w g³¹b tkanki. Preparaty przeznaczone do badañ w mikroskopie skaningowym utrwalane by³y w 4% alde-hydzie glutarowym o pH 7,4 w buforze fosforanowym przez 48 h w temp. 22°C. Materia³ nastêpnie odwadniano w ró¿-nych seriach stê¿eñ acetonu, a w koñcowej fazie w aceto-nie 100%. Preparaty poddano napyleniu warstw¹ z³ota. Ogl¹danie przeprowadzono przy u¿yciu mikroskopu ska-ningowego Tesla BS-300.
Wyniki i omówienie
W grupie kontrolnej winek morskich w prepara-tach histologicznych ze skóry stwierdzono obecnoæ naskórka o prawid³owej gruboci i strukturze z mier-nymi oznakami rogowacenia (ryc. 1). W barwieniu orcein¹ wykazano sieciowy uk³ad ciemnobrunatnych w³ókien elastycznych, które by³y wyranie zagêszczone w warstwie podnaskórkowej i uleg³y rozrzedzeniu w kierunku g³êbszych warstw skóry i tkanki podskór-nej (ryc. 2).
W grupie zwierz¹t zaka¿onych (Z) stwierdzono na-tomiast wyrane nasilenie zmian histopatologicznych w postaci hyperkeratozy, parakeratozy i akantozy na-skórka oraz obecnoæ strzêpek grzybni szczególnie w 7., 11. i 15. dniu od momentu inokulacji. Zaobser-wowano równie¿ obecnoæ wynaczynieñ podnaskór-kowych, nacieków z³o¿onych monocytów, limfocytów, komórek plazmatycznych, makrofagów oraz neutrofi-li tworz¹cych mikroropnie oraz zropienia cebulek i po-chewek w³osa.
Ryc. 1. Prawid³owa budowa skóry (grupa kontrolna). Barw.
HE. Pow. 100 × Ryc. 2. Zagêszczenie w³ókien elastycznych w warstwie pod-naskórkowej. Barw. orcein¹. Pow. 100 ×
Ryc. 3. Grzybnia w powierzchownej warstwie zrogowacia³e-go naskórka w 3. dniu po zaka¿eniu. Strza³k¹ zaznaczono obecnoæ grzybni. Barw. PAS. Pow. 200 ×
Ryc. 4. Hyperkeratoza komórek naskórka w 3. dniu po zaka-¿eniu. Barw. HE. Pow. 100 ×
Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 452
W grupie zwierz¹t leczonych (L) oceny preparatów histologicznych dokonano w analogicznych okresach jak w grupie poprzedniej. W 3. dniu po zaka¿eniu stwierdzono obecnoæ grzyba penetruj¹cego do po-wierzchownych warstw zrogowacia³ego naskórka (ryc. 3). Zmiany histopatologiczne ogranicza³y siê tyl-ko do naskórka i wyra¿a³y siê nadmiernym rogowace-niem, parakeratoz¹ oraz nieznaczn¹ akantoz¹ (ryc. 4). W komórkach naskórka widoczne by³y oznaki prote-olizy w postaci zwyrodnienia wodniczkowego. W skó-rze w³aciwej brak by³o zmian przy obecnoci prawi-d³owych w³osów i pochewek w³osowych. Stwierdzo-no równie¿ brak zmian w tkance podskórnej. W 7., 11. oraz 15. dniu od momentu zaka¿enia nie stwier-dzono obecnoci grzyba, natomiast zmiany histopato-logiczne w naskórku podobne by³y do zmian w 3. dniu obserwacji i utrzymywa³y siê do 11. dnia obserwacji pocz¹wszy od momentu zaka¿enia. W skórze w³aci-wej i tkance podskórnej nie stwierdzono zmian. W³o-sy i pochewki w³osowe by³y nie uszkodzone. Pocz¹w-szy od 15. dnia do 27. dnia od momentu zaka¿enia nie obserwowano w skórze grzyba, a budowa histologicz-na histologicz-naskórka, skóry w³aciwej i tkanki podskórnej by³a prawid³owa.
W preparatach ocenianych w mikroskopie skanin-gowym stwierdzono w obrêbie wierzcho³ków grzybni obecnoæ nieregularnych kulistych form gromadz¹cych krople t³uszczu (ryc. 5).
Du¿¹ skutecznoci¹ w zwalczaniu dermatofitoz cha-rakteryzuj¹ siê pochodne azolowe trzech generacji. Pierwsz¹ z nich stanowi¹: ekonazol, mikonazol, klo-trimazol, isokonazol; drug¹ stanowi¹: tiokonazol, oxi-conazol, bifonazol, ketokonazol. Do trzeciej genera-cji zalicza siê: flukonazol, terakonazol oraz itrakona-zol. Wszystkie te preparaty posiadaj¹ du¿¹ aktywnoæ miejscow¹ oraz charakteryzuj¹ siê szerokim zakresem dzia³ania ogólnego. Obecnie najwiêksz¹ popularnoci¹ ciesz¹ siê w leczeniu ogólnym pochodne trzeciej ge-neracji. Dzia³anie ich polega na hamowaniu aktyw-noci C14-alfa-demetylazy, enzymu zale¿nego od cy-tochromu P-450, odpowiedzialnego za konwersjê lanosterolu do ergosterolu, zaliczanego do g³ównego sterolu wiêkszoci b³on komórkowych grzybów, co prowadzi do zmiany struktury ciany komórki grzyba i czyni j¹ wra¿liw¹ na uszkodzenia (3, 5, 7).
Stosowanie leków przeciwgrzybiczych per os sta-nowi du¿y postêp w leczeniu g³êbokich i szeroko roz-powszechnionych grzybic skórnych, jednak¿e w przy-padku grzybic powierzchownych zmiany histopatolo-giczne dotycz¹ g³ównie powierzchownych warstw naskórka. Czynnikiem decyduj¹cym o wyborze lecze-nia jest sposób umiejscowielecze-nia grzybni, gdzie grzyb-nia wystêpuje w warstwie powierzchownej lub te¿ umiejscowienie g³êbsze, obejmuj¹ce trzon oraz po-chewkê w³osa (12). W przypadku braku dostêpu leku do g³êbszych warstw skóry rozwijaj¹ca siê tam grzyb-nia stanowi pewnego rodzaju rezerwuar, z którego dokonuje siê namna¿anie do warstwy rogowej i st¹d,
miêdzy innymi, wynika czêsto nieustaj¹ca infekcja. Efektywnoæ itrakonazolu w leczeniu grzybic dowiad-czalnych, lecz z pominiêciem obserwacji zmian struk-turalnych stwierdzili te¿ inni autorzy (11, 14, 16-18). W leczeniu grzybic u ludzi szczególn¹ uwagê zwraca siê na stosowanie itrakonazolu w tzw. terapii pulso-wej (10). Badania w³asne wskazuj¹ na likwidacjê grzybni w tkance pocz¹wszy od 4. dnia od momentu zastosowania leku oraz na brak uszkodzeñ wczeniej powodowanych przez grzyb. Wczeniejsze obserwa-cje dokonane przez innych autorów potwierdzaj¹ rów-nie¿ ten fakt i wskazuj¹ na obecnoæ zmian w obrêbie ciany komórkowej grzybni ju¿ po 1 dniu od momen-tu zastosowania leków azolowych (2). Istotnym spo-strze¿eniem mo¿e byæ fakt wskazuj¹cy, ¿e doustne podawanie leków powoduje zahamowanie inwazyj-noci grzyba do wnêtrza struktury w³osa. Podobne od-dzia³ywanie na grzybniê mia³o miejsce w odniesieniu do kandidiozy pochwy (8). Katz (9) wskazuje, ¿e itra-konazol oraz ketoitra-konazol wymagaj¹ kwanego ro-dowiska dla optymalnego wch³aniania, a wywo³ana innymi lekami redukcja odczynu pH ¿o³¹dka mo¿e spowodowaæ zmniejszenie biodostêpnoci itrakonazo-lu. Rashid i wsp. (15) obserwowali wp³yw terbinafiny na Trichophyton mentagrophytes w dowiadczeniu przeprowadzonym na ¿ywym modelu skóry cz³owie-ka. Za pomoc¹ mikroskopu skaningowego wykazali oni adherencjê artrokonidiów do keratynocytów oraz w³ókien kolagenowych. Po 2 dniach od zaka¿enia nie-które artrokonidia zaczyna³y kie³kowaæ, a po 6 dniach
Ryc. 5. Strzêpek grzybni z kulist¹ form¹ gromadz¹c¹ krople t³uszczu. Mikroskop skaningowy. Pow. 3100 ×
Medycyna Wet. 2008, 64 (4A) 453 obserwowano obfity wzrost grzybni, której strzêpki
wnika³y w szczeliny i pory na powierzchni naskórka oraz w obrêbie zrêbu kolagenowego. Dodatek do pod-³o¿a terbinafiny w iloci 0,1 mg/l spowodowa³ rozsze-rzenie i zniekszta³cenie strzêpków, które robi³y wra-¿enie pustych. Zauwa¿yli oni tak¿e przerwy w ci¹g³o-ci strzêpków. Obraz podobny zaobserwowano w ba-daniach w³asnych, gdzie zastosowanie itrakonazolu per os doprowadzi³o do deformacji strzêpków i powiêk-szenia ich objêtoci w wyniku gromadzenia kropli t³uszczu, co potwierdzono w mikroskopie skaningo-wym. Podczas stosowania leku nie stwierdzono wzros-tu gruboci naskórka, szczególnie pod koniec okresu leczenia, co mo¿e wskazywaæ na brak procesu zapal-nego. W lecznictwie weterynaryjnym najczêciej sto-sowane s¹ preparaty miejscowe. Nale¿y jednak zwró-ciæ uwagê na fakt, ¿e leczenie miejscowe powoduje uszkodzenie wy³¹cznie grzybów obecnych w warstwie rogowej, pozostawiaj¹c grzybniê nieuszkodzon¹ w ob-rêbie korzenia w³osa. Miejscowe stosowanie leków nie chroni w³osów przed inwazj¹ grzybów w szczególno-ci do trzonu w³osa. Preparaty stosowane miejscowo nie wnikaj¹ do g³êbszych warstw, co mo¿e wynikaæ z nieodpowiedniej ich biodostêpnoci. Przyczyn¹ tego mo¿e byæ biodegradacja du¿ych iloci lipidów oraz protein. Zwraca siê tak¿e uwagê na obecnoæ surowi-cy, która mo¿e wywieraæ dzia³anie hamuj¹ce na leki lipofilne imidazolowe dzia³aj¹ce miejscowo miko-nazol i clotrimazol (1).
Dobra kinetyka itrakonazolu wi¹¿¹ca siê z dostêp-noci¹ i gromadzeniem siê jego w ró¿nych miejscach w skórze oraz w naskórku jest czynnikiem odpowia-daj¹cym za eliminacjê grzyba z g³êbszych warstw skóry (13). Poddaj¹c ocenie leki dzia³aj¹ce miejscowo czy te¿ ogólnie nale¿y braæ pod uwagê nie tylko zalecane schematy postêpowania odnonie do czasu leczenia oraz dawkowania, lecz tak¿e si³ê dzia³ania leku, co mo¿e wynikaæ z mo¿liwoci penetracji jego i groma-dzenia siê w warstwach po³o¿onych g³êbiej (biodostêp-noæ). Pewn¹ pomoc¹ mog¹ s³u¿yæ badania radiogra-ficzne oraz chemiczne leczonej tkanki, co pozwala zebraæ informacjê na temat rozmieszczenia leku.
Pimiennictwo
1.Borgers M.: Ultrastructural correlates of antifungal therapy, [w:] Mc Ginnis M. R. (wyd.): Current Topics in Medical Mycology. T. 2. Springer-Verlag, New York 1988, 1, 18-23.
2.Borgers M., Xhonneux B., Van Cutsem J.: Oral itraconazole versus topical bifonazole treatment in experimental dermatophytosis. Mycoses 1993, 36, 105-109.
3.Como I. A., Dismulees W. E.: Oral azole as systemic antifungal therapy. N. Eng. J. Med. 1994, 263, 330-336.
4.Degreef H.: The treatment of superficial skin infections caused by dermato-phytes, [w:] Borgers M., Hay R., Rinaldi M. G. (wyd.): Current Topics in Medical Mycology. T. 4. Springer-Verlag, New York 1992, s. 189. 5.Georgopapadakou N. H., Walsh T. I.: Humans mycoses: drugs and targets
for emerging pathogenes. Science 1994, 264, 371-376.
6.Gupta A. K., Nolting S., de Prost Y., Delescluse J., Degreef H., Theissen U., Wallace R., Marynissen G., De Doncker P.: The use of itraconazole to treat cutaneous fungal infections in children. Dermatology 1999, 199, 248-252. 7.Gupta A. K., Sauder D. N., Shear N. H.: Antifungal agents: an overviev.
Part I. J. Am. Acad. Dermatol. 1994, 30, 677-682.
8.Jansen T., Van de Ven M., Borgers M., Odds F., Van Cutsem J.: Fungal morphology after treatment with itraconazole as a single oral dose in experi-mental vaginal candidosis in rats. Am. J. Obstet. Gynecol. 1991, 165, 1552--1557.
9.Katz H. J.: Interakcje leków w dermatologii. Mat. Symp. Satelit. XIX wiat. Kongresu Dermatologicznego, Hamilton, Islandia 1977, s. 94.
10.Moran Maese D., Tarango-Martinez V. M., Gonzalez Trevino L. A., Mayorga J.: Tinea capitis in an adult. Case report. Rev. Iberoam. Micol. 2005, 22, 54-56.
11.Nagino K., Shimohira H., Ogawa M., Uchida K., Yamaguchi H.: Compari-son of the therapeutic efficacy of oral doses of fluconazole and itraconazole in a guinea pig model of dermatophytosis. J. Inf. Chem. 2000, 6, 41-44. 12.Okuda C., Ito M., Sato Y.: Fungus invasion into human hair tissue in black
dot ringworm: light and electron microscopic study. J. Invest. Dermatol. 1988, 90, 729-736.
13.Pierard G. E., Awese J. E., De Doncher P.: Antifungal activity of itracona-zole and terbinafine in human stratum corneum: a comparative study. J. Am. Acad. Dermatol. 1995, 32, 429-436.
14.Plempel M., Regel E., Büchel K. H.: Antimycotic efficacy of bifonazole in vitro and in vivo. Drug Res. 1983, 33, 517-523.
15.Rashid A., Edward M., Richardson M. D.: Aktywnoæ terbinafiny wobec Trichophyton mentagrophytes badana na ¿ywym modelu skóry cz³owieka. Mikol. Lek. 1996, 3 (1), 59-60.
16.Van Cutsem J.: Oral and parenteral treatment with itraconazole in various superficial and systemic experimental fungal infections. Comparisons with other antifungals and combination therapy. Br. J. Clin. Pract. 1990, 44 (Suppl. 71), 32-39.
17.Van Cutsem J., Van Gerven F., Jansen P. A. J.: Activity of orally, topically and parenterally administered itraconazole in the treatment of superficial and deep mycoses. Animals models. Rev. Infect. Dis. 1987, 9 (Suppl. 1), 15-22. 18.Yamaguchi H., Uchida K.: In vivo activity of bifonazole in quinea pigs: its characteristic features and comparison with clotrimazole. Dermatologica 1984, 169 (Suppl. 1), 33-40.
Adres autora: dr Jacek Piórkowski, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin; e-mail: jacpol@hortus.ar.lublin.pl
