Interakcje między neurotoksynami na poziomie układu nerwowego owadów

Interakcje między neurotoksynami na poziomie układu

nerw ow ego owadów

M aria S tan kiew icz 1, Justyna Ciotek Françoise G rolleau 2,

Ewa Kielbasiewicz Wojciech Kądziela M arcel Pelhate 2, Vincent Corbel \ Bruno L a p ie d 2

'Zakład Biofizyki, Instytut Biologii Ogólnej i M olekularnej UMK, Toruń; “Laboratoire Récepteurs et Canaux Ioniques M em branaires (RCIM), UPRES EA

2647, Université d ’Angers, UFR Sciences, Angers, France;

l a b o r a t o ir e de Lutte contre les Insectes Nuisibles, Institut de R echerche pour le Développement, M ontpellier, France

Streszczenie

Interakcje między pyretroidam i i karbam inianem oraz toksyną ATX II z jadu anem ona m orskiego Anem onia sulcata były badane z użyciem metody pojedynczej i podwójnej przegrody olejowej. O bserw owano czynność bioelektryczną synaps w ostatnim zwoju odwłokowym oraz izolowanego aksonu olbrzym iego z układu nerwowego karaczana Periplaneta americana. Wykazano: (1) synergizm m iędzy perm etryną (pyretroidem I typu) i propoksurem (karbam inianem ), (2) przyspieszenie działania deltam etryny (pyretroidem II typu) w obecności toksyny ATX II oraz brak wpływu toksyny na efektywność permetryny.

Wstęp

Syntetyczne insektycydy m odyfikujące działanie układu nerwowego owadów są najszybciej działającym i środkami walki z owadami szkodnikami. Stąd pochodzi ich przewaga nad bio-insektycydami. Organofosforany i karbaminiany ham ują aktywność acetylocholinesterazy pow odując zaleganie acetylocholiny w szczelinie synaptycznej. Prowadzi to w pierwszej fazie do wzrostu pobudzenia błony postsynaptycznej a później do zablokow ania transm isji w synapsie. M iejscem docelowym działania pyretroidów są kanały sodowe w błonach pobudliwych; związki te pow odują tzw. efekt „knock-down” czyli szybkie unieruchom ienie owadów. Szerokie stosowanie chemicznych środków od około 30 lat spowodowało rozwój oporności owadów na te substancje. Skutkiem je st konieczność zwiększania ich daw ek co pociąga za

sobą wzrost zanieczyszczenia środow iska i zagrożenia zw ierząt kręgowych. Poszukuje się więc nowych typów insektycydów lub bardziej racjonalnego wykorzystania ju ż istniejących.

W celu ograniczenia ilości chemicznych insektycydów prowadzi się próby stosowania ich kom binacji zakładając możliwość nie tylko ich addytywnego działania ale rów nież synergizmu. Synergistyczne oddziaływ anie zostało wykazane pom iędzy pyretroidam i oraz organofosforanam i i karbam inianam i w testach na kom arach ( Culex quinquefasciatus i Anopheles gambicie), [1,2]. M echanizm tego w spółdziałania został ostatnio przedstawiony [3]. Wyniki, które um ożliwiły jeg o określenie zostaną w dalszej części opisane.

W jadach zw ierząt takich n. p. jak skorpiony lub pająki występuje szereg neurotoksyn m odyfikujących działanie kanałów sodowych. N iektóre z nich w ykazują dużą selektyw ność w stosunku do owadów. M ateriał genetyczny odpow iedzialny za ich produkcję wprowadza się do genomu bakulowirusa, naturalnego patogenu owadów. Rekombinowane bakulow irusy w ykazują znacznie w iększą skuteczność jako insektycydy niż formy niezm odyfikowane [6]. M etoda ta pozostaje na razie głównie na etapie badań.

Trzecią drogą są próby równoczesnego stosowania naturalnych neurotoksyn i klasycznych insektycydów. Bada się np. skuteczność działania pyretroidów po uprzednim zainfekowaniu owadów rekom binow anym bakulowirusem niosącym geny odpow iedzialne za produkcję neurotoksyn m odyfikujących działanie kanałów sodowych [6]. Idea takich kombinacji wywodzi się z faktu występow ania allosterycznych, dodatnich interakcji między miejscam i receptorowymi dla różnych neurotoksyn w kanale sodowym [5]. Badania na poziomie molekularnym wykazały, że wbudowyw anie się toksyn do m iejsca receptorow ego 3 w kanale sodowym w zrasta w obecności pyretroidów. Podobnie je st w odwrotnej sytuacji. Powinowactwo pyretroidów do kanału sodowego rośnie w obecności toksyny [4]. W warunkach polow ych łatwiej sobie wyobrazić sytuację, w której owady najpierw zo stają zainfekowane bakulowirusem niosącym geny odpowiedzialne za produkcję toksyny a następnie są traktow ane pyreroidem niż odw rotną kolejność. Wyniki uzyskane w testach toksyczności nie zawsze jed nak są zgodne z oczekiwaniam i. W prowadzenie neurotoksyny (n. p. As II, or Sh 1 z jad u anem onów morskich) do ciała ow ada nie zawsze podnosi efektywność pyretroidów [7]. Przypuszczać należy, że istotny będzie tu dobór zarówno typu toksyny jak i pyretroidu. Poniżej przestaw ione są wstępne wyniki testów, przeprow adzonych na preparacie aksonalnym z układu nerwowego owada, których celem jest ocena współdziałania neurotoksyny ATX II z jad u anem ona m orskiego (Anem onia

sulcata, wbudow ującej się do m iejsca receptorow ego 3 w kanale sodowym)

Metody

Interacje między perm etryną (pyretroidem typu I) oraz propoksurem (karbam inianem ) badano wykorzystując technikę pojedynczej przegrody olejowej [9]. Pozwala ona na obserwację aktywności synaps znajdujących się w ostatnim zwoju odwłokowym karaczana ( Periplaneta am ericana) między zakończeniem aksonalnym neuronu m echanosensorycznego oraz dendrytami olbrzym iego interneuronu. Transmiterem w tych synapsach jest acetylocholina, której uw alnianie jest regulowane na drodze ujem nego sprzężenia zwrotnego przez receptory m uskarynowe znajdujące się w błonie presynaptycznej [9].

W spółdziałanie toksyny ATX II oraz perm etryny i deltam etryny (pyretroidu typu II) obserwow ano rejestrując prąd sodowy w błonie aksonu olbrzym iego interneuronu za pom ocą metody podw ójnej przegrody olejow ej [8].

Wyniki i dyskusja

W spółd ziałan ie perm etryny i propoksuru na poziom ie synapsy. Rozpatrując w pływ danej substancji na transm isję synaptyczną zawsze należy brać pod uwagę m ożliwość jej działania na błonę aksonalną. W przypadku perm etryny efektem pierwotnym je st m odyfikacja prądu sodowego w aksonie (Ryc. 1A). Szybki prąd sodowy w ciągu 20 min m inim alnie się zm niejsza, pojawia się natom iast nowy prąd w czasie trwania impulsu depolaryzującego oraz po jego zakończeniu. Podaw anie im pulsów depolaryzujących z dużą częstotliw ością (25 Hz) powoduje sum owanie się prądu końcow ego (Ryc. IB ), który wygasa ze stałą czasow ą około 500 ms. Prąd ten jest odpow iedzialny za depolaryzację następczą, która przy szybkiej stymulacji aksonu także ulega sumowaniu. Przy braku stymulacji polaryzacja aksonu wraca do wartości w yjściow ej w ciągu kilkuset ms.

Podniesienie stanu pobudzenia aksonu powoduje zw iększenie w ydzielania acetylocholiny w synapsie co jest obserwowane, po 20 min, jak o niewielki (o 14±5 % ) w zrost am plitudy postsynaptycznych potencjałów pobudzających (PSPP), rejestrow any przy bardzo niskich stężeniach (10 's M) permetryny. Przy większych jej stężeniach (3x10 7 M) następuje spadek am plitudy PSPP (Ryc. 2A) o 28±5 %. Jest to w ynikiem zwrotnego ham owania w ydzielania Ach w wyniku pobudzenia presynaptycznych receptorów m uskarynow ych. Zostało to sprawdzone w doświadczeniach z zastosowaniem atropiny, blokera receptorów m uskarynowych.

P ropoksur ( 2 x l0 ‘7 M) blokuje aktywność acetylocholinesterazy w wyniku czego wzrasta ilość acetylocholiny w synapsie. Po upływie 10 min obserwowany jest wzrost (o 13±6 %) am plitudy PSPP. Prawdopodobnie efekt blokera

acetylocholinesterazy okazuje się nieco silniejszy niż m echanizm y regulacyjne w synapsie jednakże nie pozw alają one na pełne ujawnienie się efektu propoksuru.

A

AKSON

kontrola

permetryna 3x10'7 M

В

|50nA

200ms

R y c. 1. D ziałan ie pc rm e tryn y (3 x10 7 M ) na prąd sodow y rejes trow an y z ak sonu olbrzym iego karaczana. A. M od yfik acja prądu sodow ego, w yw oła nego 5 m s im pulsem d epo laryzu jący m z -60 do -10 m V , po 20 m in d ziałania perm etryny. B. Prąd so do w y w yw oła ny im pulsam i d epola ryzują cym i p oda w anym i z c zę stotliw oś cią 25 H z w w aru nka ch k on tro ln yc h i po perm etrynie. Strzałki w sk azu ją induk ow any p erm etryn ą prąd w c zasie im pulsu d epo laryz ujące go o raz p rąd końcow y.

Traktow anie preparatu przez 10 min perm etryną o stężeniu З х Ю 7 M a następnie podanie m ieszaniny permetryny (ЗхЮ '7 M ) i propoksuru ( 2 x l0 ‘7 M) powoduje w ciągu 10 min spadek PSPP (Ryc. 2B) o 66±3 %. Jest to efekt znacznie przekraczający sumę efektów (spadek PSPP o 12±5 % ) wywołanych perm etryną (po 20 min) i propoxurem (po 10 min) podanym i oddzielnie. Wykazany został w ten sposób synergizm występujący między pyretroidem i karbam inianem, na którego istnienie wskazywały wyniki testów toksyczności. Synergistyczne działanie perm etryny i propoksuru dokonuje się za pośrednictwem działania receptorów m uskarynowych. Zostało to udowodnione w doświadczeniach z zastosow aniem atropiny w obecności, której prawie żadnego spadku PSPP nie zaobserwow ano. Szczegółowe dane opisane są w publikacji [3].

SYNAPSA

R yc . 2. M od yfik acja postsyna ptyczn ycli po tencjałów p obu dz ają cyc h (PS P P ) w obec ności inse ktycydów . A. Z m ia ny zare jestro w an e po 20 m in w obe cnoś ci pe rm etry ny (3x 10 7 M). B. Z m ia ny zare jestrow ane po w stęp nym traktow a niu, przez 10 m in, preparatu pe rm e try ną (3 x10 7 M) a n astępn ie d zies ięc iu m inutach aplikacji m ieszanki perm etryny i pro po ks uru (2x 10 7 M).

W spółdziałanie toksyny ATX II i pyretroidów.

N a izolowany akson karaczana działano perm etryną o stężeniu 10 6 M. Insektycyd w tym stężeniu pow oduje powstanie opisanych poprzednio prądów ale równocześnie obserw ow any je st spadek am plitudy prądu szybkiego. W kolejnej serii doświadczalnej akson traktowany był toksyną ATX II w stężeniu ( 1 0 6 M) wyw ołującym zaham owanie w około 20 % procesu inaktywacji prądu sodowego i nie wpływającym na am plitudę prądu. Po 10 min przepłukiwano akson roztworem permetryny (10 û M). Stw ierdzono, że obecność toksyny nie przyspiesza działania permetryny. W następnych dośw iadczeniach sprawdzono w podobny sposób działanie deltam etryny ( 1 0 6 M). Okazało się, że obecność ATX II w znacznym stopniu przyspieszyła działanie pyretroidu (Ryc. 3). Średni spadek am plitudy prądu sodowego po deltam etrynie wzrósł

z 7,5 пА/m in ( w obecności samej deltametryny) do 22,5 nA/min (w obecności ATX II).

A

kontrola

_permetryną

_СГМ

I

nA

ms

ATXII

x

'7M

permetryną

'6M

R y c. 3. Z m iany prąd u sod ow ego rejestrow aneg o z akson u po 20 m in d zia łan ia perm etryny (10 M ). A. D z iałanie sam ej pe rm etryny. B. D ziałanie pe rm etryn y w ob ecn oś ci tok syny A T X II (2x1 0 '7 M).

Uzyskane wyniki wskazują, że łączenie różnych substancji o działaniu neurotoksycznym może znacznie podnosić ich efektywność. Przy dobieraniu substancji mających ze sobą współdziałać nie wystarczy jed nak jed ynie znajomość ich charakterystyki ale konieczne są liczne testy, które pozw olą na dobór właściwych par związków i właściw ych ich stężeń. Testy toksyczności powinny być prowadzone rów nolegle z obserw acjam i na poziom ie układu nerwowego poniew aż to daje szansę na poznanie m echanizm ów występujących interakcji.

Piśmiennictwo

1. B onnet J., C orbel V., D arriet F., C ha ndrę F., H ougard J.M . (20 04) T o pical ap plications o f py re thro id an d orga no ph os ph ate m ixtures revealed po sitive in teraction against py rethroid- resistant A n o p h eles g am biae . J. A m. M osq. C ontrol. A ssoc. 20: 43 8-43 .

2. C orbe l V., C ha nd rę F., D arriet F., Lardeux F., H ouga rd J.M . (2 003 ) Syn ergism betw een pe rm e thrin an d prop o x ur against C ulex q uinq ue fa sciatu s m os quito larvae. M ed Vei E n tom o l.

17:158-64.

3. C orb el V., S ta nk iew ic z M ., B onnet J., G rolleau F., H o uga rd J.M ., L apied B. (2006). Synergism be tw ee n inse cticid es perm eth rin and p ro po x u r oc curs throu gh activatio n o f pre syn aptic m usc arinic ne gativ e feedback o f ace tylch olin e releas e in th e insect central ne rvous system . N e uro to xico l. w d ruku

4. G illes N., G ure v itz M., G ordon D. (2 003) A llosteric in tera ction s a m on g pyrethroid, b rev etox in, and s co rpio n to xin re ceptors on insect so dium ch an ne ls ra ise an alterna tive a pp roac h fo r in se ct co ntro l. F E B S l<ett. 540: 81-85.

5. G ord on D. (199 7) So dium chan nel as targets o f n eurotox ins. M ode o f action and interac tion o f n eu ro tox in s w ith re ce pto r sites on so diu m channels. W: To xin s a n d S ig n a l Tr ansduction. Red. Y G utm an n i P .Lazarovici, H ar w o o d A cad em ic P ublishers, The N eth erlan ds , s. 119-49 6. K am ita S .G., K ang K .-D ., H am m ock B.D. 2005. G e netica lly m o difie d b ac uliv iru se s for pest

in sect c ontro l. W: C om pr ehe nsiv e M olecu lar Insect Science, Red. L I . G ilbert, K. latrou, S.S. G ill; E ls ev ie r LtD. O xford, UK, s. 271-322.

7. Poph am H .J.R ., P rik h o d 'k o G .G., Fe lcetto T .J., O stlin d D A., W arm ke J .W ., C ohe n C .J., M iller L.K. (1 998 ) E ffect o f de ltam e thrin treatm e nt on lep id op te ran larva e infec ted with b a culov iru s es e x pre ss in g in sect-se lectiv e tox ins m -A ga-IV , A s II, o r Sh 1. Biol. C ontro l 12: 79-87.

8. Stank ie w icz M ., Pane k I., Grajpel В., T ęgow sk a E., K ą dzie la W., Pelhate M. (2000). M o dyfikacja czyn noś ci bioelektryc zne j oś rodkow ego układu nerw ow ego ow ada w wyniku dz iałania ne uroto ksy n. Post. Hig. Med. Dośw. 54: 371-379.

9. S tan kiew icz M ., H ue B „ Pelha te M ., L apied B. (200 4). T rans m isja sy na ptyc zna w ośro dko w y m uk ład zie nerwow ym ow ada. W: Techniki e lek trofizjologic zne . W bada nia ch zja w is k bioe lek tryc zny ch: o d kan ałów jo n o w yc h p o sie ci neu ron alne. Red. M.H. Le w a ndo w sk i, Inst. Z o olog ii UJ, K raków , s. 101-110

A dres do k o re sp o n de n cji: M a r ia S ta n k ie w ic z Z a kład B iofizyki Instytut B iologii O góln ej i M olekularnej U n iw e rsy tet M iko łaja K o pernika ul. G a garin a 9 87-100 T oruń teł. (48 56) 611 42 96 e-m ail: stan k iew icz @ biol.uni.torun.p l