Jolanta Artym | Michał Zimecki
Rola laktoferyny w zakażeniach i zapaleniu
The role of lactoferrin in infections and inflammation
Zakład Terapii Doświadczalnej Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. L. Hirszfelda we Wrocławiu } Jolanta Artym, Zakład Terapii Doświadczalnej, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej, Polska Akademia Nauk im. L. Hirszfelda
we Wrocławiu, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław, Tel.: (71) 370 99 18, Fax: (71) 337 13 82, e-mail: limbiol@iitd.pan.wroc.pl
Wpłynęło: 28.07.2013 Zaakceptowano: 21.08.2013
Streszczenie: Działanie przeciwmikrobiologiczne laktoferyny
(LF) należy do najwcześniej odkrytych i obecnie najlepiej udoku-mentowanych właściwości tego białka, potwierdzonych licznymi badaniami laboratoryjnymi i testami klinicznymi. LF jest aktywna wobec wszystkich grup drobnoustrojów: bakterii, grzybów, pier-wotniaków chorobotwórczych i wirusów. Mechanizm działania białka wobec trzech pierwszych jest podobny i obejmuje głównie różne sposoby bezpośredniego uszkadzania komórek patogenów oraz blokowania ich interakcji z komórkami gospodarza. Aktyw-ność wobec wirusów polega przede wszystkim na hamowaniu wczesnych etapów zakażenia, czyli adsorpcji i wnikania cząste-czek wirusów do komórek gospodarza. W zwalczaniu wszystkich typów drobnoustrojów duże znaczenie ma pośrednie działanie laktoferyny, aktywujące własne siły obronne ustroju. LF wykazuje synergistyczne działanie z innymi naturalnymi białkami o działa-niu przeciwmikrobiologicznym oraz standardowo stosowanymi chemioterapeutykami. Jako produkt naturalny jest całkowicie bezpieczna i może być przyjmowana przez pacjentów w różnym wieku i stanie zdrowia w celach profilaktyki oraz terapii zakażeń i stanów zapalnych. W zbliżającej się dobie poantybiotykowej, laktoferyna może zatem stanowić jeden z alternatywnych ele-mentów terapii zakażeń oraz terapii działających synergistycznie z antybiotykami.
Słowa kluczowe: laktoferyna | sepsa | stan zapalny | zakażenie:
bakteryjne, grzybicze, pierwotniakowe, wirusowe
Abstract: Among properties of lactoferrin (LF) the antimicrobial
actions were firstly discovered and best documented in subse-quent, numerous laboratory studies and clinical trials. LF is active against all categories of microorganisms: bacteria, fungi, protozoa and viruses. The mechanisms of lactoferrin action against the first three categories of pathogens is similar and encompasses various ways of direct destruction of pathogen cells and disturbance of their interactions with host’s cells. The actions of LF against viruses involve chiefly early stages of infection i.e. virus adsorption and penetration of host’s cells. In combat of all types of microorgani-sms a major significance is attributed to the indirect actions of lactoferrin via activation of self defense mechanisms. LF displays
Wstęp
Gdy w pierwszej połowie XX wieku wprowadzono do użytku antybiotyki, wydawało się, że problem leczenia zakażeń został skutecznie rozwiązany. Powszechność sto-sowania tych leków uratowała w ciągu kolejnych kilku-dziesięciu lat życie milionów ludzi. Dzięki antybiotykom i szczepionkom prawie całkowicie udało się wyeliminować większość śmiertelnych chorób zakaźnych, takich jak: bło-nica, cholera, dżuma czy dur brzuszny. Jednak to właśnie powszechność stosowania antybiotyków zarówno w lecze-niu ludzi i zwierząt domowych, jak i w hodowli zwierząt gospodarskich doprowadziła do rozwoju oporności wielu szczepów bakteryjnych. To sprawiło, że obecnie leczenie poważnych infekcji, w tym tych, które rozwijają się w śro-dowisku szpitalnym, jest trudniejsze i nie zawsze kończy się sukcesem [1, 2].
Podatność populacji ludzkiej na zakażenia jest w dużym stopniu związana z funkcjonowaniem układu odporno-ściowego (immunologicznego). W krajach rozwiniętych, o wysokim standardzie życia i poziomie opieki zdrowotnej, naturalna odporność organizmu stale się pogarsza, praw-dopodobnie na skutek niewłaściwego stylu życia i złych nawyków żywieniowych oraz znacznego zanieczyszczenia środowiska. Szczególne znaczenie ma stosowanie używek, przewlekły stres oraz wszelkie stany niedoborów żywienio-wych, a także zaburzenia odżywiania, w tym coraz częstsza
a synergistic action with other natural antimicrobial proteins and with conventional chemotherapeutics. Lactoferrin is absolutely safe as a natural product and may be applied both in prophylaxis as well as in therapy of infections by patients of different age and health condition. In times of inevitably approaching post-anti-biotic era lactoferrin could serve as an alternative or synergistic treatment in addition to antibiotic therapy.
Key words: bacterial, fungal, protozoan, viral infections |
inflam-mation | lactoferrin | sepsis
jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
schorzenia układu krążenia. Dodatkowo na pogarszający się status układu immunologicznego wpływa nieuzasadnio-ne nadużywanie leków, nie tylko antybiotyków, lecz także łatwo dostępnych (bez recepty) środków przeciwbólowych i niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Upośledzone działanie układu odpornościowego obserwuje się również u chorych po przeszczepach narządów, cierpiących na scho-rzenia z autoagresji, choroby nowotworowe i u zakażonych wirusem HIV. W wyniku postępu medycyny ilość takich pa-cjentów wciąż rośnie. U tych chorych można spodziewać się różnego rodzaju zakażeń miejscowych i uogólnionych, bar-dzo często spowodowanych nie tylko przez chorobotwórcze patogeny, lecz także przez drobnoustroje oportunistyczne barier ochronnych organizmu – skóry i błon śluzowych. Inne uwarunkowania przyczyniają się do wciąż bardzo licznych zakażeń w ubogich rozwijających się krajach Azji i Afryki, gdzie blisko dwa miliardy ludzi nie ma odpowied-niego dostępu do czystej i bezpiecznej wody pitnej oraz do służby zdrowia. Biegunki infekcyjne o różnej etiologii są przyczyną śmierci około 1,8 miliona ludzi na świecie rocznie, szczególnie małych dzieci (do 5. roku życia), głów-nie w okresie po odstawieniu od piersi.
Obecnie prognozuje się nastanie ery poantybiotykowej, kiedy to większość patogenów będzie oporna na antybio-tyki, co spowoduje duże trudności w skutecznym leczeniu infekcji. Wydaje się, że należy zweryfikować podejście do le-czenia zakażeń oraz zmienić złe nawyki nie tylko lekarzy, lecz także samych pacjentów. Zasadniczą rolę odgrywa tu zrozumienie złożoności wzajemnych oddziaływań orga-nizmu człowieka i środowiska, w którym żyjemy. Należy pamiętać, że organizm ludzki już w okresie porodu siłami natury jest zasiedlany przez liczne mikroorganizmy bytują-ce w układzie rodnym, pokarmowym oraz na skórze mat-ki. Dalsza kolonizacja następuje w okresie noworodkowym i niemowlęcym, tak że już w pierwszym roku życia ustala się równowaga pomiędzy mikroflorą stałą i okresowo zasiedla-jącą organizm, w tym względnie patogenną (oportunistycz-ną). Mikroorganizmy kolonizujące człowieka stają się sym-biontami (komensalami), skutecznie konkurując o miejsce do życia z patogenami ze środowiska zewnętrznego. „Spo-łeczność” różnych drobnoustrojów zasiedlających ludzki organizm (mikrobiom) znacznie przewyższa liczbę komó-rek, z których składa się ciało człowieka: na jedną komórkę przypada aż 10 komórek drobnoustrojów (łącznie to około 1014 komórek drobnoustrojów, co w przeliczeniu na wagę
daje około 2–2,5 kg). Skórę, oczy i uszy zasiedla 48 gatun-ków, górne drogi oddechowe – 130 gatungatun-ków, drogi moczo-wo-płciowe – 70 gatunków, a przewód pokarmowy – 110 gatunków drobnoustrojów, głównie bakterii i grzybów [3]. Od niedawna znany jest różnoraki pożyteczny wpływ tych mikroorganizmów na zdrowie człowieka. Wiadomo, że ko-rzystnie wpływają one m.in. na jelita, chronią przed
rozwo-odpowiadać na zewnętrze zagrożenia oraz chronią przed rozwojem schorzeń autoimmunologicznych [4]. Znisz-czenie tej mikroflory jest niepożądanym działaniem po-wszechnie stosowanych antybiotyków o szerokim spektrum działania, prowadzącym do rozwoju zakażeń mikroflorą pa-togenną bądź względnie papa-togenną.
W świetle zaprezentowanych faktów wydaje się, że za-sadnicze znaczenie dla zdrowia człowieka ma zachowanie równowagi między wszechobecnymi drobnoustrojami a or-ganizmem gospodarza, czego nie zapewni użycie chemio-terapeutyków (w tym antybiotyków przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybiczych itp.). Pomóc mogą tutaj różnego rodza-ju naturalne środki, które powinny znaleźć zastosowanie nie tylko w leczeniu już istniejących infekcji i wywołanych przez nie stanów zapalnych, lecz także w skutecznej ochro-nie organizmu przed rozwojem tych schorzeń. Do takich naturalnych środków przeciwmikrobiologicznych może-my zaliczyć choćby bakteriofagi (stosowane już w klinice) oraz różnego rodzaju białka izolowane z żywności (w tym z mleka), które są obecnie intensywnie badane w próbach przedklinicznych i klinicznych [5, 6]. Część z nich znalazła również zastosowanie w produktach przemysłu farmaceu-tycznego i spożywczego [6]. Do takich naturalnych produk-tów izolowanych z mleka możemy zaliczyć m.in.: kazeinę, α-laktoalbuminę, immunoglobuliny, laktoperoksydazę, li-zozym oraz laktoferynę.
Laktoferyna jest ewolucyjnie starym, wielofunkcyjnym białkiem zaangażowanym w metabolizm żelaza oraz odpor-ność wrodzoną i nabytą u ssaków. Występuje w wydzieli-nach ustrojowych (mleku, łzach, ślinie, wydzielinie śluzów-ki nosa, dróg oddechowych, pokarmowych oraz rodnych, pocie, moczu itp.) oraz ziarnistościach krążących neutro-filów (granulocytów obojętnochłonnych), skąd może być uwalniana do osocza i miejsc lokalnie naciekanych przez te komórki [7, 8]. Obecnie uważa się, że białko pełni nie-co odmienne funkcje w zależności od lokalizacji: LF w pły-nach wydzielniczych uczestniczy głównie w odpowiedzi przeciwzakaźnej we wrotach zakażenia oraz reguluje skład mikroflory komensalnej, natomiast LF zawarta w neutrofi-lach – poza działaniem przeciwzakaźnym – reguluje rów-nież funkcje układu odpornościowego, procesy mielopoezy, tworzenia kości, metabolizm glukozy i lipidów oraz inne procesy [9, 10]. Białko wykazuje swoją aktywność po zwią-zaniu się do różnego rodzaju receptorów obecnych na więk-szości komórek ustroju. Są to m.in.: glikozaminoglikany (GAG), receptory lektynowe (np. obecna na nabłonku jeli-towym intelektyna), nukleolina, receptor LRP1 i inne [11]. LF wchodzi ponadto w interakcje z innymi cząsteczkami organizmu gospodarza, m.in. rozpuszczalnym receptorem bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS) – cząsteczką sCD14 czy komórkowym receptorem LPS – TLR4 (ang. Toll-like receptor 4) [12]. Białko wiąże się również z różnymi
struk-mi komórkowystruk-mi, LPS/lipidem A, białkastruk-mi porynowystruk-mi, adhezynami, niemetylowanymi oligonukleotydami CpG, kwasami nukleinowymi i innymi. Oddziaływania LF z tymi cząsteczkami, czy to pochodzenia ssaczego czy mikrobiolo-gicznego, mają zasadnicze znaczenie dla aktywności prze-ciwmikrobiologicznej i immunomodulującej białka.
W pracy omówiono właściwości przeciwmikrobiologicz-ne i immunomodulujące laktoferyny. Skupiono się na me-chanizmie działania białka wobec poszczególnych grup drobnoustrojów: bakterii, grzybów, pierwotniaków oraz wirusów. Omówiono również wybrane, przykładowe bada-nia przedkliniczne i kliniczne z użyciem LF w profilaktyce i terapii różnego rodzaju zakażeń oraz związanych z nimi stanów zapalnych.
Właściwości przeciwmikrobiologiczne
laktoferyny
Przeciwmikrobiologiczne działanie białka należy do jego najwcześniej odkrytych i najlepiej udokumentowanych wła-ściwości. LF działa na wszystkie grupy mikroorganizmów: bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, grzyby, pasożyt-nicze pierwotniaki oraz wirusy otoczkowe i bezotoczko-we [13]. Taką aktywność ma zarówno białko wydzielnicze, obecne na powierzchni błon śluzowych, jak i to zawarte w ziarnistościach granulocytów i stąd uwalniane do krąże-nia oraz lokalnie do tkanek objętych zakażeniem i proce-sem zapalnym. W stanie zdrowia surowicze stężenia LF nie są duże i zwykle nie przekraczają 0,5–1 μg/ml. W ostrych stanach zapalnych lub urazach wzrastają jednak wielokrot-nie, osiągając przykładowo wartość 200 μg/ml w sepsie i 40 μg/ml po rozległym oparzeniu. Podobnie stężenie białka wzrasta lokalnie w miejscu toczącego się procesu zapalnego. W ślinie osób zdrowych wynosi średnio 4 μg/ml, u chorych z periodontitis osiąga wartość 12 μg/ml, a u osób naświetla-nych w ramach radioterapii raka – 80 μg/ml [10]. Oszaco-wano, że zdrowy organizm człowieka wytwarza dziennie około 5 g LF neutrofilowej, z czego jedynie około 0,5 g jest uwalniane podczas normalnego obrotu granulocytów. W czasie zakażenia lub zapalenia ilości te wzrastają do 30 g, z czego ⅓ (10 g) jest uwalniana do krążenia i miejsc lokalnie naciekanych przez neutrofile, co stanowi niebagatelną ilość.
Granulocyty obojętnochłonne to jedne z najważniejszych komórek uczestniczących w zwalczaniu zakażeń. Ich na-pływ do miejsc zakażenia lub uszkodzenia tkanek jest moż-liwy dzięki wcześniejszej aktywacji układu odpornościowe-go, m.in.: makrofagów, mastocytów, eozynofilów, komórek NK (ang. natural killer) czy komórek dendrytycznych. W tej wczesnej odpowiedzi uczestniczą cytokiny prozapalne, głównie: interleukina (IL)- 1, -6, -8 czy TNF-α (ang. tumor necrosis factor α). Aktywowane neutrofile unieszkodliwiają
na Ryc. 1. Neutrofile – ulegając degranulacji – wyrzucają na zewnątrz liczne enzymy (m.in.: elastazę, kolagenazę, lizo-zym, mieloperoksydazę, laktoferynę), które niszczą komórki drobnoustrojów. Podobny los spotyka patogeny pochłonię-te przez granulocyty na drodze fagocytozy. W końcu, jak niedawno ustalono, granulocyty mogą tworzyć tzw. zew- nątrzkomórkową sieć neutrofilową – NET (ang. neutrophil extracellular traps) [8, 14, 15]. Po aktywacji komórki wy-rzucają na zewnątrz DNA (wraz z histonami) oraz zawar-tość ziarnistości, które tworzą razem charakterystyczną sieć. W utworzoną strukturę zostają złapane drobnoustroje: bak-terie, grzyby, parazyty, a nawet wirusy (np. HIV) i są tam niszczone przez czynniki bójcze komórek gospodarza. W czasie unieszkodliwiania zarazków ginie również sam granulocyt. Taki proces aktywnej śmierci określany jest jako NET-oza (ang. NET-osis). Obecnie wiadomo, że w skład NET wchodzą 24 różne białka niejądrowe, w tym elastaza, kalprotektyna i LF stanowią 2–6% wszystkich białek w sieci (70% to histony). Ich ilość w NET wykazuje dość duże zróż-nicowanie osobnicze. Oszacowano, że zawartość LF w NET waha się w przedziale 0,1–0,85 μg/106 neutrofilów,
w zależ-ności od badanego dawcy tych komórek [15]. W procesie
Ryc. 1. Sposoby zwalczania patogenów przez granulocyt obojętno-chłonny. A. Po dotarciu na miejsce zakażenia komórka ulega degranu-lacji, uwalniając na zewnątrz zawartość ziarnistości (w tym: laktoferynę, elastazę, mieloperoksydazę), które niszczą drobnoustroje. B. LF może być degradowana do aktywnych peptydów (laktoferycyny i innych), które działają razem z natywnym białkiem. C. Komórki patogenów mogą być fagocytowane, a po połączeniu fagosomu z ziarnistościami komórkowymi powstaje fagolizosom, w którym dochodzi do niszcze-nia patogenów. Tu również mogą powstawać z LF pochodne peptydy.
D. Po połączeniu białek ziarnistości z uwolnioną z jądra chromatyną na
zewnątrz komórki tworzy się NET, która jest swoistą pułapką dla pato-genów. Tu są one niszczone przez składniki komórki gospodarza.
Przedruk z: Artym J. Laktoferyna – Niezwykłe Białko. 1st edn. Wydawnictwo
lecz także uwalniane z niej przy udziale enzymów komórko-wych lub bakteryjnych aktywne peptydy (w tym laktofery-cyna). Warto zaznaczyć, że peptydy te wykazują często wie-lokrotnie silniejsze działanie przeciwmikrobiologiczne niż natywne białko [16]. Dokładne mechanizmy działania LF i pochodnych peptydów na poszczególne grupy patogenów zostały omówione w dalszej części pracy.
O roli laktoferyny w utrzymaniu odporności przeciwza-kaźnej ustroju możemy wnioskować z obecności polimorfi-zmów pojedynczego genu (ang. single nucleotide polymor-phism – SNP) w obrębie jej genu. Te zmiany, które dotyczą regionów cząsteczki istotnych dla funkcji przeciwmikrobio-logicznej białka (w tym początkowego złożonego z kilku-dziesięciu aminokwasów fragmentu laktoferycyny), skutku-ją pogorszeniem obronności organizmu [10]. Na przykład polimorfizm Lys29Arg (zmiana lizyny na argininę w pozy-cji 29. dojrzałego białka) wiąże się z występowaniem agre-sywnego zapalenia tkanek przyzębia u badanych pacjentów z Tajwanu, a polimorfizm Thr11Ala – z agresywnym zapa-leniem przyzębia u Afroamerykanów (ale nie występującym u rasy białej). Inne SNP w genie LF powiązano z podatnością na przewlekłe zapalenie zatok i tworzenie się polipów no-sowych w populacji polskiej, większą zapadalnością na bie-gunkę podróżnych u Amerykanów oraz z większym ryzy-kiem i nasileniem zakażenia oczu wirusem Herpes simplex. Obecność kilkudziesięciu polimorfizmów SNP stwierdzono też w genie LF bydła [17]. Cześć z nich wiąże się ze zmie-nioną ilością i strukturą powstającego białka i może mieć wpływ m.in. na podatność zwierząt na zapalenie wymienia.
Przeciwbakteryjne działanie laktoferyny
Już w kilka lat po izolacji LF z mleka ludzkiego oraz kro-wiego okazało się, że białko to hamuje wzrost bakterii. Mas-son i wsp. zaobserwowali, że laktoferyna z mleka ludzkiego dodana do hodowli hamuje wzrost Staphylococcus albus, ale działanie to zanika, gdy do roztworu białka doda się żelazo (Fe) [18]. Kolejne testy potwierdziły działanie LF poprzez sekwestrację żelaza, ale wykazały też wiele innych mecha-nizmów przeciwbakteryjnej aktywności białka. Możemy do nich zaliczyć: niszczenie osłon komórkowych i uszko-dzenie metabolizmu komórek bakteryjnych, hamowanie tworzenia biofilmu bakteryjnego, rozkład enzymatyczny bakteryjnych czynników wirulencji, tworzenie toksycznych dla bakterii reaktywnych form tlenu (RFT), indukcję śmierci apoptotycznej zakażonych komórek gospodarza oraz utrud-nianie procesu przylegania (adhezji) bakterii do komórek gospodarza. Wszystkie te działania możemy zaliczyć do bez-pośrednich sposobów zwalczania infekcji bakteryjnych, w odróżnieniu od pośredniego działania białka, polegające-go na wzmacnianiu układu odpornościowepolegające-go polegające-gospodarza, co w oczywisty sposób przyczynia się do skutecznej walki
działa nie tylko na bakterie, lecz także na grzyby mikrosko-powe i pasożytnicze pierwotniaki.
Laktoferyna obecna w ustroju (pochodzenia nabłonko-wego i neutrofilonabłonko-wego) jest wysycona żelazem w niewielkim stopniu (przeważnie 10–20%), dzięki czemu może łatwo wią-zać jony Fe, które napotka w środowisku. Podczas zakażenia stężenie tych jonów wrasta lokalnie na skutek uwalniania ich z uszkodzonych tkanek i komórek patogenów. Żelazo jest dla drobnoustrojów niezbędnym składnikiem odżywczym, stymulującym ich wzrost. Z tego też powodu organizm roz-winął różne strategie ukrywania żelaza przed patogenami. Do najbardziej skutecznych należy sekwestrowanie jonów
Fe przez białka: transferynę (TF) i laktoferynę. Takie
działa-nie przeważdziała-nie hamuje wzrost bakterii (czyli wywiera efekt bakteriostatyczny), a osłabione brakiem pierwiastka drobno-ustroje stają się łatwym celem dla innych składników układu odpornościowego [19]. Bakteriostatyczne (lub nawet bakte-riobójcze) działanie LF poprzez sekwestrację jonów żelaza zaobserwowano w testach in vitro wobec m.in.: Streptococcus
mutans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseu-domonas aeruginosa, Salmonella newport, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus oraz Legionella pneumophila [20–22].
Jak należy oczekiwać, takie działanie miała tylko apo-LF (LF w postaci ubogowysyconej żelazem), z kolei holo-LF (LF wy-sycona żelazem) traciła swoją aktywność, a nawet w niektó-rych przypadkach promowała namnażanie patogenów [22]. Wyniki uzyskiwane w układzie in vivo często były mniej jednoznaczne: apo-LF hamowała wzrost S. aureus w hodow-li, podczas gdy holo-LF nie wykazywała takiej aktywności. Jednak po podaniu białka myszom zakażonym bakteriami, obserwowano jego podobną aktywność bez względu na sto-pień wysycenia żelazem [23]. Warto tu też wspomnieć o cie-kawych wynikach testów na myszach zakażonych gruźlicą, gdzie bydlęca LF korygowała „przeładowanie” żelazem zwią-zane z genetycznym defektem metabolizmu tego pierwiast-ka (nopierwiast-kaut genu β2- mikroglobuliny) [24]. Obserwowano zredukowany rozsiew bakterii w narządach wewnętrznych na skutek sekwestracji żelaza przez laktoferynę. Zastosowa-no jednak białko wysycone żelazem aż w 70%, które z zało-żenia powinno być mało skuteczne. Ponadto odnotowano podniesienie surowiczych stężeń tlenku azotu (NOt) oraz
obniżenie ekspresji receptora transferyny na makrofagach, co ograniczało pobieranie żelaza przez te komórki. Zapre-zentowane wyniki badań sugerują, że w bardziej skompliko-wanych układach in vivo aktywność białka nie zależy wyłącz-nie od zdolności wiązania jonów żelaza.
Laktoferyna i transferyna po związaniu żelaza mogą stać się jego źródłem dla niektórych patogenów. Wykaza-no, że bakterie takie jak: Helicobacter pylori, Haemophilus
influenzae, Legionella pneumophila, Aeromonas hydrophila, Bordetella pertussis, E. coli oraz Moraxella sp. i Neisseria sp.
przystosowanie bakterii nie jest niczym zaskakującym, bio-rąc pod uwagę niezbędność żelaza do życia oraz jego bardzo niskie stężenia utrzymywane w ustroju gospodarza. Niektó-re bakterie (H. pylori, H. influenzae) wykształciły na swojej powierzchni specjalne białka, które wiążą białka gospodarza sekwestrujące żelazo i mogą z nich bezpośrednio pozyskiwać ten pierwiastek. Przeważnie są to białka swoiste gatunkowo, na przykład komórki ludzkiego patogenu – H. pylori nie po-bierają żelaza z LF bydlęcej, ale wyłącznie z laktoferyny lub transferyny ludzkiej [25]. Inne bakterie mogą z kolei wytwa-rzać tzw. siderofory, czyli rozpuszczalne niskocząsteczkowe związki silnie wiążące żelazo i dostarczające je do komórek „właściciela”. Przykładami takich związków są: wytwarzana przez A. hydrophila amonabaktyna, enterochelina jelito-wych szczepów E. coli, pobierające żelazo z TF i LF oraz pio-werdyna P. aeruginosa pozyskująca żelazo z TF [19].
Powyższe obserwacje mogą nasunąć pytania o bezpie-czeństwo stosowania laktoferyny w celach profilaktycznych lub leczniczych. Cytowane wyniki pochodzą z testów in
vi-tro, wymagają więc potwierdzenia w badaniach in vivo, ale
obecnie panuje przekonanie, że tu białko nie stanowi zagro-żenia, zważywszy głównie na zwykle jego niewielki stopień wysycenia żelazem. Ponadto ponad 90% patogenów nie wy-kształciło zdolności współzawodnictwa o żelazo z białkami chelatującymi gospodarza, a większość wytwarza siderofory, które wyłapują równie skutecznie wolne żelazo, więc LF czy TF nie są jego głównymi źródłami. Niemniej jednak, z uwa-gi na bezpieczeństwo, w schorzeniach wywoływanych przez wspomniane bakterie, białko (szczególnie zgodną gatunko-wo LF ludzką) należy aplikować z ostrożnością.
Podczas infekcji i stanów zapalnych, w tym uogólnionych oraz chorób przewlekłych (np. nowotworowych), obserwuje się obniżenie stężenia żelaza we krwi. Jego poziom jest wów-czas niższy nawet o połowę niż w stanie zdrowia, a wów-czasem Fe jest w ogóle niewykrywalne w krążeniu. Taki stan to hipofer-remia stanu zapalnego lub chorób przewlekłych. Zmniejsza się znacznie wchłanianie żelaza z przewodu pokarmowego z jednoczesną jego akumulacją w magazynach ustrojowych: wątrobie i śledzionie, co ogranicza dostawy pierwiastka do szpiku kostnego oraz proces hematopoezy. Jednocześnie ograniczona jest dostępność Fe dla drobnoustrojów czy ko-mórek raka. W latach 70. XX wieku powstała hipoteza, która z tym zjawiskiem wiąże LF [19, 26]. Według jej założeń, lak-toferyna uwolniona z aktywowanych granulocytów odbiera żelazo transferynie lub współzawodniczy z nią o ten pier-wiastek uwolniony np. z uszkodzonych tkanek czy komórek drobnoustrojów i odnosi go do komórek magazynujących w wątrobie i śledzionie, co może przyczynić się do ograni-czenia rozwoju choroby. Kilka badań potwierdza taki me-chanizm działania laktoferyny. Dożylne podanie prosię-tom LPS lub komórek E. coli w ciągu kilkudziesięciu minut znacznie (o 60%) obniżyło wyjściowe stężenie osoczowego
wej LF [27]. Można tu dostrzec wczesny mechanizm ochro-ny przed infekcją z udziałem endogennej laktoferyochro-ny. W po-dobny sposób działa białko egzogenne podane w celach profilaktycznych lub leczniczych. W badaniach Zagulskiego i wsp., przeprowadzonych na septycznych myszach i króli-kach, LF podana dożylnie zwiększała przeżywalność zwie-rząt, czemu towarzyszył czasowy spadek stężeń osoczowe-go żelaza oraz zmniejszenie wysycenia żelazem osoczowej TF, co wskazuje na rozwój hipoferremii. Bardziej skuteczna była laktoferyna słabo wysycona żelazem. Podanie Fe krótko przed zakażeniem lub po nim zmniejszało ochronne działa-nie LF, ale go działa-nie znosiło, co sugeruje bardziej kompleksowy mechanizm działania białka [28, 29]. Znacznie późniejsze badania nad metabolizmem żelaza wykazały, że za główny czynnik odpowiadający za rozwój hipoferremii w zapaleniu należy uznać hepcydynę – białko wytwarzane przez hepato-cyty i uwalniane do krążenia. Ogranicza ono przyswajanie żelaza z pokarmu oraz zatrzymuje je w ustrojowych maga-zynach, a zatem obniża jego stężenie w krążeniu i dostęp-ność dla procesów hematopoezy. Regulacja wytwarzania hepcydyny jest skomplikowana i – jak się wydaje – wciąż nie do końca poznana. Niedawne testy na zwierzętach i lu-dziach wykazały, że również LF może wpływać na poziom ekspresji hepcydyny [30, 31].
Ze zdolnością do sekwestracji żelaza wiąże się kolejne działanie przeciwbakteryjne LF – hamowanie tworzenia
biofilmu bakteryjnego, czyli zwartej struktury tworzonej
przez niektóre bakterie na powierzchni nabłonków podczas przewlekłych infekcji. Przejście form bakterii wolno żyją-cych do form tworzążyją-cych biofilm zawsze jest niekorzystne, bowiem te ostatnie są znacznie bardziej oporne zarówno na mechanizmy obronne gospodarza, jak i na podawane antybiotyki. Jedynie postać apo-LF hamowała tworzenie biofilmu przez P. aeruginosa, a wysycenie cząsteczki żelazem znosiło tę aktywność [32]. Poprzez sekwestrację żelaza lak-toferyna stymulowała ruch drgający komórek bakteryjnych, które dzięki temu stale przemieszczały się po podłożu oraz nie tworzyły kolonii i zwartej struktury biofilmu (Ryc. 2). Do utworzenia biofilmu potrzebne jest bowiem wyższe stężenie żelaza, ponieważ dostęp poszczególnych komó-rek do tego pierwiastka jest tutaj ograniczony. Obecność LF zmniejszyła także oporność bakterii na czynniki bakte-riobójcze: H2O2 oraz antybiotyk tobramycynę. Co ważne, do opisanego działania potrzebne są znacznie niższe stęże-nia LF niż do zahamowastęże-nia wzrostu bądź zabicia komórek bakteryjnych [32]. Laktoferyna hamowała również tworze-nie biofilmu przez komórki S. mutans oraz Porphyromonas
gingivalis i Prevotella intermedia, patogeny kolonizujące
jamę ustną i odpowiedzialne za próchnicę zębów oraz cho-roby przyzębia [33, 34]. Kolonizacja powierzchni zębów poprzedza rozwój płytki nazębnej, która ostatecznie pro-wadzi do rozwoju tych schorzeń. LF działała
synergistycz-nie z antybiotykami: ciprofloksacyną, klarytromycyną oraz minocykliną [34].
W co najmniej kliku badaniach zwraca się uwagę na synergistyczne przeciwbakteryjne działanie LF i in-nych białek ustrojowych: lizozymu, laktoperoksydazy oraz RNA-azy [35–38]. Współdziałanie laktoferyny i lizozy-mu obserwowano m.in. w: mleku, łzach, wydzielinie ucha środkowego czy ziarnistościach neutrofilów, ale szczególne znaczenie może ono mieć w zwalczaniu zakażeń bakteryj-nych oka. Apo-LF działała synergistycznie z lizozymem w hamowaniu wzrostu klinicznych izolatów Staphylococcus
epidermidis, co może mieć znaczenie ochronne dla osób
no-szących szkła kontaktowe [35, 39]. Okazało się, że bakterie te łatwo kolonizują powierzchnie różnych protez i implan-tów, ale nie powierzchnię soczewek kontaktowych, choć są one wykonane z podobnych materiałów. Można zatem przypuszczać, że właśnie słabo wysycona żelazem LF (ale nie holo-LF) oraz lizozym wspólnie warunkują taką ochro-nę. Laktoferyna zwiększała również aktywność wankomy-cyny zarówno wobec bakterii wolno żyjących, jak i tych izolowanych z biofilmu łzowego [39]. W próbie klinicznej, w której LF i lizozym podawano małym dzieciom z biegun-ką zakaźną jako dodatek do standardowego roztworu na-wadniającego, uzyskano lepsze wyniki leczenia niż w grupie kontrolnej otrzymującej tylko leczenie nawadniające [36]. Próba kliniczna u osób ze schorzeniami jamy ustnej i ha-litozą (nieprzyjemny zapach z ust) wykazała skuteczność tabletek z dodatkiem laktoferyny i laktoperoksydazy [37]. W testach in vitro RNA-zy wyizolowane z mleka krowiego znacznie zwiększały aktywność LF i pochodnych peptydów wobec różnych szczepów bakterii (m.in.: S. aureus, E. coli,
Salmonella Enteritidis, Klebsiella pneumoniae i innych) oraz
ków nie jest zaskoczeniem, bo mają one nieco inny zakres i mechanizm działania, dlatego doskonale się uzupełniają. Na przykład LF ułatwia przekształcenie nieaktywnej postaci lizozymu w aktywną oraz wstępnie narusza ścianę komó-rek bakteryjnych, ułatwiając tym samym dostęp lizozymu do struktur komórkowych położonych głębiej. Dzięki temu laktoferyna i lizozym wspólnie skutecznie niszczą bakterie Gram-ujemne (o złożonej ścianie komórkowej), podczas gdy sam lizozym działa na bakterie Gram-dodatnie [40].
W przytoczonym wcześniej badaniu Oho i wsp. mecha-nizm działania LF był inny niż sekwestracja jonów żela-za [33]. Mianowicie białko hamowało agregację S. mutans indukowaną obecnością śliny oraz ograniczało adhezję bakterii do filmu utworzonego przez ślinę na powierzchni zębów. LF silnie wiązała się do aglutyniny ślinowej i na za-sadzie współzawodnictwa uniemożliwiała związanie do niej komórek bakteryjnych. Zaprezentowane wyniki to przykład kolejnego przeciwbakteryjnego działania LF –
ogranicza-nia adhezji bakterii do powierzchni komórek gospoda-rza. Zjawisko przylegania bakterii jest ważnym czynnikiem
wirulencji, umożliwiającym skuteczne zasiedlanie tkanek, współzawodnictwo z mikroflorą fizjologiczną i unikanie mechanizmów obronnych gospodarza. Adhezję umożliwia-ją adhezyny – swoiste białka lub glikoproteiny w fimbriach i pili na powierzchni komórek bakteryjnych. Laktoferyna, wiążąc się z tymi cząsteczkami, uniemożliwia ich wiązanie się z komórkami nabłonka. Białko i pochodne peptydy po-dane doustnie ograniczały rozwój eksperymentalnego zaka-żenia układu moczowego u myszy [41]. Wiążąc się do fim-brii typu I na powierzchni uropatogennych szczepów E. coli, hamowały ich adhezję do nabłonka pęcherza moczowego. W obecności LF zanotowano również silną aglutynację bak-terii. W tych oddziaływaniach uczestniczyły reszty cukrowe cząsteczki laktoferyny [42]. Z kolei interakcje białka z ad-hezyną CFA I hamowały przyleganie enterotoksygennych
E. coli (ETEC) do komórek nabłonkowych [43]. Inny jest
na-tomiast mechanizm hamowania adhezji H. influenzae do ko-mórek nabłonkowych. Bakterie te wytwarzają niebezpieczne substancje: adhezynę Hap i proteazę IgA1. Pierwsza warun-kuje adhezję komórek bakteryjnych, a druga ten proces uła-twia, usuwając cząsteczki wydzielniczych przeciwciał klasy A (sIgA) z powierzchni bakterii. Laktoferyna degraduje obie substancje, ograniczając możliwość kolonizacji nabłonków. Białko to ma aktywność proteazy serynowej z centrum kata-litycznym przy resztach Ser259-Lys73 [44, 45]. LF może więc nie tylko wiązać i blokować składniki ustrojowe lub bakte-ryjne uczestniczące w adhezji patogenów, lecz także niektóre z nich degradować i w ten sposób unieczynniać.
Ten kolejny mechanizm przeciwbakteryjnego działania białka jest możliwy dzięki jego aktywności enzymatycznej. Wspomniana już aktywność proteazy serynowej warunko-wała bójcze działanie LF wobec S. aureus. IsdA,
powierzch-Ryc. 2. Hamowanie tworzenia biofilmu przez komórki bakteryjne w obecności laktoferyny. A. W nieobecności LF komórki bakteryjne wiążą się do powierzchni i namnażają. Komórki potomne zbijają się w większe zgrupowania, tworząc mikrokolonie, które ostatecznie tworzą biofilm. B. Obecność LF nie wpływa na wiązanie do powierzch-ni apowierzch-ni namnażapowierzch-nie komórek bakteryjnych, ale stymuluje ruchliwość bakterii, dzięki temu przemieszczają się one w różnych kierunkach, co zapobiega tworzeniu biofilmu.
Przedruk z: Artym J. Laktoferyna – Niezwykłe Białko. 1st edn. Wydawnictwo
niowe białko tych bakterii uczestniczące w kolonizacji nabłonka, może natomiast wiązać i inaktywować laktofery-nę [46]. Wyizolowana z mleka LF rozkładała proteazy cyste-inowe (m.in. katepsynę L), które są czynnikami wirulencji niektórych bakterii i wirusów [47]. Laktoferyna usuwała receptor hemoglobiny (HbR) z powierzchni komórek P.
gin-givalis [48]. HbR służy bakteriom do pozyskiwania żelaza
z hemoglobiny, która staje się jego dobrym źródłem podczas stanów zapalnych tkanki przyzębia. Działanie LF było ha-mowane przez inhibitory proteazy cysteinowej, co potwier-dza jej proteazową aktywność. Innym celem dla laktoferyny jest tzw. system sekrecji typu III enteropatogennych E. coli (EPEC) oraz Shigella flexneri [49, 50]. Ten skomplikowany system tworzą różne białka (m.in. EscF, EspA, IpaB), które umożliwiają bakteriom bezpośredni kontakt i uszkodzenie komórek nabłonkowych. LF może degradować niektóre z wymienionych białek, znacznie ograniczając tym samym wirulencję bakterii. W testach in vitro laktoferyna ograni-czała zdolność S. flexneri do infekowania komórek nabłon-kowych linii HeLa, a in vivo chroniła króliki przed enteritis spowodowanym przez te bakterie [51, 52]. LF działała sy-nergistycznie z ampicyliną i trimetoprimem-sulfameto-ksazolem na ponad 30 szczepów Shigella sp. wyizolowanych od dzieci z biegunką. Większość izolatów była oporna na za-stosowane antybiotyki, a kilka uzyskało wrażliwość dopie-ro po inkubacji z laktoferyną [53]. W badaniu klinicznym, w którym LF podawano doustnie pacjentom leczonym cy-tostatykami, zaobserwowano zmniejszenie ryzyka ogólno-ustrojowych zakażeń bakteriami z rodziny
Enterobacteriace-ae: mniejsza była liczba bakteriemii E. coli i K. pneumoniae,
krótszy czas ich trwania oraz łagodniejszy przebieg [54]. Białko wykazuje ponadto aktywność DNA- azy, RNA-azy,
odznaczają się dużą cytotoksycznością, porównywalną z działaniem TNF-α [55].
Innym możliwym mechanizmem działania laktoferyny w zakażeniach jest indukcja śmierci apoptotycznej
zakażo-nych komórek, co może ograniczać namnażanie
i rozprze-strzenianie się patogenów. Zjawisko takie zaobserwowano dla komórek nabłonka jelitowego. Białko podane dożołąd-kowo szczurzym noworodkom z bakteryjnym enteroco litis stymulowało apoptozę i złuszczanie zakażonych enterocy-tów (zjawisko nazwane anoikis), co chroniło sąsiednie ko-mórki przed infekcją i ograniczało stan zapalny. Jak sugerują autorzy badań, taki mechanizm może chronić noworodki karmione mlekiem matki (które zawiera duże ilości LF) przed nekrotycznym zapaleniem jelita, częstym powikła-niem u wcześniaków [56].
Kolejnym oddziaływaniem laktoferyny na bakterie jest
uszkadzanie struktur komórkowych (ściany i błony ko-mórkowej), co w rezultacie prowadzi do zaburzeń
osmo-tycznych i śmierci komórek bakteryjnych. N-końcowa kationowa część cząsteczki LF wiąże się do anionowych kwasów lipotejchojowych (LTA) w ścianie komórkowej bak-terii Gram- dodatnich. Uwolnienie LTA uszkadza strukturę ściany i odsłania położone głębiej warstwy peptydoglikanu (mureiny), które mogą być niszczone przez lizozym [40]. Laktoferyna uszkadza również bardziej skomplikowaną strukturę ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. Wiąże się do anionowej cząsteczki LPS i usuwa ją ze ściany. Podobnie wiąże i usuwa kationy dwuwartościowych metali Ca2+ i Mg2+, których zadaniem jest stabilizacja ściany
komór-kowej. Skutkiem takiego działania białka jest rozerwanie ściany i uszkodzenie komórki na drodze szoku osmotycz-nego [57, 58]. Co więcej, laktoferyna wiąże się z białkami porynowymi wchodzącymi w skład ściany bakterii Gram-ujemnych. Takie zjawisko obserwowano m.in. dla poryn komórek E. coli (OmpF, OmpC i PhoE) i Salmonella Typhi-murium, a zdolność wiązania LF do tych struktur wyraź-nie korelowała z jej działawyraź-niem przeciwbakteryjnym [59]. Białka porynowe w postaci dimerów lub trimerów tworzą kanały, którymi dostarczane są do wnętrza komórki niektó-re jony i cząsteczki. LF zatem nie tylko zaburza strukturę ściany komórkowej, lecz także utrudnia napływ niektórych składników odżywczych do komórki. Mechanizm bezpo-średniego uszkadzania osłon zewnętrznych bakterii Gram--ujemnych przedstawiono na Ryc. 3. Takie działanie białka możemy jednak obserwować w testach in vitro, gdzie sztucz-nie ogranicza się ilość kationów oraz zmsztucz-niejsza siłę jonową środowiska. Niektórzy autorzy podkreślają, że w ustroju, w którym wszystkie płyny ustrojowe zawierają dużo soli i kationów dwuwartościowych, działanie LF poprzez ten mechanizm może być ograniczone [60]. Większą zdolność do niszczenia struktur komórek bakteryjnych mają peptydy (m.in. laktoferycyna) uzyskiwane z ludzkiej i bydlęcej LF,
Ryc. 3. Mechanizm działania laktoferyny na bakterie Gram-ujemne. Przedstawiono działanie LF na ścianę komórkową. A. Dodatnio na-ładowana cząsteczka laktoferyny wiąże się do lipidu A cząsteczki lipopolisacharydu, powodując jego uwolnienie ze struktury błony zewnętrznej, co w konsekwencji prowadzi do uszkodzenia ściany ko-mórkowej i śmierci komórki bakteryjnej. B. LF wiąże dwuwartościowe jony magnezu i wapnia stabilizujące strukturę ściany, co powoduje jej destabilizację. C. LF wiąże się ponadto do białek porynowych, co ogranicza przepływ jonów i składników odżywczych przez ścianę ko-mórkową i ostatecznie uszkadza jej strukturę.
Przedruk z: Artym J. Laktoferyna – Niezwykłe Białko. 1st edn. Wydawnictwo
kość” cząsteczki [58]. Modyfikacja chemiczna takich pep-tydów (np. poprzez acylację) może dalej zwiększać ich siłę działania [61].
Jednym z ważnych mechanizmów bójczych, wykorzysty-wanych przez neutrofile i makrofagi, jest zdolność
do two-rzenia toksycznych reaktywnych form tlenu. Po
kontak-cie z komórką patogenu dochodzi do aktywacji oksydazy NADPH w błonie komórkowej i błonie ziarnistości we-wnątrzkomórkowych fagocytów. W wyniku tego w tzw. wy-buchu oddechowym (ang. respiratory burst) powstają RFT: anionorodnik ponadtlenkowy (O2t) oraz nadtlenek wodoru
(H2O2), uwalniane na zewnątrz komórki i do wnętrza fa-golizosomów. Proces ten jest bardzo wydajny: w ciągu se-kundy jeden granulocyt wytwarza odpowiednio aż 3,2 mln i 3,6 mln O2t i H
2O2. Z udziałem jonów żelazawych (Fe 2+)
w tzw. biologicznej reakcji Fentona (katalizowanej jonami żelaza reakcji Habera-Weissa) powstaje rodnik hydrok-sylowy (tOH), najbardziej reaktywny i toksyczny spośród
wszystkich RFT:
O2 + H2O2 Fe2+/Fe3+ OH + OH + O2
Oprócz wymienionych, w organizmie powstają też inne RFT, m.in.: ozon (O3), tlen singletowy (1O
2), tlenek azotu
(NOt), dwutlenek azotu (NO 2
t), kwas podchlorawy (HOCl)
i inne. Poza toksycznością wobec bakterii, grzybów, pasoży-tów i komórek nowotworowych, cząsteczki te pełnią ważne funkcje regulacyjne w procesach takich jak: namnażanie i różnicowanie komórek, apoptoza, przekazywanie sygna-łów w komórce, przewodnictwo komórkowe, regulacja ciśnienia krwi i wiele innych. Wytwarzanie RFT jest regu-lowane przez wiele czynników, m.in. cytokiny. W procesie tym uczestniczy też LF, a konkretnie dostarczane przez nią jony Fe2+, potrzebne do tworzenia tOH. W fagolizosomie
panuje niskie pH (~3,0–4,0), co sprzyja aktywności działa-jących tutaj enzymów proteolitycznych. W takim kwaśnym środowisku LF „oddaje” związane jony żelaza, które katali-zują reakcję Fentona. Istnieje dość dużo badań (głównie in
vitro) potwierdzających taką aktywność laktoferyny. Białko
wyizolowane z mleka lub neutrofilów i sztucznie wysycone żelazem wydajnie zwiększało wytwarzanie tOH przez
ludz-kie neutrofile, ale traciło taką aktywność, gdy zostało pozba-wione żelaza [62]. W serii badań nad aktywnością bójczą mysich makrofagów i ludzkich monocytów udało się wy-kazać stymulujące działanie LF. Białko nie tylko zwiększało fagocytozę, lecz także zdolność zabijania wewnątrzkomór-kowych form parazytów Trypanosoma cruzi oraz bakterii
Listeria monocytogenes [63, 64]. Stwierdzono zwiększone
wydzielanie: 1O 2, O2
t, tOH i H
2O2 przez fagocyty
w obecno-ści LF wysyconej żelazem. Uwalnianiu żelaza z laktoferyny sprzyjają enzymy degradujące cząsteczkę białka (elastaza, alkaliczna proteaza i inne). Ich źródłem są zarówno akty-wowane komórki odpornościowe, jak i komórki
patoge-może obejmować aktywację oksydazy NADPH, a NOt –
ak-tywację indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS) [66–68]. RFT – poza korzystnymi działaniami w ustroju człowieka – mogą niestety być groźne również dla własnych, zdrowych komórek. Stąd organizm wykształcił sprawne mechanizmy ochrony przed nadmiarem wolnych rodników. Zaliczamy do nich również działanie laktoferyny. W większości sytu-acji, gdy białko nie jest degradowane przez enzymy ustro-jowe lub bakteryjne, a odczyn zbliżony do obojętnego (lub słabo kwaśny), może ono skutecznie chelatować jony żelaza, czyniąc je niedostępnymi dla tworzenia tOH. Wówczas LF
działa jako antyoksydant. Taka aktywność białka jest szcze-gólnie istotna w wygaszaniu stanów zapalnych, w których RFT odgrywają dużą rolę, jest więc jednym z elementów przeciwzapalnego działania laktoferyny [10].
Laktoferyna ogranicza mikroflorę patogenną w orga-nizmie człowieka również dzięki korzystnemu wpływowi
na wzrost mikroflory fizjologicznej. Jak możemy
wniosko-wać z niektórych badań, białko i pochodne peptydy – przy silnym działaniu hamującym patogeny – nie wpływają na wzrost flory symbiotycznej/komensalnej lub stymulują go. Laktoferycyna dodana do hodowli (0,3–150 μg/ml) ha-mowała wzrost lub zabijała 13 różnych szczepów bakterii patogennych, m.in.: K. pneumoniae, S. aureus, S. Enteritidis,
Proteus vulgaris, Yersinia enterocolitica, L. monocytogenes
czy Clostridium perfringens. Na działanie peptydu oporne były szczepy: Enterococcus faecalis, Bifidobacterium
ado-lescentis, B. breve oraz B. longum, a B. bifidum wykazywał
wzrost pod jego wpływem [69]. W innym badaniu uzyska-no stymulację wzrostu kilku szczepów bifidobakterii, gdy wzbogacono medium hodowlane w różne składniki (w tym LF) wyizolowane z mleka ludzkiego lub krowiego [70]. Aktywność laktoferyny nie zależała od stopnia wysycenia żelazem, ale korelowała ze zdolnością białka do wiązania się do powierzchni komórek bakteryjnych [71]. Z innych badań wynika, że szczep B. breve był zdolny do pobiera-nia żelaza z holo-LF [72]. Laktoferyna promowała wzrost bifidobakterii w jelicie myszy germ-free, którym doustnie podano symbiotyczną florę wyizolowaną z kału noworod-ków [73]. Gdy noworodki szczurze, zakażane Lactobacillus i E. coli, pojono roztworem LF, nie obserwowano wpraw-dzie wzrostu bakterii probiotycznych, ale odnotowano wyraźne zahamowanie wzrostu potencjalnie patogennych pałeczek okrężnicy [74]. W próbie klinicznej karmienie noworodków mieszanką mleczną wzbogaconą w LF (0,1 lub 1 mg/ml) promowało ustalenie mikroflory z dominacją
Bifidobacterium, jednak dopiero po trzech miesiącach
sto-sowania preparatu [75]. Wydaje się zatem, że laktoferyna może sprzyjać ustaleniu i utrzymaniu prawidłowej mikro-flory jelitowej, zwłaszcza u niemowląt. Działanie białka jest wzmacniane przez dodatek innych aktywnych składników mleka [10].
na stymulacji układu odpornościowego, zostanie omówione w dalszej części pracy, jako że można je zaliczyć do właści-wości immunomodulujących o zasadniczej roli w procesie zapalenia.
Przeciwgrzybicze działanie laktoferyny
Białko wykazuje aktywność wobec grzybów mikrosko-powych z rodzajów: Candida, Trichophyton, Aspergillus i Rhodotorula. Przeciwgrzybicze działanie laktoferyny wy-kazano po raz pierwszy już w 1971 roku. Obserwowano wówczas zahamowanie wzrostu C. albicans poprzez se-kwestrację jonów żelaza [76]. Późniejsze testy udowod-niły, że LF może również zabijać komórki C. albicans i C. krusei, uszkadzając bezpośrednio błonę komórkową. W obrazie mikroskopowym widoczne były duże zmiany na powierzchni komórek grzybów: obkurczanie, tworzenie pęcherzyków i wyciek białek [77]. Laktoferyna może także indukować apoptozę komórek C. albicans poprzez uszko-dzenie mitochondriów, zwiększenie wytwarzania RFT oraz wypływu jonów K+ z komórek [78]. Według innych badań
mechanizm działania LF i pochodnych peptydów wobec
C. albicans polega na zahamowaniu dostarczania jonów
żelaza, pobierania glukozy przez komórki grzybowe oraz ograniczeniu syntezy DNA i białek. Obserwowano rów-nież zwiększoną aktywność bójczą granulocytów, wzrost wytwarzania O2t, aktywności oksydazy NADPH, kinazy
białkowej C (PKC) oraz kinazy p38 MAPK. Skuteczność LF/peptydów była podobna do mykonazolu, a działanie mykonazolu i amfoterycyny B wzmocnione w ich obecno-ści [79]. Fragment laktoferycyny podany dożylnie myszom z systemową kandydozą znacznie zwiększał przeżycie zwierząt, a mechanizm jego działania obejmował: aktywa-cję fagocytów, zwiększoną aktywność iNOS oraz oksydazy NADPH, większe wytwarzanie NOt oraz O
2
t, większe
wy-dzielanie endogennej LF oraz defensyn z aktywowanych neutrofilów i makrofagów. Peptyd poprawiał skuteczność amfoterycyny B i czynnika wzrostu kolonii granulocytów i makrofagów (ang. granulocyte-macrophage colony-sti-mulating factor – GM-CSF) [80].
Laktoferyna podawana doustnie była również skuteczna w leczeniu zakażeń Trichophyton mentagrophytes u świnek morskich. Przyspieszała gojenie zmian skórnych, głównie poprzez aktywację komórek odpornościowych (limfocytów i makrofagów) do walki z zakażeniem [81]. Podana doustnie łagodziła u pacjentów objawy grzybicy stóp spowodowanej
T. mentagrophytes i T. rubrum [82]. Płukanka do ust z LF
i lizozymem (jako dodatek do terapii itrakonazolem) sku-tecznie wyleczyła przewlekłą ciężką drożdżycę jamy ustnej u chorej zakażonej wirusem HIV [83]. Ciekawych wyników dostarczyła próba kliniczna przeprowadzona niedawno na wcześniakach z bardzo niską wagą urodzeniową, gdzie
(Lactobacillus rhamnosus GG) zmniejszało częstość inwa-zyjnych infekcji grzybiczych oraz progresji od kolonizacji do aktywnego zakażenia. Według autorów badania, LF ogra-niczała zdolność grzybów lokalnie kolonizujących organizm dziecka do wywoływania zakażeń ogólnoustrojowych [84].
Przeciwpierwotniakowe działanie laktoferyny
Zarówno laktoferyna, jak i pochodne peptydy wykazują aktywność wobec pasożytniczych pierwotniaków: Giardia
lamblia, Entamoeba histolytica, Pneumocystis carinii, Trypa-nosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Eimeria stiedai oraz Pla-smodium sp. Mechanizm działania polega na bezpośrednim
uszkadzaniu i niszczeniu pasożytów oraz wspomaganiu eli-minacji zakażenia poprzez aktywację układu odpornościo-wego. LF i peptydy zabijają parazyty jelitowe G. lamblia, któ-re są przyczyną lambliozy (giardiazy), powszechnej głównie u dzieci. Inkubacja trofozoitów (form wegetatywnych) tego pasożyta z laktoferyną wywołała zmiany w strukturze komó-rek, w obrębie błony komórkowej i błon wewnątrzkomórko-wych oraz cytoszkieletu, co prowadziło do śmierci komórek. Wykazano wiązanie LF do powierzchni parazytów, które było hamowane w obecności kationów dwuwartościowych, w tym żelaza [85]. Aktywność laktoferyny wobec G. lamblia potwierdzono w próbie klinicznej na peruwiańskich dzie-ciach w wieku 12–36 miesięcy (po odstawieniu od piersi) z biegunkami o różnej etiologii, w tym pierwotniakowej. LF podawana doustnie nie wpływała wprawdzie na ilość biegu-nek, ale istotnie skracała ich trwanie oraz zmniejszała czę-stość kolonizacji G. lamblia i poprawiała wskaźniki rozwoju u badanych dzieci [86].
Sporozoity (zakaźne formy bezpłciowe) T. gondii oraz
E. stiedai preinkubowane w obecności laktoferycyny
mia-ły mniejszą zdolność do zakażania odpowiednio komórek mysich i króliczych. U myszy i królików zakażonych takimi sporozoitami stwierdzono dłuższy czas przeżycia i mniej-szą liczbę oocyst (form płciowych) [87]. Z kolei w testach
in vivo wykazano, że laktoferycyna podana per os lub
do-otrzewnowo myszom przed zakażeniem cystami T. gondii chroniła je przed śmiercią: w grupie badanej przeżyło 100%, a w grupie kontrolnej jedynie 20% zwierząt. Przeżycie kore-lowało z mniejszą liczbą cyst w mózgu [88]. LF, wiążąc się do receptorów LRP1 na powierzchni komórek, redukowała o 60–70% ich zakażenie przez sporozoity zarodźca malarii
(Plasmodium berghei). LRP1 to jeden z receptorów
komór-kowych „używanych” przez tego pasożyta w celu wnikania do komórek gospodarza [89]. LF hamowała również wzrost
Plasmodium falciparum w hodowli erytrocytów. Jej
dzia-łanie wiązało się prawdopodobnie z aktywacją uwalniania RFT, które uszkadzały zarówno komórki pasożytów, jak i krwinki zaatakowane przez zarodźca [90]. We wspomina-nych już badaniach Limy i Kierszenbauma, LF zwiększała
nik etiologiczny choroby Chagasa) przez ludzkie monocyty i mysie makrofagi. W procesie tym uczestniczyły toksyczne RFT, głównie O2t i H
2O2 [63]. Z badań na modelu mysim
można wnioskować o skuteczności LF w zwalczaniu za-każeń pełzakiem czerwonki (E. histolytica). LF podawana doustnie eliminowała zakażenie u 63% zwierząt, co stwier-dzono przez brak trofozoitów oraz uszkodzeń i obrzęku tka-nek jelita. Zaobserwowano ponadto aktywację odpowiedzi przeciwpasożytniczej typu Th2, widoczną jako wzrost wy-twarzania IL-4, IL-6 oraz IgA w jelicie [91]. LF hamowała wzrost izolowanych od chorych szczepów P. carinii – czyn-nika powodującego zapalenie płuc u pacjentów z obniżoną odpornością. Obserwowano ponadto synergistyczne dzia-łanie laktoferyny i standardowo stosowanych leków o od-miennych mechanizmach działania: klarytromycyny, mino-cykliny i pirymetaminy. Aktywne było białko nie wysycone żelazem, co wskazuje na działanie poprzez sekwestrację jo-nów żelaza [92].
Niestety, podobnie jak w przypadku niektórych bakterii, również dla parazytów LF może się stać źródłem żelaza. Po-zyskiwanie tego pierwiastka z cząsteczki laktoferyny obser-wowano dla rzęsistków Trichomonas vaginalis i T. foetus (pa-togeny, odpowiednio ludzi i bydła) oraz Leishmania chagasi (czynnik etiologiczny lejszmaniozy) [10, 19]. W obecności LF metabolizm T. vaginalis wzrasta nawet sześciokrotnie. Patogen ten zasiedla bogatą w laktoferynę śluzówkę pochwy, a objawy zakażenia są najsilniejsze w czasie krwawienia miesiączkowego, kiedy lokalne stężenia tego białka i żelaza wzrastają. U mężczyzn zakażenie cewki moczowej, gdzie występuje LF, ale mało jest żelaza, ulega samoograniczeniu. W przypadku zakażeń wymienionymi parazytami, laktofe-rynę (szczególnie ludzką) należy stosować z ostrożnością.
Przeciwwirusowe działanie laktoferyny
Białko i pochodne peptydy działają hamująco na wiele wi-rusów otoczkowych i bezotoczkowych, m.in.: wirusy grypy, paragrypy, ludzkie wirusy niedoboru odporności (ang. Hu-man Immunodeficiency Virus – HIV), wirusy opryszczki (Herpes Simplex Virus – HSV), cytomegalii (ang. Cytome-galovirus – CMV), zapalenia wątroby typy B (ang. Hepati-tis B Virus – HBV) i C (Hepati(ang. Hepati-tis C Virus – HCV), wirusy brodawczaka (Human Papilloma Virus – HPV), adenowi-rusy, pikornawirusy i inne [93]. Mechanizm działania białka polega głównie na hamowaniu wstępnych etapów zakaże-nia, czyli adsorpcji i wnikania cząsteczek wirusów do komó-rek gospodarza. W przypadku niektórych wirusów (HIV) udało się też udowodnić działanie LF na późniejsze etapy infekcji, głównie poprzez hamowanie aktywności enzymów uczestniczących w powstawaniu potomnych cząsteczek wi-rusów. Białko, podobnie jak podczas innych zakażeń, indu-kuje również odpowiedź immunologiczną (głównie typu
Możliwe mechanizmy przeciwwirusowego działania LF po-kazano schematycznie na Ryc. 4.
Laktoferyna, blokując określone cząsteczki na po-wierzchni komórek docelowych lub na popo-wierzchni wi-rusów, ogranicza ich wzajemne interakcje, a tym samym zapobiega zakażeniu. W serii testów na linii ludzkich hepa-tocytów wykazano, że LF wiązała się do białka E2 osłonki wirusa HCV, blokując jego penetrację do komórek. Jak się okazało, fragment cząsteczki LF jest podobny do ludzkiego antygenu CD81, który jest komórkowym receptorem wiru-sa HCV (czyli białko E2 zamiast z CD81 połączyło się z LF i tym samym zostało zablokowane) [95]. Badacze japońscy, zachęceni wynikami prób in vitro, podjęli się sprawdze-nia skuteczności terapii LF u pacjentów zakażonych HCV. W sumie dotąd przeprowadzono 9 prób klinicznych, w któ-rych przebadano łącznie 603 chow któ-rych. W większości udało się wykazać korzystne działanie laktoferyny podawanej do-ustnie. Obserwowano poprawę wskaźników wątrobowych, spadek wiremii oraz poziomu wirusowego RNA we krwi, wzrost surowiczych stężeń IL-18 oraz liczby limfocytów IFN-γ+IL-4-, czyli o korzystnym fenotypie Th1. W jednej
z prób podawano LF w monoterapii lub terapii skojarzonej łącznie z IFN-α2b i rybawiryną, które są standardowo sto-sowane w leczeniu zakażeń HCV [96]. To postępowanie od-znacza się jednak zmienną skutecznością, dlatego poszukuje się nowych leków, które podane łącznie mogłyby ją zwięk-szyć. Ochronne działanie LF w hepatitis może wynikać rów-nież z obniżania ilości wolnego żelaza w wątrobie, a poprzez
Ryc. 4. Mechanizmy przeciwwirusowego działania laktoferyny. A. LF wiąże się do białek na powierzchni wirusa, np. pętli V3 białka otocz-kowego gp120 na powierzchni wirusa HIV, co hamuje fuzję i wnikanie wirusa do komórek. B. LF wiąże się z cząsteczkami powierzchniowymi błony komórkowej gospodarza, które są wykorzystywane przez wiru-sy jako koreceptory lub receptory. Zaznaczono wiązanie LF do łańcu-chów glikozaminoglikanów oraz receptorów/koreceptorów dla wiru-sów (np. CXCR4 lub CCR5 wykorzystywanych przez HIV). C. LF działa przeciwwirusowo również po wniknięciu wirusów do komórki (m.in. przez hamowanie enzymów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV).
D. Działanie pośrednie LF poprzez stymulację odpowiedzi
przeciwwi-rusowej.
Przedruk z: Artym J. Laktoferyna – Niezwykłe Białko. 1st edn. Wydawnictwo
cji lipidów, które uczestniczą w patogenezie stanu zapalnego i nowotworzenia [97].
Kilka badań wykazało skuteczność LF wobec wirusa HIV-1. Białko hamowało zakażenie linii limfocytów T, gdy zostało dodane przed lub podczas etapu adsorpcji wirusa. Ta obserwacja potwierdza blokowanie wczesnych etapów infekcji. Dotyczyło jednak ono tylko tych wariantów wirusa, które korzystają z komórkowych koreceptorów chemokino-wych CXCR4 lub CCR5, co sugeruje ich wiązanie i blokowa-nie przez LF [98]. Późi blokowa-niejsze testy wykazały, że laktoferyna może również blokować receptory dla HIV-1 na powierzch-ni komórek dendrytycznych [99]. DC-SIGN to recepto-ry typu lektynowego, które umożliwiają wiązanie i inter-nalizację HIV do komórek dendrytycznych, które z kolei przekazują zakażenie limfocytom T CD4+. Z drugiej strony
laktoferyna może wiązać się i blokować cząsteczkę gp120 na powierzchni wirusa HIV, co uniemożliwia jej interakcje z receptorem CD4 i koreceptorami komórkowymi [100]. LF ogranicza również późniejsze etapy infekcji HIV, hamując namnażanie wirusa. Białko silnie obniża aktywność odwrot-nej transkryptazy, a słabiej proteazy i integrazy – enzymów wirusowych istotnych dla procesów replikacji wirusa [101]. Co ważne, skuteczność LF potwierdzono w próbie klinicz-nej u dzieci zakażonych HIV wertykalnie. Po półroczklinicz-nej te-rapii spadło miano wirusa we krwi, a zwiększył się udział krążących limfocytów T CD4+. Skuteczność leczenia
wzro-sła, gdy laktoferynę podano łącznie z klasyczną terapią przeciwretrowirusową [102].
Działanie LF wobec HPV, HSV, CMV i adenowiru-sów polega na hamowaniu wiązania wiruadenowiru-sów do komór-kowego receptora o charakterze GAG, a działanie wobec enterowirusów (np. wirusa polio) i kociego kaliciwirusa – na hamowaniu ich wiązania do lipoproteinowych re-ceptorów komórkowych. Białko może wchodzić w inte-rakcje zarówno ze strukturami na powierzchni komórek docelowych, jak i wirusów. Z kolei wiązanie LF do czą-steczek na powierzchni wirusów grypy hamuje wstępne etapy zakażenia. Wirusy grypy wykorzystują kwas sjalowy na komórkach docelowych, zatem ich związanie z kwa-sem sjalowym w cząsteczce LF uniemożliwia te interak-cje [103]. Laktoferyna może ponadto hamować apoptozę komórek zainfekowanych wirusem grypy, co ogranicza jego rozprzestrzenianie się w organizmie [104]. LF podana myszom eksperymentalnie zakażonym wirusem grypy wy-gaszała pogrypowe zapalenie płuc, redukując liczbę infil-trujących leukocytów i hamując hiperreaktywność układu immunologicznego [105].
Laktoferyna może wzmacniać działanie niektórych le-ków przeciwwirusowych. Obserwowano działanie synergi-styczne białka z: acyklowirem, cidofowirem i IFN/rybawi-ryną w zakażeniach, odpowiednio: HSV, CMV i HCV oraz z klasyczną terapią antyretrowirusową w infekcji HIV.
LF jest naturalnym immunomodulatorem, zdolnym regulować (optymalizować) aktywność układu odpor-nościowego. Wpływa zarówno na wrodzoną, jak i nabytą odpowiedź immunologiczną. Ze względu na swoje właści-wości, przez niektórych badaczy jest nawet określana jako „supercytokina” lub „inteligenta cytokina”. W zależności od potrzeb organizmu może wzmacniać bądź hamować odpowiedź immunologiczną, czyli działać prozapalnie lub przeciwzapalnie. Mechanizm „inteligentnego” (czyli zróż-nicowanego) wpływu LF na odpowiedź odpornościową wciąż nie jest do końca poznany, choć można przypusz-czać, że działanie białka zależy m.in. od: natury komórek, ich aktualnego stanu aktywacji, lokalnych stężeń białka w tkankach, obecności białka w postaci wolnej lub skom-pleksowanej np. z LPS i wielu innych czynników. Zasadnicze znaczenie może mieć tutaj choćby zdolność LF do interakcji z komórkowymi receptorami (np. GAG) oraz innymi czą-steczkami, w tym pochodzenia mikrobiologicznego (LPS i DNA bakteryjny). Wiadomo na przykład, że natura oraz ilość GAG na powierzchni komórek zależy od ich stanu róż-nicowania i dojrzewania oraz aktywacji. LF wiąże się mało swoiście, ale mocno do tych cząsteczek, które niejako uła-twiają jej późniejsze związanie z bardziej swoistymi recepto-rami komórkowymi, np. LRP1 czy nukleoliną. Te receptory po związaniu cząsteczki LF przekazują sygnały hamujące/ aktywujące do wnętrza komórki lub ułatwiają internaliza-cję laktoferyny do komórki, gdzie bezpośrednio może ona regulować różne szlaki sygnałowe. Duża ilość GAG na po-wierzchni komórek może utrudniać interakcje LF z inny-mi cząsteczkainny-mi, takiinny-mi jak bakteryjny LPS czy fragmenty bakteryjnego DNA (CpG). Te cząsteczki wiążą się wówczas przez przeszkód do receptorów komórkowych i aktywują komórki. Tak się dzieje, gdy stężenia LF w danym miejscu są niskie. Gdy jednak proces zapalny toczy się nadal (prze-wlekłe zapalenie), z kolejnych napływających granulocytów są uwalniane duże ilości laktoferyny oraz wzrasta stosunek LF/LPS lub LF/bakteryjny DNA, wówczas białko wiążąc te cząsteczki może działać jako ich „neutralizator”, hamować odpowiedź immunologiczną i wygaszać tym samym stan zapalny.
Przedstawiony mechanizm regulacyjnego działania LF jest raczej hipotetycznym i jednym z możliwych. Pewne jest, że białko może stymulować odpowiedź odpornościo-wą, co ma duże znaczenie ochronne podczas początkowych etapów infekcji. Ale gdy odpowiedź ta jest zbyt silna, trwa zbyt długo i jest już nieadekwatna do potrzeb ustroju, jak np. w czasie przewlekłego zapalenia, może ją wygaszać. Dokładne omówienie mechanizmów pro- i przeciwzapal-nego działania białka znacznie wykracza poza ramy pracy, jest również przedmiotem wielu innych aktualnych opra-cowań [9–12, 60]. Poniżej podano jedynie przykłady
od-z omówionym już zjawiskiem hipoferremii w zapaleniu oraz działaniem antyoksydacyjnym stanowią o jego udziale w procesie zapalenia.
Laktoferyna aktywuje komórki immunologiczne zaan-gażowane w stymulację odpowiedzi komórkowej i humoral-nej. Białko stymuluje dojrzewanie i aktywność limfocytów T i B, zwiększa aktywność cytotoksyczną komórek NK i LAK (powstających z komórek NK po stymulacji IL-2), wytwa-rzanie cytokin uczestniczących w odpowiedzi przeciwza-kaźnej (IL- 1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF-α, IFN-α i -γ) i wytwarzanie NOt (czynnika
mikrobiobójcze-go i regulatorowemikrobiobójcze-go) oraz reguluje odpowiedź komórkową typu Th1/Th2 (z przewagą odpowiednio mechanizmów ko-mórkowych lub humoralnych). LF pobudza ekspresję czą-steczek adhezyjnych i kostymulujących (ICAM-1, łańcucha zeta CD3, CD4, LFA-1, CD11b, CD18, selektyny P, MHC klasy II) na powierzchni komórek, co ułatwia ich wzajemne interakcje i aktywację, stymuluje ekspresję komórkowych receptorów umożliwiających rozpoznawanie patogenów (np. receptora NOD2). Laktoferyna zwiększa aktywność cytotoksyczną monocytów, wzmacnia zdolność komórek fagocytujących (granulocytów i makrofagów) do pochłania-nia i zabijado pochłania-nia drobnoustrojów, stymuluje proces mielopo-ezy (zwiększa zatem liczbę fagocytów), promuje chemotak-sję i adhezję granulocytów do śródbłonka oraz działa jako opsonina, ułatwiając fagocytozę opłaszczonych cząstek/ko-mórek. LF może też działać wspólnie ze składnikami kom-plementu (dopełniacza) oraz przeciwciałami w neutralizacji czynnika zakaźnego. Może ponadto indukować dojrzewanie oraz aktywować tzw. profesjonalne komórki prezentujące antygen limfocytom T: komórki dendrytyczne (w tym skór-ne komórki Langerhansa), makrofagi i limfocyty B. Dzię-ki regulacji aktywności tych komórek, laktoferyna uważa-na jest za czynnik łączący wrodzoną i uważa-nabytą odpowiedź immunologiczną.
LF hamuje aktywację i rekrutację komórek
immunolo-gicznych w miejscu toczącego się zapalenia. Może
hamo-wać wytwarzanie cytokin prozapalnych: IL-1β, IL-6, TNF-α przez komórki stymulowane LPS. Ponadto zwiększa wy-dzielanie cytokin przeciwzapalnych: IL-4, IL-10 oraz IL-11. Hamuje aktywność limfocytów B, ogranicza aktywność oraz hamuje wydzielanie IL-8 przez komórki śródbłonka, hamu-je wytwarzanie metaloproteinaz (MMP), prostaglandyny E2 (PGE2), cyklooksygenazy-2 (COX-2). Obniża indukowaną LPS ekspresję niektórych cząsteczek adhezyjnych i kosty-mulujących (selektyny E, ICAM-1, CD86) na powierzchni komórek, co ogranicza ich interakcje i pobudzenie. Hamuje aktywność komórek tucznych (mastocytów), uczestniczą-cych w reakcjach alergicznych i zapalnych, oraz aktywność komórek dendrytycznych, a także obniża aktywność ukła-du dopełniacza. Obserwowano również hamujące działanie białka na komórki Langerhansa, niedojrzałe postaci
komó-odpowiedzi zapalnej.
Przeciwzapalne właściwości LF potwierdzono w licznych próbach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych. Mia-ły one znaczenie w profilaktyce i leczeniu schorzeń o podło-żu zapalnym: infekcyjnych (m.in. zapalenia układu moczo-wego u myszy po podaniu E. coli, zapalenia stawów u myszy indukowanego S. aureus, zapalenia wymienia u krów po po-daniu E. coli, zapalenia jelit indukowanego S. flexneri u kró-lików, pogrypowego zapalenia ucha u pacjentki, zapalenia gardła o etiologii S. pneumoniae u dzieci, sepsy u pacjentów) oraz nieinfekcyjnych: o podłożu alergicznym lub autoim-munologicznym (m.in. zapalenia stawów indukowanego u myszy podaniem kolagenu, indukowanego chemicznie wrzodziejącego zapalenia okrężnicy u szczurów, indukowa-nego oksazolonem alergiczindukowa-nego zapalenia skóry ucha u my-szy, astmy alergicznej u owiec, małp i myszy).
Dostępność laktoferyny do zastosowań
klinicznych
W zaprezentowanych badaniach laboratoryjnych in
vi-tro oraz u zwierząt i ludzi stosowano LF ludzką (izolowaną
z mleka lub wytwarzaną przez organizmy transgeniczne) bądź bydlęcą (izolowaną z mleka). Aktywność tych bia-łek była podobna, choć w niektórych testach dało się za-uważyć większą skuteczność bydlęcej LF i jej pochodnych peptydów. Laktoferyna ludzka (z obu źródeł), jako białko zgodne gatunkowo, może być stosowana w terapii zarówno enteralnie, jak i parenteralnie (np. dożylnie, śródskórnie, do przemywania jam ciała, na skórę, na rany). LF bydlęca (z mleka), jako białko obce gatunkowo, może być podawa-na jedynie enteralnie: doustnie lub dojelitowo. W wielu te-stach na zwierzętach i ludziach wykazano aktywność białka podawanego zarówno drogą enteralną, jak i pozajelitową. Z dotychczasowych badań wynika, że u niemowląt białko podane doustnie może ulegać częściowemu wchłanianiu z przewodu pokarmowego w natywnej postaci lub w formie pochodnych peptydów powstających w czasie trawienia. Może więc docierać do różnych tkanek i narządów i od-działywać na nie bezpośrednio. Laktoferyna działa oczy-wiście również na tkanki (w tym immunologiczne) jelita. Według przeważających poglądów, u osobników dorosłych LF raczej nie wchłania się do krążenia, ale działa lokalnie na tkanki jelita, a tą drogą – dzięki istnieniu zintegrowanej odporności śluzówkowej – na inne tkanki, nawet od niego odległe [10]. Laktoferyna może zatem być z powodzeniem stosowana w postaci preparatów doustnych, które mogą być przyjmowane przez pacjenta samodzielnie o dogod-nej porze i w preferowadogod-nej postaci (np. tabletki do połyka-nia, tabletki do ssania lub rozpuszczapołyka-nia, gotowy płyn lub proszek).
