Hodowla i genetyka
O
O
O
C
C
C
E
E
E
N
N
N
Y
Y
Y
C
C
C
Y
Y
Y
T
T
T
O
O
O
LL
L
O
O
O
G
G
G
II
I
C
C
C
Z
Z
Z
N
N
N
E
E
E
S
S
S
T
T
T
O
O
O
S
S
S
O
O
O
W
W
W
A
A
A
N
N
N
E
E
E
W
W
W
P
P
P
R
R
R
A
A
A
C
C
C
A
A
A
C
C
C
H
H
H
H
H
H
O
O
O
D
D
D
O
O
O
W
W
W
LL
L
A
A
A
N
N
N
O
O
O
--
-
---
G
G
G
E
E
E
N
N
N
E
E
E
T
T
T
Y
Y
Y
C
C
C
Z
Z
Z
N
N
N
Y
Y
Y
C
C
C
H
H
H
N
N
N
A
A
A
D
D
D
Z
Z
Z
II
I
E
E
E
M
M
M
N
N
N
II
I
A
A
A
K
K
K
II
I
E
E
E
M
M
M
mgr Iwona Wasilewicz-Flis
IHAR – PIB, Zakład Genetyki i Materiałów Wyjściowych Ziemniaka w Młochowie ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów, e-mail: i.wasilewicz-flis@ihar.edu.pl
ceny cytologiczne wykorzystywane w pracach hodowlano-genetycznych nad ziemniakiem są technikami po-mocniczymi. Należy do nich określanie płod-ności pyłku oraz poziomu ploidalpłod-ności, a także – w wypadku ziemniaków diploidal-nych – zdolności tworzenia gamet o niezre-dukowanej liczbie chromosomów. Wymie-nione techniki usprawniają i ułatwiają skom-plikowany cykl hodowlany ziemniaka. Zosta-ły one opracowane głównie w latach 60. i 70. ubiegłego wieku i do dziś są stosowane z niewielkimi modyfikacjami.
Ocena płodności pyłku
Płodność pyłku można określać na podsta-wie kiełkowania jego ziaren na pożywce oraz na podstawie wybarwiania się ziaren na pre-paratach mikroskopowych. W pierwszej me-todzie, bardziej bezpośredniej, obserwuje się kiełkowanie ziaren pyłku na pożywce. Pyłek kiełkujący przynajmniej w 2% jest uważany za funkcjonalny (Martenson i in. 1964), jed-nak procent kiełkujących ziaren w dużym stopniu zależy od składu pożywki (King, Johnston 1958).
W pracach hodowlanych i genetycznych formy ojcowskie do programu krzyżowań są typowane na podstawie procentowego udziału wybarwionych ziaren pyłku na prepa-ratach mikroskopowych. W tym celu, ze względu na duży wpływ czynników środowi-ska oraz genotypu na proces mejozy, pyłek zbiera się z kilku dojrzałych kwiatów z róż-nych roślin badanego klonu i ocenę powta-rza w następnym sezonie. Preparat
mikro-skopowy powstaje przez zabarwienie pyłku kwaśną laktofuksyną. Przy powiększeniu 200x, w kilku polach widzenia, wśród 100- -200 ziaren określa się procentowy udział wybarwionych na kolor ciemnoróżowy, nie-zdeformowanych ziaren pyłku (fot. 1).
Fot. 1. Ziarna pyłku ziemniaka diploidalnego; widoczne duże ziarna (2n), ziarna haploidalne (n)
i pyłek niepłodny (niewybarwiony)
Pyłek wybarwiony przynajmniej w 30% jest płodny i może być efektywnym zapyla-czem w programie krzyżowań (Abdalla 1970; Janssen, Hermsen 1976). Jest to pośrednia, ale prosta i szybka metoda określania płod-ności pyłku genotypów wytypowanych do krzyżowań, która zapewnia zastosowanie płodnych form ojcowskich.
Wynik krzyżowania zależy również od formy matecznej oraz barier między krzyżo-wanymi formami. W latach 70. i na początku lat 80. ubiegłego stulecia w oddziale Instytu-tu Ziemniaka w Młochowie (obecnie oddział
IHAR) oznaczano w celach badawczych zgodność między krzyżowanymi genotypami diploidalnymi na podstawie kiełkowania ła-giewek na znamieniu słupka i przerastania ich przez szyjkę do zalążni. Obserwacje wy-konywano w mikroskopie fluorescencyjnym na preparatach gniecionych barwionych błę-kitem anilinowym.
W materiałach wywodzących się z Mło-chowa występują głównie dwa typy sterylno-ści. Pierwszy, spotykany w genotypach di-ploidalnych (2x) i tetradi-ploidalnych (4x), to niewybarwiające się nierozwinięte i nieży-wotne ziarna pyłku. W ziemniaku tetraploi-dalnym występuje również sterylność tetra-dowa, polegająca na tym, że cztery ziarna pyłku, powstałe podczas mejozy, są ze sobą sklejone i mimo wybarwienia nie są zdolne do zapylenia.
Ocena zdolności do tworzenia gamet o niezredukowanej liczbie chromosomów w ziemniaku diploidalnym
W ziemniaku diploidalnym męska płodność jest ważną cechą braną pod uwagę w czasie selekcjonowania klonów. Inną ważną cechą cytologiczną ziemniaka 2x jest zdolność do tworzenia męskich gamet o niezredukowanej liczbie chromosomów (gamety 2n). Gamety tego typu są wykorzystywane do przenosze-nia na poziom tetraploidalny genetycznego potencjału diploidalnych form ojcowskich w krzyżowaniach interploidalnych typu 4x x 2x. Wstępną oceną zdolności do tworzenia mę-skich gamet 2n jest mikroskopowa obserwa-cja wielkości ziaren pyłku przy okazji okre-ślania płodności pyłku. Średnica typowych dla diploidów ziaren pyłku waha się od 18 do 23 µm, co wskazuje na prawidłowy przebieg mejozy i wytworzenie gamet haploidalnych (n) o zredukowanej liczbie chromosomów. Obecność dużych ziaren pyłku, o średnicy powyżej 25 µm, wskazuje, że badany klon może tworzyć męskie gamety 2n (Quinn i in. 1974) (fot. 1). Na preparacie barwionym kwaśną laktofuksyną określa się procentowy udział dużych ziaren pyłku wśród 200 płod-nych ziaren. Jacobsen (1980) uważa, że klony diploidalne powinny wytwarzać mini-mum 1-5% dużych ziaren, aby być skutecz-nymi zapylaczami w krzyżowaniach interplo-idalnych. Zaburzenia obserwowane przed, w czasie oraz po mejozie, takie jak diady,
tria-dy, zlane lub równoległe wrzeciona karioki-netyczne, zaburzenia cytokinezy, potwier-dzają wstępną ocenę zdolności do tworzenia gamet 2n oraz określają typ gamet (Veilleux 1985).
Obserwacje przebiegu powstawania zia-ren pyłku (mikrosporogenezy) prowadzi się na preparatach gniecionych pylników, bar-wionych karminem, pod powiększeniem 1000x. Przygotowanie materiału roślinnego do obserwacji nie jest skomplikowane. Z badanego genotypu zbiera się młode pączki kwiatowe, a wyizolowane z nich pylniki utrwala w utrwalaczu Carnoya. Po przemyciu pylników w 30-proc. alkoholu etylowym moż-na je przechowywać w 70-proc. etanolu przez kilka miesięcy. Preparaty wykonuje się na bieżąco przed obserwacją mikroskopową. U ziemniaka występują głównie dwa typy gamet 2n – FDR i SDR. Gamety typu FDR (First Division Restitution) powstają na sku-tek zlania lub równoległego ułożenia wrze-cion kariokinetycznych w anafazie II, nato-miast gamety typu SDR (Second Division Restitution) powstają przy zaburzeniach cy-tokinezy (Mok, Peloquin 1975). Najczęściej diploidalne klony wytwarzają równocześnie oba typy gamet (Wagenvoort, Zimnoch-Gu-zowska 1991). Szczególnie cenne dla ho-dowli są gamety typu FDR, ponieważ mogą posiadać rodzicielskie genomy w stanie nie-zmienionym.
Funkcjonalność męskich gamet 2n testuje się w krzyżowaniach interploidalnych 4x x 2x, oceniając wiązanie nasion na jedną ja-godę oraz procent tetraploidalnych form w potomstwie. Jako wyznacznik dobrego dzia-łania gamet 2n przyjmuje się minimum 10 nasion na jedną jagodę. W potomstwie z krzyżowań typu 4x x 2x, gdy zapylacz tworzy funkcjonalne gamety 2n, występuje ok. 85% form tetraploidalnych, ok. 10% diploidów oraz, dzięki silnie działającemu u ziemniaka blokowi triploidalnemu, zaledwie kilka pro-cent triploidów.
W diploidalnych klonach występuje rów-nież zdolność do tworzenia żeńskich gamet 2n. Jednak ocena tej cechy jest trudniejsza i bardziej pracochłonna w stosunku do okre-ślania zdolności formowania męskich gamet 2n. Powstawanie żeńskich gamet 2n wstęp-nie ocenia się na mikroskopowych prepara-tach półtrwałych, a ich funkcjonalność w
programach krzyżowań interploidalnych typu 2x x 4x (Jongedijk 1985).
Zdolność do tworzenia gamet 2n jest zja-wiskiem powszechnym w świecie roślin, również u ziemniaka. Liczne gatunki ziem-niaka diploidalnego zostały opisane jako zdolne do tworzenia gamet 2n (Den Nijs, Peloquin 1977; Leue, Peloquin 1980; Nar-kiewicz 1986). W grupie męskopłodnych diploidalnych mieszańców otrzymanych w Młochowie ok. 49% klonów posiada zdol-ność do tworzenia męskich gamet 2n (Strzelczyk-Żyta i in. 1997). Natomiast zdol-ność do tworzenia żeńskich gamet 2n wyka-zują nieliczne formy z tej grupy.
Ocenę cech związanych z procesem me-jozy, na który duży wpływ mają warunki śro-dowiskowe oraz cechy fizjologiczne rośliny, należy wykonywać przynajmniej dwukrotnie.
Określanie poziomu ploidalności ziemniaka
Poziom ploidalności jest określany dla geno-typów tetraploidalnych pochodzących z pro-gramów hodowlanych w przypadkach wąt-pliwych. Natomiast w pracach z formami diploidalnymi jest to ocena rutynowa. Ko-nieczne jest kontrolowanie poziomu ploidal-ności roślin genotypów otrzymywanych z krzyżowań interploidalnych mających na celu zarówno haploidyzację, jak i tetraploidyzację materiału. Ze względu na powszechne wy-stępowanie gamet 2n w ziemniaku diploidal-nym w przypadkach wątpliwych należy
sprawdzić poziom ploidalności genotypów uzyskiwanych z krzyżowań na poziomie di-ploidalnym. W krzyżowaniach interploidal-nych (4x - 2x) i intraploidalinterploidal-nych (2x - 2x) po-wstaje potomstwo tetraploidalne, diploidalne oraz w niewielkim procencie triploidalne.
Poziom ploidalności można określać me-todami pośrednimi lub bezpośrednio. Do metod pośrednich należy liczenie chloropla-stów w komórkach przyszparkowych aparatu szparkowego (Rothacker i in. 1966, Jaku-czun i in. 1997) oraz oznaczanie zawartości jądrowego DNA za pomocą cytometru prze-pływowego (Arumuganathan, Earle 1991; Jakuczun i in. 1997). Metoda bezpośrednia polega na liczeniu chromosomów metafazo-wych w wierzchołkach wzrostu korzeni (Schreiter 1988).
Określanie poziomu ploidalności przez li-czenie chloroplastów w komórkach przy-szparkowych jest metodą powszechnie sto-sowaną w pracach nad ziemniakiem, rów-nież w oddziale IHAR – PIB w Młochowie. W celu policzenia chloroplastów wykonuje się preparat mikroskopowy ze skórki pobranej ze spodniej strony blaszki liściowej. Skrobia w chloroplastach jest barwiona płynem Lugo-la (jod w jodku potasu) na ciemnobrązowy kolor, a chloroplasty liczone pod powiększe-niem 1000x. Średnią liczbę chloroplastów badanego genotypu określa się na podsta-wie liczby chloroplastów z 10 aparatów szparkowych (fot. 2).
Fot. 2. Chloroplasty w komórkach przyszparkowych ziemniaka diploidalnego (a) i tetraploidalnego
Według Rothackera i innych (1966) śred-nia liczba chloroplastów w aparacie szparko-wym w dihaploidach wynosiła 11,2 (zakres 7,5-14,0), w triploidach 14,4 (zakres 10,7- -19,0) i w tetraploidach 19,7 (zakres 16,0- -25,7). W badaniach Jakuczun i innych (1997) średnia liczba chloroplastów u mię-dzygatunkowych mieszańców diploidalnych wynosiła 13,0 (zakres 10,7-15,1), u triploi-dalnych 17,5 (zakres 16,5-18,1) i u tetraploi-dów 21,0 (zakres 18,3-23,5). Metoda ta jest wystarczająca do masowych ocen, chociaż jest obarczona błędem wynikającym z wpły-wu różnych czynników na liczbę chloropla-stów w obrębie poszczególnych poziomów ploidalności (Jakuczun i in. 1997). Poza tym zakresy poszczególnych poziomów ploidal-ności częściowo pokrywają się. Średnia licz-ba chloroplastów w aparacie szparkowym waha się w zależności od badanego materia-łu oraz środowiska, w jakim są prowadzone rośliny. W niektórych przypadkach trudno policzyć chloroplasty na preparacie, ponie-waż skrobia jest słabo wybarwiona lub roz-proszona w komórce.
Cytometria przepływowa, druga metoda pośrednia, uważana jest za szybką i dokład-ną metodę oznaczania zawartości jądrowego DNA, która jest miernikiem poziomu ploidal-ności. Metoda ta wymaga jednak kosztow-nego sprzętu i odczynników oraz właściwego dobrania wzorców. Jest to metoda wykorzy-stywana głównie w badaniach naukowych.
W wybranych przypadkach stosuje się bezpośrednią metodę określania poziomu ploidalności, czyli liczenie chromosomów w mitozie, w stadium metafazy w wierzchoł-kach wzrostu korzeni. Jest to metoda naj-pewniej określająca poziom ploidalności ro-śliny, jednak nie jest stosowana w maso-wych ocenach, ponieważ jest trudna i praco-chłonna. Obserwacja mitozy u ziemniaka jest utrudniona ze względu na drobne chromo-somy oraz krótko trwające stadium metafa-zy. Wierzchołki wzrostu korzonków pobiera się z 3-4-tygodniowych roślin. Chromosomy mitotyczne należy poddać procesowi skró-cenia, stosując 8-hydroksychinolinę, kolchi-cynę lub niską temperaturę (ok. 3-5oC).
Ko-rzonki utrwala się w utrwalaczu Carnoya, przemywa w alkoholu etylowym i przechowu-je w 70-proc. etanolu. W celu wybarwienia chromosomów korzonki umieszcza się w
acetokarminie i sporządza preparat gniecio-ny. Chromosomy są liczone na płytce meta-fazowej widzianej z góry, przy dobrym roz-proszeniu chromosomów. Odczytu dokonuje się z pięciu komórek ocenianego genotypu, pod powiększeniem ok. 1000x.
Materiał do badań cytologicznych należy zbierać z roślin ziemniaka ok. godz. 10, po-nieważ wtedy następują intensywne podziały mejotyczne i mitotyczne, a skrobia jest skon-centrowana w chloroplastach. Rośliny po-winny być dobrze podlane i naświetlone.
Literatura
1. Abdalla M. M. F. 1970. Inbreeding, heterosis,
ferti-lity, plasmon differentiation and Phytophthora re-sistance in Solanum verrucosum Schlechtd. and some interspecific crosses in Solanum. – Agr. Res. Rep. Wageningen 748: 213; 2. Arumuganathan K., Earle
E. D. 1991. Estimation of nuclear DNA content of
plants by flow cytometry. – Mol. Biol. Rep. 9: 229-241;
3. Den Nijs T. P. M., Peloquin S. J. 1977. 2n gametes
in potato species and their function in sexual polyploi-dization. – Euphytica 26: 585-600; 4. Jacobsen E.
1980. Increase of diplandroid formation and seed set in 4x x 2x-crosses in potatoes by genetical manipulation
of dihaploids and some theoretical consequences. – Z. Pflanzenzüchtg 85: 110-121; 5. Jakuczun H.,
Strzel-czyk-Żyta D., Narkiewicz M. 1997. Zastosowanie
pośrednich metod oznaczania poziomu ploidalności ziemniaka. – Biul. Inst. Ziemn. 48/I: 91-98; 6. Janssen
A. W. B., Hermsen J. G. T. 1976. Estimating pollen
fertility in Solanum species and haploids. – Euphytica 25: 577-586; 7. Jongedijk E. 1985. The pattern of megasporogenesis and megagametogenesis in diploid
Solanum species hybrids: its relevance to the origin of 2n eggs and the induction of apomixis. – Euphytica 34: 599-611; 8. King J. R., Johnston T. M. 1958. Factors affecting Irish potato pollen germination in an artificial environment. – Am. Potato J. 35: 689-700; 9. Leue E.
F., Peloquin S. J. 1980. Selection for 2n gametes and
tuberization in Solanum chacoense. – Am. Potato J. 57: 189-195; 10. Mok D. W. S., Peloquin S. J. 1975. Three mechanisms of 2n pollen formation in dihaploid potatoes. – Can. J. Genet. 17: 217-225; 11.
Morten-son L. R., Peloquin S. J., Hougas R. W. 1964.
Ger-mination of Solanum pollen on artificial media. – Am. Potato J. 41: 322-328; 12. Narkiewicz M. 1986. Ocena wybranych diploidalnych klonów ziemniaka pod wzglę-dem zdolności wytwarzania męskich gamet niezredu-kowanych. – Hod. Rośl. 30(5/6): 1-9; 13. Quinn A. A.,
Mok D. W. S., Peloquin S. J. 1974. Distribution and
Sola-nums. – Am. Potato J. 51: 16-21; 14. Rothacker D.,
Schreiter J., Junges W. 1966. Untersuchungen zur
Erzeugung und Auslese dihaploider Sämlinge bei
Solanum tuberosum L. – Eur. Potato J. 9: 99-110; 15. Schreiter J. 1988. Variabilität der Chromosomen-zahl in den sproßbürtigenWurzeln der Kartoffel
Sola-num tuberosum L. 2n = 4x = 48. – Arch. Züchtungs-forsch. 18: 169-174; 16. Strzelczyk-Żyta D.,
Jaku-czun H., Zimnoch-Guzowska E. 1997. Zdolność do tworzenia męskich gamet 2n w diploidalnych klonach
ziemniaka z programu syntezy diploidalnych form
rodzicielskich. – Biul. Inst. Ziemn. 48/I: 99-105;
17. Veilleux R. E. 1985. Diploid and polyploid gametes
in crop plants: mechanisms of formation and utilization in plant breeding. – Plant Breed. Rev. 3: 253-288;
18. Wagenvoort M., Zimnoch-Guzowska E. 1991.
Gene centromere mapping in potato by half-tetrad analysis: map distances of H1, Rx and Ry and their possible use for ascertaining the mode of 2n-pollen formation. – Genome 35: 1-7