Widok Białka wiążące wapń jako markery stanów patologicznych.

(1)

KOSM OS 1992, 41 (1): 105— 121

JA C E K K U Z N IC K I J O L A N T A K O R D O W SK A

Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Warszawa

BIAŁKA W IĄ ŻĄ C E W A PŃ JA K O M A R K E R Y STANÓW PA T O L O G IC Z N Y C H

W STĘP — W Y STĘPO W A N IE I R O LA W A PN IA W O R G A N IZ M IE

W apń — jeden z głównych składników nieorganicznych organizmu — pełni w nim różne funkcje strukturalne i regulacyjne (art. przegl. S c h a f f n e r i D a m b a d e r 1989; K u ź n i c k i 1988). W trzech głównych kom partm entach organizm u stężenie w apnia jest bardzo różne: w kościach kilkumolowe, we krwi i innych płynach ustrojowych — milimolowe, natom iast wewnątrz kom ó rek — m ikrom olowe (rys. 1). C ałokształt procesów utrzym ujących w dynamicz nej równowadze ten specyficzny rozkład nazywamy hom eostazą wapniową.

Rys. 1. W ystępowanie w apnia w trzech głównych kom partm entach organizmu: w kom órkach (A), we krwi (B) i w kościach (C)

(2)

106 Jacek Kuźnicki, Jolanta Kordowska

Dzięki dużej różnicy stężeń między wnętrzem kom órki a środowiskiem zewnętrznym wapń może pełnić rolę w przekazywaniu sygnałów przez błonę kom órkową oraz w regulacji procesów fizjologicznych, takich jak: skurcz mięśni, ruchliwość kom órek niemięśniowych i tworzenie cytoszkieletu, wydzielanie, podział komórkowy, synteza białek i przepuszczalność przez błony (art. przegl. R a s m u s s e n 1990; B e r r i d g e 1989). W ewnątrzkomórkową homeostazę wapniową można schematycznie przedstawić w postaci trzech kolejnych etapów. Pierwszy polega na aktywacji receptorów błonowych przez różnorodne czynniki (np. horm ony lub zmiany potencjału), co prowadzi do wzrostu stężenia wolnych jonów wapnia w cytoplazmie. W drugim etapie jony te są wiązane przez specyficzne białka wiążące wapń, które przenoszą sygnał na białka docelowe. W trzecim etapie enzymatyczne i strukturalne białka docelowe wywołują okreś loną odpowiedź fizjologiczną (rys. 2). Obniżenie stężenia wapnia powoduje jego oddysocjowanie od białek wiążących, co hamuje aktywność białek docelowych.

Rys. 2. Aktywacja kom órki za pośrednictw em jonów wapnia i białek wiążących wapń.

K O M Ó R K O W A H O M EO STA ZA W A PN IO W A W STA N A CH PA TO L O G IC ZN Y C H

N orm alne funkcjonowanie kom órki ma miejsce wtedy, gdy stężenie Ca2 + jest precyzyjnie kontrolow ane zarów no w czasie, jak i w przestrzeni przez współ działające ze sobą błonowe i cytoplazm atyczne białka wiążące wapń. Różne stany patologiczne zmieniają tę równowagę, co może prowadzić do dalszego rozregulowania m etabolizm u kom órki. W momencie uszkodzenia kom órki lub podczas jej starzenia obserwuje się zaburzenia procesów biorących udział

(3)

Białka wiążące wapń ja ko m arkery stanów patologicznych 107

w wewnątrzkom órkowej homeostazie w apnia, co staje się powodem zwięk szonego wpływu Ca2+ do kom órki, uwalniania Ca2+ z wewnątrzkom órkowych magazynów i ham ow ania jego wydalania. Prowadzi to do znacznego wzrostu stężenia cytoplazm atycznego Ca2+ , które utrzym uje się na nienorm alnie wysokim poziomie. N a przykład w kom órkach mięśni hodowanych in vitro uzyskanych od pacjentów chorych na dystrofię m iotoniczną, hom eostaza Ca2 +

jest nieprawidłowa ( J a c o b s i in. 1991). G dy jony wapnia są obecne

w pożywce, kom órki te m ają wyższy poziom [Ca2+] w cytoplazmie, niż kom órki osób zdrowych, co jest spowodowane zwiększonym wpływem jonów poprzez kanał Ca2 + .

W wyniku starzenia zmienia się dystrybucja wapnia w głównych kom part- m entach organizmu: zwiększa się jego ilość w kom órkach, a zmniejsza w koś ciach. Poziom wapnia we krwi pozostaje taki sam, nawet niewielkie zmiany stężenia tego jo n u m ogą wywołać poważne zaburzenia w funkcjonowaniu różnych narządów, m.in. serca. Zaw artość całkowitego [Ca2+] w komórce (tab. 1) zwiększa się w m iarę starzenia o 52% , a u chorych na chorobę Alzheimera nawet o 197%, co stwierdzono w fibroblastach pobranych ze skóry ( P e t e r s o n i G o l d m a n , 1986). W kom órkach krwi pacjentów z nadciśnieniem stwierdza się zaburzenia w transporcie jonów w apnia przez błony kom órkow e oraz wzrost jego stężenia wewnątrz kom órki (O s h i m a i in. 1988).

T a b e l a 1 Poziom w apnia w fibroblastach ( P e t e r s o n , G o l d m a n 1986)

W apń Linia fibroblastów od pacjentów

pmol Ca2+/p.g białka młodych w starszym wieku z chorobą Alzheimera

całkowity 9,7 ± 0,5 14,6 + 1,0 28,6 ± 1,3

wewnątrzkom órkowy 3,7 ± 0,2 7,6 ± 1,2 14,4 + 0,4

Innym przykładem zaburzeń hom eostazy wapniowej jest zachowanie się kom órek nowotworowych ( B o y n t o n i W h i t f i e l d 1976; S w i e r e n g a i in. 1978). K om órki prawidłowe wymagają do wzrostu odpowiedniego stężenia jonów wapnia. Ich podziały zatrzym ują się, gdy stężenie [Ca2+] w środowisku jest zbyt niskie. Ta sama linia kom órek po transform acji nowotworowej wirusem SV-40 okazuje się niewrażliwa na zmiany [Ca2+]. K om órki takie dzielą się nawet wtedy, gdy stężenie w apnia w środowisku jest bardzo niskie (H a z e 11 o n i T u p p e r 1981).W kom órkach nowotworowych wykazujących zjawisko tzw. oporności wielolekowej (M D R) (N a i r i in. 1986; G r z e l a k o w s k a - S z t a - b e r t 1989) poziom w ew nątrzkom órkowego Ca2+ jest podwyższony w porów naniu z kom órkam i nowotworowym i wrażliwymi na leki (T s u r u o i in. 1984). Utrzym ujące się wysokie stężenie jonów wapniowych może doprowadzić do śmierci kom órki m.in. poprzez rozbicie cytoszkieletu i nie kontrolow aną

(4)

108 Jacek Kuźmicki, Jolanta Kordowska

aktywację enzymów katabolicznych, np. endonukleaz i proteaz. A poptoza, czyli program ow ana śmierć kom órki, odbywa się najpraw dopodobniej m.in. poprzez zależne od Ca2+ endonukleazy (O r r e n i u s i in. 1989) (rys. 3)

Rys. 3. Praw dopodobne mechanizmy odpowiedzialne za zależną od wapnia program ow aną śmierć kom órki

K LA SY FIK A C JA BIA ŁEK W IĄ ŻĄ C Y C H W A PŃ (CaBP)

N a zmiany poziom u jonów wapnia w kom órce reagują białka wiążące wapń, mające struktury wyspecjalizowane do wiązania tych jonów . Obecnie znanych jest ponad 200 takich białek. Część z nich scharakteryzow ano, ale tylko dla nieznacznej części określono funkcję ( H e i z m a n n i B e r c h t o l d 1987; H e i z m a n n i H u n z i k e r 1990). Białka wiążące wapń m ożna podzielić na cztery grupy:

1. Białka, które wiążą wapń dzięki tzw. dom enom „ E F -h an d ” — struk turom o charakterystycznej budowie, składającym się z dwóch odcinków a-helisy i pętli je łączącej. Zalicza się do nich kalbindyny D28k i kalretininy (mające 6 domen „E F -h an d ” ), kalm odulinę i troponinę C (4 domeny), (rys. 4) parw album iny i onkom odulinę (2 + 1 nieaktywna) oraz białka z rodziny S-100 (2 dom eny „E F -h an d ” );

2. Białka, które zawierają dom eny funkcjonalne i dom eny homologiczne do struktury „E F -h an d ” . Przykładami są: a-aktynina (białko sieciujące filamenty aktynowe), dystrofina — produkt genu, którego m utacja powoduje dystrofię D uchenna i Beckera, kalpaina — proteaza zależna od Ca2+;

3. Białka wiążące wapń, które nie m ają struktur „ E F -h an d ” , a które wiążą fosfolipidy w sposób zależny od jonów wapnia. Do grupy tej należą lipokortyny, kalpaktyny, chrom obindyny i kalcimedyny, ogólnie zwane anneksynam i ( G e r - k e 1989; G e r k e i in. 1990). N iektóre z tych białek ulegają fosforylacji m.in. w resztach tyrozynowych w czasie aktywacji kom órki przez czynniki wzrostowe;

4. Inne białka, których nie m ożna zaklasyfikować do trzech powyższych grup.

(5)

Rys. 4. Budowa dom eny E F -h a n d i schem at białka wiążącego wapń zawierającego cztery domeny.

W Y STĘPO W A N IE BIAŁEK W IĄ ŻĄ C Y C H W A PŃ W STA N A CH PA TO L O G IC ZN Y C H

Badając zmiany patologiczne związane z m etabolizmem wapniowym, zwraca się m.in. uwagę na obecność różnych białek wiążących wapń. N iektóre z nich mogą się stać m arkeram i pewnych chorób (np. te, które występują tylko w ściśle określonych kom órkach lub te, których poziom w kom órce zmienia się). Białka wiążące wapń, których występowanie i ekspresja zmieniają się w stanach patologicznych m ożna podzielić na dwie grupy:

1. Białka ulegające ekspresji w specyficznych w arunkach i praktycznie nie występujące w zdrowej tkance (np. onkom odulina i sorcyna);

2. Białka występujące w normalnej tkance, ale mające zmienioną ekspresję w w arunkach patologicznych, np. kalm odulina, kalbindyny, parwalbum iny, białka S-100 (H e i z m a n n i S c h a f e r 1990).

Niżej opisano właściwości niektórych białek wiążących wapń, które praw dopodobnie będą mogły być m arkeram i określonych stanów patologicznych.

O nkom odulina (M r = 11 700) jest to białko podobne do parw album iny ( M a c M a n u s i W h i t f i e l d 1983; G i l l e n i in. 1987). Tworzy ono dimery (poprzez grupę SH), które wydają się być form ą aktyw ną biologicznie. O nkom odulina jest nieobecna w norm alnych fibroblastach, ale po transform acji nowotworowej pojawia się w tych kom órkach w znacznej ilości. W czasie * rozwoju prenatalnego pojawia się w łożysku, podczas gdy w norm alnych

(6)

tkankach człowieka dorosłego nie występuje. O nkom odulina została znaleziona w 80% przebadanych nowotworów zwierzęcych i ludzkich. Jej poziom w tkan kach nowotworowych jest różny i nie ma związku ani z szybkością wzrostu now otw oru, ani ze zdolnością do tworzenia przerzutów. O nkom odulina jest obecna w wielu now otw orach ludzkich, ale jej poziom jest niski i dlatego nie wydaje się, by oznaczanie poziom u tego białka mogło mieć praktyczne znaczenie w diagnostyce onkologicznej.

Sorcyna (ang. sorcin — soluble resistance-related calcium binding protein)

jest cytoplazm atycznym białkiem o M r 22 000, mającym 4 miejsca wiązania Ca2 + . Podobnie jak onkom odulina tworzy dimery. Synteza sorcynyjest znacznie zwiększona w kom órkach nowotworowych wykazujących oporność wielo- lekową, co jest efektem amplifikacji genu sorcyny. Zwielokrotnienie tego genu zachodzi równolegle z ampliflkacją genu P-glikoproteiny, błonowego białka transportującego różne związki chemiczne z wnętrza kom órki na zewnątrz, odpowiedzialnego za zwiększoną oporność kom órek nowotworowych na działa nie leków. N adprodukcja sorcyny nie jest ani wystarczającym, ani niezbędnym w arunkiem do uzyskania oporności na leki i jest najpraw dopodobniej przypad kowa. Niemniej obecność tego białka w badanych kom órkach jest wskaźnikiem nabycia wielolekowej oporności ( R o b e r t s i in. 1989; H a m a d a i in. 1988; Meyers i in. 1987; art. przegl. G r z e l a k o w s k a - S z t a b e r t 1989).

W przeciwieństwie do innych białek wiążących wapń kalm odulina występuje powszechnie we wszystkich kom órkach, chociaż jej stężenie nie wszędzie jest jednakow e. W kilku przypadkach stwierdzono, że poziom kalm oduliny wzrasta w wyniku transform acji nowotworowej wywołanej wirusami (art. przegl. H e i z m a n n i B e r c h t o l d 1987). Ponadto w kom órkach mięśni gładkich u szczurów z nadciśnieniem poziom prawidłowej kalm oduliny wzrasta i pojawia się jej zm utow ana forma.

Inne białka wiążące wapń, takie jak parw album iny, kalbindyny i białka S-100 wykazują specyficzność tkankow ą i kom órkow ą i dlatego m ogą się okazać szczególnie dobrymi m arkeram i niektórych chorób. Parw album ina jest białkiem wiążącym wapń o M r = 12 000, występującym w wysokim stężeniu w szybkich miofibrylach mięśni szkieletowych. Fibryle te w pierwszej kolejności ulegają dezintegracji w przebiegu m iopatii i dlatego w surowicy myszy M dx (odpowied nik ludzkiej dystrofn Duchenna) obserwuje się znacznie podwyższony poziom parw album iny, co jest konsekwencją zwiększonej m artwicy mięśni szkieleto wych (J o c k u s c h i in. 1990). Oznaczenie poziom u parw album iny w surowicy może być czułym m arkerem stopnia dezintegracji mięśni szkieletowych (parw al bum iny nie znajduje się w mięśniach gładkich i mięśniu sercowym).

Parw album ina występuje w ośrodkow ym układzie nerwowym — w nie których GABA-ergicznych neuronach hipokam pa (S k o 11 i i N i t s c h 1991). U pacjentów cierpiących na epilepsję obserwowano ubytek kom órek hipokam pa, głównie w tzw. obszarach CA1 i CA3 ( L e r n a t h i R i b a k 1991), natom iast kom órki nerwowe z obszaru CA2 były mniej wrażliwe na

(7)

uszkodzę-Białka wiążące wapń ja ko markery stanów patologicznych 111

nie. Badania immunologiczne prow adzone na szczurach wykazały, że obszar CA2 m a wyższy niż w obszarach CA1 i CA3 poziom parw album in (i kalbindyn D28K) w kom órkach piram idalnych. Sugeruje się, że kom órki piram idalne obszaru CA2 są oporne na toksyczność wapniową wywołaną nadm iernym pobudzeniem właśnie dzięki ochronnej roli białek wiążących wapń (L e r n a t h i R i b a k 1991. U pacjentów z chorobą Alzheimera zmniejsza się liczba neuronów zawierających parw album inę ( I c h i m i y a 1988). U pacjentów z syndromem DiGeorge obserwuje się delecję genu parwalbum iny, co może być m arkerem tej choroby (B e r c h t o 1 d i in. 1987).

W mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera poziom kalbindyny D28k obniża się, co jest najpraw dopodobniej spowodowane zmniejszaniem się liczby neuro nów zawierających to białko (B a i m b r i d g e i in. 1985). Zaobserw owano, że D28k, podobnie jak parw album ina, chroni kom órki nerwowe przed toksycznym wpływem wapnia, który pojawia się w kom órce w zwiększonej ilości w wyniku nadmiernego pobudzenia. H odow ane in vitro neurony hipokam pa zawierające kalbindynę D28k są bardziej oporne na niszczący wpływ elektrostymulujących aminokwasów, niż neurony nie mające tego białka ( M a t t s o n i in. 1991). N eurony z kalbindyną D28k bardziej efektywnie niż neurony bez niej obniżają wysoki poziom wewnątrzkom órkowego wapnia pojawiający się po pobudzeniu. Ekspresja kalbindyn D28k występujących w kom órkach nerwowych jest regulo wana m.in. przez glukokortykoidy oraz przez neuronalne czynniki wzrostu. W przewlekłych chorobach neurologicznych, takich jak choroba Alzheimera, H untingtona czy Parkinsona, poziom kalbindyny D28k (oraz jej m RN A ) jest zredukow any w objętych chorobą rejonach mózgu. W ymienione przykłady świadczą o tym, że zmniejszająca się w różnych stanach patologicznych (lub wraz z wiekiem) w różnych procesach patologicznych ekspresja kalbindyny D28k może prowadzić do zachwiania hom eostazy wapniowej kierowanej przez układ neuronalny.

Białka z rodziny S-100 to co najmniej 10 różnych polipeptydów (M r od 9000 do 14 000), występujących na ogół w określonym typie kom órek. Białka S-100 zawierają dwie domeny ,,E F -hand” ; m onom er może zatem wiązać dwa jony wapnia, a dimer cztery. N iektóre białka z tej rodziny wiążą jony cynku. Białka S-100 m ają dwie ważne cechy odróżniające je od innych białek zawierających domeny „E F -h an d ” . Pierwsza — to wydzielanie białek S-100 na zewnątrz kom órki do płynów ustrojowych lub pożywki, co wskazuje, że m ogą one działać pozakom órkow o. D ruga cecha — geny kodujące białka S-100 są aktywowane w określonej fazie cyklu kom órkow ego łub w przebiegu procesu różnicowania. Nie są to więc białka stale syntetyzowane w komórce.

M ózgowe białka S-100 występują w postaci dimerów zbudowanych z dwóch rodzajów podjednostek: S-lOOa i S- 100/k Polipeptydy te wykazują około 50% identyczności i m ogą tworzyć hom o- i heterodimery. Białko S-I00ß zlokali zowano w największej ilości w kom órkach gleju, ale występuje ono również w adipocytach. Białko S-lOOa znajduje - się przede wszystkim w

(8)

neuro-11 2 Jacek Kuźnicki, Jolanta Kordowska

T a b e l a 2 Właściwości białek S-100

N azwa białka

(genu) W ystępowanie Indukow anie*

Ekspresja zależna od cyklu kom órko

wego lub etapu różnicowania

Pozakom órkow e (E) i tworzące

dim er (D)

S-lOOa neurony, mięśnie, + D

nerka, skóra

S-100/? kom órki gleju, tkanki + E/D

tłuszczowej, jąd ra

S-100L kom órki płuc

M R P -14 *w ostrych i przewlekłych + E/D

C F -A g stanach zapalnych L - l Ag

M R P -8 *w przewlekłych stanach + E/D

L - l Ag zapalnych

K alcyklina *surowicą w fibroblastach + E/D

PRA połączony z receptorem

prolaktyny

18A2 *surowicą w fibroblastach +

P9K a w kom órkach mioepitelialnych +

pEL68 w now otw orach + E/D

m tsl w przerzutach nowotworowych +

42A *N G F w kom órkach PC 12 +

ICaBP *witaminą D w kom órkach jelita +

p i l podjednostka anneksyny II

42C *N G F w kom órkach PC 12 + D

nach centralnego i obwodowego układu nerwowego, a mniejsze jego ilości występują w kom órkach mięśni, nerki i melanocytach. Dotychczas nie wyjaś niono jak ą rolę pełnią białka S-lOOa i S-100/?. O statnio stwierdzono jednak, że hom odim er S-100/1 wydłuża czas przeżycia neuronów w hodowli oraz stymuluje wydłużanie neurytów ( K l i g m a n i M a r s h a k 1985). Wydzielanie S-100/1 zachodzi pod wpływem horm onu kortykotropow ego.

Synteza białka S-100/1 w m ózgu pacjentów z chorobą Dow na i Alzheimera jest podwyższona ( G r i f f i n i in. 1989). Zwiększenie ilości białka S-100 w trakcie rozwoju m ózgu może być przyczyną neurologicznych zmian wy stępujących w chorobie D ow na, co sugeruje się m.in. na podstawie obserwacji myszy transgenicznych (z genem białka S-100). D odatkow ą w skazówką sugeru jącą, że białko S-100/1 jest związane z patogenezą syndrom u D ow na jest fakt, że

fragm ent chrom osom u 21 zawierający gen tego białka ulega triplikacji. Poziom białka S-100/1 oznaczony w płynie mózgowo-rdzeniowym jest podwyższony również w innych chorobach ośrodkow ego układu nerwowego, takich jak

(9)

nowotwory, zmiany towarzyszące miażdżycy naczyń mózgowych, wylew krwi do mózgu. Użycie m onoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko białku S-100/7 umożliwia identyfikację różnych nowotworów układu nerwowego u ludzi. W tabeli 3 pokazano w jakich nowotworach znajduje się, a w jakich nie m a białka S-100/k We wszystkich badanych przypadkach znaleziono to białko w nowotworach pochodzących z kom órek wspomagających (gleju), a nie znaleziono w nowotworach wywodzących się z neuronów (Van E l d i k i in. 1986).

T a b e l a 3 Im munologiczna lokalizacja białka S-1 OOy? w ludzkich now otw orach układu nerwowego (Van E l d i k i in. 1986)

N ow otw ór S-100/?

A strocytom a (gwiaździak) 23/23

G lioblastom a (glejak) 14/14

Schwannoma (osłoniak) 6/6

Ependym om a (kom órki wyściółki) 3/3 Oligodendroglom a (skąpodrzewiak) 0/5

M emigioma (oponiak) 0/12

M edulloblastom a (rdzeniak) 0/7

N euroblastom a (zwojak zarodkow y) 0/7

Białko S-lOOa w kom órkach mięśniowych jest obecne tylko w fibroblastach serca i fibrylach typu I mięśni szkieletowych ( E l a i m o t o i K a t o 1987). W surowicy pacjentów z dystrofią m iotoniczną typu 1 stwierdza się podwyż szony poziom enzymów takich jak enolaza mięśniowa (dwukrotny), kinaza kreatyninow a i mioglobina (trzykrotny), anhydraza węglanowa (czterokrotny) oraz ponad sześciokrotny — białka S-lOOa. W ydaje się, że białko to i jego poziom jest czułym i łatwym do oznaczania m arkerem tej dystrofii.

Białko S-100ß występuje w czerniakach i liniach kom órkowych otrzymanych z tych nowotworów. Nie znaleziono białka S-\00ß w norm alnych melanocytach, w kom órkach epitelialnych i w fibroblastach. Sugeruje się, że synteza tego białka zwiększa się po transform acji nowotworowej melanocytów w związku z progre sją cyklu kom órkowego.

Poziom kalbindyny D9k w jelicie cienkim zmienia się w różnych stanach patologicznych. Zaobserw owano korelację między poziomem kalbindyny D9k a zdolnością jelita do wchłaniania wapnia (tab. 4). Ponadto u szczurów z nadciśnieniem poziom kalbindyny D9k obniża się (R a o i in.).

Dwa białka z rodziny białek S-100 zwane M RP-8 i M RP-14 (to ostatnie jest identyczne z tzw. antygenem mukowiscydozy — patrz niżej) są białkami charakterystycznym i dla kom órek pochodzących ze szpiku. W w arunkach norm alnych obserwuje się je w granulocytach i m onocytach krwi, a nie ma ich

(10)

w płytkach krwi i limfocytach oraz w norm alnych tkankow ych m akrofagach (tab. 5).

T a b e l a 4 Poziom kalbidyny D9k w jelicie ( S t a u n , J a r n u m 1988) Pacjenci z ograniczonym wchłanianiem jelitowym Liczba przypadków Poziom kalbidyny D9k ug/mg (biopsje) Short-bowel syndrom 5 2,5 Celiakia nietraktow ana 4 0,3 remisja 7 1,8 Jelitowa bypass 5 13,7 Biegunka chroniczna 7 11,5 K ontrola (podrażnienie jelit) 12 6,9 T a b e l a 5 Ekspresja M RP-8 i M RP-14 w kom órkach białaczki i

w stanach zapalnych (Z w a 1 d o i in. 1983)

Stan chorobow y M R P -8 M R P -14

% kom órek pozytywnych O stra białaczka szpikowa

O stra białaczka limfatyczna Przewlekła białaczka szpikowa Przewlekła białaczka limfatyczna Ostre stany zapalne

(np. zapalenie dziąseł) Przewlekłe stany zapalne

(np. reum atoidalne zapalenie stawów)

10-40 10-40 0 0 50-80 50-80 0 0 0 15-78 50-100 50-100

W ostrych stanach zapalnych (np. w zapaleniu dziąseł, łuszczycy, świerz biączce) w m akrofagach pojawia się jedynie białko M RP-14. W przewlekłych stanach zapalnych, takich jak np. reum atoidalne zapalenie stawów, m akrofagi syntetyzują oba białka: M RP-8 i M RP-14. Obecność m akrofagów zawierających M RP-8 wskazuje na przewlekłą naturę stanu zapalnego ( O d i n k i in. 1987) Z w a 1 d o i in. 1988).

W przewlekłych i ostrych białaczkach szpikowych obserwuje się obecność zarówno M RP-8 i M RP-14. W innych nowotworach układu białokrwinkowego nie stwierdzono obecności tych białek. Obecność M RP-14 w surowicy wynika albo ze zwiększonej lizy m akrofagów i innych kom órek, albo jest skutkiem wydzielania tego białka przez kom órki w trakcie zapalenia. U pacjentów z mukowiscydozą obserwuje się podwyższony poziom białka „C F-antygen” identycznego z białkiem M RP-14. M ukowiscydozą związana jest z nienorm alnie

(11)

Białka wiążące wapń ja ko markery stanów patologicznych 115

niskim transportem jonów chlorkowych przez błonę. Gen odpowiedzialny za tę chorobę został zidentyfikowany, sklonowany, a defekt genu w postaci mutacji wykryty (art. przegl. K o s h l a n d 1989). CF-antygen (MRP-14) jest zawsze obecny w surowicy (u osób zdrowych 2-135 ng.ml'1), ale u chorych na mukowiscydozę (B r ü g g e n i in. 1988) jest obecny w dużo wyższym stężeniu (250-2500 ng.ml"1). Zwiększony poziom CF-antygen (MRP-14) obserwuje się u osobników heterozygotycznych, którzy nie wykazują objawów chorobowych (12-380 ng.ml"1). Oznaczenie poziom u tego białka w surowicy jest czulszym testem niż oznaczenie innych białek, np. związanych z aktywacją granulocytów, i może być testem na nosicielstwo genu mukowiscydozy.

T a b e l a 6 CaBP jako m arkery chorób

Białko Stan chorobow y

O nkom odulina Sorcyna Parw album ina K albidyna D9k D 28k Białko S-100 M RP-8 M R P -1 4 /C F -A g Kalcyklina niektóre nowotwory

kom órki now otw orowe z M D R choroby mięśni

choroba Alzheimera choroby jelit, nadciśnienie choroba Alzheimera dystrofia

czerniaki nowotwory nerki nowotwory mózgu chroniczne stany zapalne, ostre stany zapalne m ukowiscydoza niektóre now otw ory marskość żółciowa

18A2, p9K a, pEL68, m tsl i 42A to nazwy tego samego białka (genu) wykrytego w różnych kom órkach i badanego przez różne grupy badaczy (zob. Tab. 2 i art. przegl. H i l t i K l i g m a n 1991). Białko kodowane przez ten gen wiąże wapń i jest indukowane przez różne czynniki. N iektóre z nich są związane ze stanam i patologicznymi; np. zwiększoną syntezę tego białka obserwuje się po transform acji nowotworowej, a szczególnie w nowotworach wykazujących zdolność do przerzutów. Białko 18A2 występuje w różnych tkankach, ale jego największe stężenie jest w macicy i w łożysku ciężarnych myszy. Szczyt syntezy 18A2 obserwuje się w fazie S cyklu kom órkow ego ( J a c k s o n - G r u s b y i i n . 1987). Polipeptyd p9K a pojawia się w 10-15-krotnej ilości w mioepitelialnych kom órkach ssaków po ich przekształceniu z macierzystych kom órek epitelialnych (B a r r a c 1 o u g h i in. 1990).

Kom órki pheochrom ocytom a PC 12 wykazują właściwości chromafmowych kom órek nadnerczy. Pod wpływem nerwowego czynnika wzrostu (N G F)

(12)

Rys. 5. W ystępowanie kalcykliny w w ątrobie i nerce wyznaczane przy pomocy przeciwciał. (K om órki zawierające kalcyklinę m ają ciemne zabarwienie). Oznaczenia: a i b — w ątroba (m arskość żółcio wa); c -f— nerka (zdrowa), c — fragm ent kłębka; d — cewki w korze, e — cewki w rdzeniu, f — rdzeń

(13)

kom órki te uzyskują właściwości sympatetycznych neuronów, czego wyrazem jest m.in. pojawienie się i wzrost neurytów ( K l i g m a n i M a r s h a k 1985). Ten proces może być odzwierciedleniem indukowanego przez N G F procesu różnicowania embrionalnych neuroblastów . W czasie różnicowania się kom órek PC 12 pod wpływem N G F pojaw iają się dwa białka wiążące Ca2+, zwane 42Ä (mające 101 reszt aminokwasowych) i 42 C (identyczne z p i l podjednostką anneksyny II) mające 95 reszt aminokwasowych. Poziom m R N A 42C wzrasta 5-krotnie, a m R N A 42A — 25-krotnie ( M a s i a k o w s k i i S h o o t e r 1988).

Kalcyklina to białko wiążące wapń ( K u ź n i c k i i F i l i p e k 1987; K u ź n i - c k i 1991), którego gen ulega ekspresji pod wpływem czynników wzrostowych (C a 1 a b r e 11 a i in. 1986). N orm alnie występuje w fibroblastach i kom órkach epitelialnych ( K u ź n i c k i i in. 1992). Zwiększony poziom m R N A kalcykliny (pojawiający się w fazie G o/S cyklu kom órkowego) stwierdzono w ostrej białaczce szpikowej, w niektórych typach czerniaków (W e t e r m a n i in. 1992), w neuroblastom a (T o n i n i i in. 1991) i w nowotworze H odgkina (G a b i u s i in. 1989) (rys. 5). Ponadto kalcyklina okazała się identyczna z białkiem związanym z receptorem prolaktyny ( M u r p h y i in. 1989). Nie dziwi więc obserwacja T h o r d a r s o n a i in. (1991), że kalcyklina jest wydzielana przez kom órki doczesnej i stymuluje wydzielanie laktogenu II z trofoblastu. Jest to kolejny przykład białka z rodziny S-100, które występuje pozakom órkow o i wykazuje określoną aktywność biologiczną. Oznaczanie poziom u kalcykliny w tkankach lub w płynach ustrojowych może mieć znaczenie diagnostyczne. Ze względu na to, że kalcyklina występuje w fibroblastach, choroby związane z przerostem tkanki łącznej m ogą być diagnozowane na podstawie wzrostu poziom u tego białka. Inne choroby, np. żółciowa m arskość w ątroby (którą cechuje zwiększona proliferacja kom órek kanalików żółciowych), m ogą być również w ten sposób diagnozowane ( K u ź n i c k i in. 1992).

Z A K O Ń C Z E N IE

Oznaczanie występowania białek wiążących wapń oraz ich poziom u nie jest dotychczas stosowane rutynow o w celach diagnostycznych. Sytuacja ta może się niedługo zmienić, ponieważ coraz więcej danych wskazuje na to, że białka te mogą być m arkeram i wielu stanów patologicznych.

Niektóre właściwości białek wiążących wapń czynią je szczególnie cennymi m arkeram i: a) występują one tylko w pewnych tkankach i typach kom órek i to w dużym stężeniu, b) ekspresja wielu z nich zależy od fazy cyklu kom órkowego, c) występują głównie w cytoplazmie, d) niektóre są wydzielane na zewnątrz do płynów ustrojowych, e) nie ulegają szybkiej proteolizie. W najbliższych latach można oczekiwać nowych informacji na tem at zastosowania białek wiążących wapń jako m arkerów stanów patologicznych.

(14)

C A L C IU M B IN D IN G PR O T E IN S AS M A R K E R S O F PA TH O L O G IC A L C O N D ITIO N S S u m m a r y

The distribution o f calcium ion in eukaryota and its role in cellular functions are described in the introduction. Next chapter contains the inform ation about calcium homeostasis under pathological conditions such as muscle dystrophy and tumorigenesis. Classification of calcium binding proteins and their general properties are summarized in the next chapter. Sorcin, oncom odulin, parvalbum in, calbindin and S -100 proteins are described in the relation to some pathological situations. M ajority of inform ation is focused on some members o f S-100 proteins family such as S-100 alpha, S-100 beta, M RP-8 i M RP-14 (cystic fibrosis antigen), p9K a and calcyclin. These proteins seem to be potential m arkers o f some diseases since they are: soluble, expressed in tissue- and cell-specific manner, excreted from cells, and resistant to proteolysis. It is suggested that some members o f S-100 proteins family might become the clinically useful m arkers o f some diseases.

L IT E R A T U R A

B a i m b r i d g e K. G. , M o o d y I., M i 11 e r J. J. — Reduction o f rat hippocampal calcium binding protein following commissural, amygdala, septal, perforant path and oflactory bulb kindling. Epilepsia 26: 460-465, 1985.

B a r t h e C., C a r r e r e J. F i g a r e l l a C., G u y - C r o t t e O. — Isolation o f th e ,,Cystic Fibrosis Protein”fro m Serum. Clin. Chem. 35: 1901-1905, 1989.

B a r r a c l o u g h R., S a v i n J., K., R u d 1 a n d Ph. S. — Molecular cloning and sequence o f the gene fo r p9Ka. A cultured myoepithelial cell protein with strong homology to S-100, a calcium-binding protein. J. Mol. Biol. 198: 13-20, 1987.

B a r r a c l o u g h R., G i b b s F., S m i t h J. A., H a y n e s G. A. , R u d l a n d P h . S. — Calcium-ion binding by the potential calcium-ion-binding protein, p9Ka. Biochem. Biophys.

Res. Com m un. 169: 660-666, 1990.

B e r c h t o l d M. W. , E p s t e i n P., B e a u d e t A. L., P a y n e M. E., H e i z m a n n C. W. , M e a n s A. R. — Structural organization and chromosomal assignment o f the parvalbumin gene. J. Biol. Chem. 262: 8696-8701, 1987.

B e r r i d g e M. J. — Cell signalling through cytoplasmic calcium oscillations, w ,,Experiments to Theoretical M odels”, G o l d b e t e r A. (red.), Academic Press Limited, 449-459, 1989. B o y n t o n A. L., W h i t f i e l d J. F. — D ifferent calcium requirements fo r proliferation o f

conditionally and unconditionally tumorigenic mouse cells. Proc. N atl. Acad. Sei. USA 73: 1651-1654, 1986.

B r ü g g e n J., T a r c s a y L., C e r l e t t i N. , O d i n k K. , R u t i s h a u s e r M. , H o l l a n d e r G. , S o r g C. — The molecular nature o f cystic fibrosis antigen. N ature 331: 570, 1988. C a l a b r e t t a B., V e n t u r e l l i D. , K a c z m a r e k L., N a r n i F., T a l p a z M. , A n

d e r s o n B., B e r a n M. , B a s e r g a R. — Altered expression o f G l-specific genes in human malignant m yeloid cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 1495-1498, 1986.

C e l is J. E. i in. — The M R C -5 human embryonal lung fibroblasts two-dimensional gel cellular protein database: Quantitative identification o f polypeptides whose relative abundance differs between quiescent, proliferating and SV 40 transformed cells. Electrophoresis 11: 1072-1113,

1990.

C i t t a c h i n i A., B o s s i D. , D n i A. M. , C a l v i e l l o G. , W o l f F., T e r r a n o v a T. — Lack o f effect o f the CcP+ -ionophore A23187 on tumor cells. Biochem. Biophys. A cta 645:

177-182, 1981.

C l e m e n t s M. R. J o h n s o n L., F r a s e r D. R. — A new mechanism fo r induced vitamin D deficiency in calcium deprivation. N ature 324: 62-65, 1987.

(15)

F u j i t a T. — Aging and calcium metabolism, [w ] The Biology and Medicine o f Signal Transduction, N i s h i z u k a Y. i in., (red.), Raven Press, New Y ork, 542-547, 1990.

G a b i u s H . J., B a r d o s i A., G a b i u s S., H e l l m a n n K. L., K a r a s M. , K r a t z i n H. — Identification o f cell cycle-dependent gene product as a sialic acid-binding protein.Biochem. Biophys. Res. Com m un. 163: 506-512, 1989.

G e r k e V. — Tyrosine protein kinase substrate p36: A member o f the annexin fam ily o f Ca2 + (phospholipid-binding proteins. Cell M otil. Cytoskel. 14: 449-454, 1989.

G e r k e V., J o h n s s o n N. , W e b e r K. , — Intestinal Ca2+ (lipid-binding proteins, [w ] Stimulus Response Coupling: The role o f intracellular calcium-binding proteins, S m i t h V . L ., D e d m a n J. R. (red.), CRS Press, Boston, 311-338, 1990.

G i l l e n M. F., B a n v i l l e D., R u t l e d g e R. G. , N a r a n g S., S e l i g y V. L., W h i t f i e l d J. F., M a c M a n u s J. P. — A complete complementary D NA fo r the oncodevelopmental calcium-binding protein, oncomodulin. J. Biol. Chem. 262: 5308-5312, 1987. G r z e l a k o w s k a - S z t a b e r t B. — Oporność wielolekowa kom órek nowotworowych. Post.

Bioch. 35: 513-542, 1989.

H a i m o t o H. K a t o K. — S I 00 ( alfa-alfa) protein, a calcium binding protein is localized in the slow-twitch muscle fiber. J. Neurochem. 48: 917-923, 1987.

H a m a d a H. , O k o c h i E., O h - h a r a T., T s u r u o T. — Purification o f the M r 22,000 Calcium-binding Protein (Sorcin) associated with multidrug resistance and its detection with monoclonal antibodies. Cancer Res. 48: 3173-3178, 1988.

H a z e l t o n B. J. T u p p e r T. — Intracellural ionic changes in norm al and transform ed hum an fibroblasts after extracellular Ca2+ deprivation. Biochem. J. 194: 707-711, 1981

H e i z m a n n C. W. — Molecular and functional aspects o f some cytosolic calcium-binding protein. N ATO ASI 48, Calcium T ransport and Intracellular, 1990.

H e i z m a n n C . W., B e r c h t o l d M. W. — Expression o f parvalbumin and other Caz+ -binding proteins in normal and tumor cells: a topical review. Cell Calcium 8: 1-41, 1987.

H e i z m a n C. W. , B r a u n K. — Changes in Ca 2+ binding in human neurogenerative disorders. Trends in Neurosciences (w druku).

H e i z m a n n C. W. , H u n z i k e r W. Intracellular calcium-binding molecules, [w] Intracellular Calcium Regulation”, F. B r o n n e r , (red.) A lan R. Liss, Inc., 211-247, 1990.

H e i z m a n n C. W. , S c h a f e r B. W. — Internal calcium-binding proteins. Cell. Biol. 1: 277-282, 1990. H i l t D . C . , K l i g m a n D . — The S-100 protein fam ily: a biochemical and functional overview [w] Novel Calcium Binding Proteins. Fundamentals and Clinical Implications, C. W. H eizmann (red.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 1991, s. 65-104.

I c h i m i y a Y., E m s o n P. C., M o u n t j o y C . , Q . , L a w s o n D. E. M. , H e i z m a n n C. W. — Loss o f calbindin immunoreactive neurons fro m the cortex in Alzheimer-type dementia. Brain Res. 475: 156-159, 1988.

J a c k s o n - G r u s b y L. L., S w i e r g i e l J., L i n z e r D. I. H. — A growth-related m R N A in cultured mouse cells encodes a placental calcium binding protein. Nucl. Acid. Res. 15:6677-6690,1987. J a k o b s A. E. M. , B e n d e r s A. D. A. G. M. , O o s t e r h o f A., V e e r k a m p J. H. van M i e r P., W e v e r s R. A., J o o s t e n E. M .G . — The calcium homeostasis and the membrane potential o f cultured muscle cells fro m patients with myotonic dystrophy. Biochem. Biophys. A cta

1096: 14-19, 1991.

J o c k u s c h H. , F r i e d r i c h G. , Z i p p e l M. — Serum parvalbumin, an indicator o f muscle disease in murine dystrophy and myotonia. Muscle & Nerve 13: 551-555, 1990.

K a t o K. , H a i m o t o H. , A r i y o s h i Y., H o r i s a w a M. , W a s h i d a H. , K i m u r a S. — High levels o f S-100 ( alfa-alfa) protein in tumor tissues and in sera o f patients with renal cell carcinoma. J. Cane. Res. 78, 856-862, 1085.

K l i g m a n D., M a r s h a k D. — Purification and characterization o f a neurite extension factor fro m bovine brain. Proc. N atl. Acad. Sei. USA 85: 7136-7139.

K o s h 1 a n d D. E., — The cystic fibrosis gene story. Science 245, 1029, 1989.

(16)

1 2 0 Jacek Kuźnicki, Jolanta Kordowska

K u ź n i c k i J.— Calcyclin — From gene to protein, [w] Novel Calcium Binding Proteins. Fundamentals and Clinical Implications. C. W. H eizm ann (red.), Berlin, Heidelberg, Sprin ger-Verlag 1991, s. 157-168.

K u ź n i c k i J., F i l i p e k A. — Purification o f a novel calcium-binding protein (10,5 kD a) from Ehrlich ascites tumour cells. Biochem. J. 247: 663-667.

K u ź n i c k i J., K o r d o w s k a J., P u z i a n o w s k a M. , W o ź n i e w i c z B.M. — Calcyclin as a new marker o f human epithelial cells and fibroblasts. Exp. Cell Res. (w druku).

L e r a n t h C., R i b a k C.E. — Calcium-binding proteins are concentrated in the CA2 field o f the m onkey hippocampus: a possible key to this region’s resistance to epileptic damage. Exp. Brain Res. 85: 129-136, 1991.

M a c M a n u s J.P., W h i t f i e l d J.F . — Oncomodulin: A calcium-binding protein fro m Morris Hepatoma, [w] “Calcium and cell fu n ctio n ”, IV Academic Press, Inc. 412-440, 1983.

M a s i a k o w s k i P., S h o o t e r E.M . — Nerve growth factor induces the genes fo r two proteins related to a fa m ily o f calcium-binding proteins in PC12 cells. Proc. N atl. Acad. Sei. USA 85: 1277-1281, 1988.

M a t t s o n M .P., R y c h l i k B., C h u Ch., C h r i s t a k o s S. — Evidence fo r calcium-reducing and excito-protective roles fo r the calcium-binding protein calbindin-D28K in cultured hippocam pal neurons. N euron 4: 41-51, 1991.

M a y e l - A f s h a r S., L a n e S.M ., L a w s o n D.E. — Relationship between the levels o f calbindin synthesis and calbindin m R N A in chick intestine. J. Biol. Chem. 263: 4355-4361, 1988. M e y e r s M.B., S c h n e i d e r K.A., S p e n g l e r B.A., C h a n g T.D ., B i e d 1 e r — J.L . Sorcin

(V 1 9 ), a soluble acidic calcium-binding proteins is overproduced in multidrug-resistant cells. Biochem. Pharm acol. 36: 2373-238, 1987.

M o r g a n D.W ., W e l t o n A .F. — Specific in vitro activation o f Ca, M g-ATPase by vitamin D-dependent rat renal calcium binding protein (calbindin D 28K). Biochem. Biophys. Res. Com m un. 138: 547-553, 1986.

M o s s S.E., C r u m p t o n M .J. — The lipocortins and the EF-hand evolution. TiBS 15: 11-12,1990. M u r p h y C.L., M u r p h y L.J., T s u y u k i D., D u c k w o r t h M .L., S h i u R.P.C. — Cloning

L. and characterization o f a cD NA encoding a highly conserved, putative calcium binding protein, identified by an anti-prolactin receptor antiserum. J. Biol. Chem. 263: 2397-2401, 1988. N a i r S., S a m y T.S.A., K r i s h a n A. — Calcium, calmodulin, and protein content o f

adriamycin-resistant a n d — sensitive murine leukemic cells. Cancer Res. 46: 229-232, 1986. O d i n k K. , C e r l e t t i N. , B r u g g e n J., C l e r e R .G ., T a r c s a y L., Z w a d l o G. ,

G e r h a r d s G. , S c h l e g e l R., S o r g C. — Two calcium-binding proteins in infiltrate macrophages o f rheumatoid arthritis. N ature 330: 80-82, 1987.

O r r e n i u s S., M c C o n k e y J.D ., B e 11 o m o G ., N i c o t e r a P. — Role o f Ca2+ in toxic cell killing. TiBS 10: 281-284, 1989.

O s h i m a T., M a t s u u r a H. , M a t s u m o t o K. , K i d o K. , K a j i y a m a G. — Role of cellular calcium in salt sensitivity o f patients with essential hypertension. Hypertension 11: 703-707, 1988.

P e t e r s o n C., G o l d m a n J.E. — Alternations in calcium content and biochemical processes in cultured skin fibroblasts fro m aged and Alzheimer donors. Proc. N atl. Acad. Sei. USA 83: 2758-2762, 1986.

R a s m u s s e n H. — The complexities o f intracellular CcP + signalling. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371: 191-204, 1990.

R o b e r t s De. W. , M e y e r s M.B., B i e d 1 e r J.L., W i g g i n s L.G. — Association o f sorcin with drug resistance in L1210 cells. Cancer Chem other. Pharm . 23: 19-25, 1989.

S c h a f f n e r W. , D a m b a d e r M.A. — Homeostaza wapnia. Sandoz Revue 1: 41-48, 1989. S c o 11 i A.L., N i t s c h C. — The perforant path in the seizure sensitive gerbil contains the

Caz + -binding protein parvalbumin. Exp. Brain. Res. 85: 137-143, 1991.

S h i b u y a S., W a k a y a m a Y., N a k a d a H. , J i m i T., K a t o K. — Serum S-100 protein level in myotonic dystrophy. Med. Sei. Res. 15: 1055, 1987.

(17)

S m i t h V., K a e t z e l M .A ., D e d m a n J.R . — Stimulus-response coupling: the search for intracellular calcium m ediator proteins. Cell regulation 1: 165-172, 1990.

S t a u n M. , J a r n u m S. — Measurement o f the 10 000 - Molecular weight calcium-binding protein in small-intestinal biopsy specimens from patients with malabsorption syndromes., 1988. S t u h l f a u t h I., R e i n i n g h a u s J., J o c k u s c h H. , H e i z m a n n C.W. — Calcium-binding

protein, parvalbumin, is reduced in m utant mammalian muscle with abnormal contractile properties. Proc. N atl. Acad. Sei. USA 81: 4814-4818, 1984.

S w i e r e n g a S.H ., W h i t f i e l d J .F., K a r a s a k i S. — Loss ofproliferative calcium dependence: Simple in vitro indicator o f tumorigenicity. Proc. N atl. Acad. Sei. USA 75: 6069-6072, 1978. T h o r d a r s o n G. , S o u t h a r d J.N ., T a l a m a n t e s F. — Purification and characterization o f

mouse decidual calcyclin: a novel stimulator o f mouse placental lactogen — I I secretion. Endocrinology 129: 1257-1265, 1991.

T o n i n i G .P., A n t o n e 11 a C., C a r a A., Di M a r t i n o D .Di. — Inducible expression o f calcyclin, a gene with strong homology to S-100 protein, during neuroblastoma cell differentiation and its prevalent expression in Schwann-like cell lines. Cancer Res. 51: 1733-1737, 1991. T s u r u o T., L i d a H. , K a w a b a t a H. , T s u k a g o s h i S., S a k u r a i Y. — High calcium

content o f pleiotropic drug-resistant P388 and K562 leukemia and Chinese hamster, ovary cells. Cancer Res. 44: 5095-5099, 1984.

T u p p e r T . , K a u f m a n L., B o d i n e P.B. — Related effects o f calcium and serum on the G1 phase o f the human W I 38 fibroblasts. J. Cell Physiol. 104: 97-103, 1980.

V a n E 1 d i k L.J., J e n s e n R .A ., E h r e n f r i e d B.A., W h e t s e 11 W.O. — Immunohistoche- mical localization o f S-100 in human nervous system tumors by using monoclonal antibodies with specificity fo r S-100 polypeptide. J. Histochem. Cytochem. 8: 977-982, 1986.

W a 1 r e r s J.R .F., H o w a r d A., C h a r p i n M.V., G n i e c k o K.C. B r o d i n P., T h u 1 i n E., F o r s e n S. — Stimulation o f intestinal basolateral membrane calcium-pump activity by recombinant synthetic calbindin-D9K and specific mutants. Biochem. Biophys. Res. Comm un.

170: 603-608, 1990.

W e t e r m a n M .A .J., S t o o p e n G .M ., v a n M u i j e n G .N .P., K u ź n i c k i J., R u i t e r D.J., B 1 o m e r s H .P.J. — Expression o f calcyclin in human melanoma cell lines correlates with metastatic behaviour in nude mice. Cancer Res. 52, 1291-1296, 1992.

Z w a d l o G. , B r ü g g e n J., G e r h a r d s G. , S c h i e g e l R., S o r g C. — Two calcium-binding proteins associated with specific stages o f myeloid cell differentiation are expressed by subsets o f macrophages in inflammatory tissues. Clin. Exp. Im munol. 72: 510-515, 1988.