Widok Rola cytoszkieletu w rozwoju organizmów jednokomórkowych (na przykładzie orzęska Tetrahymena i porównawczo drożdża Schisosaccharomyces pombe).

K

osmos

PROBLEMY NAU KB IOLO G^CZNYCH_____________ Polskie Tow arzystw o Przyrodn ików im. K opern ika

Ja n in a Ka c z a n o w s k a, Do r o t a Wł o g a, Ma u r y l a Kie r s n o w s k a, Ew a j o a c h i m ia k i An d r z e j Ka c z a n o w s k i

Zakład Cytofizjologii, Instytut Zoologii, Uniwersytet Warszawski

Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa

ROLA CYTOSZKIELETU W ROZWOJU ORGANIZMÓW JEDNOKOMÓRKOWYCH (NA PRZYKŁADZIE ORZĘSKA TETRAHYMENA I PORÓWNAWCZO DROŻDŻA

SCHISOSACCHAROMYCES POMBE)

RÓŻNORODNE FUNKCJE CYTOSZKIELETU W REGULACJI ROZWOJU KOMÓREK EUKARIOTYCZNYCH

Cytoszkielet wszystkich komórek organi­ zmów eukariotycznych jest zbudowany głównie z włókien mikrotubularnych i mikrofilamentów aktynowych wraz z towarzyszącymi im białkami motorycznymi, z cytoszkieletu podbłonowego (złożonego głównie ze spektiyn i sieciowanej aktyny) oraz z tzw. filamentów pośrednich. Tym białkom strukturalnym towarzyszy bardzo wie­ le białek regulujących stabilność i przemiany w cytoszkielecie. Cytoszkielet jest nie tylko stru­ kturą komórki stanowiącą jej trwałe rusztowa­ nie i wyznaczającą jej kształt, ale pełni w niej również inne funkcje. Mechanizm ruchu komó­ rek opiera się na funkcjonowaniu cytoszkieletu rzęsek, wici i przemieszczających się po podłożu wypustek cytoplazmatycznych wspartych stru­ kturami cytoszkieletu. Cytoszkielet buduje również szlaki komunikacji wewnątrz komórki umożliwiając przemieszczanie się poszczegól­ nych organelli komórkowych. Jądra, mitochon­ dria, czy też pęcherzyki sekrecyjne mogą się podczepiać do białek motoiycznych, a nastę­ pnie wraz z nimi przemieszczać po włóknach mikrotubul lub mikrofilamentów do punktów docelowych, gdzie podlegają zakotwiczaniu. W ten sposób cytoszkielet uczestniczy w endocy- tozie i sekrecji. Cytoszkielet podtrzymuje także terytorialne zróżnicowanie komórki decydując między innymi o rozmieszczeniu różnych rodza­ jów białek, a także transkiyptów (mRNA róż­ nych białek), które mogą być docelowo tran­ sportowane, a następnie zakotwiczane do błony komórkowej i tam dopiero wykorzystywane do syntezy białek ( H a z e l r i g g 1998).

Kształt typowej komórki pobranej z organi­ zmu Metazoa, np. fibroblastów lub komórek nabłonkowych, może się zmieniać w zależności od tego, czy komórka przylega do podłoża lub do innych komórek, czy też jest zawieszona w środowisku płynnym, a także od tego czy jest to komórka spoczynkowa, czy też dzieli się na dwie komórki potomne. Cytoszkielet zmienia się w zależności od różnicujących sygnałów z otocze­ nia, a także od sygnałów wewnętrznych związa­ nych z przebiegiem cyklu komórkowego i two­ rzeniem polarności komórki. A więc cytoszkielet jest strukturą dynamiczną, podlegającą reorga­

nizacji na drodze polimeryzacji i depolimeiyza- cji włókien, zarówno w cyklu podziałów mitoty­ czny eh, jak i w trakcie procesów różnicowania. Cytoszkielet jest nie tylko odbiorcą sygna­ łów rozwojowych, ale także pełni funkcje regu­ latora w szlakach przekazywania sygnałów ze środowiska do komórki. A oto znamienny przy­ kład: komórki linii 3T3 myszy w obecności czyn­ ników wzrostu zaczynają przylegać do macierzy pozakomórkowej znajdującej się na dnie szalki i wchodzą w replikację DNA i podziały komór­ kowe. Pobudzenie syntezy DNA odbywa się przez aktywację czynnikami wzrostu recepto­ rów integrynowych obecnych w błonie komó­ rek. Ta aktywacja prowadzi z jednej strony do przylegania komórek do podłoża, a z drugiej sygnał ten jest przekazywany do jądra inicjując syntezę DNA. Otóż, przyleganie do podłoża ko­ mórek prowadzi do lokalnej reorganizacji cyto­ szkieletu, tworzą się wtedy miejsca przylegania (ang. foci) podtrzymywane spolimeryzowanymi

wiązkami aktyny, natomiast spada stabilność cytoplazmatycznych mikrotubul. Zatem w obe­ cności czynników wzrostu adhezja komórek do podłoża wraz z reorganizacją cytoszkieletu sta­ nowi sygnał inicjacji syntezy DNA i namnażania się komórek. Jednakże komórki 3T3, nawet przy braku czynników wzrostu, mogą tworzyć miejsca przylegania, jeżeli ich wewnętrzny sta­ bilizujący cytoszkielet mikrotubularny zostanie zdemontowany (przez podanie nokodazolu lub winblastyny). Tej wymuszonej adhezji towarzy­ szy także wejście komórek w replikację DNA

( B e r s h a d s k y i współaut. 1996). Tak więc orga­ nizacja cytoszkieletu ma bezpośredni wpływ na proliferację komórek. Inne doświadczenia (SOR-

g e r i współaut. 1997) wykazały, że obecność

lub odwrotnie depolimeiyzacja struktur mikro- tubularnych wpływają na dalsze losy komórek indukując apoptozę (w przypadku demontażu cytoszkieletu) lub różnicowanie (przy cytoszkie- lecie stabilnym). Te obserwacje wykazują, że zmiany w cytoszkielecie mogą same stanowić wew nętrzne sygnały aktywujące ścieżki przekażnictwa kontrolujące zarówno namnaża- nie się, jak też apoptozę i różnicowanie komó­ rek.

Dobrym modelem do badania udziału cyto­ szkieletu w rozwoju są wolnożyjące jednoko­ mórkowe organizmy zdolne do procesów płcio­ wych (a więc takie, u któiych można badać te procesy stosując metody genetyki rozwoju), jak komórki drożdży Schisosaccharomyces pombe i orzęsków z rodzaju Tetrahymena. Te organizmy stały się modelowymi obiektami dla badania roli cytoszkieletu w rozwoju. W komórkach spo­ czynkowych (nie dzielących się) ich cytoszkiele- ty tworzą bardzo określony wzór morfologiczny. Wznowienie cykli komórkowych, a także podję­ cie procesów płciowych przez komórki, wiąże się z zasadniczą reorganizacją tego wzoru, to zna­ czy z reorganizacją cytoszkieletu. A więc są to modele, w których można badać zależność po­ między przemianami w cytoszkielecie a realiza­ cją programu rozwoju. Obserwacje tych zmian pozwoliły wyznaczyć rolę cytoszkieletu w prze­ biegu szeregu procesów rozwoju komórek, w których udział i regulacyjna rola cytoszkieletu była zupełnie nieoczekiwana.

W tym artykule rozważymy rolę cytoszkie­ letu:

— w różnicowaniu biegunów komórki, a więc omówimy zagadnienie powstawania polar- ności komórki i wyznaczania stref wzrostu w trakcie cyklu komórkowego:

— w regulacji transkrypcji genów kodują­ cych struktury cytoszkieletalne (zjawisko jak dotąd wykryte tylko w komórce Tetrahymena) i

regulacji posttranslacyjnej stabilności struktur mikrotubularnych.

Kolejnym przedstawionym zagadnieniem będzie udział cytoszkieletu w procesie płciowym (koniugacji): utworzeniu połączenia koniugują- cych komórek, indukcji mejozy i regulacji prze­ biegu dalszych etapów procesu płciowego Tetra­ hymena. Uwarunkowania wejścia komórek w mejozę u S. pombe są inne i wobec tego te procesy nie będą tutaj omawiane.

W szczepach Tetrahymena thermophila opi­ sano wielokrotnie proces starzenia się klonów wegetatywnych przejawiający się wzrostem licz­ by komórek bezpłodnych, niezdolnych do two­ rzenia pronukleusów. Szereg badań wskazuje na to, że bezpłodność ta jest związana ze zmia­ nami starczymi w tworzeniu i funkcjonowaniu cytoszkieletu.

A oto bardziej szczegółowy zarys poszczegól­ nych zagadnień.

Pierwsze pytanie dotyczy roli cytoszkieletu podbłonowego i mikrotubul w wyznaczaniu po- larności komórki i określenie strefy wzrostu komórki. Mikrotubularne organellum komórki eukariotycznej nazwane centrosomem w ko­ mórkach zwierząt, komórkach niższych roślin i wielu pierwotniaków, wyznacza biegun przedni komórki. Na elektronogramach centrosom ma postać spolaryzowanej pałeczki złożonej ze struktury wewnętrznej przypominającej tzw. „koło zębate” (ang. cartwheel structure) i dzie­ więciu koliście rozmieszczonych potrójnych włókienek mikrotubularnych. Centrosom jest otoczony warstwą białek pericentrosomalnych i razem z nimi tworzy centriolę. Komórka w trakcie przygotowania się do podziału odtwarza centriolę potomną usytuowaną pod kątem pro­ stym w stosunku do centrioli macierzystej. Centriola może pełnić różne funkcje w komórce; np. w migrującej komórce ameboidalnej cen­ triola wraz z aparatem Golgiego wyznacza kie­ runek ruchu i biegun przedni komórki, a w organizmach posiadających rzęski lub wici cen­ triola w kontakcie z błoną komórkową staje się ciałkiem podstawowym. Położenie ciałka pod­ stawowego reguluje tworzenie potomnych cia­ łek podstawowych w okolicy tej struktury ma­ cierzystej i wyznacza miejsca tworzenia wici i rzęsek ( K r i o u t c h k o v a i O n is h c h e n k o 1999).

W komórkach roślin wyższych i innych ty­ pach komórek acentriolarnych (np. zmutowa­ nych liniach zwierzęcych, w których brak centrio­ li) wykazano, że białka pericentrosomalne, a nie struktura centrosomu, są odpowiedzialne za or­ ganizację biegunów wrzeciona mitotycznego.

Ale są i inne sposoby wyznaczania biegunów wrzeciona mito tycznego, np. u ssaków komórka

jajowa jest pozbawiona centrosomu lub ma tyl­ ko pojedyńczą centriolę. Przy zapłodnieniu ple­ mnik wnosi nie tylko haploidalne jądro, ale także centriolę wyznaczającą oś ciała zygoty (Hable i Kroft 2000). Miejsce wniknięcia ple­ mnika z dwiema centriolami do acentriolarnego jaja nicienia Caenorhabditis elegans wyznacza biegun tylny zygoty, a równocześnie na przeciw­ ległym końcu przednim zachodzi gromadzenie się aktyny. Tworzy się zatem spolaryzowana oś przednio-tylna zarodka i względem tych stru­ ktur polarnych odbywa się asymetryczne roz­ mieszczanie zarówno ziarnistości biegunowych tylnych, jak i asymetryczne zgrupowanie róż­ nych receptorów i podbłonowych kinaz.

Powstają pytania, jak odbywa się wytworze­ nie biegunów komórki w trakcie podziału ko­ mórki o mitozie wewnątrzjądrowej (np. Schi- sosaccharomyces pombe) oraz w komórce także o mitozie wewnątrzjądrowej, ale trwale spolary­ zowanej , w której oś ciała wyznaczają powielone spolaryzowane rzędy ciałek podstawowych (np. Tetrahymena).

W trakcie podziału mitotycznego komórki centriolarnej dwie centriole, macierzysta i po­ tomna, stanowią bieguny wrzeciona mitotycz­ nego i wyznaczają dwubiegunową oś tego po­ działu. W przypadku komórek acentriolarnych, takich jak komórki roślin wyższych, funkcje biegunów wrzeciona mitotycznego spełniają centra mikrotubulogenezy — MTOC (ang. mic- rotubule organizing center). W linii zmutowa­ nych acentriolarnych komórek macierzystych Drosophila hodowanych in vitro wykazano, że specyficzna odmiana białka tubulinowego, a mianowicie y-tubulina, odgrywa zasadniczą ro­ lę w organizacji biegunów wrzeciona. W sta­ dium cyklu komórki, który sprzyja polimeryza­ cji stabilnych mikrotubul, y-tubulina pojawia się w centrach mikrotubulogenezy tworząc fun­ kcjonalne bieguny mitotyczne. Wynika stąd wniosek, że warunki aktywujące wytworzenie dwóch lub więcej MTOC w komórce mogą sto­ pniowo prowadzić do wytworzenia dwubieguno­ wej osi komórki, często z wtórną eliminacją

nadliczbowych MTOC (Debec i współaut.

1995). Obecnie wiadomo, że wytworzenie dwu­ biegunowego wrzeciona związane jest także z polimeryzacją mikrotubul w bezpośrednim są­ siedztwie kondensujących chromosomów i wy­ maga aktywności kinazy fosforylującej histon H3 (kinaza typu Aurora), współdziałających z fosfatazą (typu PP1) (Hsu i współaut. 2000) i innymi kinazami towarzyszącymi funkcjonowa­

niu wrzeciona mitotycznego (Robinson i Spu-

DICH 2000).

W komórkach o mitozie centriolarnej biegu­ ny wrzeciona mitotycznego są źródłem sygnału

wyznaczającego oś komórki i położenie bruzdy cytokinetycznej rozdzielającej komórki potom­ ne. Tworzone na centrosomie mikrotubule są strukturami polarnymi; ich koniec minus (-) jest przy centrosomie, natomiast peryferyczne końce stanowią końce plus (+). Polaryzacja mi­ krotubul stanowi instrukcję strukturalną dla białek motorycznych i przyległej błony komór­ kowej. W okresie poprzedzającym podział mito- tyczny komórki, dwubiegunowe wrzeciono mi- totyczne zakotwicza się biegunami do błony komórkowej. Zakotwiczenie to stabilizuje oś wrzeciona mitotycznego, a sygnały wysyłane z biegunów wyznaczają prostopadłe położenie

bruzdy cytokinetycznej (Robinson i Spudich

2000). Zbudowanie prawidłowej struktury wrzeciona mitotycznego w stadium metafazy stanowi punkt kontrolny (ang. spindle check­ point) dla przejścia komórki w stadium anafazy

i wytworzenia bruzdy cytokinetycznej (Rudner

i Murray 1996). Ten sygnał oznacza równocześ­

nie proteolizę szeregu białek, w tym białka łą­ czącego dwie chromatydy i cyklin stanowiących składnik MPF (ang. mitosis promoting factor), oraz rozpoczęcie demontażu struktur mikrotu- bularnych wrzeciona. Natomiast bardziej za­ gadkowy jest udział pewnej kinazy białkowej, POLO-kinazy, związanej z białkiem motorycz- nym typu kinezyn (u Drosophila nazwanego białkiem PAVAROTTI), a także innych kinaz białkowych, np. NIMA , Aurora i innych (Fry

1998, Hsu i współaut. 2000). Te kinazy począt­ kowo mają różną lokalizację w komórce, ale w trakcie funkcjonowania wrzeciona przemiesz­ czają się do bruzdy cytokinetycznej. Mutanty zarówno POLO-kinazy, jak i kinezyny (PAVA­ ROTTI) wchodzą w mitozę, osiągają telofazę, ale

nie tworzą pierścienia cytokinetycznego (Adams

i współaut. 1998).

A więc zarówno w przypadku mitoz centrio- larnych, jak i acentriolarnych wyznaczenie osi wrzeciona mitotycznego i biegunów komórki odgrywa zasadniczą rolę w wyznaczaniu poło­

żenia bruzdy cytokinetycznej (Robinson i Spu­

dich 2000). Z kolei, wyznaczanie położenia

bruzdy podziałowej może warunkować przebieg dalszych procesów rozwojowych, jak to ma miejsce w bruzdkowaniu zarodka nicienia Cae­ norhabditis elegans. Prawidłowe wyznaczenie położenia bruzd cytokinetycznych jest pod kontrolą genów programu rozwoju i jest nie­ zbędne dla przeżycia zarodka i prawidłowego

przebiegu różnicowania blastomerów (Watts i

współaut. 2000).

Zarówno u grzybów (drożdże), jak i u orzę- sków mitoza odbywa się wewnątrz otoczki ją ­ drowej. Jest to tzw. acentriolarna mitoza za­ mknięta, w której w kontakcie z otoczką jądro­

wą tworzą się bieguny zwane ciałkami polarny­ mi — SPB (ang. spindle polar body), w przeci­ wieństwie do mitoz otwartych, w których oto­ czka jądrowa rozprasza się w stadium tworze­ nia dwubiegunowego wrzeciona. Powstaje pyta­ nie, jaki jest mechanizm przestrzennej zależno­ ści między wytworzeniem osi komórki a wyzna­ czeniem położenia bruzdy podziałowej w przy­ padku komórki apolarnej (S. pombe) i komórki stale spolaryzowanej (Tetrahymena). Tetrahy­ mena (Rye. 1) jest pobudliwą, trwale

spolaryzo-Ryc.l. Schemat wzoru rozmieszczenia mikrotubu- larnych struktur kortykalnych Tetrahym ena.

Biegun przedni jest miejscem od którego rozpoczyna się przebieg struktur południkowych (włókna mikrotubularne i rzędy ciałek podstawowych rzęsek). Pod biegunem prze­ dnim zlokalizowany jest aparat gębowy. Na biegunie tyl­ nym, cytoprokt lokuje się koło podgębowego rzędu No. 1, a 90° na prawo znajdują się otworki Wodniczki tętniącej.

waną komórką (a więc pływającym „jednoko­ mórkowym neuronem”), a morfogeneza podzia­ łowa ma charakter metameryczny. Ponadto, znaczniki (markery) powierzchniowe ciała obu obiektów pozwalają na badanie korelacji wzro­ stu komórki z przemianami w cytoszkielecie. Powstaje pytanie, czy ciałka podstawowe rzęsek Tetrahymena pełnią funkcję w regulacji polary­ zacji ciała i czy odbierają sygnały wyznaczające położenie bruzdy cytokinetycznej.

Genom S. pombe jest już poznany, a badania dotyczące sekwencjonowania genomu T. ther- mophila podjęte są na szeroką skalę. W ciągu ostatniego roku grupa badaczy z USA przedsta­ wiła plan częściowego sekwencjonowania geno­ mu T. thermophila (ang. Tetrahymena genome project). Dalsza realizacja projektu umożliwi poszukiwanie poszczególnych genów w geno­ mie, a także wstępną charakterystykę ich pro­ duktów białkowych. Opracowanie metod gene­

tyki molekularnej dla T. termophila spowodowa­ ło, że orzęsek ten stał się doskonałym obiektem badań procesów regulacji transkrypcji i zmian posttranskrypcyjnych białek cytoszkieletu. Ist­ nieje opracowana metoda pozbawiania komórki Tetrahymena prawie wszystkich rzęsek, to zna­ czy eliminacji z komórki ogromnej ilości spoli- meryzowanej tubuliny. Stworzyło to realną mo­ żliwość zbadania, czy ilość spolimeryzowanej i pula niespolimeryzowanej tubuliny w komórce Tetrahymena mogą stanowić sygnał dla regula­ cji poziomu transkrypcji tubuliny, i jak są re­ gulowane posttranslacyjne zmiany w polime­ rach tubuliny.

Komórki T. thermophila w określonych wa­ runkach są zdolne do procesu płciowego (ko­ niugacji). Wytworzenie pary indukuje nie tylko mejozę mikronukleusów w obu partnerach, ale także zmianę cytoszkieletu wewnątrzcytopla- zmatycznego w poszczególnych stadiach koniu­ gacji, tzn. podczas powstawania połączeń ko­ niugacyjnych, tworzenia pronukleusów, ich wymiany i krzyżowej fuzji jąder prowadzącej do powstania jąder zygotycznych (synkarionów) oraz różnicowania jąder postzygotycznych w nowe makronukleusy i mikronukleusy (patrz art. K o śc iu s z k o i P r z y b o ś w tym numerze KOS­ MOSU). We wszystkich tych stadiach pojawiają się przejściowo określone struktury cytoszkiele- talne. A więc losy jąder w takich przejściowo wielojądrowych komórkach koniugantów zależą od wykształcenia i funkcjonowania cytoszkieletu indukowanego czasowym połączeniem się komó­ rek dwóch różnych typów płciowych.

Wraz z wiekiem klonu T. thermophila, mie­ rzonym liczbą podziałów komórkowych odby­ tych po uprzedniej koniugacji, maleje liczba komórek płodnych, to znaczy zdolnych do wy­ tworzenia przedjądrzy (pronukleusów). Komór­ ki te są żywotne i mogą parować z komórkami innych typów płciowych i zawsze w obu komór­ kach pary zachodzi mejoza mikronukleusa. Jednakże wszystkie jądra postmejotyczne są następnie resorbowane. Dotychczasowe bada­ nia wskazują, że utrata zdolności do wytworze­ nia przedjądrzy i w konsekwencji odtworzenia w trakcie koniugacji nowych makronukleusów i mikronukleusów łączy się z utratą zdolności do wytworzenia specyficznych struktur cyto- szkieletalnych wokół któregokolwiek z jąder postmejotycznych. A więc istnieją przesłanki aby sądzić, że wraz z wiekiem klonalnym zacho­ dzą zmiany, które uniemożliwiają prawidłową organizację cytoszkieletu koniugacyjnego, co powoduje bezpłodność. Zadaniem tego artyku­ łu jest próba scharakteryzowania udziału cyto­ szkieletu w omówionych tutaj zjawiskach roz­ wojowych.

BADANIA NAD POLARNOŚCIĄ — ROLA CENTRÓW ORGANIZACJI MIKROTUBUL W PRZEBIEGU MORFOGENEZY PODZIAŁOWEJ

ODMIENNY WZOR PRZESTRZENNY WZROSTU KOMORKI I TYPU MORFOGENEZY U TETRAHYMENA I S. POMBE Jak się odbywa morfogeneza podziałowa Schisosaccharomyces pombe? Komórka, która znajduje się w fazie G1 cyklu komórkowego rośnie wyłącznie na starym (przedpodziałowym) biegunie i jest to jednobiegunowa faza wzrostu (Ryc. 2). Wejściu w fazę s DNA cyklu towarzyszy

aktywacja przez pobudzenie receptora typu Rho (ang. Ras homolog) ( F u r g e i współaut. 1998).

Małe białko Rho zlokalizowane w błonie komór­ kowej, po przyłączeniu cząsteczki GTP w miej­ sce GDP, działa jako GTPaza aktywując PAK-ki- nazy, np. Rho-kinazę. Wykazano, że aktywacja tej kinazy jest niezbędna dla podtrzymania dwubiegunowości komórki w mitozie i koordy­ nacji zmian w błonie komórkowej z cyklem ko­ mórkowym ( V e r d e i współaut. 1998). Białka te

Ryc. 2. Zmiany w położeniu strefy wzrostu w cyklu komórkowym drożdża Schisosaccharom yces pom be (dalsze objaśnienia w tekście).

kontrolowane genetycznie przejście z jedno- biegunowego wzrostu do wzrostu komórki na obu końcach (faza wzrostu dwubiegunowego). Dobudowa błony komórkowej w regionie dru­ giego bieguna wymaga uprzedniego przemiesz­ czenia do tego bieguna, wzdłuż osi komórki, F-aktyny i innych białek z cytoplazmy. Po ukoń­ czeniu replikacji (stadium G2/M), w otoczce jądra komórkowego drożdża tworzą się dwa

biegunowe ciałka polarne (SPBs) (M a s u d a

1995). Te nowe ciałka biegunowe w otoczce jądra wiążą y-tubulinę i białka GTBPs (ang. gamma-tubulin binding proteins) ( S c h i e b e l

2000). Pomiędzy ciałkami biegunowymi tworzy się wewnątrzjądrowe wrzeciono mitotyczne. Dwubiegunowość komórki jest regulowana przez białka motoryczne wrzeciona mitotyczne- go oraz przez stan polimeryzacji mikrotubul

(S a w in i N u r s e 1998, F u r g e i współaut. 1998).

We wczesnych stadiach mitozy, przynajmniej trzy białka kortykalne: F-aktyna, białko cyto- szkieletalne łącznikowe KELCH, wiążące ciałka polarne (SPBs) z biegunami komórki, i białko RAL 3, gromadzą się symetrycznie na obu sta­ rych biegunach komórki. RAL 3 nie jest wpraw­ dzie białkiem cytoszkieletalnym, ale pośredni­ czącym (ang. scaffold protein), które wiąże wiele białek cytoszkieletu. Te bieguny regulują oś wrzeciona mitotycznego i zapewniają osiowy wzrost komórki. Procesy lokalizacji białek cyto- szkieletalnych, regulujących biegunowy wzrost komórki drożdża, kontrolowane są przez kilka białek, w tym przez produkt genu sspl, który jest kinazą serynowo/treoninową typu PAK-ki­

nazy (M a t s u s a k a i współaut. 1995). Cechą ki­

naz PAK (ang. pRas activated kinases) jest ich

w czasie anafazy przemieszczają się do regionu tworzącej się bruzdy. Z podanych tutaj danych wynika, że w S. pombe istnieje mechanizm sprzęgający aktywność SPBs z przemianami w cytoszkielecie, który prowadzi do dwubieguno­ wego podziału komórki.

Nasze wiadomości o mechanizmach podzia­ łu wegetatywnego Tetrahymena są znacznie skromniejsze. W przeciwieństwie do większości innych komórek posiada ona względnie stabil­ ny cytoszkielet nadający komórce stały kształt i stałą polaryzację przekazywaną podczas kolej­ nych podziałów komórkowych. Oś ta jest wy­ znaczona południkowym rozmieszczeniem podpowierzchniowych struktur cytoszkieletal- nych, które wraz z systemem błony powierzch­ niowej i podbłonowych cystern stanowią tzw. korteks orzęska. W obrębie struktur południko­ wych wyróżnia się rzędy ciałek podstawowych rzęsek z towarzyszącymi im włókienkami kotwi­ czącymi. Ciałko podstawowe, o strukturze przy­ pominającej centriolę, jest strukturą spolaryzo­ waną; ma swoją część przednią i tylną oraz stronę lewą i prawą (B e is s o n i J e r k a - D z i a d o s z

1999). Tak więc struktury południkowe składa­ ją się z podjednostek spolaryzowanych stano­ wiących domeny korteksu (ang. basal body do­ main), które można wyznakować szeregiem przeciwciał ( W i llia m s i współaut. 1990, F r a n k e l

1999). Ciałko podstawowe odbiera również syg­ nały zewnętrzne regulujące ruch rzęski, a więc jest strukturą spolaryzowaną nie tylko morfolo­

gicznie, ale także fizjologicznie (H e n n e s s e y i

K u r u v i l l a 1999). Ciałka podstawowe zawierają y-tubulinę i powielają się podobnie do centrioli, a ostatnio wykazano, że inaktywacja funkcji

genu y-tubuliny (u innego o rzęska, Parame- ciuni) zatrzymuje ich powielanie w korteksie (Ruiz i współaut. 1999).

Orzęsek ma wyróżnialny morfologicznie bie­ gun przedni i tylny. Pod biegunem przednim Tetrahymena występuje charakterystyczna struktura aparatu gębowego, złożona z zespo­ łów orzęsionych ciałek podstawowych tworzą­ cych błonki. Rytmiczny ruch błonek napędza pokarm do zagłębienia, w którym odbywa się zlokalizowana fagocytoza. Aparat gębowy jest asymetryczny i ma różne krawędzie, lewą i pra­ wą oraz przednią i tylną (Kie r s n o w s k ai Go l iń-

s k a 1996). Położenie gęby jest wyznacznikiem

zarówno przodu ciała, jak i strony brzusznej orzęska. W okolicy bieguna tylnego występuje wsparty cytoszkieletem cytoprokt, któiy jest zlokalizowanym miejscem defekacji, czyli usu­ wania na zewnątrz niestrawionych zawartości wodniczek pokarmowych. Także w okolicy bie­ guna tylnego występują stałe, wzmocnione cytoszkieletem, otworki Wodniczki tętniącej — CVPs (ang. contractile vacuole pores), przez które usuwany jest nadmiar wody i płynne metabolity komórki. Struktury południkowe oraz struktury gęby, cytoproktu i otworki Wod­ niczki tętniącej są morfologicznymi znacznika­ mi biegunów komórki (ang. cortical landmarks) i polarności korteksu. Struktury te tworzą (Ryc. 1) określony kortykalny wzór przestrzen­ ny cytoszkieletu (ang. cortical pattern) (Na n n e y

1966, Fr a n k e l 1989).

W okresie międzypodzialowym przyrost po­ wierzchni ciała Tetrahymena zachodzi w środ­ kowej strefie komórki (Ryc. 3). Towarzyszy temu polimeryzacja struktur cytoszkieletalnych oraz proliferacja ciałek podstawowych i rzęsek w

rzędach południkowych. Nowe ciałka podsta­ wowe (jedno lub więcej) powstają z przodu ist­ niejącego, orzęsionego ciałka podstawowego i początkowo są nieorzęsione. Następnie dobu- dowywane są rzęski i struktury włókniste ko­ twiczące ciałka podstawowe w korteksie i w ten

sposób powstają nowe domeny kortykalne (Al­

l e n 1969, szczegółowo geometrię tego procesu

u Tetrahymena omawia Fr a n k e l 1999). Pozycja

ciałek podstawowych w rzędach południko­ wych jest pod kontrolą genetyczną (Na n n e y

1975). Komórka jest spolaryzowana jako ca­ łość, bowiem w mutancie T. thermophila (disor­ der) ciałka podstawowe i rzęski nie tworzą re­ gularnych rzędów, a mimo to komórka zacho­ wuje nadal charakterystyczny kształt i prawid­ łowe położenie bruzdy podziałowej (Je r k a- Dz ia-

d o s z i współaut. 1995).

Komórka orzęska w trakcie podziału wege­ tatywnego dzieli się poprzecznie względem osi przodo-tylnej, która zostaje zachowana w ko­ mórkach potomnych. Oznacza to, że potomny osobnik przedni (zwany proterem) tworzy się z przedniej części ciała osobnika rodzicielskiego i wytwarza nowy biegun tylny, a osobnik tylny (zwany opistorem) wytwarza nowy biegun prze­ dni i tworzy się z tylnej części ciała osobnika rodzicielskiego. Ponieważ bruzda podziałowa Tetrahymena przebiega poprzecznie w stosun­ ku do rzędów rzęsek i rozdziela tworzący się biegun tylny protera i biegun przedni opistora, to podział ten nie jest podziałem symetrycznym (Rye. 4A), lecz metamerycznym, czyli segmen - talnym (Rye. 4B) (Fr a n k e l 1989).

W trakcie podziału Tetrahymena zachodzi częściowa reorganizacja cytoszkieletu. W tylnej połowie komórki tworzy się nowy aparat gębowy

- strefa wzrostu korteksu - zróżnicowana strefa bruzdy

Ryc. 3. Zmiany w p o ło że n iu strefy wzrostu i tworzenie strefy b ru z d y w tra­ kcie morfogene- zy podziałowej T e t r a h y m e n a (d a lsz e o b ja ś ­ n ie n ia w tek­ ście).

dla przyszłego osobnika tylnego, czyli opistora, oraz nowy cytoprokt i nowe otworki wodniczek tętniących w przedniej połowie dla przyszłego protera (Ryc, 4B) ( F r a n k e l 1989). Zawiązek

biegunach, natomiast wydłuża się w strefie środkowej (Ryc. 3) (K a c z a n o w s k i 1978). Analiza wzoru przestrzennego namnażania się ciałek podstawowych na powierzchni Tetrahymena

Ryc. 4. Schematy typów symetrii podziału i polaryzacja komórek potomnych (strzałki).

A. podział symetryczny wyznaczony osią wrzeciona kariokinetycznego. B. Podział metameryczny (segmentalny) Tetrahy­

mena; bruzda przebiega poprzecznie względem osi ciała, a bruzda rozdziela różne bieguny ciała potomnych komórek

C. Tworzenie metamerycznych gradientów zmian w rozmieszczeniu epitopu anty-B w cytoszkielecie kortykalnym (kropko­ wanie). Strefa bruzdy powstaje na granicy segmentalnego powtórzenia gradientów (dalsze objaśnienia w tekście).

nowego aparatu gębowego powstaje po lewej stronie zagębowego, południkowego rzędu cia­ łek podstawowych rzęsek, zwanego rzędem Nr. 1, mniej więcej w połowie jego długości. Powstanie zawiązka nowej gęby (OA2) wyznacza położenie przyszłej poprzecznej bruzdy podzia­ łowej. W ten sposób, w obrębie wzoru kortykal- nego komórki powstają metamerycznie dwa wzory dla dwóch komórek potomnych. Miejsca powstawania poszczególnych struktur korty- kalnych (nowa gęba, nowy cytoprokt i nowe CVPs) są wyznaczone przez mapę istniejącego korteksu, który wytwarza sygnały dla morfoge- nezy kortykalnej. Sygnały te są związane z cy­ klem podziału wegetatywnego komórki i z pun­ ktami kontrolnymi tego cyklu.

Bez względu na wielkość, Tetrahymena two­ rzy bruzdę podziałową mniej więcej w środku długości ciała, a więc położenie bruzdy podzia­ łowej wyznacza geometria całej powierzchni cia­ ła. W przeciwieństwie do podziału symetryczne­ go wielu innych typów komórek, wyznaczonego biegunami wrzeciona mitotycznego (Rye. 4A), podział wegetatywny orzęska jest związany z wyznaczeniem położenia nowych biegunów ko­ mórek potomnych w bruździe podziałowej (Rye. 4B). Tetrahymena nie rośnie na swoich

wskazuje na istnienie dwóch gradientów tego procesu: przednio-tylnego (z najwyższymi wskaźnikami w strefie podrównikowej, a zero­ wymi dla biegunów ciał, które nie rosną) oraz grzbietowo-brzusznego (z największą aktywno­ ścią rzędów rzęskowych numer: 1 i 2 na stronie brzusznej i najniższą dla rzędów grzbietowych). Miejsce powstania nowej gęby, OA2, dla opisto­ ra może być opisane przez najwyższy wskaźnik proliferacji ciałek podstawowych (K a c z a n o w s k i

1978).

Gatunek T. thermophilajest jednym spośród wielu kryptogatunków, które dawniej obejmo­ wano wspólną nazwą T. pyriformis. T. thermo- phila, jako typowy orzęsek, posiada zarówno mitotyczne jądro generatywne nieaktywne transkiypcyjnie — mikronukleus, jak i zróżni­ cowane funkcjonalnie jądro — makronukleus, które dzieli się amitotycznie w końcowej fazie cytokinezy. Cytokineza T. thermophila je s t sprzężona czasowo zarówno z mitozą mikronu- kleusa, jak i podziałem makronukleusa. Jed­ nak istnieją także tetrahymeny (np. T. pyrifor­ mis), a także amikronuklearny mutant T. ther­ mophila, które nie posiadają mikronukleusa, a mimo to dzielą się w taki sam sposób jak ko­ mórki mikronuklearne. Wyznaczanie

położę-nia bruzdy podziałowej u T. pyriformis, a także w komórkach gatunków mikronuklearnych zachodzi bez udziału struktur wrzeciona mitotycznego. Proces morfogenezy podziałowej w komórce Tetrahymena ma charakter meta- meryczny i jest zdeterminowany wyłącznie przez reorganizację cytoszkieletu kortykalnego.

A więc u orzęsków w trakcie podziału nie tworzy się dwubiegunowa oś ciała komórki po­ mimo zasadniczego podobieństwa struktural­ nego, sposobu powielania oraz budowy centro- somu (ciałek podstawowych rzęsek). Z drugiej strony, w dzielących się komórkach drożdży tworzy się dwubiegunowa oś ciała, pomimo za­ sadniczo odmiennej struktury i lokalizacji SPB w stosunku do centrosomu. Natomiast we wszystkich tych strukturach mamy pewne ce­ chy wspólne, tzn. występowanie y-tubuliny, po­ wielanie struktury w określonej fazie cyklu i aktywność w organizowaniu polimeryzacji tu- buliny.

Powstaje pytanie, czy i jakie istnieją punkty kontrolne w cyklu podziału orzęska i drożdża, które determinują zależność pomiędzy struktu­ rami o charakterze centrów polimeryzacji mi- krotubul zawierających y-tubulinę a wyznacze­ niem i funkcjonowaniem bruzdy cytokinetycznej.

PODOBIEŃSTWA W KONTROLI SPRZĘŻENIA CYKLU KOMÓRKOWEGO Z FOSFORYLACJA BIAŁEK CYTOSZKIELETU

U S. POMBE I TETRAHYMENA

Aktywacja dwóch servnowo/ treoninowych kinaz białkowych: p34cdc /cyklina B oraz kina­ zy NIMA (ang. never in mitosis Aspergillus) po­ woduje jednoczesną fosforylację białek wcho­ dzących w skład wielu struktur komórki droż­ dży S. pombe. Te kinazy wpływają na profazalną kondensację chromosomów i fosforylują biegu­ ny wrzeciona mitotycznego, kinetochory oraz SPB. Jednocześnie, fosfoiylacje te są wykrywa­ ne przeciwciałem MPM-2 w ekstrahowanych cytoszkieletach dzielących się komórek. Nastę­ pnie, kinaza NIMA, podobnie jak cyklina B, jest degradowana w stadium telofazy (Ye i współaut. 1995).

To samo przeciwciało, MPM-2, wiąże się z wieloma strukturami cytoszkieletu w interfa- zalnej komórce Tetrahymena ( K i e r s n o w s k a i G o l i ń s k a 1996), a fosforylacja poszczególnych

struktur cytoszkieletu zmienia się w trakcie cyklu komórkowego (K a c z a n o w s k a i współaut.

1999). Co więcej w Tetrahymena wykryto za­ równo homolog kinazy p 3 4cdc2 (G o n d a i współ­ aut. 1999 a, patrz także poniżej), jak i homolog kinazy NIMA (W a n g i współaut. 1998).

W czasie podziału komórki Tetrahymena tworzą się dwa metameryczne gradienty niektó­

rych własności korteksu, np. wzrostu rzęsek

( F r a n k e l i współaut. 1981). Granicą pomiędzy tymi gradientami jest bruzda ( F r a n k e l 1989). W strefie bruzdy zahamowane jest tworzenie nowych ciałek podstawowych, a strefy wzrostu aktywują się w środkowych rejonach powstają­ cego protera i opistora (Fig. 3) (K a c z a n o w s k a i współaut. 1993). Znakowanie dzielących się te- trahymen przeciwciałem MPM-2 wykazało, że fosforylacja w południkowych rzędach ciałek podstawowych rzęsek jest najbardziej inten­ sywna w przedniej okolicy komórki oraz bezpo­ średnio za bruzdą podziałową, a spada stopnio­ wo w dalszych ciałkach podstawowych. Wyka­ zano również różnice w ufosforylowaniu stru­ ktur nowej i starej gęby. A więc w czasie podzia­ łu Tetrahymena intensywność fosforylacji cia­ łek podstawowych tworzy wzdłuż południków metameryczne gradienty, a na ich granicy po­ wstaje bruzda podziałowa ( K a c z a n o w s k a i

współaut. 1999).

Podobne dwa gradienty wiązania pewnych epitopów białek cytoszkieletu podbłonowego

( W illia m s i współaut. 1987, 1990), rozdzielone

strefą bruzdy, powstają w dzielących się Tetra­ hymena (Rye. 4C) (K a c z a n o w s k a i współaut.

1999). Ponadto, w mutantach T. thermophila dzielących się na dwa nierówne osobniki po­ tomne wykazano, że przesunięciu bruzdy towa­ rzyszy odpowiednia zmiana w gradientach fo­ sforylacji ciałek podstwowych i epitopów białek podbłonowych ( K r z y w i c k a i współaut. 1999).

Te dane wskazują, że zarówno u S. pombe, jak i u Tetrahymena zmiany w intensywności fosforylacji w cytoszkielecie dzielących się ko­ mórek, wykrywane przeciwciałem MPM-2, były zawsze wskaźnikiem procesu tworzenia bruzdy podziałowej (LOGARINHO i S u n k e l 1998, B a h l e r

i współaut. 1998).

WYZNACZANIE POŁOŻENIA I FUNKCJONOWANIA BRUZDY PODZIAŁOWEJ S. POMBE, POŚREDNIE DANE DOTYCZĄCE

TETRAHYMENA

M a t a i N u r s e (1997) stwierdzili, że położenie

bruzdy podziałowej u S. pombe wyznaczane jest przez kortykalne punkty odniesienia, którymi są rosnące bieguny komórki (Ryc. 2). Pier­ wszym etapem jest aktywacja biegunów wrze­ ciona mitotycznego, a następnie biegunów ko­ mórki. Położenie bruzdy podziałowej w połowie osi ciała u S. pombe kontrolowane jest przez produkty genu M idlp i dwie kinazy seryno- wo/treoninowe: Poml i Pio 1 (tak zwana POLO- kinaza). Produkty fosforylacji cytoszkieletu przez kinazę Plol wykrywane są również prze­ ciwciałem MPM-2 ( B A h l e r i współaut. 1998). Podobnych białek nie zidentyfikowano jeszcze

u Tetrahymena. Istnieją jednak pośrednie do­ wody na to, że w trakcie podziału komórki zachodzi aktywacja przynajmniej bieguna prze­ dniego Tetrahymena, skoro gęba OA1 i część apikalna komórki podlega kilkustopniowej reorganizacji. Reorganizacja ta jest związana z cyklem zmian w ufosforylowaniu poszczegól­ nych struktur cytoszkieletu gęby, wykrywa­

nych przeciwciałem MPM-2 (Kaczanowska i

współaut. 1999).

Przemieszczanie się w region bruzdy aktyn i aktyno-podobnych białek (np. profiliny, fim- bryny ) oraz białek enzymatycznych, (jak kilku kinaz, np. cdc7 — kinazy i GTPazy, np. Spglp) reguluje powstanie i funkcjonowanie bruzdy podziałowej S. pombe. Zmiany te odbywają się po przejściu metafazowo-anafazowym cyklu, tzn. po uruchomieniu proteolizy i inaktywacji MPF. Wszystkie te przemiany stanowią składo­ we nowej ścieżki sygnalizacyjnej łączącej cykl

jądrowy z przebiegiem cytokinezy (Evangelista

i współaut. 1997, Sparks i współaut. 1999,

Balasubramanian i współaut. 2000).

Podczas cytokinezy w komórce Tetrahyme­ na, podobnie jak w innych badanych komór­

kach, tworzy się strukturalny pierścień (Jerka-

Dziadoszi współaut. 1995) wyznaczający miej­ sce podczepienia cytoszkieletu pierścienia kur­

czliwego (Jerka-Dziadosz 1981). Obecnie zlo­

kalizowano w bruździe dzielącej się Tetrahyme­ na szereg białek pierścienia kurczliwego, np.

aktynę (HlRONO i współaut. 1987), profilinę

(Edematsu i współaut. 1992) i białko podobne

do fimbryny (Watanabe i współaut. 1998). Po­

dobnie w bruździe drożdża zlokalizowano białka zależne od kinazy zależnej od kalmoduliny u

drożdża (McCollumwspółaut. 1995) i podobną

kinazę w pierścieniu cytokinetycznym Tetrahy­ mena thermophila (Gonda i współaut. 1999 a, b).

Wszystkie te dane wskazują na podobień­ stwo molekularne mechanizmów regulujących zarówno przemiany cytoszkieletalne w podziale dwubiegunowym drożdży, jak i w podziale seg- mentalnym orzęsków.

WPŁYW ZMIAN POSTTRANSLACYJNYCH TUBULIN W CYTOSZKIELECIE T. THERM O PH ILA NA RÓŻNICOWANIE WŁASNOŚCI STRUKTUR MIKROTUBULARNYCH

s t u k t u r yt u b u l in o w ej a k o ź r ó d ł o s y g n a ł u REGULUJĄCEGO TRANSKRYPCJĘ GENÓW TUBULINOWYCH

Zmiany posttranslacyjne tubuliny

Struktura korteksu Tetrahymena jest bar­

dzo złożona (Allen 1967). Wiele struktur mikro-

tubularnych wykazuje różną stabilność w cyklu komórkowym, jak też różną odporność na czyn­

niki depolimeryzujące (Frankel 1999). W ko­

mórce T. thermophila wyróżniono co najmniej kilkanaście różnych typów struktur mikrotu- bularnych. Tetrahymena jest zatem znakomi­ tym modelem do badania wpływu zmian post- translacyjnych tubulin na właściwości mikro- tubul oraz zależnej od tubuliny regulacji fun­ kcjonowania genów tubuliny.

Podstawowym budulcem mikrotubul są heterodimery tubulinowe złożone z cząsteczek a- i (3-tubuliny. Występowanie wielu struktur mikrotubularnych o różnorodnych własno­ ściach i stabilności w obrębie jednej cyto plazmy wynika, albo z obecności izoform tubulinowych, albo ich modyfikacji posttranslacyjnych oraz ze współdziałania z białkami MAP, białkami moto- rycznymi z rodziny kinezyn i dynein oraz biał­

kami opiekuńczymi (Luduena 1993, Lee 1993,

Skoufias i Scholey 1993, Soares i współaut.

1995, Williams i Nelsen 1997). W jaki sposób

może być regulowane powstawanie mikrotubul o różnych właściwościach, a w konsekwencji różne funkcje mikrotubul ?

Po pierwsze, jest to związane z występowa­ niem wielu genów dla a- i/lub (3-tubuliny (Lit­ tlei Seehaus 1988, Burns 1991), a w rezultacie

wielu izotypów tubuliny i heterodimerów tubu­ linowych. Taka różnorodność powoduje, że da­ ny rodzaj mikrotubul jest budowany tylko z pewnych rodzajów heterodimerów, co może wpływać na późniejsze własności mikrotubul, ich trwałość wiązania białek motorycznych lub białek MAP oraz oddziaływania z innymi białka­ mi itp. Okazuje się, że w niektórych tkankach (np. gonady męskiej Drosophila) ekspresji ule­ gają tylko niektóre geny tubulinowe i nigdy nie stwierdza się obecności izotypów powstałych na skutek ekspresji pozostałych genów tubuliny

(Savage i współaut. 1989, Hoyle i Raff 1990). W ten sposób, w niektórych wyspecjalizowa­ nych tkankach dochodzi do wytworzenia mi­ krotubul o ściśle określonych właściwościach.

Po drugie, właściwości mikrotubul związane są również ze zmianami posttranslacyjnymi i oddziaływaniem z innymi białkami, np. białka­ mi MAP, kontrolującymi stabilność mikrotubul, białkami opiekuńczymi TCP-1 powodującymi zmiany w strukturze tubulin i różną ich stabil­

ność (Gao i współaut. 1993) oraz czynnikami

mórkowego, zmieniającymi kinetykę polimery­ zacji/ depolimeiyzacji heterodimerów tubulino- wych (Soa r e s i współaut. 1995, A n d e r s e n

1999). Z kolei, mikro tubule w rzęskach Tetra- hymena są przykładem struktur bardzo stabil­ nych, które nie ulegają depolimeiyzacji pod wpływem czynników, które depolimeryzują mi- krotubule w komórkach interfazowych i podzia­ łowych.

Komórki Tetrahymena mają tylko jeden gen dla a-tubuliny i dwa geny dla P-tubuliny, kodu­ jące takie samo białko (ostatnie doniesienia wskazują na istnienie trzech genów dla (3-tubu- liny) ( G a e r t i g i współaut. 1993, Gu — informa­

cja ustna). Przy tak małej różnorodności hete­ rodimerów powstających z prawie jednolitej pu­ li monomerów tubulinowych, pojedyncza ko­ mórka jest w stanie wytworzyć aż około 17 różnych struktur mikrotubularnych. Zatem, dysponująca znacznie mniejszą liczbą izotypów tubuliny Tetrahymena wytwarza mikrotubule o różnych własnościach w liczbie podobnej jak organizmy wielokomórkowe, mające wiele izoty­ pów tubuliny. Ponieważ niewielka liczba genów tubulinowych charakteryzuje organizmy wy­ twarzające wici i rzęski, być może im mniejsza jest różnorodność heterodimerów, tym bardziej stabilne struktury mikrotubularne mogą być z nich wytworzone w komórce ( G a e r t i g i współ­ aut. 1993). Dalsze badania tubulin Tetrahyme­ na wykazały występowanie kilku izomerów a- tubulinowych ( G a e r t i g i współaut. 1995). Sko­ ro same izoformy tubulin nie są źródłem zmien­ ności mikrotubul Tetrahymena wydaje się, że w komórce tej główną rolę w różnicowaniu włas­ ności poszczególnych izomerów tubuliny mają modyfikacje posttranslacyjne.

Tubuliny w procesie obróbki posttranslacyj- nej mogą ulegać acetylacji, tyrozylacji/detyro- zylacji, poliglicylacji, poliglutamylacji i fosfory­ lacji. Większość miejsc modyfikacji posttransla- cyjnych tubulin znajduje się na C-końcu tego białka. Jak do tej pory żadnej z tych modyfikacji nie udało się przypisać specyficznej funkcji (Hai i Gorovsky — informacja ustna, H ir a n o - O h n is i

i W a t a n a b e 1989, P e n q u e i współaut. 1991). Wydaje się, że przynajmniej z dwóch powodów Tetrahymena jest odpowiednim obiektem do badań zmian posttranslacyjnych tubulin: (1) małej liczby genów kodujących tubulinę (jeden gen a-tubuliny i dwa, być może trzy geny (3-tu- buliny), (2) łatwości konstruowania mutantów i manipulacji genetycznych przez wprowadzenie do komórki zmutowanego genu i jego podsta­ wianie w miejsce dzikiego. W ten sposób kon- strukt znajduje się na swoim miejscu w geno­ mie i podlega ekspresji takiej, jak gen dziki

( G a e r t i g i współaut. 1994).

W ostatnim okresie dokładnie przebadano funkcje jakie spełnia acetylacja lizyny 40 zlo­ kalizowanej na N-końcu a-tubuliny. W tym celu w komórkach Tetrahymena zastąpiono gen dzi­ ki konstruktem, w którym kodowana tubulina w miejscu lizyny 40 miała podstawioną argininę (oba aminokwasy zawierają grupę zasadową). Okazało się, że zmodyfikowane białko nie było acetylowane. Tym niemniej komórki tworzące zmutowane białko nie wykazywały żadnych za­ uważalnych zmian w porównaniu z komórkami kontrolnymi ( G a e r t i g i współaut. 1995). Wyda­

je się więc, że acetylacja lizyny 40 nie ma wpły­ wu na stan mikrotubul. Dlaczego więc amino­ kwas ten jest konserwowany ewolucyjnie? Na­ suwa się kilka odpowiedzi.

1. Być może modyfikacja ta działa synergi- stycznie z innymi. W komórce Tetrahymena wykazano istnienie izoform a-tubuliny i P-tu- buliny związanych ze zmianami posttranslacyj- nymi. Wszystkie izoformy a-tubuliny są acety­ lowane na lizynie, ale różnią się ładunkiem. Świadczy to o występowaniu jeszcze innych modyfikacji posttranslacyjnych w tubulinie. Być może zmiany we właściwościach mikrotu­ bul spowodowane przez te modyfikacje wraz z acetylacją, doprowadzają do zmian właściwości a-tubuliny, a następnie powodują zmianę w funkcji heterodimeru tubulinowego i całej mi- krotubuli.

2. Być może jednak „sprawność” mikrotubul i całej komórki pod wpływem acetylacji lizyny 40 zmienia się w sposób na razie nieuchwytny do wykazania, ale na tyle istotny, że jest kon­ serwowany ewolucyjnie.

3. Możliwe również, że a-tubulina jest dru­ gorzędnym (przypadkowym) substratem dla modyfikującej ją acetylazy, której główny sub- strat ma miejsce acetylacji o podobnej budowie jak (3-tubulina. Zatem tubulina byłaby acetylo- wana „przy okazji” acetylacji innego białka, któ­ rego modyfikacja mogłaby mieć dużo większe znaczenie. Można by zatem mówić o konserwa­ cji ewolucyjnej enzymu modyfikującego tubuli­ nę, a nie samej modyfikacji ( G a e r t i g i współaut.

1995).

Udało się również uzyskać mutanty Tetrahy­ mena, w których na C-końcu a- lub p-tubuliny, usunięto miejsca poliglicylacji kwasu glutami­ nowego. Badania wykazały, że brak poliglicyla­ cji a-tubuliny nie powoduje zmian ruchliwości i przeżywalności komórek. Natomiast w przy­ padku P-tubuliny efekt mutacji zależy od liczby zmutowanych miejsc. W P-tubulinie na C-koń­ cu występują cztery miejsca poliglicylacji. Za­ stąpienie trzech miejsc poliglicylacji powoduje spowolnienie wzrostu, zmniejszoną ruchliwość, a także zatrzymanie podziałów. Mutanty bardzo

często wykazują nienormalną wielkość, a także zwiększoną liczbę jąder. Zdarza się również, że komórki nie przechodzą cytokinezy lub też bruzda podziałowa jest położona niesymetrycz­ nie. Takie fenotypy mogą być wynikiem niepra­ widłowych oddziaływań mikrotubul z białkami motorycznymi i strukturalnymi związanymi z tubulinami. Natomiast zastąpienie czterech miejsc poliglicylacji (3-tubuliny jest letalne. Eks­ presję nieprawidłowych fenotypów komórek za­ wierających zmutowany gen można jednak od­ wrócić. Do komórek zawierających zmutowany gen (3-tubuliny wszczepiono gen a-tubuliny, w którym C-koniec zastąpiono C-końcem pocho­ dzącym z dzikiego genu (3-tubuliny. Takie ko­ mórki nie wyrażały nieprawidłowego fenotypu (Xia i współaut. 2000, Gaertig — informacja ustna).

Udział tubuliny w regulacji transkrypcji genów tu ­ bulin

Jedną z ciekawych własności tubuliny jest jej udział w regulacji ekspresji genów, z czego najlepiej poznanym przykładem jest regulacja ekspresji genów a- i (3-tubuliny. Badania z inhi­ bitorami tubulin na komórkach ssaków wyka­ zały, że przy zastosowaniu środków depolime- ryzujących mikro tub ule obserwowano spadek ilości mRNA tubulin, a przy zastosowaniu środ­ ków stabilizujących mikrotubule, wzrost jego ilości (Cl e v e l a n d i współaut. 1981, 1983). W następnych badaniach stwierdzono, że pod wpływem zmian w poziomie monomeru tubuli- nowego następuje zmiana ilości mRNA tubulin. Wzrost ilości monomerów tubuliny pobudza

specyficzną degradację mRNA (3-tubuliny (Ba-

c h u r s k i i współaut. 1994, Cl e v e l a n d 1989). Przyżyciowe odrzęsianie Tetrahymena przy pomocy czynników chemicznych (Thompson i współaut. 1974) powoduje odpadnięcie wszy­ stkich rzęsek, z zachowaniem ich ciałek podsta­ wowych. Zachodząca następnie synchroniczna i masowa regeneracja rzęsek pozwala na bada­ nie molekularnych mechanizmów tego procesu.

Wydaje się, że w komórkach Tetrahymena regulacja transkrypcji genów tubulinowych przebiega w nieco inny sposób niż w komórkach ssaków. Depolimeryzacja mikrotubul przy po­ mocy oiyzaliny lub kolchicyny wywołuje wzrost ilości mRNA dla a-tubuliny, a co za tym idzie wzrost ilości monomeru a-tubulinowego, a więc nie występuje charakterystyczna dla komórek ssaków degradacja mRNA tubulinowego. Co ciekawsze, to samo zjawisko (czyli wzrost ilości monomerów tubuliny) występowało pod wpły­ wem czynników stabilizujących mikrotubule, między innymi taksolu (St a r g e l l i współaut.

1992). Wydaje się więc, że Tetrahymena gene­ ralnie reaguje na zakłócenia w cy to szkielecie poprzez wzrost ilości mRNA dla a-tubuliny.

Dalsze badania wykazały, że Tetrahymena posiada dwa niezależnie działające mechani­ zmy reagowania na zniszczenie mikrotubul (Gu

i współaut. 1995). Pierwszy z nich jest urucha­

miany, gdy komórka Tetrahymena zostaje od- rzęsiona, a więc zniszczeniu uległy mikrotubule budujące rzęski. W odpowiedzi na odrzęsienie, w komórce zostaje uruchomiona transkrypcja wszystkich genów kodujących tubulinę (gen a- tubulinowy i dwa geny (3-tubuliny). Natomiast w przypadku, gdy nastąpi tylko depolimeiyza- cja mikrotubul cytoplazmatycznych bez odrzę- siania, pobudzana jest ekspresja genu a-tubu- liny i tylko jednego z dwóch genów (3-tubuliny.

W jaki sposób komórka „rozróżnia”, które ze struktur mikrotubularnych uległy zniszczeniu? Po pierwsze, u orzęsków, jak to zbadano w Paramecium caudatum, kanały wapniowe zależ­ ne od napięcia występują wyłącznie na rzę­ skach (Ma c h e m e ri Og u r a 1979, patrz art. Fa b- c z a k i Fa b c z a k w tym numerze KOSMOSU).

Zniszczenie rzęsek może być w jakiś sposób skorelowane z otwarciem tych kanałów, a to mogłoby powodować specyficzny sygnał uru­ chamiający translację genów tubulinowych. Kanały tego samego typu mogłyby występować powszechnie w rzęskach orzęsków, w tym rów­ nież u Tetrahymena. Następnie, rzęski zawiera­ ją unikalną kinezynę (Be r n s t e in i współaut.

1994) i dyneinę (Pa s c h a l i współaut. 1992), a w rzęskach Tetrahymena wykazano także istnie­ nie unikalnej kinazy tubulinowej Ca2+ /kalmo- dulino-zależnej (Hir a n o-Oh n is h i i Wa t a n a b e

1989) i to decydowałoby o specyfice sygnału transkrypcji genów tubulinowych.

Trudniej jest określić jaki mechanizm mógł­ by uruchamiać transkrypcję tubulin po znisz­ czeniu mikrotubul cytoplazmatycznych. Pewne przypuszczenia opierają się na wynikach wcześniejszych doświadczeń nad wpływem czynników depolimeryzujących i taksolu na po­

ziom mRNA tubulin (St a r g e l l i współaut.

1992). Prawdopodobnie w obu przypadkach, zarówno w przypadku depolimeryzacji mikrotu­ bul pod wpływem oryzaliny, jak i w przypadku ich stabilizacji taksolem, dochodzi do spadku ilości monomerów tubulin: w przypadku depo­ limeryzacji monomery są wiązane przez czynnik depolimeryzujący, natomiast w przypadku sta­ bilizacji taksolem monomery pozostają związa­ ne w polimery mikrotubul.

Pomimo pewnych wątpliwości interpretacyj­ nych, w Tetrahymena wykazano po raz pier­ wszy, że cytoszkielet jest składnikiem ścieżki

transdukcji sygnału w regulacji transkrypcji genu tubuliny i może uczestniczyć w regulacji funkcji genów. Cytoszkielet nie jest więc jedynie

„wykonawcą” odebranych sygnałów, ale rów­ nież ich źródłem i ścieżką przekazu (Gu — informacja ustna).

ROLA CYTOSZKIELETU W KONIUGACJI

PRZEBIEG KONIUGACJI

Warunkiem koniecznym do wejścia komó­ rek w koniugację (Ryc. 5A) jest ich okresowe głodzenie (inicjacja) oraz wzajemne oddziaływa­ nie na siebie komórek różnych typów płciowych (kostymulacja), które następnie łączą się prze­ dnimi okolicami ciała (przedgębowymi) (Br u n s

i Br u s s a r d 1974). Połączenie koniugacyjne (ang. conjugation junction), które trwa około 10 godzin, pobudza proces mejozy (Ryc. 5A, b). Jedno z czterech jąder postmejotycznych dzieli się mitotycznie (mitoza pregamiczna), zaś trzy pozostałe są przesuwane ku tyłowi komórki, gdzie ulegają degradacji (Ryc. 5A, c-e). W wyni­ ku podziału mitotycznego w każdym z koniu- gantów powstają dwa przedjądrza: stacjonarne i migracyjne (Rye. 5A, f). Po wzajemnej wymia­ nie przedjądrzy migracyjnych (Ryc. 5 A, g-h), dochodzi do ich fuzji z przedjądrzami stacjonar­ nymi (Ryc. 5 A, i). Powstałe w ten sposób jądro zygotyczne, zwane także synkarionem, prze­ chodzi dwa podziały postzygotyczne (5 A, j-m), po czym jądra potomne podlegają różnicowa­ niu: dwa z nich, zlokalizowane w przedniej czę­ ści komórki, stają się zawiązkami nowych ma- kronukleusów, zaś dwa jądra położone w tyle komórki, pozostają mikronukleusami (Ryc. 5A, n-o). W tym czasie stary, przedkoniugacyjny makronukleus przesuwa się ku tyłowi komórki i ulega degradacji (Ryc. 5A, o-p.). W trakcie koniugacji orzęska zachodzą więc wielokrotne podziały mikronukleusa (mejoza, mitoza prega­ miczna) oraz postzygotyczne podziały synkario- nu bez cytokinezy. W ten sposób, przejściowo, powstają wielojądrowe komórki. O losach po­ szczególnych jąder, to znaczy o kolejnych po­ działach, różnicowaniu lub resorpcji decydują: położenie jąder w cytoplazmie, gotowość jąder do odpowiedzi na określone sygnały docierające do nich z cytoplazmy w poszczególnych etapach koniugacji oraz specyficzne stuktuiy cytoszkie- letalne. Tetrahymena thermophita jest więc ko­ mórką, w której można badać udział cytoszkie­ letu w kontroli przebiegu koniugacji.

Z badań nad innymi typami komórek (oocyt Drosophila) wiadomo, że wewnątrzcytopla- zmatyczne mikrotubule pełnią dwojaką rolę: są zaangażowane w przemieszczanie się jądra

oo-cytu w cytoplazmie oraz w transport ważnych determinant rozwojowych (mRNA, białek).

Istnienie kompartmentalizacji cytoplazmy w koniugujących tetrahymenach sugerują do­ świadczenia N a n n e y ’a (1953): wymuszone sil­

nym wirowaniem przemieszczenie mikronu- kleusów w koniugantach powodowało zmiany w liczbie tworzących się mikronukleusów i za­ wiązków makro nuklearny eh.

Zależności między stanem cytoplazmy a lo­ sami jąder obserwowano również u Paramecium

(M ik a m i 1980, G r a n d c h a m p i B e i s s o n 1981, Y a n a g i 1987). W komórce wegetatywnej mikro-

nukleus nigdy nie przekształca się w zawiązek makronuklearny. Dopiero proces płciowy umo­ żliwia podziały jąder, fuzję przedjądrzy i różni­ cowanie zawiązków makronuklearny eh. Prze­ niesienie mikronukleusa z komórki wegetatyw­ nej P. caudatum do koniuganta w okresie II podziału postzygotycznego lub tuż po tym po­ dziale, może zmusić przeszczepiony, „wegeta­ tywny” mikronukleus do różnicowania się w zawiązek makronuklearny z „ominięciem” eta­ pu mejozy i fuzji przedjądrzy (M ik a m i i N g 1983).

Zatem w przypadku Paramecium, ani fuzja przedjądrzy, ani nawet podziały mejotyczne nie są warunkami niezbędnymi dla procesu różni­ cowania zawiązków makronuklearnych, konie­ czny jest natomiast odpowiedni „stan” cytopla­ zmy i cytoszkieletu.

ZMIANY POWIERZCHNIOWE I CYTOSZKIELETALNE W REGIONIE POŁĄCZENIA KONIUGACYJNEGO

W okresie kostymulacji dochodzi do zmiany

morfologii przedniego (powyżej gęby) bieguna komórki (ang. tip transformation) ( W o l f e i G r i ­ m e s 1979). Staje się on gładki, pozbawiony rzęsek, ciałek podstawowych, mikrotubul kor­ ty kalnych i alweoli ( E l l i o t t i T r e m o r 1958, SUGANUMA i współaut. 1984, W O LF E 1982). Bło­

nę komórkową w tym rejonie podściela rozbu­ dowana warstwa gęsto upakowanego materiału fibrylarnego ( W o l f e 1985). W wierzchołkach

kostymulowanych komórek, pod tą elektrono­ wo gęstą warstwą, występują filamenty zbudo­ wane z białka o masie 64 kDa, tak zwane fila­ menty fenestrynowe ( N e l s e n i współaut. 1994).

Opisanym wyżej lokalnym zmianom korty- kalnym towarzyszy gromadzenie się w

szczyto-wej części komórki transbłonowego białka (ang. transmembrane protein) — glikoproteiny wią­

żącej się z konkanawaliną A (Wolfei współaut. 1986). Konkanawalina A sprzężoną z FITC,

zna-Ryc. 5. Przemiany jądrowe i cytoszkieletalne w trakcie koniugacji T. thermophila.

A. Podczas pierwszego podziału mejotycznego mikrotubule cytoplazmatyczne tworzące gęstą siatkę częściowo zanikają (5A,

a, b). Pod koniec mejozy nowe mikrotubule polimeryzują w regionie połączenia koniugacyjnego i wokół dwóch (5A, c) spośród czterech jąder postmejotycznych (tzw. mikrotubule perinuklearne). Mikrotubule perinuklearne utrzymują się wokół jądra, które „podczepia” się do połączenia koniugacyjnego i w ten sposób jest rekrutowane do trzeciego podziału prezygotycznego (5A, d). W podczepieniu tym biorą udział mikrotubule polimeryzujące z regionu połączenia koniugacyjnego i mikrotubule perinuklearne. Nieliczne mikrotubule powstałe wokół otoczki drugiego jądra, szybko zanikają. Wokół pozostałych dwóch jąder postmejotycznych nie obserwuje się mikrotubul perinuklearnych (Ga e r t igi Fle u r y 1992, Ta k a g ii współpaut. 1991, Kie r s n o w sk adane niepublikowane). W wyniku mitozy pregamicznej powstają dwa przedjądrza (stacjonarne i migracyjne).

Oba przedjądrza połączone są z sobą i z regionem połączenia koniugacyjnego pasmami mikrotubul (5A, e, f). Podczas wymiany przedjądrzy, mikrotubule otaczające przedjądrza migracyjne oraz mikrotubule odchodzące od połączenia koniugacyjnego tworzą tzw. koszyczek mikrotubularny (5A, g, f). Łączące się przedjądrza otoczone są pasmami mikrotubul (5A, i; tzw. channel-like structure — wg Ga e r t ig ai Fl e u r y 1992) zanikającymi przed pierwszym podziałem postzygotycznym (5A, j). W stadiach postzygo tycznych jądra nie są otoczone mikrotubulami perinuklearnymi (5A, j-p). Mikrotubule cytoplazmatyczne (tworzące siatkę wewnętrzną) stopniowo odtwarzane są w okresie różnicowania zawiązków makronu- klearnych (5A , o, p). Oznaczenia: Mi — mikronukleus, Ma — makronukleus, r — resorbowane jądra postmejotyczne, zMa — zawiązki makronuklearne, sMa — skondensowany przedkoniugacyjny makronukleus: na schemacie w jednym koniugancie (z wyjątkiem 5 A, g, h) przedstawiono wcześniejsze i późniejsze stadium tego samego etapu przemian jądrowych, w rzeczywistości procesy jądrowe zachodzą synchronicznie. B. Rozmieszczenie fenestryny w koniugantach, objaśnienia w tekście.

kuje nie tylko przedni biegun kostymulowa- nych komórek, ale również, aż do końca paro­ wania, połączenie koniugacyjne.

Kostymulowane komórki łączą się zmienio­ nymi biegunami i dzięki częściowej fuzji błon tworzą pary. W strefie połączenia koniugacyj- nego powstają bardzo liczne pory o średnicy około 0,2 pm ( E l l i o t t i T r e m o r 1958, W o l f e

1982) łączące cytoplazmę obu koniugantów i

umożliwiające wymianę makromolekuł (Mc Do­

n a l d 1966). W okresie wymiany przedjądrzy organizacja i wielkość porów ulegają zmianie,

umożliwiając migrację przedjądrzy (O r ia s

1986).

Znakowanie przeciwciałem antyfenestryno- wym połączenia koniugacyjnego wykazuje, że filamenty fenestiynowe obrzeżają pory. To zna­ kowanie utrzymuje się przez cały okres parowa­ nia komórek, przy czym wzmożona intensyw­ ność znakowania tego regionu jest obserwowa­ na po III podziale prezygotycznym i podczas

wymiany przedjądrzy ( N e l s e n i współaut.

1994).

CYTOSZKIELET MIKROTUBULARNY

Podczas koniugacji Tetrahymena organiza­ cja somatycznych struktur kortykalnych nie ulega zmianie, natomiast w aparacie gębowym dochodzi do zaniku wiązki mikrotubularnej włókien gębowych (ang. deep fibers, DF) oraz resorpcji kilkunastu ciałek podstawowych membranelli gębowych. Nieczynna, wypłycona, z niefunkcjonalnymi membranellami gęba nie ulega dalszym zmianom, aż do czasu ukończe­ nia przemian jądrowych. Dopiero w ekskoniu- gancie dochodzi do resorpcji „starych”, zamro­ żonych dotychczas struktur gębowych i utwo­ rzenia nowego aparatu gębowego na drodze tak zwanej wymiany gęby (ang. oral replacement), po czym komórki mogą podejmować fagocytozę

( K ie r s n o w s k a i współaut. 1993).

W wegetatywnych komórkach Tetrahyme­ na, oprócz mikrotubul kortykalnych uporząd­ kowanych w określone struktury, występują również mikrotubule tworzące gęstą sieć we- wnątrzcytoplazmatyczną oraz mikrotubule we- wnątrzjądrowe (w obu jądrach), uczestniczące w ich podziale (L a F o u n t a in i D a v id s o n 1980).

W koniugujących tetrahymenach obserwuje się zmiany w cytoszkielecie wewnątrzcytopla- zmatycznym. Dotychczasowa, rozbudowana sieć mikrotubul stopniowo zanika, tworzą się natomiast specyficzne, niezależne od wrzecion mitotycznych, przejściowe struktuiy związane tylko z niektórymi mikronukleusami w wieloją- drowym koniugancie. I tak, wokół jednego z czterech jąder postmejotycznych pojawiają się

mikrotubule perinuklearne, jednocześnie w re­ jonie połączenia koniugacyjnego polimeryzują

mikrotubule rozrastające się w głąb cytopla- zmy. Biorą one udział w podczepieniu do połą­ czenia koniugacyjnego jednego z jąder post­ mejotycznych, leżącego w pobliżu tego połącze­ nia i otoczonego mikrotubulami perinuklearny- mi. Tylko to jądro dzieli się mitotycznie (trzeci podział prezy go tyczny). Jedno z jąder poto­ mnych, przylegające ściśle do połączenia koniu­ gacyjnego, jest pronukleusem migracyjnym, drugie, położone poniżej, jest pronukleusem stacjonarnym. Oba pronukleusy są przez cały czas otoczone materiałem mikrotubularnym, który nie tylko podczepia oba jądra do połącze­ nia koniugacyjnego, ale również łączy je ze sobą (nie jest to pozostałość wrzeciona mitotyczne- go). Szczególnie silnie rozbudowana otoczka mi- krotubularna obejmuje pronukleusy migracyj­ ne tuż przed przejściem do komórki partnera i w samym momencie transferu tego jądra. Mi- krotubularna „tuba” otacza także łączące się pronukleusy i następnie jądro zygotyczne

( G a e r t i g i FLEURY 1992). Zanikanie wewnętrz­

nej sieci oraz pojawianie się nowych struktur mikrotubularnych jest przedstawione na Rye. 5A.

Podanie inhibitorów antytubulinowych (no- kodazol, winblastyna) w czasie koniugacji Te­ trahymena nie tylko wstrzymuje podziały jąder na skutek depolimeiyzacji wrzecion podziało­ wych, lecz również uniemożliwia fuzję przedją­ drzy (H a m ilt o n i współaut. 1988, K a c z a n o w s k i

i współaut. 1991). Dzięki doświadczeniom z nokodazolem udało się również wykazać, że już przedjądrza mogą różnicować się w zawiązki makronuklearne oraz wskazać na zależność między różnicowaniem zawiązków makronu- klearnych a położeniem jąder postzygo tycznych w cytoplazmie komórki ( K a c z a n o w s k i i współ­

aut. 1991).

FILAMENTOWE ELEMENTY CYTOSZKIELETU

W skład cytoszkieletu otaczającego przedją­ drza oprócz mikrotubul wchodzą również dwa typy filamentów zbudowane odpowiednio z biał­ ka 64 kDa, tworzącego filamenty fenestrynowe

( N e l s e n i współaut. 1994) oraz białka 49 kDa (T a k a g i i współaut. 1991). Po III podziale pre­

zygotycznym (powstanie przedjądrzy) obserwu­ je się wzmożoną polimeryzację filamentów fene-

strynowych w rejonie połączenia koniugacyj- nego oraz wokół przedjądrzy migracyjnych i stacjonarnych (Ryc. 5B, a, b). Powstałe filamen­ ty fenestrynowe delikatnymi wiązkami łączą ze sobą przedjądrza, a mocniejszymi podczepiają jądra migracyjne bezpośrednio do połączenia

koniugacyjnego. W trakcie wymiany przedją­ drzy pojawia się bardzo silne zagęszczenie fila- mentów fenestrynowych wokół jądra przecho­ dzącego przez połączenie koniugacyjne, tworzą­ cych tzw. koszyczek (Rye. 5B, c, d). Po wymianie przedjądrzy, związane z nimi struktury fene- strynowe utrzymują się tylko przez krótki czas. W dalszych przemianach jądrowych nie obser­ wowano udziału filamentów fenestrynowych

(Rye. 5B, e, f). A więc przeciwciało skierowane przeciwko fenestrynie rozpoznaje tylko jądra funkcjonujące jako przedjądrza ( C o l e i S o e l t e r

1997).

Białko o masie molekularnej około 49 kDa ma podwójną naturę - występuje w mitochon- driach w postaci monomeru — enzymatycznego białka o właściwościach syntazy cytrynianowej

(K o jim a i współaut. 1997) oraz w cytoplazmie —

w formie spolimeryzowanej, tworząc 14 nm fi- lamenty nie wykazujące aktywności syntazy cy­ trynianowej. Obie formy, to jest enzymatyczna i filamentowa, są kodowane przez ten sam gen

(N u m a ta i współaut. 1991, N u m a t a 1996), a róż­

nice we właściwościach obu form (nieznacznie wyższa masa molekularna i dodatkowy punkt izoelektryczny dla formy filamentowej) są pra­ wdopodobnie związane z modyfikacjami post- translacyjnymi. Warto jednocześnie zaznaczyć, że oczyszczone białko 49 kDa, w określonych warunkach in vitro, może przechodzić z formy spolimeryzowanej w formę monomeryczną (en­ zym) i odwrotnie.

Filamenty 14 nm biorą udział w morfogene- zie aparatu gębowego (N u m a t a i współaut. 1983)

oraz w koniugacji (N u m a ta i współaut. 1985). W

czasie procesu płciowego filamenty te pojawiają się pod koniec drugiego podziału mejotycznego w rejonie połączenia koniugacyjnego. Polimery­ zują one z tego regionu i sięgają do około 1/3 w głąb komórki (T a k a g i i współaut. 1991). W cza­ sie III podziału prezygotycznego 14 nm filamen­ ty kolokalizują się z mikrotubulami otaczający­ mi oba przedjądrza oraz pronukleusy migracyj­ ne przechodzące przez połączenie koniugacyj­ ne. Znakowanie przeciwciałem skierowanym przeciwko 14 nm filamentom zanika po fuzji przedjądrzy.

PRZERWANIE POŁĄCZENIA MIĘDZY KOMÓRKAMI PARY NIE WSTRZYMUJE PRZEMIAN W CYTOSZKIELECIE Wczesne koniuganty (tj. około 2,5 godz.) można rozdzielić mechanicznie bez uszkodze­ nia komórek ( K i e r s n o w s k a i współaut. 2000).

Okazuje się, że jeśli rozdzielano koniuganty, w których mikronukleus został już pobudzony do podziału mejotycznego (stadium I i II profazy mejotycznej I), to były one zdolne utworzyć pro­

nukleusy, które łączyły się ze sobą (cytogamia). Z jądra zygotycznego powstawały nowe makro- nukleusy i mikronukleusy. Mikrotubule i włók­ na fenestrynowe tworzyły struktury chara­ kterystyczne dla poszczególnych stadiów ko­ niugacji. A więc, kontakt z drugą komórką podczas procesu płciowego jest niezbędny do zainicjowania koniugacji, ale nie jest konieczny do jej kontynuowania. Świadczy to o tym, że raz pobudzone komórki (pobudzenie ścieżki/ście­ żek sygnalizacji wewnątrzkomórkowej) mogą realizować cały, złożony program koniugacji oraz, że pobudzone komórki mają potencjalną zdolność do przejścia pełnego programu koniu­ gacji, a obserwowane zmiany w tym programie wynikają z hamowania już pobudzonych szla­ ków rozwojowych.

WPŁYW INHIBITORA KINAZ BIAŁKOWYCH, 6-DMAP, NA PRZEBIEG KONIUGACJI

W obecności inhibitora pewnej klasy kinaz serynowo/treoninowych, 6-DMAP, mejoza i mi­ toza pregamiczna są opóźnione i często przebie­ gają asynchronicznie w obu komórkach pary. W niektórych koniugantach zachodzi nawet tyl­ ko jeden podział mejotyczny. Jednakże wokół żadnego z jąder (bez względu na ich liczbę) nie występują mikrotubule pericentriolarne. Nato­ miast polimeryzacja mikrotubul w regionie po­ łączenia koniugacyjnego przebiega tak jak w koniugantach kontrolnych. Mikrotubule te roz­ rastają się w głąb cytoplazmy i niektóre-wiązki mogą dochodzić (a nawet otaczać) do jednego lub dwóch jąder (mogą to być również produkty I-ego podziału mejotycznego) położonych w po­ bliżu połączenia koniugacyjnego (Kiersnowska i Włoga — obserwacje nie publikowane). Jądra te mogą znaleźć się w połączeniu koniugacyj- nym, ale nie dochodzi do przejścia ich do part­ nera, ani też do fuzji jąder i rozwoju postzygo- tycznego. Wyniki te świadczą o tym, że cytosz- kielet perinuklearnyjest niezbędny do utworze­ nia funkcjonalnych pronukleusów, przemiesz­ czenia się ich do komórki partnera, fuzji oraz do różnicowania się zawiązków makronuklear- nych.

Podobne skutki działania 6-DMAP na cyto- szkielet komórki obserwowano w oocytach je ­ żowców ( S t - P i e r r e i D u f r e s n e 1990, D u f r e s n e

i współaut. 1991, S t - P i e r r e i współaut. 1994).

Przeniesienie zapłodnionych oocytów do środo­ wiska z 6-DMAP powoduje zatrzymanie proce­ sów, w które zaangażowane są mikrotubule: migrację przedjądrzy, lokalizowanie przedją­ drza i wreszcie fuzję przedjądrzy. W zapłodnio­ nym jaju poddanym działaniu 6-DMAP, nie ob­ serwowano mikrotubul astralnych plemnika,