Marcin Matuszczak
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin – Państwowy Instytut Badawczy, Oddział w Poznaniu Autor korespondencyjny – M. Matuszczak, e-mail: marmat@nico.ihar.poznan.pl
DOI: 10.5604/12338273.1101230
Markery molekularne w badaniach rzepaku
(Brassica napus
L.)
I. Przegląd stosowanych technik
Molecular markers for study of oilseed rape (Brassica napus
L.)
I. The review of marker techniques
Słowa kluczowe: markery molekularne, metody, rzepak, Brassica napus, genotypowanie, MAS Streszczenie
Współczesna biologia molekularna dostarcza wciąż nowych metod pozwalających na opraco-wywanie markerów genetycznych, w tym przede wszystkim markerów molekularnych (markerów
DNA). Znajdują one zastosowanie w różnych badaniach dotyczących rzepaku. Ich wykorzystanie
w hodowli znacznie przyspiesza uzyskiwanie nowych odmian. Markery molekularne umożliwiają postęp w badaniach genomu. Istotne jest także znaczenie markerów molekularnych w badaniach pokrewieństwa oraz identyfikacji odmian. W pracy dokonano przeglądu technik poszukiwania markerów, które już znalazły lub mogą znaleźć zastosowanie w badaniach nad rzepakiem. Omówiono zarówno metody, które były stosowane na wczesnym etapie rozwoju tej dziedziny, jak i te, które stosowane są obecnie. Zasygnalizowano także prawdopodobne kierunki rozwoju nowych technologii dla pozyskiwania markerów w przyszłości.
Key words: molecular markers, methods, oilseed rape, Brassica napus, genotyping, MAS
Abstract
Modern molecular biology is the continuous source of new techniques that can be applied
to obtain genetic markers, including, first of all, molecular (DNA) markers. Such markers are widely
used for study of oilseed rape. Their application in breeding can speed up the formation of new varieties. Molecular markers can generate the progress in study of various genomes. There are many cases of their use for relationship analysis or variety identification. The review of marker techniques,
both those already applied and as yet not applied for study on oilseed rape, is presented here. In this
review past and present methods are described according to the sequence of their invention and use. The prospects of new technologies that may be used for marker development in the near future are also mentioned.
Wstęp
Markery molekularne stanowią obecnie istotne narzędzie badań dotyczących roślin uprawnych. Znalazły one także liczne zastosowania w badaniach rzepaku (Brassica napus L. ssp. oleifera Metzg.), który jest amfidiploidalną rośliną oleistą, należącą do rodziny Brassicaceae (kapustowate).
Aby możliwe było wykorzystanie markerów, stosowane są różne metody prowadzące do ich powiązania z badanymi cechami roślin. W przypadku cech jednogenowych lub dokładnie opisanych mutantów, w celu identyfikacji odpo-wiedniego markera można stosować metody analizy sprzężeń markerów z badaną cechą oraz analizę sekwencji określonych genów (Falentin i in. 2007a, 2007b, Rahman i in. 2008, Mikołajczyk i in. 2010a, 2012, Matuszczak i in. 2013). W przypadku cech wielogenowych duży postęp uzyskano poprzez molekularną analizę struktury genomów roślinnych. Konstruowanie map genetycznych o dużej gęstości w połączeniu z analizą QTL (Delourme i in. 2006, Basunanda i in. 2007, Kaur i in. 2009, Matuszczak 2010), a ostatnio stosowane na szerszą skalę ma-powanie asocjacyjne (Snowdon i Friedt 2004, Hasan i in. 2008) umożliwia zna-lezienie sprzężeń poszczególnych markerów z cechami użytkowymi. Stanowi to niezbędny wstęp do prowadzenia hodowli wspomaganej markerami molekular-nymi (ang. Marker Assisted Selection, MAS). Metoda ta umożliwia ocenę geno-typów już w stadium siewki, przez co skraca się czas niezbędny do wybrania materiałów o pozytywnych cechach, a tym samym możliwe jest szybsze uzyskanie pożądanych efektów hodowlanych (Tanksley i in. 1989, Krzymański 1997, Collard i Mackill 2008).
Kolejnym ważnym dla hodowli zastosowaniem markerów molekularnych jest ocena dystansu genetycznego między formami wyjściowymi dla mieszańców. Analizy takiej dokonuje się w celu uzyskania lepszego efektu heterozji u mie-szańców (Liersch i in. 2010). Ocena dystansu genetycznego ma także znaczenie dla określania pochodzenia odmian oraz badania filogenetycznego pokrewieństwa gatunków (Song i in. 1988, Lombard i in. 2000, Shiran i in. 2006, Allender i King 2010). Markery mogą być również przydatne do identyfikacji odmian i ochrony praw ich twórców (Jondle 1992, Matuszczak 2004).
W niniejszej pracy przedstawiono przegląd najczęściej stosowanych technik wykrywania markerów molekularnych zarówno w ujęciu historycznym, jak i pod względem ich obecnego wykorzystania w badaniach rzepaku.
Markery
genetyczne
–
od markerów morfologicznych do markerów molekularnych
Markery genetyczne stanowią łatwe do identyfikacji i dokładnie sprecyzo-wane cechy badanych organizmów, które wykazują zróżnicowanie w obrębie badanej populacji (polimorfizm). Markery takie można wykorzystać do opisu genotypu oraz śledzić dzięki nim sposób dziedziczenia rozmaitych cech.
Początkowo jako markery genetyczne wykorzystywano wyłącznie cechy mor-fologiczne, czyli możliwe do zaobserwowania różnice cech zewnętrznych, będące wynikiem ekspresji określonych genów. Markery tego typu nie mają jednak szerszego zastosowania ze względu na stosunkowo niewielką liczbę łatwych do obserwacji różnic morfologicznych w obrębie badanych populacji. Ich istotną wadę stanowi także silny modyfikujący wpływ środowiska (Collard i in. 2005). Przykładem takiego markera jest cecha karłowatości rzepaku, będąca wynikiem ekspresji genu Bzh (Foisset i in. 1995).
Rozwój współczesnej genetyki molekularnej dostarczył nowych praktycznych narzędzi dla pozyskiwania różnego rodzaju markerów genetycznych. Tego typu markery otrzymywane w wyniku analizy złożonych molekuł, takich jak izolowane z organizmów żywych białka lub kwasy nukleinowe, można – w szerokim zna-czeniu tego słowa – określić jako markery molekularne. Zalicza się tutaj markery izoenzymatyczne stanowiące rodzaj markerów biochemicznych oraz markery DNA będące markerami molekularnymi sensu stricto (Collard i in. 2005). Te ostatnie występują w dużej liczbie i są niezależne od wpływów środowiska. Markery takie informują o polimorfizmie na poziomie molekularnym, niedostępnym bezpośrednio dla ludzkich zmysłów, lecz mogą wykazywać sprzężenie z istotnymi, obserwowal-nymi cechami organizmów żywych.
Rodzaje markerów molekularnych
W ciągu ostatniego półwiecza notuje się stały postęp w dziedzinie poszu-kiwania różnego typu markerów molekularnych. Obecnie znanych jest bardzo wiele technik, które to umożliwiają (tab. 1). Zostaną one szczegółowo omówione w kolejnych rozdziałach. Tutaj przedstawiono natomiast przyjęty powszechnie podział markerów na określone typy.
Już od dawna stosuje się markery izoenzymatyczne. Są one otrzymywane w oparciu o analizę białek enzymatycznych przy użyciu elektroforezy w żelach skrobiowych oraz wykrywanie ich aktywności katalitycznej przy pomocy specy-ficznego barwienia. Z kolei nowsze metody określania markerów molekularnych, wykorzystujące analizę kwasów nukleinowych, korzystają w sposób bezpośredni z informacji zawartej w materiale genetycznym. Wśród markerów DNA wyróżnia
Tab Zes ta w ien ie po ds ta w ow yc h w ła ści w oś ci r óżn yc h m ar ker ów m ol ek ul ar ny ch — The s um m ar y of bas ic pr ope rti es of v m ol ecu la r m ar ker s M ar ker M ar ker Ilo ść / j ak oś ć D N A d o an al izy Q ua nt ity / q ua lity of DN A f or a na ly si s Poz iom pol im or fiz m u Level of p ol ymo rp hi sm Ty p d zi ed zi czen ia Typ e of inhe ri ta nc e Po w tar zal no ść Re pe ata bility Ko sz ty opr ac ow ani a D evel op m en t co st s K os zt y an Run ni ng c Izo en zy m y Is oen zym es – / – śr edni – m edi um kodom ina cj a codom ina nc e śr ed ni a – m edi um ni ski e – lo w ni sk ie – R FLP duż a / ba rdz o do br a la rg e / ver y g oo d śr edni – m edi um kodom ina cj a codom ina nc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh w ys oki e R AP D m ał a / ba rdz o do br a sm al l / ver y g oo d śr edni – m edi um dom ina cj a dom in anc e ni ska – lo w ni ski e – lo w ni ski e – AF LP śr edni a / b ar dzo do br a m ed iu m / ver y g oo d śr edni – m edi um dom ina cj a dom in anc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh w ys oki e D Ar T m ał a / b ar dzo do br a sm al l / ver y g oo d śr edni – m edi um dom ina cj a dom in anc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh śr edni e – M ik ro sa te lity M ic ro sa te llite s m ał a / b ar dzo do br a sm al l / ver y g oo d w ys oki – h igh kodom ina cj a codom ina nc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh śr edni e – ISSR m ał a / b ar dzo do br a sm al l / ver y g oo d śr edni – m edi um dom ina cj a dom in anc e śr ed ni a – m ed iu m śr edni e – m edi um śr edni e – AC GM śr edni a / b ar dzo do br a m ed iu m / ver y g oo d śr edni – m edi um kodom ina cj a codom ina nc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh śr edni e – SC AR m ał a / dobr a sm all / g oo d śr edni – m edi um dom ina cj a dom in anc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh ni ski e – C AP S m ał a / dobr a sm all / g oo d śr edni – m edi um kodom ina cj a codom ina nc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh śr edni e – SNP śr edni a / b ar dzo do br a m ed iu m / ver y g oo d ni ski – lo w kodom ina cj a codom ina nc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh śr edni e – Se kw enc jonow ani e Se que nc ing śr edni a / b ar dzo do br a m ed iu m / ver y g oo d zal eż ny od se kw enc ji seq uen ce d ep en den t kodom ina cj a codom ina nc e w ys oka – hi gh w ys oki e – hi gh w ys oki e
się dwie podstawowe grupy: markery oparte na metodzie hybrydyzacji specyficz-nych znakowaspecyficz-nych sond z całkowitym DNA badanego organizmu oraz markery otrzymywane poprzez amplifikację pewnych rejonów DNA z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) (Wolko i Bartkowiak-Broda 1997). Obecnie podział ten nie jest już wystarczający, po-nieważ często w celu wykrycia, a następnie praktycznego zastosowania określo-nych markerów molekularnych wykorzystuje się cały wachlarz różnych technik. W praktyce wiele metod wzajemnie się pokrywa i często różnią się one jedynie drobnymi detalami. Istnieją techniki określania markerów, które wykorzystują obie wymienione wcześniej strategie w połączeniu z cięciem cząsteczek DNA za po-mocą enzymów restrykcyjnych (Botstein i in. 1980, Konieczny i Ausubel 1993, Zabeau i Vos 1993, Vos i in. 1995). W celu wizualizacji polimorfizmu wykorzy-stywana jest analiza wielkości fragmentów przy pomocy elektroforezy w żelach lub elektroforezy kapilarnej. W nowszych metodach dla wykrywania polimorfizmu DNA stosowane są mikromacierze i bezpośrednia ocena stopnia hybrydyzacji znakowanych fragmentów DNA przy pomocy analizy spektrofotometrycznej (Jaccoud i in. 2001). Ostatnio coraz częściej wykorzystuje się także markery two-rzone na podstawie poznanej wcześniej specyficznej sekwencji lub bezpośrednio poprzez sekwencjonowanie DNA (Poland i Rife 2012).
Markery izoenzymatyczne
Podstawy dla wykorzystania markerów izoenzymatycznych opracowano już w latach 50. XX wieku (Hunter i Markert 1957). Izoenzymy to homologiczne enzymy w obrębie danego organizmu, katalizujące tę samą reakcję biochemiczną, lecz różniące się pod względem struktury, powinowactwa do substratu czy też szybkości katalizowanej reakcji. Geny kodujące izoenzymy zajmują różne loci oraz ulegają ekspresji w różnych tkankach i w różnych stadiach rozwojowych rośliny. Dzięki zastosowaniu elektroforezy w żelach skrobiowych w połączeniu z barwie-niem produktów reakcji enzymatycznych katalizowanych przez izoenzymy moż-liwa jest ich detekcja w badanych formach hodowlanych. Uzyskany w ten sposób wzór izoenzymów jest charakterystyczny dla danej rośliny i może wykazywać polimorfizm pomiędzy różnymi odmianami lub liniami hodowlanymi.
Markery izoenzymatyczne zastosowano do analizy genetycznej gatunków z rodzaju Brassica (Arús i Orton 1983, Delourme i Eber 1992, Chèvre i in. 1995) oraz dla identyfikacji odmian (Gupta i Röbbelen 1986, Mündges i in. 1990, Chèvre i in. 1991). Są to markery tanie i łatwe do uzyskania, stąd nadal bywają wy-korzystywane dla wspomagania prac hodowlanych (Wolko i Bartkowiak-Broda 1997) oraz do rozróżniania odmian (Popławska i in. 2007). Ich wadą jest jednak to, że możliwość ich detekcji zależy od warunków środowiska oraz od faz
rozwo-jowych rośliny. Istnieje jedynie ograniczona liczba dostępnych systemów izo-enzymatycznych. W związku z tym technika ta nie może stanowić podstawy dla mapowania genomu i markery izoenzymatyczne stanowią tylko uzupełnienie innych markerów molekularnych umieszczanych na mapach genetycznych (Foisset i in. 1996, Lombard i Delourme 2001).
Markery RFLP
Jeszcze nie tak dawno powszechnie stosowanymi markerami DNA wykorzy-stującymi technikę hybrydyzacji były markery RFLP (ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) (Botstein i in. 1980, Figdore i in. 1988, Song i in. 1988). W tej metodzie całkowity DNA rośliny poddawany jest najpierw trawieniu za pomocą enzymów restrykcyjnych. Uzyskane fragmenty restrykcyjne są rozdzielane za pomocą elektroforezy, poddawane denaturacji w środowisku alkalicznym, a na-stępnie przenoszone i unieruchomione na filtrze nylonowym lub nitrocelulozo-wym. Na tym etapie wykonuje się hybrydyzację ze specyficzną, znakowaną sondą, a następnie, po odpowiednim naświetleniu kliszy, uzyskuje się obraz, na którym można zidentyfikować fragmenty DNA badanej rośliny pasujące do zastosowanej sondy. Metoda ta pozwala wykrywać polimorfizm DNA w badanych roślinach. Wynika to z tego, że enzymy restrykcyjne tną DNA tylko w miejscach o określonej sekwencji. Różnice w sekwencji między badanymi roślinami mogą więc prowadzić do powstawania fragmentów restrykcyjnych o różnej długości. Dodatkowo sonda jest również specyficzna i rozpoznaje tylko określone sekwencje, co eliminuje nadmiar fragmentów podlegających wizualizacji i pozwala na uproszczenie uzys-kiwanego obrazu. Dlatego też po zakończeniu całej procedury można zaobser-wować wyraźne polimorficzne prążki, które odzwierciedlają różnice w badanych genomach.
Markery te są szczególnie przydatne do badania genomów roślinnych i anali-zy zmienności na poziomie DNA, ponieważ pozwalają na wykoranali-zystanie pranali-zy mapowaniu informacji pochodzących z organizmów pokrewnych. Dla rzepaku powstały liczne mapy genetyczne oparte na markerach RFLP (Landry i in. 1991, Chyi i in. 1994, Ferreira i in. 1994, Parkin i in. 1995, Sharpe i in. 1995, Uzunova i in. 1995, Howell i in. 1996, Foisset i in. 1996, Lombard i Delourme 2001, Lowe i in. 2004, Parkin i in. 2005). W pracach tych często wykorzystuje się znakowane sondy pochodzące z rośliny modelowej Arabidopsis thaliana oraz z różnych gatun-ków z rodzaju Brassica, przez co można dokonać analizy stopnia kolinearności w budowie chromosomów oraz określenia lokalizacji i liczby kopii genów o zna-nych funkcjach w genomie rzepaku. Metoda pozwala znaleźć dużą liczbę mar-kerów, które stanowią niezależnie segregujące loci równomiernie rozproszone po całym genomie. Dodatkowym atutem jest to, że markery RFLP mają charakter kodominujący, czyli można obserwować odmienne prążki dla różnych alleli w da-nym locus.
Metoda RFLP, pomimo wielu zalet, jest jednak stosunkowo kosztowna i pracochłonna. Obecnie coraz częściej zastępuje się ją bardziej wydajnymi i prostszymi technikami. Konieczność wyizolowania dużej ilości materiału DNA o bardzo dobrej jakości stanowi znaczne utrudnienie dla praktycznego zastoso-wania tych markerów w hodowli.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)
Przełomem w badaniach genomu oraz w pozyskiwaniu markerów moleku-larnych okazało się wynalezienie oraz upowszechnienie metod z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) (Mullis i Faloona 1987, Williams 1989). Technika ta umożliwia namnażanie (amplifi-kowanie) precyzyjnie określonych fragmentów genomowego DNA. W tym celu w omawianej reakcji wykorzystuje się termostabilną polimerazę DNA oraz dwa krótkie, łatwe do zsyntetyzowania starterowe odcinki DNA, o sekwencjach kom-plementarnych do obu końców namnażanego fragmentu. Uzyskiwanie markerów przy wykorzystaniu techniki PCR wymaga niewielkiej ilości wyjściowego mate-riału DNA oraz stosunkowo małych kosztów. Wykonanie analiz jest szybsze i mniej pracochłonne niż w przypadku RFLP. Łatwa jest także automatyzacja tego procesu (Williams 1989, Kesseli i in. 1992, Rafalski i Tingey 1993, Sztuba-Soliń-ska 2005). Pojawienie się PCR zaowocowało rozwojem wielu nowych metod poszukiwania markerów molekularnych. Stanowią one modyfikacje podstawowej techniki PCR lub też amplifikacja jest jednym z kilku etapów prowadzących do otrzymania markera. Wszystkie metody opisane w dalszych częściach pracy w różnym stopniu wykorzystują PCR.
Markery MAAP (RAPD, AP-PCR i DAF)
Przykładem zastosowania amplifikacji DNA do wykrywania markerów mole-kularnych są metody określane jako MAAP (ang. Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) (Caetano-Anollés 1994, Wolko i Bartkowiak-Broda 1997). Do tej grupy zalicza się takie techniki jak RAPD (ang. Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams i in. 1990, Uzunova i in. 1995, Foisset i in. 1996), AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) (Welsh i McClelland 1990) oraz DAF (DNA Amplification Finger-printing) (Caetano-Anollés i in. 1991). Najszersze zastosowanie uzyskała metoda RAPD. Dla otrzymywania markerów tego typu stosuje się amplifikację losowo wybranych fragmentów genomu poprzez zastosowanie w mieszaninie PCR dowol-nego 10-nukleotydowego startera o przypadkowo dobranej sekwencji. Dla dadowol-nego startera uzyskuje się unikatowe wzory prążków w żelu, charakterystyczne dla danego genotypu, przy pomocy których można stwierdzić istniejące różnice pomiędzy badanymi obiektami na poziomie DNA. W ten sposób można łatwo i stosunkowo tanim kosztem otrzymać dużą liczbę markerów molekularnych.
Wadą metody RAPD jest słaba powtarzalność, wynikająca z dużego wpływu warunków początkowych reakcji na ostateczny wynik amplifikacji. Niezbędne jest więc branie pod uwagę tylko najbardziej intensywnych i wyraźnych prążków (Penner i in. 1993, Ellsworth i in. 1993, Bielawski i in. 1995, Khandka i in. 1997, Perez i in. 1998). Pewnym ograniczeniem w stosowaniu tych markerów w mapo-waniu jest też ich dominujący charakter, co przejawia się tym, że zwykle dla da-nego locus obserwujemy tylko prążek związany z jednym allelem. Brak natomiast informacji o innych allelach z tego locus. Tylko wówczas, gdy polimorfizm wy-nika z różnicy w długości namnażanego fragmentu, a nie z jego obecności lub braku, markery RAPD przyjmują charakter kodominujący, lecz taka sytuacja zdarza się rzadko. Dlatego markery RAPD wykorzystuje się głównie na mapach opartych na populacjach linii podwojonych haploidów, dla których dominujący charakter markerów nie stanowi przeszkody w mapowaniu (Foisset i in. 1996, Lombard i Delourme 2001).
Markery AFLP
Założenia metody AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism lub Amplified Restriction Fragment Polymorphism) (Zabeau i Vos 1993, Vos i in. 1995, Lombard i in. 2000) łączą w sobie pewne zalety technik RFLP oraz PCR.
Całkowity DNA badanego organizmu jest trawiony za pomocą enzymów restrykcyjnych tak, aby powstały fragmenty o dwóch różnych końcach. Następnie dokonuje się przyłączenia (ligacji) odpowiednich adapterów do tych końców. Sekwencje adapterów oraz miejsc pozostałych po hydrolizie są rozpoznawane przez komplementarne do nich startery do PCR. W dalszych etapach następuje dwukrotna amplifikacja fragmentów. Dzięki temu, że startery posiadają na końcach 3’ dodatkowe nukleotydy, następuje selekcja namnażanych fragmentów, co sta-nowi w metodzie AFLP podstawowe założenie. Na etapie pre-amplifikacji startery posiadają po jednym dodatkowym nukleotydzie. Przy drugiej amplifikacji selekcja jest jeszcze bardziej wyraźna, ponieważ stosowane są startery posiadające na końcach 3’ trzy dodatkowe nukleotydy. W efekcie liczba amplifikowanych frag-mentów ulega wydatnemu zmniejszeniu, przez co po ich rozdzieleniu możliwe jest uzyskanie wyraźnego obrazu. Do rozdziału fragmentów można używać różnych metod, takich jak elektroforeza w żelu poliakrylamidowym czy też elektroforeza kapilarna. Różne mogą być także metody wizualizacji prążków. Stosuje się między innymi barwienie metodą srebrową lub znakowanie starterów wykorzystywanych na etapie amplifikacji selekcyjnej (Zabeau i Vos 1993, Vos i in. 1995).
Technika AFLP bywa często porównywana z analizą RFLP, ponieważ w obu metodach wykorzystuje się trawienie przy pomocy enzymów restrykcyjnych. W technice RFLP selekcja fragmentów restrykcyjnych oparta jest na homologii sekwencji tych fragmentów z sekwencją sondy, przez co obserwowane prążki są powiązane z określonymi miejscami w genomie. W przypadku AFLP selekcja
fragmentów restrykcyjnych dokonuje się poprzez amplifikację przy użyciu star-terów selekcyjnych, co całkowicie odróżnia tę technikę od RFLP. Taka selekcja poprzez amplifikację jest całkowicie losowa, a znalezione w ten sposób markery – podobnie jak markery RAPD – mają zwykle dominujący charakter.
Dzięki technice AFLP można w pojedynczej analizie uzyskać dużą liczbę bardzo stabilnych i powtarzalnych markerów, co decyduje o jej atrakcyjności dla mapowania genomu oraz dla wielu innych zastosowań wymagających dużej ilości danych. Ze względu na swój dominujący charakter markery te są zazwyczaj stoso-wane do tworzenia map genetycznych opartych na populacjach linii podwojonych haploidów. Zaobserwowano, że u gatunków z rodzaju Brassica są one nierówno-miernie rozłożone w genomie i mają tendencje do grupowania się w pewnych rejonach (Sebastian i in. 2000, Lombard i Delourme 2001).
Istotną wadą opisywanej metody jest to, że jest ona chroniona patentem, przez co nie jest dostępna dla zastosowań komercyjnych. Pewną niedogodność stanowią także różnice w sposobach analizy fragmentów DNA, co utrudnia porównanie wyników uzyskanych za pomocą tej techniki w różnych laboratoriach.
Markery DArT
W ostatnich latach można zaobserwować wzrost znaczenia technologii DArT (ang. Diversity Array Technology) (Jaccoud i in. 2001). Wynika to przede wszyst-kim z jej potencjału dla wykrywania ogromnej liczby markerów w bardzo krótwszyst-kim czasie. Jest to obecnie najbardziej wydajna metoda wzbogacania puli markerów molekularnych dla gatunków pozbawionych bogatej kolekcji danych na temat sekwencji genomowych. Markery typu DArT zostały po raz pierwszy zastosowane dla ryżu (Jaccoud i in. 2001) i jęczmienia (Wenzl i in. 2004), lecz obecnie są one dostępne także dla rzepaku (Raman i in. 2012).
Pierwszym etapem niezbędnym dla zastosowania technologii DArT do ana-lizy genomu danego gatunku jest przygotowanie reprezentacji genomowej z puli genotypów reprezentujących zróżnicowanie genetyczne dla tego gatunku. W tym celu po zmieszaniu DNA z różnych odmian i linii wsobnych wykonuje się tra-wienie enzymami restrykcyjnymi, ligację adapterów, a następnie dokonuje selekcji fragmentów restrykcyjnych poprzez amplifikację przy użyciu starterów selekcyj-nych. Następnie uzyskaną mieszaninę fragmentów klonuje się w celu wytworzenia biblioteki genomowej gatunku. W kolejnym etapie fragmenty z tej biblioteki są amplifikowane oraz immobilizowane (drukowane) na szklanej płytce (mikromacie-rzy), stanowiącej zbiór sond do hybrydyzacji. Proces drukowania mikromacierzy przebiega w sposób zautomatyzowany i jest sterowany komputerowo. W celu uzyskania markerów DArT należy przygotować także reprezentację genomową poszczególnych analizowanych osobników. Reprezentacje takie otrzymuje się taką samą metodą redukcji złożoności genomu jak reprezentacje użyte do utworzenia biblioteki genomowej gatunku. Fragmenty każdej indywidualnej reprezentacji
genomowej są wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym, a dodatkowo są wy-mieszane z fragmentem wektora użytego do klonowania (sekwencja referencyjna), który jest wyznakowany innym barwnikiem fluorescencyjnym. Uzyskana wcześ-niej mikromacierz z reprezentacją genomową gatunku jest następnie poddawana hybrydyzacji z przygotowaną mieszaniną reprezentacji genomowej osobnika i fragmentu pochodzącego z wektora. Po zakończeniu hybrydyzacji i odpłukaniu niespecyficznie związanych fragmentów następuje laserowy odczyt sygnałów emitowanych przez barwniki fluorescencyjne, a następnie komputerowa analiza uzyskanych obrazów w celu identyfikacji polimorficznych markerów DArT (Jaccoud i in. 2001, Seroczyńska i Kilian 2010).
Opisywane markery w pewnym stopniu przypominają markery AFLP, po-nieważ obie techniki wykorzystują taką samą metodę redukcji złożoności genomu, która opiera się na następujących po sobie reakcjach trawienia, ligacji i amplifi-kacji. Tu jednak kończą się podobieństwa obu metod. W technologii DArT polimorfizmy są ujawniane za pomocą zróżnicowania poziomu hybrydyzacji, a nie poprzez wizualizację obecności lub braku amplifikowanego fragmentu o określonej wielkości (Seroczyńska i Kilian 2010).
Utrudnieniem w stosowaniu markerów typu DArT jest konieczność wstęp-nego przygotowania mikromacierzy z biblioteką klonowanych fragmentów charak-terystycznych dla danego gatunku. Obecnie dla rzepaku są już gotowe takie mikro-macierze (Raman i in. 2012). Metoda ta ma też wiele atutów. Przede wszystkim stosowana technologia pozwala na łatwą automatyzację poszczególnych etapów analizy. Ze względu na stosowanie techniki hybrydyzacji dla rozpoznania poli-morfizmu dużo łatwiej jest także uzyskać informację na temat lokalizacji polimor-ficznego rejonu na mapie fizycznej. Oprócz tego możliwe jest poznanie sekwencji polimorficznego odcinka DNA (Seroczyńska i Kilian 2010).
Mikrosatelity (markery SSR, STR, STMS)
Mikrosatelity (Litt i Luty 1989), określane też jako SSR (ang. Simple Sequence Repeats) (Jacob i in. 1991, Akkaya i in. 1992), STR (ang. Short Tandem Repeats) (Edwards i in. 1991) lub STMS (ang. Sequence-Tagged Microsatellite Site) (Barret i in. 1995), wykrywano najpierw u człowieka (Hamada i in. 1984, Weber i May 1989, Litt i Luty 1989, Edwards i in. 1991, Butler 2007) oraz u wielu zwierząt (Tautz i Renz 1984, Tautz 1989, Jacob i in. 1991), a następnie także u roślin (Akkaya i in. 1992, Lagercrantz i in. 1993, Wang i in. 1994, Barret i in. 1995). Loci te charakteryzują się występowaniem kolejno (tandemowo) powtórzo-nych krótkich sekwencji DNA (zwykle od 2 do 6 par zasad) określapowtórzo-nych jako DNA mikrosatelitarny (Litt i Luty 1989). Ponieważ liczba tych powtórzeń wykazuje duże różnice między poszczególnymi odmianami a nawet osobnikami, takie
miej-sca w genomie mogą stanowić podstawę dla generowania doskonałych markerów o kodominującym charakterze. Trudność stanowi odkrycie tych miejsc w genomie badanego organizmu oraz zaprojektowanie dla nich specyficznych starterów po obu stronach sekwencji powtórzonych. Aby tego dokonać potrzebne jest zasto-sowanie technik klonowania i sekwencjonowania genomu. Gdy znane są już odpowiednie startery, metoda ta jest stosunkowo prosta do zastosowania, ponieważ z technicznego punktu widzenia jest to standardowa reakcja PCR. Analiza markerów SSR wymaga jednak dobrego sposobu rozdziału fragmentów DNA, gdyż zwykle bazuje na wykrywaniu bardzo niewielkich różnic w wielkości tych fragmentów.
Markery SSR są na ogół specyficzne dla danego gatunku, ale stwierdzono, że niektóre z nich można także odnaleźć u gatunków blisko spokrewnionych. Pozwoliło to na wykorzystanie informacji o sekwencjach z A. thaliana do analiz gatunków z rodzaju Brassica, chociaż nie zawsze z pozytywnym skutkiem (Bell i Ecker 1994, Barret i in. 1995, Westman i Kresovich 1998). Do niedawna było niewiele markerów tego typu dostępnych dla rzepaku. Obecnie jednak w różnych bazach danych na świecie pojawia się coraz więcej informacji pozwalających na detekcję różnych markerów SSR w rzepaku i innych Brassica (Lagercrantz i in. 1993, Kresovich i in. 1995, Szewc-McFadden i in. 1996, Uzunova i Ecke 1999, Suwabe i in. 2002, Lowe i in. 2004 – BBSRC Microsatellite Programme, Piquemal i in. 2005 – Celera AgGen Brassica Consortium, AAFC Consortium, BrassicaDB). Nie wszystkie znane loci SSR są powszechnie dostępne, ponieważ dla niektórych nie udostępniono sekwencji starterów (Plieske i Struss 2001) lub też ich użycie wymaga zgody instytucji finansujących ich odkrycie.
Markery SSR są wykorzystywane zarówno do mapowania, jak i badania dystansu genetycznego. Gdy dostępne są precyzyjne informacje o ich lokalizacji chromosomowej to stanowią one stałe i dobrze scharakteryzowane elementy genomu – podobnie jak markery specyficzne dla wybranych genów. Dodatkową zaletą markerów SSR jest wysoki poziom polimorfizmu, który sprawia, że można wykryć zróżnicowanie w tych loci dla większości badanych populacji segre-gujących. Pozwala to na łatwą wymianę informacji między różnymi laboratoriami oraz integrację map genetycznych tworzonych przy użyciu takich markerów.
Markery ISSR
Innym rodzajem markerów używanych do analizy genomu są markery ISSR (ang. Inter-SSR Amplification) (Ziętkiewicz i in. 1994). Podstawą dla tej techniki są istniejące w genomie sekwencje mikrosatelitarne. Markery te pod wieloma względami przypominają jednak bardziej markery typu RAPD i inne metody, które nie wymagają znajomości sekwencji DNA badanego organizmu. Jest to bardzo prosta metoda otrzymywania złożonych obrazów prążkowych, wykorzystująca polimorfizm odcinków DNA znajdujących się pomiędzy loci mikrosatelitarnymi. Polimorfizm markerów ISSR wynika z mutacji, insercji lub delecji w obrębie
regionu SSR, czego efektem są zmiany profilu fragmentów DNA amplifikowanych przy użyciu techniki PCR. W oryginalnej metodzie do amplifikacji stosuje się pojedynczy starter o długości 17–18 pz, na który składa się sekwencja powtórzona oraz kilka zdegenerowanych nukleotydów selekcyjnych na końcu 3’ lub 5’, warun-kujących przyłączenie startera do miejsc na styku mikrosatelity i unikatowego DNA. Istnieją także odmiany tej techniki wykorzystujące startery komplementarne wyłącznie do sekwencji powtórzonych. Po wykonaniu reakcji amplifikacji otrzy-mane liczne produkty rozdzielane są za pomocą elektroforezy w poliakrylamido-wym żelu sekwencyjnym. Markery ISSR zostały wykorzystane m.in. do analiz pokrewieństwa pomiędzy odmianami dla różnych gatunków z rodzaju Brassica (Charters i in. 1996, Leroy i in. 2000).
Markery ACGM
W przypadku badań dotyczących rzepaku warto odnotować także markery ACGM (ang. Amplified Consensus Genetic Markers) (Brunel i in. 1999, Masojć 2001, Fourmann i in. 2002), ponieważ jest to jeden z przykładów wykorzystania poznanych sekwencji z genomu A. thaliana do badania DNA gatunków pokrew-nych z rodzaju Brassica. Dla wybrapokrew-nych sekwencji kodujących o znanej funkcji, pochodzących z A. thaliana, zaprojektowano zdegenerowane startery komplemen-tarne do sekwencji pochodzących z egzonów. Po wykonaniu PCR z tymi starterami otrzymano specyficzne amplifikacje genów homologicznych pomiędzy A. thaliana a gatunkami z rodzaju Brassica. Uzyskane fragmenty, pochodzące z kilku homolo-gicznych loci w złożonych genomach Brassica, można było następnie rozdzielić w żelu poliakrylamidowym. Po odzyskaniu DNA z żelu poliakrylamidowego poszczególne fragmenty ponownie amplifikowano i wykonywano bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR. Tak opracowane sekwencje mogą posłużyć do identyfikacji polimorficznych rejonów w obrębie badanych genów, a następnie do projektowania markerów allelo-specyficznych powiązanych z konkretnymi loci (Brunel i in. 1999). Polimorfizm markerów ACGM może być także analizowany na podstawie różnic zaobserwowanych podczas rozdziału elektroforetycznego. Takie podejście jest preferowane, gdy markery są wykorzystywane do mapowania genetycznego. Omawiane tu markery ACGM opracowano na podstawie 32 genów z A. thaliana, wśród których znajdują się różne geny związane z syntezą kwasów tłuszczowych, mechanizmami obronnymi rośliny, odpornością na choroby, czasem kwitnienia czy też morfologią kwiatów. W rzepaku znaleziono i opisano 102 sek-wencje DNA homologiczne do tych genów. Dla części markerów sekwencjo-nowano większą liczbę genotypów w celu poszukiwania polimorfizmów w obrębie badanych loci (Fourmann i in. 2002).
Markery SCAR
Markery typu SCAR (ang. Sequence Characterized Amplified Regions) (Kesseli i in. 1992) stanowią krok w kierunku praktycznego zastosowania marke-rów w hodowli (Barret i in. 1998, Mikołajczyk i in. 1998, Mikołajczyk i in. 2008). Można je opracować na podstawie markerów otrzymanych metodą RAPD lub AFLP, poprzez klonowanie i sekwencjonowanie polimorficznych fragmentów DNA, a następnie projektowanie specyficznych starterów. Dzięki temu możliwa jest amplifikacja specyficznej sekwencji DNA, a jednocześnie wykrywany jest znaleziony wcześniej polimorfizm. Jeśli wykrywana różnica sekwencji znajduje się blisko lub w obrębie ważnego genu, takie markery SCAR mogą służyć do łatwej identyfikacji form różniących się jakąś istotną cechą. Dlatego też stanowią one dobre rozwiązanie w przypadku opracowywania markerów cech użytkowych. Zwykle markery takie mają charakter dominujący i są uniwersalne dla wielu populacji danego gatunku. Są one proste w użyciu i pozwalają na prowadzenie selekcji wspomaganej markerami (MAS).
Markery CAPS
Zastosowanie markerów typu CAPS (ang. Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) (Konieczny i Ausubel 1993, Jourdren i in. 1996, Drenkard i in. 1997) jest bardzo przydatne w sytuacji, gdy znane są sekwencje starterów specyficznych dla genu, lecz przy użyciu PCR nie udaje się wykazać żadnego polimorfizmu pomiędzy liniami posiadającymi różne allele tego genu. W celu otrzymania mar-kerów CAPS najpierw przeprowadza się specyficzną amplifikację określonego fragmentu DNA, a następnie pojedynczy produkt reakcji jest trawiony enzymami restrykcyjnymi. W zależności od potrzeb można przetestować jeden lub więcej takich enzymów. Dla uzyskania markera CAPS wybierane są te, które rozpoznają w badanym amplikonie miejsca o sekwencji polimorficznej pomiędzy badanymi liniami. Produkty reakcji hydrolizy są następnie rozdzielane w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, przez co można zaobserwować polimorfizm (Jourdren i in. 1996). Markery CAPS są specyficzne dla określonej sekwencji w genomie, a dodatkowym atutem jest ich kodominujący charakter. Do poszukiwania tych markerów wystarczą dosyć proste i niedrogie techniki. Podobnie jak markery SCAR, nadają się one świetnie do genotypowania w celu prowadzenia selekcji wspomaganej markerami (MAS). Dużą liczbę markerów typu CAPS opracowano dla gatunku modelowego A. thaliana (Konieczny i Ausubel 1993). Markery takie opracowano także dla rzepaku, przy czym nierzadko dostępna jest sekwencja całego badanego fragmentu DNA, co ułatwia znalezienie enzymu restrykcyjnego, który umożliwia detekcję polimorfizmu (Falentin i in. 2007b, Matuszczak i in. 2013).
Markery SNP
Ostatnio coraz większego znaczenia nabierają markery SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphisms) (Rahman i in. 2008, Hayward i in. 2012), będące efektem polimorfizmu pomiędzy pojedynczymi miejscami nukleotydowymi. Opi-sując te markery trudno jest wskazać jakąś konkretną metodę czy procedurę ich określania. Podstawowym wyzwaniem dla badaczy jest w tym przypadku identy-fikacja punktowych mutacji (loci SNP) występujących w genomie (Brookes 1999). Stosowane w tym celu metody zmieniały się w miarę rozwoju technologii zwią-zanych z analizą genomu. W początkowej fazie – zanim dostępne stały się duże bazy danych z sekwencjami genowymi – dominowały metody, które nie wymagały poznania pełnej sekwencji (Hayward i in. 2012). Do takich metod należy roz-poznawanie różnic w miejscach cięcia enzymami restrykcyjnymi, a także różne metody wykrywania zmian konformacji DNA. Wśród tych ostatnich warto wy-mienić metody SSCP (ang. Single-Strand Conformational Polymorphism) (Orita i in. 1989), HET (ang. Heteroduplex Analysis) (Ruano i Kidd 1992, Jensen i Straus 1993), DGGE (ang. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Fodde i Losekoot 1994) oraz DHPLC (ang. Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) (Underhill i in. 1997). Metodą pozwalającą na wydajne indukowanie i wykrywanie mutacji punktowych jest TILLING (ang. Targeting Induced Local Lesions IN Genomes). Technika ta łączy chemiczną mutagenezę oraz metodę DHPLC (McCallum i in. 2000a, 2000b). W miarę przybywania coraz większej liczby danych sekwencyjnych możliwe stało się wykorzystanie istniejących baz danych do poszukiwania loci SNP (Hayward i in. 2012). Ostatnio coraz większe znaczenie dla wykrywania tego rodzaju polimorfizmów zyskują nowe metody masowego sekwencjonowania genomu (Deschamps i Campbell 2010). Dzięki temu, że wy-krycie locus SNP idzie w parze z poznaniem sekwencji leżących w bezpośrednim otoczeniu danej mutacji punktowej, można łatwo opracować odpowiedni marker SNP. Na podstawie danych uzyskanych z sekwencjonowania genomu możliwe jest opracowanie ogromnej liczby takich markerów. Znajomość sekwencji otaczających locus SNP znacząco ułatwia genotypowanie oraz umożliwia powiązanie danego markera z konkretnym genem.
Podsumowanie –
przyszłość markerów molekularnych
Jaka jest przyszłość wykorzystywania markerów molekularnych w hodowli rzepaku oraz innych roślin uprawnych? Wydaje się, że można obecnie wskazać dwa rozwijające się równolegle kierunki. Z jednej strony markery, które zostały już zidentyfikowane i powiązane z określonymi użytecznymi cechami czy konkret-nymi mutacjami są ulepszane w celu maksymalnego skrócenia czasu wykonania analizy. Stosuje się coraz bardziej uproszczone i zautomatyzowane metody,
po-zwalające na jednoczesną analizę dużej liczby roślin. Wprowadza się także różne sposoby redukcji odrębnych analiz wielu cech do wspólnej, pojedynczej analizy (ang. multiplexing), aby zminimalizować nakład pracy i koszty (Mikołajczyk i in. 2010b, 2012). Z drugiej strony rozwijane są nowe metody analiz genotypu oparte na masowym równoległym sekwencjonowaniu. Jest to możliwe w związku z no-wymi technologiami umożliwiającymi szybkie sekwencjonowanie (ang. Next Generation Sequencing, NGS) (Kircher i Kelso 2010, Glenn 2011, Liu i in. 2012, Quail i in. 2012). Pozwalają one na szersze zastosowanie sekwencjonowania zarówno do genotypowania (ang. Genotyping-by-sequencing, GBS) (Poland i Rife 2012), jak również do fizycznego mapowania genomu (Wang i in. 2011) oraz do wyszukiwania użytecznych markerów molekularnych (zwykle markerów typu SNP) (Deschamps i Campbell 2010). Obecnie istnieje kilka tego rodzaju tech-nologii. Chociaż nie wszystkie były już wykorzystywane do analiz DNA rzepaku, to jednak stanowią one poważny krok naprzód, jeśli chodzi o szybkie opracowanie sekwencji. Można tu wymienić technologie drugiej generacji opracowane w fir-mach Roche (Margulies i in. 2005), Illumina (Bentley i in. 2008), Life Techno-logies (Shendure i in. 2005) czy Ion Torrent (Rothberg i in. 2011). Różnią się one pod względem stosowanych metod sekwencjonowania (poprzez syntezę lub ligację) oraz metod detekcji sygnału (detekcja świetlna, fluorescencja, detekcja zmian pH) (Kircher i Kelso 2010). Z kolei technologie trzeciej generacji opra-cowywane przez firmy Pacific Bioscience (Eid i in. 2009) i Oxford Nanopore Technologies (Clarke i in. 2009) dotyczą metod sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek DNA, co w przyszłości może całkowicie zrewolucjonizować podejście do odczytu informacji genetycznej oraz obniżyć koszty tego typu analiz.
Literatura
Akkaya M.S., Bhagwat A.A., Cregan P.B. 1992. Length polymorphisms of simple sequence repeat
DNA in soybean. Genetics, 132: 1131-1139.
Allender C.J., King G.J. 2010. Origins of the amphiploid species Brassica napus L. investigated by chloroplast and nuclear molecular markers. BMC Plant Biology, 10: 54.
Arús P., Orton T.J. 1983. Inheritance and linkage relationships of isozyme loci in Brassica oleracea. Journal of Heredity, 74: 405-412.
Barret P., Chèvre A.M., Delourme R. 1995. Interspecific amplification of STMS (sequence tagged microsatellite site) between Arabidopsis thaliana and Brassica napus. Proc. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, July 1995, Vol. 4, J 43: 1187-1189.
Barret P., Delourme R., Foisset N., Renard M. 1998. Development of a SCAR (sequence characterised amplified region) marker for molecular tagging of the dwarf BREIZH (Bzh) gene
in Brassica napus L. Theor. Appl. Genet., 97: 828-833.
Basunanda P., Spiller T.H., Hasan M., Gehringer A., Schondelmaier J., Lühs W., Friedt W., Snowdon R.J. 2007. Marker-assisted increase of genetic diversity in a double-low seed quality winter oilseed rape genetic background. Plant Breeding, 126: 581-587.
Bell C.J., Ecker J.R. 1994. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics, 19: 137-144.
Bentley D.R., Balasubramanian S., Swerdlow H.P., Smith G.P. i in. 2008. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature, 456: 53-59.
Bielawski J.P., Noack K., Pumo D.E. 1995. Reproducible amplification of RAPD markers from vertebrate DNA. Biotechniques, 18 (5): 856-860.
Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.V. 1980. Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32: 314-331.
Brookes A.J. 1999. The essence of SNPs. Gene, 234: 177-186.
Brunel D., Froger N., Pelletier G. 1999. Development of amplified consensus genetic markers (ACGM) in Brassica napus from Arabidopsis thaliana sequences of known biological function.
Genome, 42: 387-402.
Butler J.M. 2007. Short tandem repeat typing technologies used in human identity testing. BioTechniques, 43: Sii-Sv.
Caetano-Anollés G. 1994. MAAP: a versatile and universal tool for genome analysis. Plant Mol. Biol., 25: 1011-1026.
Caetano-Anollés G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. 1991. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology, 9: 553-557.
Charters Y.M., Robertson M.J., Wilkinson M.J., Ramsay G. 1996. PCR analysis of oilseed rape cultivars (Brassica napus L. ssp. oleifera) using 5'-anchored single sequence repeat (SSR)
primers. Theor. Appl. Genet., 92: 442-447.
Chèvre A.M., Delourme R., Eber F., Arús P. 1991. First results of rapeseed variety identifications by isozyme electrophoresis. Cruciferae Newsletter, 14/15: 70-71.
Chèvre A.M., Delourme R., Eber F., Margale E., Quiros C.F., Arús P. 1995. Genetic analysis and nomenclature for seven isozyme systems in Brassica nigra, B. oleracea and B. campestris. Plant Breeding, 114 (6): 473-480.
Chyi Y.-S., Hoenecke M.E., Sernyk J.L. 1994. Mycogen Plant Sciences Brassica RFLP linkage maps. Cruciferae Newsletter, 16: 38-40.
Clarke J., Wu H.C., Jayasinghe L., Patel A., Reid S., Bayley H. 2009. Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing. Nature Nanotechnol., 4: 265-270.
Collard B.C.Y., Jahufer M.Z.Z., Brouwer J.B., Pang E.C.K. 2005. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica, 142: 169-196.
Collard B.C.Y., Mackill D.J. 2008. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Phil. Trans. R. Soc. B, 363: 557-572.
Delourme R., Eber E. 1992. Linkage between an isozyme marker and a restorer gene in radish cytoplasmic male sterility of rapeseed (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet., 85: 222-228.
Delourme R., Falentin C., Huteau V., Clouet V., Horvais R., Gandon B., Specel S., Hanneton L.,
Dheu J.E., Deschamps M., Margale E., Vincourt P., Renard M. 2006. Genetic control of oil content in oilseed rape (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet., 113: 1331-1345.
Deschamps S., Campbell M.A. 2010. Utilization of next-generation sequencing platforms in plant genomics and genetic variant discovery. Mol. Breeding, 25: 553-570.
Drenkard E., Glazebrook J., Preuss D., Ausubel F.A. 1997. Use of cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) for genetic mapping and typing. [W:] Caetano-Anollés G., Gresshoff P.M. (eds). DNA Markers – Protocols, Applications and Overviews. Wiley-Liss, New York: 187-198.
Edwards A., Civitello A., Hammond H.A., Caskey C.T. 1991. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am. J. Hum. Genet., 49: 746-756.
Eid J., Fehr A., Gray J., Luong K., Lyle J., Otto G., Peluso P., Rank D. i in. 2009. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 323: 133-138.
Ellsworth D.L., Rittenhouse K.D., Honeycutt R.L. 1993. Artifactual variation in randomly amplified
polymorphic DNA banding patterns. Biotechniques, 14 (2): 214-217.
Falentin C., Brégeon M., Lucas M.O., Deschamps M., Leprince F., Fournier M.T., Delourme R.,
Renard M. 2007a. Identification of fad2 mutations and development of Allele-Specific Markers
for High Oleic acid content in rapeseed (Brassica napus L.). Proc. 12th International Rapeseed Congress, Wuhan, China, March 2007, 2: 117-119.
Falentin C., Brégeon M., Lucas M.O., Renard M. 2007b. Genetic markers for high oleic content in plants. International Patent Publication WO 2007/138444.
Ferreira M.E., Williams P.H., Osborn T.C. 1994. RFLP mapping of Brassica napus using doubled
haploid lines. Theor. Appl. Genet., 89 (5): 615-621.
Figdore S.S., Kennard W.C., Song K.M., Slocum M.K., Osborn T.C. 1988. Assessment of the degree of restriction fragment length polymorphism in Brassica. Theor. Appl. Genet., 75: 883-840. Fodde R., Losekoot M. 1994. Mutation detection by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).
Human Mutation, 3 (2): 83-94.
Foisset N., Delourme R., Barret P., Hubert N., Landry B.S., Renard M. 1996. Molecular-mapping
analysis in Brassica napus using isozyme, RAPD and RFLP markers on a doubled-haploid
progeny. Theor. Appl. Genet., 93: 1017-1025.
Foisset N., Delourme R., Barret P., Renard M. 1995. Molecular tagging of the dwarf BREIZH (Bzh) gene in Brassica napus. Theor. Appl. Genet., 91: 756-761.
Fourmann M., Barret P., Froger N., Baron C., Charlot F., Delourme R., Brunel D. 2002. From
Arabidopsis thaliana to Brassica napus: development of amplified consensus genetic markers
(ACGM) for construction of a gene map. Theor. Appl. Genet., 105: 1196-1206.
Glenn T.C. 2011. Field giude to next-generation DNA sequencers. Molecular Ecology Resources, 11: 759-769.
Gupta S.K., Röbbelen G. 1986. Identification of rapeseed (Brassica napus) cultivars by
electro-phoresis. Plant Breeding, 96: 363-370.
Hamada H., Petrino M.G., Kakunaga T., Seidman M., Stollar B.D. 1984. Characterization of genomic poly (dT-dG) poly (dC-dA) sequences: Structure, organization and conformation. Mol. Cell. Biol., 4: 2610-2621.
Hasan M., Friedt W., Pons-Kühnemann J., Freitag N.M., Link K., Snowdon R.J. 2008. Association of gene-linked SSR markers to seed glucosinolate content in oilseed rape (Brassica napus ssp.
napus). Theor. Appl. Genet., 116: 1035-1049.
Hayward A., Mason A., Dalton-Morgan J., Zander M., Edwards D., Batley J. 2012. SNP discovery and applications in Brassica napus. J. Plant Biotechnol., 39: 1-12.
Howell P.M., Lydiate D.J., Marshall D.F. 1996. Towards developing intervarietal substitution lines
in Brassica napus using marker-assisted selection. Genome, 39 (2): 348-358.
Hunter R.L., Markert C.L. 1957. Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels. Science, 125: 1294-1295.
Jaccoud D., Peng K., Feinstein D., Kilian A. 2001. Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Res., 29: e25.
Jacob H.J., Lindpaintner K., Lincoln S.E., Kusumi K., Bunker R.K., Mao Y.P., Ganten D., Dzau V.J., Lander E.S. 1991. Genetic mapping of a gene causing hypertension in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Cell, 67: 213-224.
Jensen M.A., Straus N. 1993. Effect of PCR conditions on the formation of heteroduplex and single-stranded DNA products in the amplification of bacterial ribosomal DNA spacer regions. PCR Methods Appl., 3: 186-194.
Jondle R.J. 1992. Legal aspects of varietal protection using molecular markers. [W:] Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. Proceedings of the Joint Plant Breeding Symposia Series, 1 November 1992, Minneapolis, USA: 50-52.
Jourdren C., Barret P., Brunel D., Delourme R., Renard M. 1996. Specific molecular marker of the genes controlling linolenic acid content in rapeseed. Theor. Appl. Genet., 93: 512-518.
Kaur S., Cogan N.O.I., Ye G., Baillie R.C., Hand M.L., Ling A.E., Mcgearey A.K., Kaur J., Hopkins C.J., Todorovic M., Mountford H., Edwards D., Batley J., Burton W., Salisbury P., Gororo N., Marcroft S., Kearney G., Smith K.F., Forster J.W., Spangenberg G.C. 2009. Genetic map construction and QTL mapping of resistance to blackleg (Leptosphaeria maculans) disease in Australian canola (Brassica napus L.) cultivars. Theor. Appl. Genet., 120: 71-83.
Kesseli R.V., Paran I., Michelmore R.W. 1992. Efficient mapping of specifically targeted genomic regions and the tagging of these regions with reliable PCR-based genetic markers. [W:] Applications of RAPD Technology to Plant Breeding, Proceedings of the Joint Plant Breeding Symposia Series, 1 November 1992, Minneapolis, USA: 31-37.
Khandka D.K., Tuna M., Tal M., Nejidat A., Golan-Goldhirsh A. 1997. Variability in the pattern
of random amplified polymorphic DNA. Electrophoresis, 18 (15): 2852-2856.
Kircher M., Kelso J. 2010. High-throughput DNA sequencing – concepts and limitations. Bioessays, 32: 524-536.
Konieczny A., Ausubel F.A. 1993. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using
co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant Journal, 4: 403-410.
Kresovich S., Szewc-McFadden A.K., Bliek S.M., McFerson J.R. 1995. Abundance and characterization of simple-sequnece repeats (SSRs) isolated from a size-fractionated library of Brassica napus L. (rapeseed). Theor. Appl. Genet., 91: 206-211.
Krzymański J. 1997. Hodowla jakościowa roślin. Hodowla roślin – materiały z I Krajowej Konferencji, 19-20 listopada 1997, Poznań: 333-337.
Lagercrantz U., Ellegren H., Andersson L. 1993. The abundance of various polymorphic
microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Res., 21: 1111-1115.
Landry B.S., Hubert N., Etoh T., Harada J.J., Lincoln S.E. 1991. A genetic map for Brassica napus
based on restriction fragment length polymorphism detected with expressed DNA sequences.
Genome, 34: 543-552.
Leroy X.J., Leon K., Branchard M. 2000. Characterisation of Brassica oleracea L. by microsatellite primers. Plant Syst. Evol., 225: 235-240.
Liersch A., Krótka K., Bartkowiak-Broda I. 2010. Możliwości zastosowania markerów molekular-nych w badaniu dystansu genetycznego linii hodowlamolekular-nych rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXXI (2): 221-228.
Litt M., Luty J.A. 1989. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of
a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet., 44: 397-401. Liu L., Li Y., Li S., Hu N., He Y., Pong R., Lin D., Lu L., Law M. 2012. Comparison of
next-generation sequencing systems. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012: Article ID 251364.
Lombard V., Baril C.P., Dubreuil P., Blouet F., Zhang D. 2000. Genetic relationships and fingerprinting of rapeseed cultivars using AFLP: consequences for varietal registration. Crop
Sci., 40: 1417-1425.
Lombard V., Delourme R. 2001. A consensus linkage map for rapeseed (Brassica napus L.): construction and integration of three individual maps from DH populations. Theor. Appl. Genet., 103: 491-507.
Lowe A.J., Moule C., Trick M., Edwards K.J. 2004. Efficient large-scale development of
micro-satellites for marker and mapping applications in Brassica crop species. Theor. Appl. Genet., 108: 1103-1112.
Margulies M., Egholm M., Altman W.E., Attiya S., Bader J.S. i in. 2005. Genome sequencing in open microfabricated high density picoliter reactors. Nature, 437: 376-380.
Masojć P. 2001. Ustalanie tożsamości genetycznej. [W:] Malepszy S. (red.). Biotechnologia roślin. PWN, Warszawa: 485-519.
Matuszczak M. 2004. Ochrona praw hodowców odmian rzepaku – koncepcja odmiany w istocie
pochodnej (EDV). Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXV (2): 655-669.
Matuszczak M. 2010. Identyfikacja loci cech jakościowych rzepaku ozimego (Brassica napus L. var.
oleifera). Praca doktorska, ZGiHRO IHAR-PIB, Poznań.
Matuszczak M., Tokarczuk I., Spasibionek S., Bartkowiak-Broda I. 2013. Analiza DNA rzepaku za pomocą markera specyficznego dla mutacji w genie fad2. Konferencja Naukowa „Nauka dla hodowli i nasiennictwa roślin uprawnych”, Zakopane, 4-8.02.2013, Streszczenia: 147-148. McCallum C.M., Comai L., Greene E.A., Henikoff S. 2000a. Targeted screening for induced
mutations. Nature Biotechnology, 18: 455-457.
McCallum C.M., Comai L., Greene E.A., Henikoff S. 2000b. Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol., 123: 439-442.
Mikołajczyk K., Bartkowiak-Broda I., Popławska W., Spasibionek S., Dobrzycka A., Dabert M.
2012. A multiplex fluorescent PCR assay in molecular breeding of oilseed rape. [W:]
Abdu-rakhmonov I. (ed.). Plant Breeding. InTech, http://www.intechopen.
com/books/plant-breeding/a-multiplex-fluorescent-pcr-assay-in-molecular-breeding-of-oilseed-rape.
Mikołajczyk K., Dabert M., Karłowski W.M., Spasibionek S., Nowakowska J., Cegielska-Taras T.,
Bartkowiak-Broda I. 2010a. Allele-specific SNP markers for the new low linolenic mutant genotype of winter oilseed rape. Plant Breeding, 129: 502-507.
Mikołajczyk K., Dabert M., Nowakowska J., Podkowiński J., Popławska W., Bartkowiak-Broda I.
2008. Conversion of the RAPD OPC021150marker of the Rfo restorer gene into a SCAR marker
for rapid selection of oilseed rape. Plant Breeding, 127: 647-649.
Mikołajczyk K., Dobrzycka A., Podkowiński J., Popławska W., Spasibionek S., Bartkowiak-Broda I. 2010b. A multiplex PCR assay for identification of the ogura male sterile cytoplasm and the Rfo
restorer gene among oilseed rape breeding forms. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXXI (2):
201-210.
Mikołajczyk K., Matuszczak M., Piętka T., Bartkowiak-Broda I., Krzymański J. 1998. Zastosowanie markerów DNA do badań odmian składników mieszańcowych rzepaku. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XIX (2): 463-471.
Mullis K.B., Faloona F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Meth. In Enzymol., 255: 335-350.
Mündges H., Köhler W., Friedt W. 1990. Identification of rapeseed cultivars (Brassica napus) by starch gel electrophoresis of enzymes. Euphytica, 45: 179-187.
Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T. 1989. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 86: 2766-2770.
Parkin I.A.P., Gulden S.M., Sharpe A.G., Lukens L., Trick M., Osborn T.C., Lydiate D.J. 2005. Segmental structure of the Brassica napus genome based on comparative analysis with
Arabidopsis thaliana. Genetics, 171: 765-781.
Parkin I.A.P., Sharpe A.G., Keith D.J., Lydiate D.J. 1995. Identification of the A and C genomes
of amphidiploid Brassica napus (oilseed rape). Genome, 38: 1122-1131.
Penner G.A., Bush A., Wise R., Kim W., Domier L., Kasha K., Laroche A., Scoles G., Molnar S.J., Fredak G. 1993. Reproducibility of random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis among laboratories. PCR Methods and Applications, 2 (4): 341-345.
Perez T., Albornoz J., Dominguez A. 1998. An evaluation of RAPD fragment reproducibility and
nature. Molecular Ecology, 7 (10): 1347-1357.
Piquemal J., Cinquin E., Couton F., Rondeau C., Seignoret E., Doucet I., Perret D., Villeger M.J., Vincourt P., Blanchard P. 2005. Construction of an oilseed rape (Brassica napus L.) genetic map
with SSR markers. Theor. Appl. Genet., 111: 1514-1523.
Plieske J., Struss D. 2001. Microsatellite markers for genome analysis in Brassica. I. Development in Brassica napus and abundance in Brassicaceae species. Theor. Appl. Genet., 102: 689-694.
Poland J.A., Rife T.W. 2012. Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. The Plant
Genome, 5: 92-102.
Popławska W., Liersch A., Bartkowiak-Broda I., Krótka K. 2007. Isozyme analysis of polymorphism of winter rapeseed Polish cultivars (Brassica napus L. var. oleifera). Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XXVIII (1): 9-25.
Quail M.A., Smith M., Coupland P., Otto T.D., Harris S.R., Connor T.R., Bertoni A., Swerdlow H.P., Gu Y. 2012. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics, 13: 341.
Rafalski J.A., Tingey S.V. 1993. Genetic diagnostics in plant breeding: RAPDs, microsatellites and
machines. Trends Genet., 9: 275-279.
Rahman M., Sun Z., McVetty P.B.E., Li G. 2008. High throughput genome-specific and gene-specific molecular markers for erucic acid genes in Brassica napus (L.) for marker-assisted selection in plant breeding. Theor. Appl. Genet., 117: 895-904.
Raman H., Raman R., Nelson M.N., Aslam M.N., Rajasekaran R., Wratten N., Cowling W.A., Kilian A., Sharpe A.G., Schondelmaier J. 2012. Diversity Array Technology markers: genetic diversity analyses and linkage map construction in rapeseed (Brassica napus L.). DNA Res., 19: 51-65. Rothberg J.M., Hinz W., Rearick T.M., Schultz J., Mileski W., Davey M., Leamon J.H., Johnson K.,
Milgrew M.J., Edwards M. i in. 2011. An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature, 475: 348-352.
Ruano G., Kidd K. 1992. Modeling of heteroduplex formation during PCR from mixtures of DNA
templates. PCR Methods Appl., 2: 112-116.
Sebastian R.L., Howell E.C., King G.J., Marshall D.F., Kearsey M.J. 2000. An integrated AFLP and RFLP Brassica oleracea linkage map from two morphologically distinct doubled-haploid mapping populations. Theor. Appl. Genet., 100: 75-81.
Seroczyńska A., Kilian A. 2010. Technologia DArT – nowe narzędzie do analizy zmienności genetycznej. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 555: 373-388.
Sharpe A.G., Parkin I.A.P., Keith D.J., Lydiate D.J. 1995. Frequent nonreciprocal translocations in the amphidiploid genome of oilseed rape (Brassica napus). Genome, 38 (6): 1112-1121.
Shendure J., Porreca G.J., Reppas N.B., Lin X., McCutcheon J.P., Rosenbaum A.M., Wang M.D., Zhang K., Mitra R.D., Church G.M. 2005. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science, 309: 1728-1732.
Shiran B., Azimkhani R., Mohammadi S., Ahmadi M.R. 2006. Potential use of Random Amplified Polymorphic DNA marker in assessment of genetic diversity and identification of rapeseed (Brassica napus L.) cultivars. Biotechnology, 5 (2): 153-159.
Snowdon R.J., Friedt W. 2004. Molecular markers in Brassica oilseed breeding: current status and future possibilities. Plant Breeding, 123: 1-8.
Song K.M., Osborn T.C., Williams P.H. 1988. Brassica taxonomy based on nuclear fragment length polymorphisms (RFLPs). 1. Genome evolution of diploid and amphidiploid species. Theor. Appl. Genet., 75: 784-794.
Suwabe K., Iketani H., Nunome T., Kage T., Hirai M. 2002. Isolation and characterization of microsatellites in Brassica rapa L. Theor. Appl. Genet., 104: 1092-1098.
Szewc-McFadden A.K.S., Kresovich S., Bliek S.M., Mitchell S., McFerson J.R. 1996. Identification
of polymorphic, conserved simple sequence repeats (SSRs) in cultivated Brassica species. Theor.
Appl. Genet., 93: 534-538.
Sztuba-Solińska J. 2005. Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli roślin.
Kosmos – Problemy Nauk Przyrodniczych, 54 (2-3): 227-239.
Tanksley S.D., Young N.D., Paterson A.H., Bonierbale M.W. 1989. RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science. Bio/Technology, 7: 257-264.
Tautz D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a source for polymorphic DNA marker.
Nucleic Acids Res., 17: 6463-6471.
Tautz D., Renz M. 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Res., 12: 4127-4138.
Underhill P.A., Jin L., Lin A.A., Mehdi S.Q., Jenkins T., Vollrath D., Davis R.W., Cavalli-Sforza L.L., Oefner P.J. 1997. Detection of numerous Y chromosome biallelic polymorphisms by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC). Genome Research, 7: 996-1005.
Uzunova M., Ecke W., Weissleder K., Röbbelen G. 1995. Mapping the genome of rapeseed (Brassica
napus L.). I. Construction of an RFLP linkage map and localization of QTLs for seed
glucosinolate content. Theor. Appl. Genet., 90 (2): 194-204.
Uzunova M.I., Ecke W. 1999. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in oilseed rape (Brassica napus L). Plant Breeding, 118: 323-326.
Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res., 23 (21): 4407-4414.
Wang X., Wang H., Wang J., Sun R., Wu J., Liu S. i in. 2011. The genome of the mesopolyploid crop
species Brassica rapa. Nature Genetics, 43: 1035-1039.
Wang Z., Weber J.L., Zhong G., Tanksley S.D. 1994. Survey of plant short tandem DNA repeats.
Theor. Appl. Genet., 88: 1-6.
Weber J.L., May P.E. 1989. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
polymerase chain reaction. American Journal of Human Genetics, 44: 388-397.
Welsh J., McClelland M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic
Wenzl P., Carling J., Kudrna D., Jaccoud D., Huttner E., Kleinhofs A., Kilian A. 2004. Diversity arrays technology (DArT) for whole-genome profiling of barley. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 9915-9920.
Westman A.L., Kresovich S. 1998. The potential for cross-taxa simple-sequence repeat (SSR) amplification between Arabidopsis thaliana L. and crop brassicas. Theor. Appl. Genet., 96: 272-281.
Williams J.F. 1989. Optimization strategies for the polymerase chain reaction. BioTechniques, 7 (7): 762-768.
Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acid Res., 18 (22): 6531-6535.
Wolko B., Bartkowiak-Broda I. 1997. Metody diagnostyki molekularnej w hodowli roślin. Hodowla roślin – materiały z I Krajowej Konferencji, 19-20 listopada 1997, Poznań: 389-402.
Zabeau M., Vos P. 1993. European Patent Publication EP 0534858.
Ziętkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20: 176-183.
