Artyku³ przegl¹dowy Review
Bezpieczeñstwo ¿ywnoci jest jednym z g³ównych celów, jaki stawia przed sob¹ Unia Europejska. Wp³yw na jakoæ artyku³ów ¿ywnociowych ma wiele biolo-gicznych, chemicznych lub fizycznych czynników, któ-re wymagaj¹ sta³ego, konsekwentnego monitoringu i oceny w kontekcie zdrowia cz³owieka. W odnie-sieniu do produkcji zwierzêcej gromadzone s¹ dane wskazuj¹ce na cis³y zwi¹zek zdrowia cz³owieka ze zdrowiem zwierz¹t. Tak wiêc koncepcja jednego zdrowia stanowi pomost pomiêdzy trosk¹ o zdrowie zwierz¹t a ochron¹ zdrowia publicznego.
Zoonozy, choroby odzwierzêce, w tym pojawiaj¹ce siê nowe jednostki chorobowe, w po³¹czeniu z coraz wiêksz¹ modyfikacj¹ rodowiska naturalnego oraz powszechna globalizacja i urbanizacja mog¹ stanowiæ istotne ród³o zagro¿enia zdrowia publicznego. Zwie-rzêta staj¹ siê czêsto wektorami przenosz¹cymi cho-roby i ród³em chorób powodowanych przez ¿ywnoæ nieodpowiedniej jakoci. W ci¹gu ostatnich dziesiê-ciu lat oko³o 75% nowo pojawiaj¹cych siê chorób ludzi by³o pochodzenia zwierzêcego. Obecnie sklasy-fikowano ponad 200 zoonoz, aczkolwiek szacuje siê,
¿e jest ich znacznie wiêcej w zale¿noci od przyjêtych kryteriów oceny (32).
Postêpuj¹ca intensyfikacja produkcji zwierzêcej wi¹¿e siê z zagro¿eniami. W wielu krajach, zarówno rozwiniêtych, jak i rozwijaj¹cych siê, jak wskazuj¹ raporty European Food Safety Authority (EFSA), pro-dukcja zwierzêca oraz jej produkty mog¹ stanowiæ potencjalne ród³o zaka¿eñ ludzi wielu zoonozami, z których obecnie najczêstsze to kampylobakerioza i salmonelloza, np. miêso drobiowe stanowi od 20% do 30% przypadków kampylobakeriozy u ludzi (EFSA, 2010), natomiast udokumentowane przypad-ki salmonellozy w UE wynios³y w 2005 r. rednio 38,2 zachorowañ na 100 000 mieszkañców (EFSA, 2006). Wycofanie w krajach UE z dniem 1 stycznia 2006 r. antybiotykowych stymulatorów wzrostu (ASW) jako dodatków paszowych stanowi wyzwanie dla hodow-ców oraz producentów pasz. Sk³ania do poszukiwania nowych rozwi¹zañ ¿ywieniowych oraz stosowania ta-kich dodatków, które bêd¹ bezpieczne dla zwierz¹t oraz w produkcji ¿ywnoci.
Rolê tak¹ mog¹ spe³niaæ probiotyki, prebiotyki i ich kombinacja, czyli synbiotyki. Probiotyki to kultury mikroorganizmów sk³adaj¹ce siê z jednego lub wiêcej
Metody oceny skutecznoci dzia³ania substancji pre-,
pro- i synbiotycznych na stan mikroflory przewodu
pokarmowego organizmów zwierzêcych*
)
IZABELA KOZ£OWSKA, AGATA DANKOWIAKOWSKA, MAREK BEDNARCZYK
Katedra Biotechnologii Zwierz¹t Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t
Uniwersytetu Technologiczno-Przyrodniczego im. Jana i Jêdrzeja niadeckich, ul. Mazowiecka 28, 85-084 Bydgoszcz
Koz³owska I., Dankowiakowska A., Bednarczyk M.
Methods of evaluating the influence of pre-, pro- and symbiotic substances on the gastrointestinal microflora in animals
Summary
The gastrointestinal tract of animals harbors a large, complex and dynamic microbiome important to the growth and health of livestock animals. This microbiome can be directly modulated, for example by antibiotic treatment or by various bioactive substances. Following the ban on the in-feed use of antibiotic growth promoters in the EU, an increased effort has been put into discovering an alternative in animal production. An indispensable tool for the evaluation of bioactive substances are complex studies combining in vitro and in vivo methods. They consist of precision tests that make it possible to evaluate not only the characteristics of specific strains of bacteria, but also the safety of their application. This paper presents the most important methods for the evaluation and selection of in vitro and in vivo bioactive substances that make it possible to stimulate the gastrointestinal microbiome of animals.
Keywords: in vitro, in vivo, in ovo, bioactive substances
*) Praca finansowana ze rodków Narodowego Centrum Nauki przyznanych na podstawie decyzji numer DEC-2011/01/B/NZ9/00642.
gatunków, które po wprowadzeniu do przewodu po-karmowego zwierz¹t lub ludzi kolonizuj¹ jelito grube, wp³ywaj¹c korzystnie na znajduj¹ca siê tam mikroflo-rê, przyczyniaj¹c siê do zachowania zdrowia organiz-mu gospodarza (39). Efektywnoæ dzia³añ probioty-ków wspomagaj¹ prebiotyki substancje, najczêciej o charakterze wêglowodanów, niezdolne do trawienia przez enzymy endogenne górnego odcinka przewodu pokarmowego zwierz¹t jedno¿o³¹dkowych, transpor-towane w niezmienionej postaci do jelita grubego, gdzie s¹ wykorzystywane przez bytuj¹c¹ tam, korzyst-n¹ dla zdrowia mikroflorê przewodu pokarmowego (34).
W ci¹gu ostatnich kilkudziesiêciu lat przeprowa-dzono wiele dowiadczeñ nad optymalnym doborem wspomnianych dodatków, ich oddzia³ywaniem na ce-chy produkcyjne zwierz¹t oraz nad mechanizmami ich oddzia³ywania (7, 9, 11, 17, 18, 27). W efekcie uzy-skano wiele czêsto wykluczaj¹cych siê wyników, któ-re s¹ efektem m.in. odmiennej procedury dowiadczal-nej, a przede wszystkim ró¿norodnoci stosowanych substancji bioaktywnych, uniemo¿liwiaj¹cych porów-nanie wyników prac ró¿nych autorów (12, 26). Wyda-je siê, ¿e kluczowym zagadnieniem w skutecznej sty-mulacji mikrobiomu zwierz¹t, a wiêc tego z³o¿onego i dynamicznego uk³adu mikroflory bytuj¹cego w prze-wodzie pokarmowym, jest odpowiednia selekcja sub-stancji bioaktywnych oraz okrelenie ich mechaniz-mów dzia³ania. Warunkiem prawid³owej selekcji jest wybór odpowiednich kryteriów i metod jej realizacji. Wed³ug Charterisa (5), kryteria selekcyjne dla pro-biotyków mo¿na podzieliæ pod wzglêdem techno-logicznym (³atwy i tani w uzyskaniu oraz obróbce, ³atwy w przechowywaniu) i naukowym. Do ostatnich nale¿¹ takie elementy, jak: odpornoæ na czynniki bio-r¹ce udzia³ w trawieniu prowadzonym w górnych od-cinkach przewodu pokarmowego, zdolnoæ redukcji poziomu cholesterolu we krwi, zdolnoæ do obni¿ania cinienia krwi i redukcji biegunek, zdolnoæ adhezji do nab³onka okrê¿nicy, stymulacja uk³adu immuno-logicznego, zmniejszenie ryzyka wyst¹pienia nowo-tworów okrê¿nicy, zdolnoæ do produkcji substancji szkodliwych dla bakterii patogennych itp. (10, 26). Ponadto wa¿ne s¹ tak¿e: bezpieczeñstwo biologiczne probiotyku, metoda jego produkcji, przetwarzania, aplikacji oraz optymalne miejsce administracji w or-ganizmie (15).
Natomiast cechy potencjalnie idealnego prebiotyku s¹ nastêpuj¹ce: odporny na kwasowoæ, hydrolizê oraz absorpcjê w przewodzie pokarmowym ssaków; ulega fermentacji prowadzonej przez mikroflorê jelit; wp³y-wa pozytywnie na wzrost i aktywnoæ prozdrowotnych mikroorganizmów jelita grubego, przyczyniaj¹c siê do poprawy zdrowia gospodarza (13, 34).
Odpowiednie dobranie synbiotycznych par bakterii probiotycznych spe³niaj¹cych ww. za³o¿enia oraz do-branych do nich, uzupe³niaj¹cych prebiotyków
wspo-magaj¹cych ich wzrost daje mo¿liwoæ stworzenia substancji optymalnej (4). Uzyskanie takiej substancji mo¿liwe jest pod warunkiem wypracowania odpowied-nich metod oceny oraz przeprowadzenia testów po-równawczych. Aby zrozumieæ rolê, jak¹ odgrywaj¹ poszczególne suplementy, konieczne jest wykonanie badañ zarówno w warunkach in vitro, jak i takich, które wymaga³yby u¿ycia ¿ywych organizmów (30). Celem niniejszej pracy jest analiza najwa¿niejszych metod oceny oraz selekcji in vitro i in vivo pro- i pre-biotyków wp³ywaj¹cych na stymulacjê mikroflory przewodu pokarmowego organizmów zwierzêcych.
Ocena in vitro substancji bioaktywnych Dokonuj¹c selekcji substancji bioaktywnych w te-stach in vitro, wykonuje siê szereg badañ, które sku-piaj¹ siê g³ównie na zmianach liczebnoci bakterii probiotycznych, ich identyfikacji i prze¿ywalnoci, zdolnoci adhezyjnych, wp³ywie okrelonych czynni-ków prebiotycznych na aktywnoæ tych bakterii, a tak¿e na zmianach w poziomie metabolitów bakterii probio-tycznych wzbogaconych prebiotykami. W tym celu zo-sta³o opracowanych wiele metod badaj¹cych powy¿-sze w³aciwoci. Do najwa¿niejszych nale¿¹ klasyczne i molekularne technologie identyfikacji mikroorganiz-mów oraz modele symuluj¹ce uk³ad pokarmowy (lub jego okrelon¹ czêæ) zwierz¹t monogastrycznych, jak: fermentatory, chemostaty, a nawet hodowle tkankowe. Izoluj¹c bakterie z próbek ka³u lub innych róde³, najwiêkszym problemem staje siê ich identyfikacja (34). O powodzeniu oznaczenia gatunku bakterii pro-biotycznej w optymalnym medium hodowlanym decy-duj¹ takie czynniki, jak: selektywnoæ po¿ywki, iden-tyfikacja kolonii przy u¿yciu mikroskopu, wie¿oæ sk³adników medium oraz sam sk³ad medium (35). Klasyczne oznaczanie gatunków w testach in vitro, jak i in vivo mo¿e odbywaæ siê na wiele sposobów. S¹ to m.in.: wygl¹d kolonii, morfologia oceniana mikrosko-powo, obecnoæ specyficznych enzymów (4), wzory fermentacji cukrów (16), a tak¿e testy API (19). Po-wszechnie stosowane techniki z u¿yciem pod³o¿y selekcyjnych nie daj¹ pe³nej pewnoci co do zidenty-fikowanych gatunków bakterii. Klasyczna kulturowa charakterystyka bakterii jest co prawda szybka, nie-droga, pozwalaj¹ca przeprowadziæ du¿¹ liczbê powtó-rzeñ, jednak jest metod¹ subiektywn¹, ograniczon¹ do bakterii zdolnych do wytworzenia kolonii, a metabo-liczna plastycznoæ organizmów mo¿e prowadziæ do b³êdu w odczycie (34). Tak¿e ocena liczebnoci bak-terii probiotycznych za pomoc¹ dostêpnych mediów hodowlanych nie jest pozbawiona b³êdu. Najczêciej pomiary in vitro i in vivo liczebnoci oraz dzia³alnoci probiotyków skupiaj¹ siê g³ównie na gatunkach Lac-tobacillus i Bifidobacterium (2, 31). Dla pe³nej oceny konieczne jest jednak poszerzenie tego pola o inne gatunki, które równie¿ mog¹ mieæ wp³yw na efektyw-noæ dzia³ania bakterii probiotycznych (40).
Molekularne sposoby identyfikacji s¹ bardziej wia-rygodne i mog¹ obejmowaæ pe³n¹ ró¿norodnoæ mi-kroflory (34), np. w oparciu o czêciow¹ analizê sek-wencji genu kinazy pirogronianowej (43) oraz z wy-korzystaniem technik PCR, takich jak: 16S rRNA, ITS i recA (7, 30), a tak¿e TGGE (temperature gradient gel electrophoresis) oraz DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis). Jedn¹ z najlepszych i najbardziej rozpowszechnionych (6, 23, 28, 33, 36) metod jest fluorescent in situ hybridization (FISH). Metoda FISH pozwala na uzyskanie informacji o pojedynczych ko-mórkach w próbkach ka³u, dziêki zastosowaniu wra¿-liwych na fluorescencjê sond, które hybrydyzuj¹ bez-porednio do komórek osadzonych na szkie³ku pod-stawowym (30, 41, 42). Szacuje siê, i¿ FISH daje mo¿-liwoæ wskazania oko³o dziesiêciokrotnie wy¿szej licz-by bakterii w próbach ka³u ni¿ tradycyjne techniki hodowlane (30), jednak jednoczesne zastosowanie co najmniej dwóch sond pozwala prawid³owo zidentyfi-kowaæ mikroorganizmy, gdy¿ sygna³ nadawany przez obie sondy potwierdza obecnoæ poszukiwanych sek-wencji charakterystycznych dla danego gatunku. Po-nadto do wad trzeba zaliczyæ czasoch³onnoæ proce-dury oraz dostêpnoæ sond, które s¹ ograniczone dla znanych bakterii (34).
Techniki TGGE oraz DGGE pozwalaj¹ na szybk¹ i dok³adn¹ ocenê mikroflory jelit zmieniaj¹c¹ siê w czasie, w oparciu o powielone fragmenty 16S rRNA bakterii (3). Elektroforetyczny rozdzia³ powielonych w reakcji PCR fragmentów DNA nastêpuje na skutek ró¿nic w chemicznej b¹d te¿ termicznej stabilnoci genów (46). TGGE i DGGE umo¿liwiaj¹ wykrycie nowych szczepów przewodu pokarmowego (30), za-równo tych tworz¹cych, jak i nie tworz¹cych kolonie. Metody TGGE i DGGE pozwalaj¹ na analizê bardziej jakociow¹ ni¿ ilociow¹ (34).
Modele symuluj¹ce uk³ad pokarmowy
Pe³ne odtworzenie swoistego mikroklimatu jelita grubego w warunkach laboratoryjnych na dzieñ dzi-siejszy nie jest, niestety, mo¿liwe, jednak¿e opraco-wanych zosta³o wiele metod naladuj¹cych naturalne warunki wystêpowania drobnoustrojów przewodu pokarmowego. Jednym z pierwszych takich systemów jest hodowla mikroorganizmów probiotycznych na mediach hodowlanych. Czynniki, które musz¹ zostaæ spe³nione przy zak³adaniu hodowli Bifidobacterium i Lactobacillus to: dostêpnoæ sk³adników od¿ywczych i substancji wzrostowych, niski potencja³ oksydacyj-no-redukcyjny, sta³e pH (35). W przypadku oceny syn-biotyków po¿ywki zawieraj¹ dodatki presyn-biotyków, najczêciej w postaci fruktooligosacharydów lub in-nych wêglowodanów (47). Rozk³ad tych substancji ocenia siê poprzez wzrost bakterii probiotycznych i zmiany pH medium (4).
W ocenie w³aciwoci prebiotycznych substancji niezwykle cennym symulatorem okaza³y siê
fermen-tatory i prowadzone w nich fermentacje tych zwi¹z-ków z wykorzystaniem bakterii ka³owych. Dziêki takim systemom mo¿na oceniæ zawartoæ krótko³añ-cuchowych kwasów t³uszczowych i innych produktów koñcowych rozk³adu prebiotyków przez bakterie je-litowe. Produkcja kwasów w procesie fermentacji cukrów znacznie ró¿ni siê pomiêdzy gatunkami. Sta-tyczna hodowla na pod³o¿u p³ynnym jest obecnie naj-prostszym na rynku rodzajem fermentatora. Ten mo-del symuluj¹cy fermentacjê w jelicie grubym zosta³ wykorzystany w wielu badaniach (28, 29, 36). Typo-wy mechanizm sk³ada siê z zespo³ów szklanych na-czyñ (z p³aszczem wodnym lub bez), g³ównej jednostki kontroluj¹cej, mieszaczy, kontrolerów temperatury oraz pH.
Fermentatory umo¿liwiaj¹ badanie substancji nawet w niewielkich stê¿eniach (29), s¹ szybkie, mog¹ byæ prowadzone równoczenie w kilku zestawach, przez co daj¹ mo¿liwoæ szybkiej oceny porównawczej (13, 36), s¹ jednak systemami zamkniêtymi z ograniczon¹ iloci¹ substratu, co ogranicza ich zastosowanie do któtkoterminowych eksperymentów (13). Nie uwz-glêdniaj¹ równie¿ takich niebagatelnych czynników, jak ruchy perystaltyczne oraz procesy zachodz¹ce w komórkach uk³adu pokarmowego.
Bardziej z³o¿onym mechanizmem s³u¿¹cymi do pomiaru zdolnoci synbiotycznych pre- i probiotyków s¹ chemostaty i prowadzone w nich ci¹g³e systemy hodowli. Systemy te wykorzystuj¹ nawet kilkanacie po³¹czonych ze sob¹ naczyñ (24), z których ka¿de re-prezentuje inn¹ czêæ przewodu pokarmowego, a ca³y system jest sterowany komputerowo. Jednoetapowy model zosta³ u¿yty przez Gibsona i Wanga (14) i by³ na-zywany chemostatem dyfuzyjnym. Sk³ada³ siê z dwóch po³¹czonych ze sob¹ komór oddzielonych specyficzn¹ membran¹, umo¿liwiaj¹c¹ wymianê substancji (wzro-stowych, metabolitów) pomiêdzy nimi, membrana ta nie by³a jednak przepuszczalna dla samych komórek. Bardziej z³o¿one modele wieloetapowe uwzglêd-niaj¹ o wiele wiêcej warunków fizykochemicznych, na jakie natrafia przesuwaj¹ca siê treæ w uk³adzie po-karmowym. Dlatego te¿ zosta³y nazwane gut models, gdy¿ w sposób bardziej precyzyjny odzwierciedlaj¹ ró¿ne warunki panuj¹ce w jelitach ¿ywego organizmu (tab. 1).
Bakterie probiotyczne maj¹ zdolnoæ blokowania kolonizacji bakterii patogennych i adhezji do nab³on-ka jelit. Najbardziej efektywn¹, powtarzaln¹ oraz czu³¹ metod¹ in vitro pomiaru zdolnoci adhezyjnych bakterii niekorzystnych dla zdrowia jest znakowanie radioaktywne. Równie¿ znakowanie fluorescencyjne jest metod¹ szybk¹ i powtarzaln¹, lecz jego czu³oæ dla s³abo przylegaj¹cych bakterii jest zbyt niska (44). Hodowle tkankowe najbardziej przypominaj¹ce rze-czywiste warunki jelita grubego, s³u¿¹ce do oceny przyczepnoci bakterii to Caco-2 oraz HT-29-MTX (37). Model jednowarstwowej hodowli Caco-2 z
do-datkiem mucyny najbardziej precyzyjnie oddaje cha-rakter nab³onka in vivo (20). Wykorzystuj¹c proste modele naladuj¹ce powierzchnie zêbowe, uda³o siê wykazaæ zdolnoci adhezyjne mikroorganizmów z pro-duktów mlecznych, przyczyniaj¹cych siê do redukcji próchnicy zêbów (8). Niestety, prowadzenie takich modeli jest bardzo drogie, czasoch³onne i nie bierze pod uwagê wszystkich czynników wystêpuj¹cych na-turalnie.
Modele in vitro symulacji przewodu pokarmowego stanowi¹ nieograniczon¹ prawami etyki mo¿liwoæ sprawdzenia zarówno nowych, jak i ju¿ dostêpnych w u¿yciu substancji prebiotycznych oraz ich powi¹-zania z probiotyczn¹ mikroflor¹ jelit. Obecnie istnie-j¹ce modele nie zastêpuj¹ jednak w stu procentach organizmu ¿ywego, dlatego kontynuuje siê badania w kierunku usprawnienia istniej¹cych modeli lub stwo-rzenia nowych.
Ocena in vivo substancji bioaktywnych Wed³ug kryteriów WHO (38), chc¹c dokonaæ reje-stracji danej substancji probiotycznej nale¿y wykonaæ szereg badañ, sporód nich wa¿n¹ rolê odgrywaj¹ te-sty in vivo wykonane na modelu zwierzêcym. W oce-nie in vivo uwzglêdnia siê takie parametry, jak: kon-dycja, objawy, dobrostan, zmniejszone ryzyko zacho-rowania, d³u¿szy czas remisji, szybsze wyzdrowienie po chorobie. W procedurze klinicznej wyró¿nia siê trzy etapy: faza 1 ocena bezpieczeñstwa probiotyku, faza 2 ocena skutecznoci danego szczepu i ewentu-alnych dzia³añ niepo¿¹danych, badanie z randomi-zacj¹ i podwójn¹ lep¹ prób¹, kontrolowane placebo, faza 3 ocena skutecznoci probiotyku w porówna-niu ze standardowym leczeniem.
Skutecznoæ dzia³ania substancji bioaktywnych in vivo analizuje siê na podstawie parametrów fizjolo-gicznych i immunolofizjolo-gicznych organizmu. Ocenie pod-legaj¹ wskaniki biochemiczne krwi, stê¿enie hor-monów oraz immunoglobulin w osoczu krwi, a tak¿e aktywnoæ enzymów trzustkowych. Ponadto, w zale¿-noci od gatunku zwierzêcia, sposobu podania sub-stancji oraz dawki, pod uwagê nale¿y wzi¹æ prze¿y-walnoæ, masê cia³a, dzienne przyrosty oraz wska-niki: wykorzystania paszy (FCR) oraz europejski wskanik wydajnoci (EWW). Do analiz pobierane s¹ równie¿ próbki ka³u w celu oceny profilu bakteryjne-go. Ocenie podlegaj¹ równie¿ narz¹dy wewnêtrzne (ledziona, grasica), ich stosunek do masy cia³a zwie-rzêcia. Szczególnie istotna jest ocena morfologii na-b³onka jelitowego, w tym: wysokoci kosmków jeli-towych, powierzchni i g³êbokoci krypt jelijeli-towych, gruboci warstwy podluzowej, liczby komórek kubkowych oraz poziomu skolonizowania i adhezji bakterii probiotycznych. Adhezjê mikroorganizmów probiotycznych mo¿na badaæ in vivo, wykonuj¹c biopsjê nab³onka po stymulacji dawcy suplementami, metoda ta jest jednak czasoch³onna, ograniczona do liczby osobników oraz ma³o precyzyjna ze wzglêdu na du¿¹ utratê bakterii podczas opró¿niania jelita w celu wykonania kolonoskopi (37).
Kosztowne oraz ograniczone prawami etyki bada-nia in vivo poprzedzaj¹ zazwyczaj eksperymenty nie wykorzystuj¹ce modeli zwierzêcych. Mog¹ one byæ tworzone w celu eliminacji substancji bioaktywnych, które wcale lub w bardzo niskim stopniu stymuluj¹ wybrane funkcje organizmu ¿ywego, oraz w celu se-lekcji substancji o najbardziej po¿¹danym dzia³aniu. Grupa preparatów, które pomylnie przesz³y selekcjê
Tab. 1. Charakterystyka wybranych modeli symuluj¹cych uk³ad pokarmowy
l e d o M Charakterystyka Autor m e t s y s y ³ g ¹ i c y w o p a t e y z r T il w o d o h y t a g o b ,i k n u r a w e n a w k ( o g e b u r g a ti l e j æ ê z c a n l a m y s k o r p : a i n y z c a n u g e r e z s w e n o i w a t s u , e n o z c ¹ ³ o p 3 _wsubstancjeod¿ywczewêglowodany,szybkipasa¿,)okrê¿nicapoprzecznaorazczêædystalna(obojêtne _warunk,iubogiwwêglowodany,wolnypasa¿;) ; m u i d e m e i n a z c r a t s o d e n a w r e z r p e i n k o ³ w z h c i k z d u l z e c ¹ z d o h c o p i k b ó r p z e z r p y n o z r o w t d o i c e rt d a ³ k s 1 2 n a m u H d e t a l u m i S ( E M I H S l a i b o r c i M l a n it s e t n I )r o t c a e r m e t s y s o c E ; e b u r g o ti l e j e n p ê t s a n y z rt ; e i k n e i c o ti l e j ¹ j u l u m y s e z s w r e i p a w d : ñ y z c a n h c y n w ó ³ g 5 ; m e t n e m y r e p s k e d e z r p e i n d o g y t 2 a n y n a i m a h c u r u ; y ³ g ¹ i c b ó s o p s w e i n t a t s o e i w d ; y ³ g ¹ i c ³ ó p b ó s o p s w æ e rt w e n a w y rt a p o a z ¹ s y r o m o k y z rt e z s w r e i p ( e n z c y ti l o r a h c a s e ir e t k a b w a t a g o b a n l a m y s k o r p æ ê z c Bacteroides;Eubacteirum;)czêædystalna _wzbogaconawbakteirerozk³adaj¹cemucynê 5 2 r o t a l u m i S n o l o c x i M o r e t n E 4prgze³ópw³ynwegnaazcózwyniiaci(eocdzyczreêgcuilopwroaknsyymprazlenzemjdaogndeystytcazlnneejz;)aworyprzyu¿yciukomputera; y ³ g ¹ i c ³ ó p b ó s o p s w iz d o h c a z i c e rt tr o p s n a rt 22 y c i n ¿ ê r k o l e d o m y w o p a t e y z r T o rt i v n i ; m e n d m i k s a ³ p z y r o t k a e r o i b e n a l k z s 3 ; a ti l e j æ ê z c ¹ n l a t s y d z a r o ¹ n z c e z r p o p , ¹ n l a m y s k o r p ¹ j u l u m y s a i n y z c a n _zawieraka³ow¹mikrolforêniemowl¹tunieruchomion¹napoilsacharydowych¿elowychkulkach; h c y w o n i s e i w a z il w o d o h h c y w o k r ó m o k o n l o w ¹ i c o n li b a t s e z y m e l b o r p æ i p ¹ t s y w ¹ g o m 6 )l e d o M l a n it s e t n I O N T ( M I T ; e i k n e i c o ti l e j i k e d ¹ ³ o ¿ e j u l u m y s ) ñ y z c a n h c y n a l k z s h c y n o z c ¹ ³ o p 8 ( a z s w r e i p :i c ê z c e i w d _druga (4po³¹czoneszklanenaczynia)symulujejeltiogrube; a i n e i n i c u i n a w o s o t s a z i e i n a i c j e n z c y t s a l e i k ê iz d h c y n z c y tl a t s y r e p w ó h c u r e i n e z d a w o r p w a i w il ¿ o m u _wodnegociskaniekonrtolujekompute;r y n a r b m e m e n a w o zi l a i d z e z r p w ó ti l o b a t e m i y d o w a j c p r o s b a a ³ a t s m e t s y s y n d a ³ k o d o z d r a b 4 2
in vitro, mo¿e byæ dalej oceniana i brakowana na zwierzêtach (4, 17). Wykazano miêdzy innymi, i¿ prawid³owo dobrane substancje pro- i prebiotyczne w warunkach testów na mediach hodowlanych po-twierdzaj¹ swoje synbiotyczne w³aciwoci in vivo (4). Efektywn¹ i stosunkow¹ now¹ metod¹ dostarcza-nia substancji bioaktywnych in vivo jest ich iniekcja do komory powietrznej inkubowanego jaja (45). Wy-korzystanie modelu zarodka kury pozwala prowadziæ selekcjê substancji bioaktywnych w oparciu o ocenê mikroflory jelitowej oraz wybranych parametrów me-tabolicznych lub/oraz ocenê systemu immunologicz-nego (1, 2, 31). Zaletami stosowania metody in ovo s¹: obni¿enie kosztów robocizny, precyzja zabiegu, eliminacja niekorzystnie wp³ywaj¹cych na wylêgowoæ czynników, stymulacja rozwoju embrionalnego, nale-¿y jednak wzi¹æ pod uwagê dawkê, rodzaj substancji oraz miejsce podania szczepionki, a tak¿e wiek za-rodka (31).
Podsumowanie
Niezbêdnym narzêdziem do walidacji substancji bioaktywnych s¹ kompleksowe badania ³¹cz¹ce me-tody in vitro oraz in vivo. Stanowi¹ one grupê precy-zyjnych testów, które nie ograniczaj¹ siê tylko do oce-ny w³aciwoci danego szczepu bakterii, ale przede wszystkim umo¿liwiaj¹ ocenê bezpieczeñstwa jego stosowania. Czêsto zdarza siê tak, i¿ dopiero w testach in vivo wychodz¹ na jaw negatywne skutki nie w pe³ni przebadanych in vitro substancji bioaktywnych. Ko-nieczne jest zatem poszerzenie tych dowiadczeñ o mo-dele zwierzêce lub udoskonalenie istniej¹cych metod in vitro, aby precyzyjnie oddawa³y z³o¿onoæ natural-nych procesów maj¹cych miejsce w ¿ywym organizmie. Dopiero w³aciwie przebadane zarówno pod k¹tem in vitro, jak i in vivo szczepy bakterii probiotycznych oraz prebiotyczne substraty ich metabolizmu mog¹ skutko-waæ znacznym wzmo¿eniem odpowiedzi immunolo-gicznej i antynowotworowej, redukcj¹ chorób przewo-du pokarmowego, spadkiem stê¿enia cholesterolu we krwi, lepszym wykorzystaniem paszy oraz lepszymi przyrostami. Konieczna jest wiêc dalsza selekcja sub-stancji bioaktywnych w oparciu o kompleksowe ba-dania in vitro i in vivo, gdy¿ tylko one w pe³ni obrazu-j¹ rzeczywist¹ skutecznoæ dzia³ania tych preparatów.
Pimiennictwo
1.Bednarczyk M., Brzeziñska J., S³awiñska A., Siwek M., Ubranowski M., Kasperczyk K.: Technologia in ovo narzêdziem w nowoczesnej profilak-tyce drobiu. Biotechnol. 2010, 1, 109-118.
2.Bednarczyk M., Urbanowski M., Gulewicz P., Kasperczyk K., Maiorano G., Szwaczkowski T.: Field and in vitro study on prebiotic effect of raffinose family oligosaccharides. Biull. Vet. Instit. Pulawy 2011, 55, 465-469. 3.Bello F. D., Walter J., Hertel C., Hammes W. P.: In vitro study of Prebiotic
Properties of Levan-type Exopolysaccharides from Lactobacilli and Non--digestible Carbohydrates Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. System. Appl. Microbiol. 2001, 24, 232-237.
4.Bielecka M., Biedrzycka E., Majkowska A.: Selection of probiotics and pre-biotics for synpre-biotics and confirmation of their in vivo effectiveness. Food Research Int. 2002, 35, 125-131.
5.Charteris W., Kelly P. M., Morelli L., Collins J. K.: Ingredient selection crite-ria for probiotic microorganisms in functional dairy foods. Int. J. Dairy Tech. 1998, 51, 123-136.
6.Cinquin C., Le Blay G., Fliss I., Lacroix C.: New three-stage in vitro model for infant colonic fermentation with immobilized fecal microbiota. FEMS Microbiol. Ecol. 2006, 57, 324-336.
7.Collado M. C., Meriluoto J., Salminen S.: In vitro analysis of probiotic strain combinations to inhibit pathogen adhesion to human intestinal mucus. Food Research Int. 2007, 40, 629-636.
8.Comelli E. M., Guggenheim B., Stingele F., Neeser J. R.: Selection of dairy bacterial strains as probiotics for oral health. Eur. J. Oral. Sci. 2002, 110, 218-224.
9.Drouault-Holowacz S., Foligne B., Dennin V., Goudercourt D., Terpend K., Burckel A., Pot B.: Anti-inflammatory potential of the probiotic dietary sup-plement Lactibiane Tolérance: In vitro and in vivo considerations. Clin. Nutr. 2006, 25, 994-1003.
10.Dunne C., OMahony L., Murphy L., Thornton G., Morrissey D., OHal-loran S., Feeney M., Flynn S., Fitzgerald G., Daly C., Kiely B., OSullivan G. C., Shanahan F., Collins J. K.: In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73, 386-392.
11.Ewaschuk J. B., Walker J. W., Diaz H., Madsen K. L.: Bioproduction of con-jugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice. J. Nutr. 2006, 136, 1483-1487.
12.Frece J., Kos B., Beganoviæ J., Vukoviæ S., ukoviæ J.: In vivo testing of functional properties of three selected probiotic strains. World J. Microbiol. & Biotech. 2005, 21, 1401-1408.
13.Gibson G. R., Fuller R.: Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use. J. Nutr. 2000, 130, 391-395.
14.Gibson G. R., Wang X.: Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria. J. Appl. Bacteriol. 1994, 77, 412-420.
15.Gomez-Gil B., Roque A., Turnbull J. F.: The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms. Aquacult. 2000, 191, 259-270.
16.He F., Ouwehand A. C., Isolauri E., Hashimoto H., Benno Y., Salminen S.: Comparison of mucosal adhesion and species identification of bifidobacteria isolated from healthy and allergic infants. FEMS Immunol. Medical Micro-biol. 2001, 30, 43-47.
17.Jacobsen N. C., Rosenfeldt Nielsen V., Hayford A. E., Møller P. L., Michael-sen K. F., Pærregaard A., Sandström B., Tvede M., JakobMichael-sen M.: Screening of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp. by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans. Appl. and Environmental Microbiol. 1999, 65, 4949-4956. 18.Koenen M. E., Hulst R. van der., Leering M., Jeurissen S. H. M., Boersma
W. J. A.: Development and validation of a new in vitro assay for selection of probiotic bacteria that express immune-stimulating properties in chickens in vivo. FEMS Immunol. Medical Microbiol. 2004, 40, 119-127.
19.Kos B., ukoviæ J., Beganoviæ J., Gjuraèiæ K., Frece J., Iannaccone C., Canganella F.: Characterization of the three selected probiotic strains for the application in food industry. World J Microbiol Biotechnol. 2008, 24, 699--707.
20.Laparra J. M., Sanz Y.: Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiol. 2009, 49, 695-701.
21.Macfarlane G. T., Macfarlane S., Gibson G. R.: Validation of a Three-Stage Compound Continuous Culture System for Investigating the Effect of Reten-tion Time on the Ecology and Metabolism of Bacteria in the Human Colon. Microb. Ecol. 1998, 35, 180-187.
22.Mäkivuokko H. A., Saarinen M. T., Ouwehand A. C., Rautonen N. E.: Effects of lactose on colon microbial community structure and function in a four--stage semi-continuous culture system. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70, 2056-2063.
23.Mandalari G., Faulks R. M., Bisignano C., Waldron K. W., Narbad A., Wickham M. S. J.: In vitro evaluation of the prebiotic properties ofalmond skins (Amygdalus communis L.). FEMS Microbiol. Lett. 2010, 304, 116-122. 24.Minekus M., Smeets-Peeters M., Bernalier A., Marol-Bonnin S., Havenaar R., Marteau P., Alric M., Fonty G., Huis int Veld J. H. J.: A computer-control-led system to simulate conditions of the large intestine with peristaltic mixing, water absorption and absorption of fermentation products. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 53, 108-114.
25.Molly K., Woestyne M. V., Verstraete W.: Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosys-tem. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993, 39, 254-258.
26.Morelli L.: In vitro selection of probiotic Lactobacilli: A critical appraisal. Curr. Issues Intest. Microbiol. 2000, 1, 59-67.
27.Nilsson U., Öste R., Jägerstad M., Birkhed D.: Cereal fructans: in vitro and in vivo studies on availability in rats and humans. J. Nutr. 1988, 118, 1325--1330.
28.Ogué-Bon E., Khoo C., McCartney A. L., Gibson G. R., Rastall R. A.: Invitro effects of synbiotic fermentation on the canine faecal microbiota. FEMS Microbiol Ecol. 2010, 73, 587-600.
29.Olano-Martin E., Mountzouris K. C., Gibson G. R., Rastall R. A.: In vitro fermentability of dextran, oligodextran and maltodextrin by human gut bac-teria. British J. Nutr. 2000, 83, 247-255.
30.OSullivan D. J.: Methods for analysis of the intestinal microflora. Curr. Issues Intest. Microbiol. 2000, 1, 39-50.
31.Pilarski R., Bednarczyk M., Lisowski M., Rutkowski A., Bernacki Z., Gule-wicz K.: Prebiotic activity of á-galactosides injected during embryogenesis on selected chicken traits. Folia biol. 2005, 53, 13-20.
32.Poljak Z.: Zoonotic diseases from pigs. Proc. London Swine Confer. 2009, 95-103.
33.Pompei A., Cordisco L., Raimondi S., Amaretti A., Pagnoni U. M., Mat-teuzzi D., Rossi M.: In vitro comparison of the prebiotic effects of two inulin--type fructans. Anaerobe. 2008, 14, 280-286.
34.Roberfroid M.: Prebiotics: the concept revisited. J. Nutr. 2007, 137, 830--837.
35.Roy D.: Media for the isolation and enumeration of bifidobacteria in dairy products. Int. J. Food Microbiol. 2001, 69, 167-182.
36.Rycroft C. E., Jones M. R., Gibson G. R., Rastall R. A.: A comparative in vitro evaluation of the fermentation properties of prebiotic oligosaccharides. J. Appl. Microbiol. 2001, 91, 878-887.
37.Saarela M., Mogensen G., Fondén R., Mättö J., Mattila-Sandholm T.: Pro-biotic bacteria: safety, functional and technological properties. J. Biotech. 2000, 84, 197-215.
38.Schmidt M., Olejnik-Schmidt A.: Metody selekcji mikroorganizmów o w³a-ciwociach prbiotycznych. Technika-Technologia 2010, 64, 40-44. 39.Shortt C.: The probiotic century: historical and current perspectives. Trends
in Food Sci. & Technol. 1999, 10, 411-417.
40.Strompfová V., Lauková A., Ouwehand A. C.: Selection of enterococci for potential canine probiotic additives. Vet. Microbiol. 2004, 100, 107-114. 41.Tuohy K. M., Finlay R. K., Wynne A. G., Gibson G. R.: A human volunteer
study on the prebiotic effects of HP-inulin - faecal bacteria enumerated using fluorescent in situ hybridisation (FISH). Anaerobe. 2001, 7, 113-118. 42.Tzortzis G., Goulas A. K., Gee J. M., Gibson G. R.: A novel
galactooligo-saccharide mixture increases the bifidobacterial population numbers in a con-tinuous in vitro fermentation system and in the proximal colonic contents of pigs in vivo. J. Nutr. 2005, 135, 1726-1731.
43.Vaugien L., Prevots F., Roques C.: Bifidobacteria identification based on 16S rRNA and pyruvate kinase partial gene sequence analysis. Anaerobe. 2002, 8, 341-344.
44.Vesterlund S., Paltta J., Karp M., Ouwehand A. C.: Measurement of bacte-rial adhesion-in vitro evaluation of different methods. J. Microbiol. Meth. 2005, 60, 225-233.
45.Villaluenga C. M., Wardeñska M., Pilarski R., Bednarczyk M., Gulewicz K.: Utilization of chicken embryo model for assessment of biological activity of different oligosaccharides. Folia biol. 2004, 52, 135-142.
46.Walter J., Tannock G. W., Tilsala-Timisjarvi A., Rodtong S., Loach D. M., Munro K., Alatossava T.: Detection and identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, 297-303. 47.Zhang F., Hang X., Fan X., Li G., Yang H.: Selection and optimization
proce-dure of synbiotic for cholesterol removal. Anaerobe. 2007, 13, 185-192. Adres autora: mgr in¿. Izabela Koz³owska, ul. Mazowiecka 28, 85-084 Bydgoszcz; e-mail: izabela.kozlowska@utp.edu.pl
