Praca oryginalna Original paper
Bisfenol A (BPA, dian, 2,2-bis(4-hydroksyfenylo) propan) to organiczny związek chemiczny należący do grupy fenoli, który jest powszechnie stosowany w produkcji tworzyw sztucznych. Substancja ta wcho-dzi między innymi w skład butelek, plastikowych pojemników, puszek, urządzeń medycznych, mate-riałów stomatologicznych oraz papieru termicznego (17). Wcześniejsze badania wykazały, iż bisfenol A może przenikać do przechowywanej w plastikowych pojemnikach żywności i negatywnie oddziaływać na organizmy żywe (37). Ponadto odpady zawierające BPA mogą być przyczyną zanieczyszczenia akwenów oraz ujęć wody pitnej, zwiększając ryzyko ekspozycji na tę substancję i powodując dodatkowe zagrożenie dla ludzi i zwierząt (7). Dotychczas wykazano, iż bisfe-nol A może wpływać negatywnie na wiele narządów i układów, szczególnie w przypadku osobników mło-dych (25, 26). Wcześniejsze badania opisują, iż działa
on neurotoksycznie, kancerogennie, uszkadza układ rozrodczy, hormonalny, pokarmowy, immunologiczny oraz sercowo-naczyniowy (5, 14, 25, 29). Ponadto wiadomo, że BPA po dostaniu się do organizmu może być kumulowany w wielu tkankach, a następnie po-woli uwalniany, co powoduje przewlekłą intoksykację nawet po ustaniu bezpośredniej ekspozycji na ten związek. Należy przy tym podkreślić, że dokładny me-chanizm oddziaływania bisfenolu A na poszczególne tkanki i narządy nie jest do końca poznany. Jako że opisywana substancja stanowi formę syntetycznego estrogenu, przypuszcza się, iż procesy te odbywają się poprzez aktywację receptorów estrogenowych. Jest to tym bardziej prawdopodobne, że, jak wspomniano powyżej, BPA oddziałuje głównie na układ rozrodczy i hormonalny (26).
W związku z relatywnie dobrze poznanym nega-tywnym oddziaływaniem BPA, wykorzystanie tej
Wpływ bisfenolu A na kodowanie chemiczne
włókien nerwowych koniuszka serca świni domowej
KRYSTYNA MAKOWSKA, KAMILA SZYMAŃSKA, KATARZYNA PALUS, SŁAWOMIR GONKOWSKI, JAROSŁAW CAŁKA
Katedra Fizjologii Klinicznej, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, ul. Oczapowskiego 13, 10-718 Olsztyn
Otrzymano 09.02.2017 Zaakceptowano 13.06.2017
Makowska K., Szymańska K., Palus K., Gonkowski S., Całka J.
Influence of bisfenol A on chemical coding of the nerve fibers of the cardiac apex in the domestic pig Summary
The study was designed to determine the effects of bisphenol A (BPA) on chemical coding of intramural nerve fibers localized in the cardiac apex of domestic pigs. Investigations were performed on 10 immature gilts. The animals were divided into two groups: control (Group K) and experimental (Group B). Gilts from Group B received capsules containing bisphenol A (0.5 mg/kg m.c/day) for 28 days. After euthanasia, fragments of the cardiac apex were collected and subjected to the standard single immunofluorescence method, using primary antisera directed against neuropeptide Y (NPY), vesicular transporter acetylcholine (VAChT), tyrosine hydroxylase (TH), substance P (SP), transcript regulated cocaine and amphetamine peptide (CART) and gene calcitonin (CGRP), as well as secondary antibodies conjugated with fluorochromes: Alexa fluor 488 or Alexa fluor 546.
The present studies demonstrated that orally administered bisphenol A causes a marked increase in the number of nerve fibers immunoreactive to NPY, VAChT, TH and SP. On the other hand, CART and CGRP immunoreactive fibers have not been detected during the present study either in healthy animals or in pigs after BPA administration. Bisphenol A affects the neurochemical profile of nerves located in the cardiac apex of domestic pigs. These fluctuations in the chemical coding of nerve fibers may be associated with neuroprotective and adaptive processes in the myocardium. However, as of yet the mechanisms of these changes are not fully explained. They may be connected with the direct action of BPA on the myocardium and/or general neurodegenerative effects of this substance on the nervous system.
substancji w procesie produkcji opakowań do prze-chowywania żywności w wielu państwach zostało znacznie ograniczone. Na terenie Unii Europejskiej określono dzienną dopuszczalną dawkę spożycia, która wynosi 0,05 mg na kilogram masy ciała (17).
Należy podkreślić, że wiele aspektów związanych z toksycznym działaniem bisfenolu A nie jest do końca wyjaśnionych. Jednym z nich jest wpływ tej substancji na unerwienie serca. Dotychczasowe badania po-twierdziły możliwość odkładania się BPA w mięśniu sercowym (16, 44). Ponadto wykazano, iż substancja ta może powodować arytmię (43) oraz przyczyniać się do różnorodnych chorób serca, takich jak zawał mięśnia sercowego czy choroba niedokrwienna serca. Stwierdzono także, że ekspozycja na bisfenol A zwięk-sza ryzyko nadciśnienia i choroby wieńcowej (3, 16, 20). Pomimo stosunkowo znacznej liczby badań na temat negatywnego wpływu BPA na układ sercowo--naczyniowy (1, 2, 12, 15, 34), dokładny mechanizm tego działania nie został do końca poznany. Można przypuszczać, iż ma on związek z neurotoksyczną aktywnością bisfenolu A. Należy jednak zaznaczyć, że mimo licznych badań dotyczących wpływu BPA na komórki i włókna nerwowe (25, 29), efekty jego wpływu na unerwienie serca nie zostały do tej pory opisane.
Z drugiej strony wiadomo jednak, iż układ nerwowy charakteryzuje się dużą plastycznością, czyli zdolno-ścią do zmian adaptacyjnych w odpowiedzi na nowo powstałe warunki środowiskowe będące wynikiem działania czynników fizjologicznych (takich jak np. wzrost i dojrzewanie organizmu) lub patologicznych (19). Proces ten dotyczy przede wszystkim struktury i/lub funkcji komórek nerwowych, a głównym ich przejawem jest zmiana charakteru neurochemiczne-go, czyli ekspresji nerwowych substancji aktywnych, pełniących głównie funkcje neuromediatorów i/lub neuromodulatorów (4).
Z tego też względu w niniejszych badaniach po raz pierwszy podjęto się określenia wpływu bisfenolu A na kodowanie chemiczne włókien nerwowych zloka-lizowanych w mięśniu sercowym. Spośród kilkudzie-sięciu neuroprzekaźników i/lub neuromodulatorów opisanych dotychczas na terenie układu nerwowego wybrano: neuropeptyd Y (NPY), pęcherzykowy trans-porter acetylocholiny (VAChT), hydroksylazę tyrozy-nową (TH), substancję P (SP), transkrypt regulowany kokainą i amfetaminą (CART) oraz peptyd kodowany genem kalcytoniny (CGRP). Wiadomo, iż substancje te na terenie układu nerwowego pełnią istotną rolę (6, 11), a ponadto większość z nich uczestniczy również w regulacji aktywności mięśnia sercowego, dlatego też wyniki otrzymane w niniejszym doświadczeniu mogą w znacznym stopniu poszerzyć wiedzę na temat me-chanizmów działania bisfenolu A na żywy organizm. Należy również zaznaczyć, iż wybór gatunku zwie-rząt doświadczalnych, jak i ich wiek nie był przypad-kowy. Dotychczasowe badania potwierdzają
miano-wicie, iż najbardziej narażone na toksyczne działanie BPA są organizmy młode. Wynika to, z jednej strony, z szerokiego zastosowania bisfenolu A w produkcji plastikowych przyborów dziecięcych (jak: butelki, smoczki, łyżeczki czy zabawki), a z drugiej – z więk-szej wrażliwości na tę substancję (7). Ponadto wiado-mo, że świnia domowa coraz częściej bywa używana jako model zwierzęcy fizjologicznych i patologicznych procesów zachodzących w organizmie ludzkim (23, 32, 40). Z kolei wybór koniuszków serca do niniej-szych badań wynikał z budowy anatomicznej serca, ponieważ w tym właśnie jego fragmencie występują włókna mięśniowe wspólne dla obydwu komór, odpo-wiedzialne za wytwarzanie głównej siły skurczu serca, a ich unerwienie wydaje się kluczowe dla właściwej pracy tego narządu (13, 38).
Celem badań było określenie wpływu BPA na neu-rochemiczną charakterystykę włókien nerwowych zlokalizowanych na terenie koniuszka serca.
Materiał i metody
Niniejsze badania zostały przeprowadzone na 10 nie- dojrzałych płciowo loszkach rasy pietrain × duroc w wie-ku około 8 tygodni i masie ciała ok. 18-20 kg. Zwierzęta podczas trwania eksperymentu przetrzymywane były w standardowych warunkach laboratoryjnych i karmione paszą przemysłową odpowiednią do gatunku i wieku. Po czterodniowym okresie adaptacyjnym loszki zostały lo-sowo podzielone na dwie grupy, po 5 zwierząt w każdej. Pierwsza z nich (grupa kontrolna – Grupa K) obejmowała świnie, którym przez 28 dni raz dziennie podczas porannego karmienia podawano doustnie puste kapsułki żelatynowe. Drugą grupę (grupa eksperymentalna, po podaniu bisfe-nolu A, Grupa B) stanowiły zwierzęta, którym podawano, w identyczny jak w grupie kontrolnej sposób, kapsułki wypełnione bisfenolem A (Sigma – Aldrich, nr katalogowy 239658) w dawce 0,5 mg/kg m.c./dzień, czyli w ilości dzie-sięciokrotnie przekraczającej dzienną dopuszczalna dawkę spożycia bisfenolu A ustaloną przez prawodawstwo Unii Europejskiej. W celu ustalenia dawki zwierzęta grupy eks-perymentalnej były ważone zarówno przed rozpoczęciem doświadczenia, jak i w czasie jego trwania (w odstępach siedmiodniowych). Dla zachowania identycznych warun-ków doświadczalnych zwierzęta kontrolne były ważone w takich samych odstępach czasowych. Wszystkie proce-dury doświadczalne były wykonywane zgodnie z wytycz-nymi Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Olsztynie (Polska) (uchwała nr 28/2013 z 22.05.2013, w zakresie wniosku 28/2013/N).
W 29. dniu doświadczenia zwierzęta zostały poddane premedykacji przy użyciu azaperonu (Stresnil, Janssen, Belgium, 0,8 mg/kg, i.m.), a po ok. 30 minutach – euta-nazji poprzez przedawkowanie tiopentalu sodu (Thipen, Samarath Life Science PVT, LTD, Indie). Bezpośrednio po eutanazji od wszystkich zwierząt pobierano koniuszki serca i utrwalano je w 4% zbuforowanym roztworze pa-raformaldehydu (pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie tkanki płukano przez 72 godziny w roztworze buforu fosforanowego (0,1 M, pH 7,4, w 4°C)
z wymianą buforu co 24 godziny. Po tym czasie koniuszki serca zostały umieszczone w 18% roztworze sacharozy (w temperaturze 4°C), gdzie przetrzymywano je do momentu zamrożenia (co najmniej dwa tygodnie). Po tym okresie koniuszki serca zamrażano w temperaturze –22°C, krojo-no prostopadle do długiej osi serca na skrawki o grubości 14 µm przy pomocy mikrotomu (Microm, HM 525, Wall-dorf, Niemcy) i umieszczano na odtłuszczonych szkiełkach podstawowych.
Tak przygotowane preparaty poddawane były barwie-niom z wykorzystaniem standardowej metody immuno-fluorescencji pojedynczej opisanej uprzednio przez Gon-kowskiego i wsp. (18). W skrócie metoda ta przedstawiała się następująco: szkiełka z fragmentami koniuszków serca suszono przez 45 minut w temperaturze pokojowej (tp), inkubowano (1 godz., tp) w roztworze blokującym składają-cym się z 10% surowicy koziej, 0,1% albuminy z surowicy bydlęcej (BSA), 0,01% NaN3, Tritonu X-100 oraz thimero-salu w buforowanym roztworze NaCl (PBS). Następnie na skrawki nałożone zostały surowice zawierające przeciw-ciała skierowane przeciwko badanym antygenom, czyli: neuropeptydowi Y (NPY), pęcherzykowemu transporterowi acetylocholiny (VAChT), hydroksylazie tyrozynowej (TH), substancji P (SP), transkryptowi regulowanemu kokainą i amfetaminą (CART) lub peptydowi kodowanemu genem kalcytoniny (CGRP). Inkubacja odbywała się w wilgotnej komorze (tp) „przez noc”. Następnego dnia fragmenty ko-niuszków serca inkubowano z gatunkowo specyficznymi przeciwciałami wtórnymi znakowanymi fluorochromami: Alexa fluor 488 lub Alexa fluor 546 (wykaz wszystkich przeciwciał użytych w niniejszym doświadczeniu przed-stawia tab. 1). Pomiędzy poszczególnymi etapami bar-wienia immunofluorescencyjnego skrawki były płukane w zbuforowanym roztworze NaCl (PBS, 0,1 mol., pH 7,4, 3 × 15 min.). Wybarwione preparaty oceniano przy pomocy mikroskopu Olympus BX51 wyposażonego w epi-fluore-scencję i odpowiednie zestawy filtrów.
Kontrola specyficzności użytych w niniejszym doświad-czeniu surowic obejmowała standardowe próby, a mianowi-cie preabsorpcję przeciwciał z odpowiednimi antygenami,
test „ominięcia” i „zamiany”, przy pomocy których uzyski-wano negatywne wyniki barwień.
Liczbę włókien nerwowych immunoreaktywnych wobec poszczególnych badanych substancji aktywnych określano poprzez zliczanie takich włókien w polu widzenia mikro-skopu (0,1 mm2). Włókna liczono w dziesięciu polach
wi-dzenia na pięciu skrawkach koniuszka serca pochodzących zarówno od loszek grupy kontrolnej, jak i doświadczalnej (w sumie objęto badaniem pięćdziesiąt pól widzenia od każdego zwierzęcia). Wyniki przedstawiono w postaci średniej liczby włókien immunoreaktywnych wobec po-szczególnych substancji zlokalizowanych w polu widzenia ± standardowy błąd średniej (SEM). W celu uniknięcia podwójnego liczenia tych samych włókien nerwowych przestrzegano zasady, żeby poszczególne skrawki objęte doświadczeniem i pochodzące od jednego zwierzęcia były od siebie oddalone o minimum 200 µm.
W celu określenia istotności różnic w liczbie włókien immunoreaktywnych wobec badanych substancji pomiędzy zwierzętami kontrolnymi i loszkami po podaniu bisfenolu A przeprowadzono analizę statystyczną, używając progra-mu komputerowego Statistica 9.1, StatSoft, Inc. a różnice uznawano za istotne statystycznie przy p ≤ 0,05.
Wyniki i omówienie
W niniejszym doświadczeniu wykazano obecność większości badanych substancji aktywnych we włók-nach nerwowych zlokalizowanych na terenie koniusz-ka serca, zarówno u zwierząt kontrolnych, jak i tych poddanych działaniu bisfenolu A (tab. 2, ryc. 1, ryc. 2).
W warunkach fizjologicznych największa liczba włókien nerwowych wykazywała immunoreaktywność wobec TH (średnio 27 ± 0,54 włókien w polu widzenia) (ryc. 1a. TH). Nieco mniejszą gęstość wykazywały włókna nerwowe, w których stwierdzono obecność VAChT (ryc. 1a. VAChT) oraz NPY (ryc. 1a. NPY). Liczebność wymienionych powyżej włókien wynosiła, odpowiednio, 22,22 ± 0,78 i 18,67 ± 0,62 (tab. 2).
W przeciwieństwie do TH, VAChT i NPY, obecność substancji P w grupie zwierząt kontrolnych
stwier-Tab. 1. Wykaz przeciwciał zastosowanych w badaniach immunohistochemicznych
Przeciwciała pierwotne
Antygen Kod Gatunek Rozcieńczenie Pochodzenie NPY NA 1115 Królik 1 : 2000 Biomol, Hamburg, Germany
VAChT H-V006 Królik 1 : 2000 Phoenix Pharmaceuticals, INC, Belmont, CA, USA TH MAB 318 Mysz 1 : 400 Millipore, Warszawa, Polska
SP 8450-0505 Szczur 1 : 1000 Bio-Rad (AbD Serotec), Kidlington, UK CART 1-003-61 Królik 1 : 8000 Phoenix Pharmaceuticals
CGRP T-5027 Świnka morska 1 : 1600 Peninsula, San Carlos, CA, USA Przeciwciała wtórne
Antygen Rozcieńczenie Pochodzenie Kozia anty-szczurza IgG sprzężona z Alexa Fluor 488 1 : 1000 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA Kozia anty-mysia IgG sprzężona z Alexa Fluor 488 1 : 1000 Invitrogen
Kozia IgG przeciw śwince morskiej sprzężona z Alexa Fluor 488 1 : 1000 Invitrogen Kozia anty-królicza IgG sprzężona z Alexa Fluor 546 1 : 1000 Invitrogen
dzono jedynie w pojedynczych włóknach nerwowych (ryc. 2a. SP). U zwierząt tych nie zaobserwowano natomiast włókien immuno-reaktywnych wobec CART (ryc. 2a. CART) i/lub CGRP (tab. 2, ryc. 2a. CGRP).
Morfologia włókien w grupie zwierząt kon-trolnych wyraźnie zależała od występujących w nich substancji. Włókna immunoreaktywne wobec VAChT były zwykle grube, długie i tworzyły sploty z wyraźnymi żylakowatościa-mi (ryc. 1a. VAChT). Włókna TH-pozytywne występowały w dwóch formach: jedne z nich były, podobnie jak w przypadku VAChT, grube i wyraźne, inne – raczej cienkie i delikatne, ale położone blisko siebie (ryc. 1a. TH). Włókna nerwowe zawierające NPY, mimo że stosunko-wo liczne, były przeważnie delikatne, cienkie i krótkie (ryc. 1a. NPY). Podobne cechy mor-fologiczne wykazywały włókna SP-pozytywne (ryc. 2a. SP).
Podanie bisfenolu A powodowało wyraźne zmiany w liczebności włókien nerwowych immunoreaktywnych wobec większości sub-stancji objętych doświadczeniem (tab. 2). Ge-
Ryc. 2. Włókna nerwowe immunoreaktywne dla substancji P (SP) oraz zdjęcia przedstawiające brak włókien immunoreaktywnych dla peptydu kodowanego genem kalcytoniny (CGRP) i transkryptu regulowanego kokainą i amfetaminą (CART) w grupie kontrolnej (a) oraz po podaniu bisfenolu A (b). Włókna nerwowe immunoreaktywne dla poszczególnych substancji zaznaczono strzałkami
Ryc. 1. Włókna nerwowe immunoreaktywne dla neuropeptydu Y (NPY), pęcherzykowego transpor-tera acetylocholiny (VAChT) oraz hydroksylazy tyrozynowej (TH) w grupie kontrolnej (a) oraz po podaniu bisfenolu A (b). Włókna nerwowe immuno-reaktywne dla poszczególnych substancji zaznaczono strzałkami
Tab. 2. Średnia liczba (± SEM) włókien nerwowych immunoreaktywnych dla poszczególnych substancji zlokalizowanych w ścianie koniuszka serca zwierząt kontrolnych (Grupa K) oraz poddanych działaniu bisfenolu A (grupa B)
Substancja Grupa K Grupa B NPY 18,67 ± 0,62 24,36 ± 1,77 VAChT 22,22 ± 0,78 31,7 ± 0,5 TH 27 ± 0,54 37,23 ± 1,68 SP 0,89 ± 0,06 1,77 ± 0,13 CART 0 0 CGRP 0 0
Objaśnienia: Liczbę włókien podano w polu widzenia (0,1 mm2). Skróty użyte w tabeli: NPY – Neuropeptyd
Y; VAChT – pęcherzykowy transporter acetylocholiny; TH – hydroksylaza tyrozynowa; SP – substancja P; CART – transkrypt regulowany kokainą i amfetaminą; CGRP – peptyd kodowany genem kalcytoniny. Różnice pomiędzy grupą K i grupą B w przypadku wszystkich substancji obecnych we włóknach nerwowych były istotne statystycznie przy p ≤ 0,05.
neralnie zmiany te polegały na zwiększeniu liczby ba-danych włókien, przy czym nasilenie zmian wyraźnie zależało od rodzaju substancji, wobec której włókna te były immunoreaktywne. Najwyraźniejszy wzrost liczebności zaobserwowano w przypadku włókien im-munoreaktywnych wobec TH i VAChT (odpowiednio: z 27 ± 0,54 do 1,77 ± 0,13 i z 22,22 ± 0,78 do 31,7 ± 0,5) (ryc. 1b. TH, 1b. VAChT). Nieco mniej widocz-ny wzrost liczby dotyczył NPY-pozytywwidocz-nych włókien nerwowych (z 18,67 ± 0,62 do 24,36 ± 1,77) (ryc. 1b. NPY). W najmniejszym stopniu bisfenol A wpływał na włókna immunoreaktywne wobec SP (wzrost z 0,89 ± 0,06 do 1,77 ± 0,13) (ryc. 2b. SP). Jednakże nawet w tym przypadku obserwowane zmiany wykazywały różnice istotne statystycznie (tab. 2). W grupie zwierząt poddanych działaniu bisfenolu A, podobnie jak u zwie-rząt kontrolnych, nie stwierdzono obecności włókien nerwowych immunoreaktywnych wobec CART i/lub CGRP (tab. 2, ryc. 2).
Podanie bisfenolu A nie wpływało znacząco na cechy morfologiczne włókien immunoreaktywnych wobec poszczególnych substancji. Wyjątkiem były jedynie włókna VAChT – pozytywne, które u zwie-rząt poddanych działaniu bisfenolu A, w porównaniu z grupą kontrolną, były grubsze, układały się w sploty i pęczki, wykazywały większą ilość żylakowatości i silniejszy sygnał immunofluorescencyjny (ryc. 1b. VAChT).
W przypadku włókien immunoreaktywnych wobec pozostałych substancji nie wykazano żadnych różnic w ich cechach morfologicznych pomiędzy zwierzętami kontrolnymi a tymi, które poddane zostały działaniu bisfenolu A.
Badaniami objęto włókna nerwowe zlokalizowane na terenie koniuszka serca. Należy podkreślić, iż śród-ścienne unerwienie tego fragmentu mięśnia sercowego nie było dotychczas badane, mimo że koniuszek serca jest miejscem, w którym według powszechnie znanej wiedzy anatomicznej zaznacza się zasadnicza budo-wa mięśnia sercowego komór, a zewnętrzna skośna warstwa włókien mięśniowych przechodzi w warstwę wewnętrzną podłużną (10, 28).
Uzyskane wyniki wskazują, że we włóknach nerwo-wych położonych w koniuszku serca mogą występo-wać różnorodne substancje aktywne. Jest to generalnie zgodne z wcześniejszymi obserwacjami dotyczącymi włókien zlokalizowanych w innych częściach serca, takich jak przegroda lub ściany przedsionków i komór (31, 35, 45), w których (podobnie jak podczas niniej-szych badań) obserwowano NPY, VAChT, TH oraz SP (8, 9, 45). Z drugiej jednak strony, zauważyć można pewne różnice pomiędzy neurochemiczną charaktery-styką włókien nerwowych zaopatrujących koniuszek serca (wyniki niniejszych badań) a strukturami nerwo-wymi w innych częściach serca opisanymi we wcze-śniejszych eksperymentach (31). Chodzi mianowicie o immunoreaktywność wobec CGRP. W niniejszym doświadczeniu nie stwierdzono takich włókien ani
w warunkach fizjologicznych, ani po podaniu bisfe-nolu A. Natomiast wcześniejsze badania wykazały stosunkowo dużą ilość CGRP-pozytywnych struktur nerwowych w innych częściach mięśnia sercowego (8, 31, 35). Ponadto wiadomo, iż CGRP jest ważnym czynnikiem regulującym pracę serca, który między innymi bierze udział w kontroli przepływu krwi przez naczynia wieńcowe oraz wykazuje działanie inotropo-wo-dodatnie oraz kardioprotekcyjne (11, 21). Opisane powyżej różnice sugerują, że unerwienie koniuszka serca wykorzystuje nieco odmienne mechanizmy i sub-stancje aktywne niż struktury nerwowe kontrolujące inne części mięśnia sercowego.
Należy zaznaczyć, iż pochodzenie włókien nerwo-wych będących przedmiotem niniejszych badań może być różne. Powszechnie wiadomo bowiem, że włókna leżące w mięśniu sercowym mogą być wypustkami neuronów zlokalizowanych poza tym narządem (uner-wienie zewnątrzpochodne współczulne i przywspół-czulne) lub komórek położonych na terenie zwojów śródsercowych (13, 30).
Funkcje obserwowanych w niniejszych badaniach włókien nerwowych immunoreaktywnych wobec po-szczególnych substancji w świetle dotychczasowych badań mogą być bardzo różne. O ile rola nerwów adrenergicznych (immunoreaktywnych wobec TH) oraz cholinergicznych (immunoreaktywnych wobec VAChT) w regulacji pracy serca jest powszechnie znana (8, 31, 35) i nie wymaga dokładniejszego omó-wienia, o tyle szczegółowe mechanizmy związane z funkcjami NPY i SP nie są już tak jednoznaczne. W dotychczasowych badaniach potwierdzono, że NPY występuje przede wszystkim w nerwach współczul-nych i poprzez kilka klas receptorów (oznaczowspółczul-nych jako NPYR1-NPYR6), szeroko rozpowszechnionych w sercu, oddziałuje na ten narząd w sposób komplek-sowy (33). Przede wszystkim NPY jest znanym czyn-nikiem powodującym skurcz naczyń krwionośnych (11). Bierze również udział w gospodarce białkowej, reguluje ekspresję niektórych genów oraz uczestniczy w mechanizmach kontrolujących angiogenezę i neu-rogenezę, przez co może zwiększać przeżywalność komórek mięśnia sercowego (27). W warunkach eksperymentalnych udowodniono ponadto możliwość zastosowania NPY jako czynnika zapobiegającego apoptozie i zwłóknieniu komórek mięśniowych (11).
Z kolei substancja P, podobnie jak CGRP, jest powszechnie znanym czynnikiem biorącym udział w przewodzeniu bodźców czuciowych i bólowych (11), które to funkcje może też pełnić na terenie ser-ca. Ponadto SP uczestniczy w regulacji przepływu krwi przez naczynia wieńcowe (21, 35) oraz pobudza unerwienie cholinergiczne serca, powodując ujemny efekt ino-, batmo- i chronotropowy (11). W warunkach eksperymentalnych SP może oddziaływać stymulująco na wzrost i rozwój kardiomiocytów (9).
Ponadto wykazano, że zarówno NPY, jak i SP mogą uczestniczyć w procesach związanych z uszkodzeniem
mięśnia sercowego, takich jak różnego typu kardio-miopatie i choroby metaboliczne (11). Udział tych substancji w regulacji czynności serca w stanach pa-tologicznych potwierdzają również wyniki niniejszych badań, które wyraźnie ukazują wpływ bisfenolu A na immunoreaktywność włókien nerwowych zlokalizo-wanych na terenie koniuszka serca, co z kolei wskazu-je, iż substancja ta może wpływać negatywnie na układ krążenia. Taki wpływ został potwierdzony również we wcześniejszych badaniach. Udowodniono mianowicie, że bisfenol A po podaniu dożylnym odkłada się między innymi w sercu (44) i uszkadza znajdujące się tam mitochondria, co wpływa negatywnie na metabolizm mięśnia sercowego oraz obniża wydolność tego na-rządu (1, 22). Inne badania wykazały, iż nawet niskie dawki bisfenolu A w diecie mogą powodować przerost mięśnia sercowego i wzrost jego wagi (24) oraz udo-wodniły BPA-zależne zwolnienie przewodzenia bodź-ców elektrycznych w sercu izolowanym (34). Ponadto stosunkowo dobrze poznane są stany chorobowe układu krążenia spowodowane bisfenolem A, do któ-rych należy zaliczyć: arytmię, podwyższone ciśnienie krwi, stany zapalne serca i naczyń oraz miażdżycę (2, 12). Wymienionym stanom chorobowym towarzyszy zwykle podwyższony poziom markerów sercowych i zmiany histopatologiczne w obrębie przedsionków i komór serca (12). Spośród wszystkich wymienionych powyżej zmian wywołanych w obrębie serca przez bisfenol A, najlepiej poznane są mechanizmy związane z arytmią. Otóż udowodniono (15), że nawet niskie dawki BPA, działając na komórki mięśnia sercowe-go, gwałtownie pobudzają dwa równorzędne szlaki sygnałowe, w których funkcję przekaźników II rzędu pełni cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP) lub 1,4,5- trifosforan inozytolu (IP 3). Szlaki te wpływają na receptory rianodynowe i zwiększają napływ jonów Ca2+, które są bezpośrednią przyczyną arytmii.
Wysoce prawdopodobne jest, iż właśnie ten mecha-nizm leży również u podstaw zmian obserwowanych w niniejszym doświadczeniu, a wahania w immuno-reaktywności włókien nerwowych stanowią przejaw procesów adaptacyjnych będących odpowiedzią na zaburzenia rytmu serca. Inną przyczyną różnic po-między grupą kontrolną a zwierzętami poddanymi działaniu bisfenolu A mogła być prozapalna aktywność tej substancji. Jest to tym bardziej prawdopodobne, że w innych częściach układu nerwowego wpływ stanów zapalnych na neurochemiczną charakterysty-kę neuronów został stosunkowo dobrze poznany (36, 41). W przypadku zapalenia zmiany w komórkach i włóknach nerwowych związane są zwykle z proce-sami adaptacyjnymi i neuroprotekcyjnymi, które mają za zadanie chronić układ nerwowy przed czynnikiem uszkadzającym tkanki (39, 42). Z dużą dozą pewności można więc przypuszczać, że przyczyna zmian obser-wowanych w niniejszym doświadczeniu była podobna. Z drugiej jednak strony, nie można wykluczyć, że wahania w immunoreaktywności włókien nerwowych
koniuszka serca mogły nie wynikać z bezpośredniego wpływu BPA na mięsień sercowy, ale być związane ze stosunkowo słabo poznanym neurodegeneracyjnym oddziaływaniem tej substancji (29).
Należy podkreślić, że podobnie jak mechanizmy prowadzące do obserwowanych zmian, również bez-pośrednie ich przyczyny pozostają niejasne. Wahania immunoreaktywności wobec poszczególnych substan-cji aktywnych mogą wynikać ze zmian w przebiegu różnych etapów biosyntezy białek, a mianowicie: transkrypcji, translacji lub modyfikacji potranslacyj-nych. Mogą być także efektem zaburzeń transportu neuronalnego z ciała komórki do zakończeń synap-tycznych.
Podsumowując, niniejsze badania jednoznacznie wskazują, iż bisfenol A może wpływać na neuro-chemiczną charakterystykę włókien nerwowych zlokalizowanych w koniuszku serca świni domowej, jednakże mechanizmy tych zmian nie są do końca wyjaśnione. Mogą być one wynikiem bezpośredniego działania BPA na mięsień sercowy, jak również ogól-nym neurodegeneracyjogól-nym wpływem tej substancji na układ nerwowy. Mimo tych niejasności i konieczności kontynuacji prac badawczych, niniejsze doświadcze-nie opisujące po raz pierwszy wpływ bisfenolu A na kodowanie chemiczne nerwów w koniuszku serca może stanowić punkt wyjściowy do lepszego zrozu-mienia negatywnego oddziaływania tej substancji na organizm żywy.
Piśmiennictwo
1. Aboul Ezz H. S., Khadrawy Y. A., Mourad I. M.: The effect of bisphenol A on some oxidative stress parameters and acetylcholinesterase activity in the heart of male albino rats. Cytotechnology 2015, 67, 145-155.
2. Bae S., Hong Y. C.: Exposure to bisphenol A from drinking canned beverages increases blood pressure: randomised crossover trial. Hypertension 2015, 65, 313-319.
3. Bae S., Kim J. H., Lim Y. H., Park H. Y., Hong Y. C.: Associations of bisphenol A exposure with heart rate variability and blood pressure. Hypertension 2012, 60, 786-793.
4. Borodinsky L. N., Belgacem Y. H., Swapna I., Sequerra E. B.: Dynamic regulation of neurotransmitter specification: relevance to nervous system homeostasis. Neuropharmacology 2014, 78, 75-80.
5. Braniste V., Jouault A., Gaultier E., Polizzi A., Buisson-Brenac C., Leveque M.,
Martin P. G., Theodorou V., Fioramonti J., Houdeau E.: Impact of oral
bisphe-nol A at reference doses on intestinal barrier function and sex differences after perinatal exposure in rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, 448-453. 6. Carniglia L., Ramírez D., Durand D., Saba J., Turati J., Caruso C., Scimonelli
T. N., Lasaga M.: Neuropeptides and microglial activation in inflammation,
pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 2017, 5048616.
7. Corrales J., Kristofco L. A., Steele W. B., Yates B. S., Breed C. S., Williams
E. S., Brooks B. W.: Global assessment of bisphenol A in the environment,
review and analysis of its occurrence and bioaccumulation. Dose Response 2015, 13, 1559325815598308.
8. Crick S. J., Anderson R. H., Ho S. Y., Sheppard M. N.: Localization and quantitation of autonomic innervation in the porcine heart II: endocardium, myocardium and epicardium. J. Anat. 1999, 195, 359-373.
9. Dehlin H. M., Levick S. P.: Substance P in heart failure: the good and the bad. Int. J. Cardiol. 2014, 170, 270-277.
10. Deng D., Jiao P., Ye X., Xia L.: An Image-Based Model of the Whole Human Heart with Detailed Anatomical Structure and Fiber Orientation. Comput. Math. Methods. Med. 2012, 2012, 891070.
11. Dvorakova M. C., Kruzliak P., Rabkin S. W.: Role of neuropeptides in cardio-myopathies. Peptides 2014, 61, 1-6.
12. Fang C., Ning B., Waqar A. B., Niimi M., Li S., Satoh K., Shiomi M., Ye T.,
Dong S., Fan J.: Bisphenol A exposure induces metabolic disoders and
enhances atherosclerosis in hyperlipidemic rabbits. J. Appl. Toxicol. 2015, 35, 1058-1070.
13. Fukuda K., Kanazawa H., Aizawa Y., Ardell J. L., Shivkumar K.: Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circ. Res. 2015, 116, 2005-2019. 14. Gao H., Yang B. J., Li N., Feng L. M., Shi X. Y., Zhao W. H., Liu S. J.: Bis-
phenol A and hormone-associated cancers: current progress and perspectives. Medicine (Baltimore) 2015, 94, e211.
15. Gao X., Liang Q., Chen Y., Wang H. S.: Molecular mechanisms underlying the rapid arrhythmogenic action of bisphenol A in female rat hearts. Endocrinology 2013, 154, 4607-4617.
16. Gao X., Wang H. S.: Impact of bisphenol a on the cardiovascular system – epidemiological and experimental evidence and molecular mechanisms. Int. J. Environ. Res. Public Health 2014, 11, 8399-8413.
17. Geens T., Aerts D., Berthot C., Bourguignon J. P., Goeyens L., Lecomte P.,
Maghuin-Rogister G., Pironnet A. M., Pussemier L., Scippo M. L., Van Loco J., Covaci A.: A review of dietary and non-dietary exposure to bisphenol A. Food
Chem. Toxicol. 2012, 50, 3725-3740.
18. Gonkowski S., Kaminska B., Burlinski P., Kroll A., Calka J.: The influence of drug-resistant ulcerative colitis on the number of cocaine- and amphet-amine-regulated transcript peptide-like immunoreactive (CART-LI) mucosal nerve fibres of the descending colon in children. Przegl. Gastroenterol. 2009, 4, 147-151.
19. Griesbach G. S., Hovda D. A.: Cellular and molecular neuronal plasticity. Handb. Clin. Neurol. 2015, 128, 681-690.
20. Han C., Hong Y. C.: Bisphenol A, hypertension, and cardiovascular diseases: epidemiological, laboratory, and clinical trial evidence. Curr. Hypertens. Rep. 2016, 18, 11.
21. Hongbao M., Yan Y., Shen C.: Gender-specific effects of calcitonin gene-related peptide and substance P on coronary blood flow in an experimental model. Angiology 2009, 60, 569-575.
22. Jiang Y., Xia W., Yang J., Zhu Y., Chang H., Liu J., Huo W., Xu B., Chen X.,
Li Y., Xu S.: BPA-induced DNA hypermethylation of the master mitochondrial
gene PGC-1α contributes to cardiomyopathy in male rats. Toxicology 2015, 329, 21-31.
23. Kang H. Y., Jung E. M., Hong E. J., Hyun S. H., Hwang W. S., Jeung E. B.: Generation of transgenic fibroblasts expressing pancreas-specific and doxy-cycline-inducible ICER Iγ for the establishment of a porcine model of human diabetes mellitus. Mol. Med. Rep. 2014, 10, 1136-1142.
24. Kobayashi K., Ohtani K., Kubota H., Miyagawa M.: Dietary exposure to low doses of bisphenol A: effects on reproduction and development in two generations of C57BL/6J mice. Congenit. Anom. (Kyoto) 2010, 50, 159-170. 25. MacLusky N. J., Hajszan T., Leranth C.: The environmental estrogen bisphenol
A inhibits estradiol-induced hippocampal synaptogenesis. Environ. Health Perspect. 2005, 113, 675-679.
26. Maffini M. V., Rubin B. S., Sonnenschein C., Soto A. M.: Endocrine disruptors and reproductive health: the case of bisphenol-A. Mol. Cell. Endocrinol. 2006, 254-255, 179-186.
27. Matyal R., Sakamuri S., Wang A., Mahmood E., Robich M. P., Khabbaz K.,
Hess P. E., Sellke F. W., Mahmood F.: Local infiltration of neuropeptide Y as
a potential therapeutic agent against apoptosis and fibrosis in a swine model of hypercholesterolemia and chronic myocardial ischemia, Eur. J. Pharmacol. 2013, 718, 261-270.
28. McBride K. K., Roth B. J., Sidorov V. Y., Wikswo J. P., Baudenbacher F. J.: Measurements of transmembrane potential and magnetic field at the apex of the heart. Biophys. J. 2010, 99, 3113-3118.
29. Nakamura K., Itoh K., Dai H., Han L., Wang X., Kato S., Sugimoto T., Fushiki S.: Prenatal and lactational exposure to low-doses of bisphenol A alters adult mice behavior. Brain Dev. 2011, 34, 57-63.
30. Parsons R. L., Locknar S. A., Young B. A., Hoard J. L., Hoover D. B.: Presence and co-localization of vasoactive intestinal polypeptide with neuronal nitric oxide synthase in cells and nerve fibers within guinea pig intrinsic cardiac ganglia and cardiac tissue. Cell Tissue Res. 2006, 323, 197-209.
31. Pauziene N., Alaburda P., Rysevaite-Kyguoliene K., Pauza A. G., Inokaitis H.,
Masaityte A., Rudokaite G., Saburkina I., Plisiene J., Pauza D. H.: Innervation
of the rabbit cardiac ventricles. J. Anat. 2016, 228, 26-46.
32. Petersen B., Carnwath J. W., Niemann H.: The perspectives for porcine-to- -human xenografts. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2009, 32, 91-105. 33. Pons J., Lee E. W., Li L., Kitlinska J.: Neuropeptide Y: multiple receptors and
multiple roles in cardiovascular diseases, Curr. Opin. Investig. Drugs 2004, 5, 957-962.
34. Posnack N. G., Jaimes R. 3rd, Asfour H., Swift L. M., Wengrowski A. M.,
Sarvazyan N., Kay M. W.: Bisphenol A exposure and cardiac electrical
con-duction in excised rat hearts. Environ. Health Perspect. 2014, 122, 384-390.
35. Rysevaite K., Saburkina I., Pauziene N., Vaitkevicius R., Jalife J., Pauza D. H.: Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm 2011, 8, 731-738. 36. Shimizu Y., Matsuyama H., Shiina T., Takewaki T., Furness J. B.: Tachykinins
and their functions in the gastrointestinal tract. Cell. Mol. Life Sci. 2008, 65, 295-311.
37. Tsai W. T.: Human health risk on environmental exposure to Bisphenol-A: a review. J. Environ. Sci. Health. C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 2006, 24, 225-255.
38. Tsamis A., Bothe W., Kvitting J. P., Swanson J. C., Miller D. C., Kuhl E.: Active contraction of cardiac muscle: in vivo characterization of mechanical activation sequences in the beating heart. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2011, 4, 1167-1176.
39. Vasina V., Barbara G., Talamonti L., Stanghellini V., Corinaldesi R., Tonini M.,
De Ponti F., De Giorgio R.: Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.
Auton. Neurosci. 2006, 126-127, 264-272.
40. Verma N., Rettenmeier A. W., Schmitz-Spanke S.: Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics 2011, 11, 776-793.
41. Voice J. K., Grinninger C., Kong Y., Bangale Y., Paul S., Goetzl E. J.: Role of vasoactive intestinal peptide (VIP) in the expression of different immune phenotypes by wild-type mice and T-cell targeted type II VIP receptor trans-genic mice. J. Immunol. 2003, 170, 308-314.
42. Woolf C. J., Salter M. W.: Neuronal plasticity: increasing the gain in pain. Science 2000, 288, 1765-1769.
43. Yan S., Song W., Chen Y., Hong K., Rubinstein J., Wang H. S.: Low-dose bisphenol A and estrogen increase ventricular arrhythmias following isch-emia-reperfusion in female rat hearts. Food Chem. Toxicol. 2013, 56, 75-80. 44. Yoo S. D., Shin B. S., Kwack S. J., Lee B. M., Park K. L., Han S. Y., Kim H. S.:
Pharmacokinetic disposition and tissue distribution of bisphenol A in rats after intravenous administration. J. Toxicol. Environ. Health A. 2000, 61, 131-139. 45. Zhu W., Dey R. D.: Distribution of the neuropeptide galanin in the cat heart and
coexistence with vasoactive intestinal peptide, substance P and neuropeptide Y. J. Mol. Cell. Cardiol. 1992, 24, 35-41.
Adres autora: dr hab. Sławomir Gonkowski, ul. Oczapowskiego 13, 10-719 Olsztyn, e-mail: slawomir.gonkowski@uwm.edu.pl
