Artyku³ przegl¹dowy Review
Babeszjoza/piroplazmoza jest transmisyjn¹ chorob¹ ludzi i zwierz¹t przenoszon¹ przez kleszcze. Jej czyn-nikiem etiologicznym s¹ wewn¹trzerytrocytarne pier-wotniaki nale¿¹ce do rodzaju Babesia, rodziny Babe-sidae, rzêdu Piroplasmida, typu Apicomplexa. Obok Babesia, w obrêbie rzêdu Piroplasmida, wyró¿nia siê tak¿e rodzaje Theileria oraz Cytauxozoon, których przedstawiciele wywo³ywaæ mog¹ u zwierz¹t choro-by podobne w przebiegu do babeszjozy. Wektorami piroplazm, w zale¿noci od gatunku gospodarza oraz szerokoci geograficznej, s¹ ró¿ne gatunki kleszczy. Nazwa piroplazmoza zwi¹zana jest z morfologi¹ pierwotniaków, które po podzia³ach komórki zacho-dz¹cych w obrêbie erytrocytów przyjmuj¹ kszta³t gruszkowaty (pear shaped). Stara nazwa Piroplasma jest ci¹gle w u¿yciu, a mianem piroplazmozy okrela siê zarówno babeszjozê, jak i tejlerozê (1, 3, 33).
Obecnie babeszjozy ludzi i zwierz¹t stwierdzane s¹ na ca³ym wiecie. W obrêbie rodzaju Babesia wyró¿-nia siê ponad 100 gatunków pierwotwyró¿-niaków. Inwazje tych paso¿ytów z najwiêksz¹ czêstotliwoci¹ stwier-dzane s¹ u byd³a oraz psów (2, 17).
Standardowa diagnostyka babeszjozy opiera siê na danych z wywiadu (kontakt chorych osobników z kleszczami), objawach klinicznych (gor¹czka,
ane-mia, ¿ó³taczka, hemoglobinuria) oraz na mikrosko-powej ocenie barwionych metodami Giemzy (7, 29), Romanowskiego (10) lub Diff-Quick (31) rozmazów krwi zwierz¹t chorych.
Mikroskopowe badanie rozmazów krwi stanowi sto-sunkowo szybk¹ metodê diagnozowania babeszjozy, niemniej jednak jego wynik uzale¿niony jest, z jednej strony, od intensywnoci inwazji, z drugiej za, od do-k³adnoci i dowiadczenia osoby oceniaj¹cej preparat. Zdarza siê bowiem, ¿e przy niskiej, niejednokrotnie okresowej parazytemii bardzo trudno jest wykazaæ obecnoæ pierwotniaków. Ponadto czêsto nie maj¹ one typowego kszta³tu, za erytrocyty chorych osobników ulegaj¹ wakuolizacji, co dodatkowo utrudnia rozpoz-nanie zara¿enia (8, 11, 22). Z tego te¿ wzglêdu istnieje koniecznoæ równoleg³ego u¿ycia w diagnostyce ba-beszjozy innych technik badawczych (12).
Coraz czêciej w rozpoznawaniu babeszjozy oraz w ocenie sytuacji epizootycznej, w tym w wykrywaniu zara¿eñ subklinicznych tymi pierwotniakami (21, 30), wykorzystywane s¹ metody biologii molekularnej, a przede wszystkim ³añcuchowa reakcja polimerazy. Druga reakcja PCR, tzw. nested PCR, jest niezwykle czu³a i pozwala na wykazanie obecnoci materia³u genetycznego Babesia ju¿ przy parazytemii
wynosz¹-Przydatnoæ techniki LAMP
w szybkim rozpoznawaniu babeszjozy u zwierz¹t
£UKASZ ADASZEK, MARTA JANKOWSKA*,DAGMARA WY£UPEK**, STANIS£AW WINIARCZYK
Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin *Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ¯ywnoci, Wydzia³ Nauk o ¯ywnoci i ¯ywieniu UP,
ul. Wojska Polskiego 48, 60-627 Poznañ
**Katedra i Klinika Chorób Wewnêtrznych Zwierz¹t, Zak³ad Chorób Wewnêtrznych Zwierz¹t Towarzysz¹cych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
Adaszek £., Jankowska M., Wy³upek D., Winiarczyk S. Usefulness of LAMP in the fast diagnosis of babesiosis in animals
Summary
Nucleic acid-based methods offer a variety of tools for the detection of parasites. This field of veterinary and medical sciences is rapidly evolving. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel nucleic acid method whereby DNA is amplified with high specificity, efficiency, and rapidity under isothermal conditions using a set of four specifically designed primers. In this paper we present the usefulness of LAMP method in the diagnosis of babesiosis in various animal species. Babesia species-specific LAMP assay may have potential clinical application in the detection and differentiation of Babesia species, particularly in countries in which babesiosis is endemic. It can be assumed that in the near future this technique will be a routinely used diagnostic test in veterinary practices.
cej zaledwie 0,0001% (6). Dodatkowo okrelanie sek-wencji uzyskanych amplikonów dostarcza cennych informacji do analizy epidemiologicznej i taksonomii. Metody oparte na reakcji amplifikacji, zarówno kla-syczny PCR, jak i PCR w czasie rzeczywistym, po-mimo i¿ pozwalaj¹ na specyficzne wykrywanie pier-wotniaków we krwi, maj¹ równie¿ istotne wady. Przede wszystkim wymagaj¹ u¿ycia kosztownego sprzêtu umo¿liwiaj¹cego prowadzenie reakcji: termocyklera sprzê¿onego z urz¹dzeniem pozwalaj¹cym na pomiar fluorescencji oraz komputera z odpowiednim oprogra-mowaniem, dlatego na tego typu badania mog¹ sobie pozwoliæ tylko zaawansowane laboratoria, posiada-j¹ce odpowiednie zaplecze finansowe i wykwalifiko-wany personel (28). Tak wiêc pomimo udowodnionej skutecznoci metod genotypowych opartych na reak-cji amplifikareak-cji nie s¹ one powszechnie stosowane w klinikach weterynaryjnych.
W ostatnim czasie w szybkiej diagnostyce babesz-jozy wykorzystywana jest, opracowana w 2000 r. przez zespó³ naukowców japoñskiego koncernu Eiken Che-mical CO, LTD, metoda LAMP (loop-mediated iso-thermal amplification). Jest to technika umo¿liwiaj¹-ca przeprowadzenie amplifikacji DNA pierwotniaków w warunkach izotermicznych, w krótkim czasie, bez koniecznoci posiadania termocyklera oraz uzyskanie szybkiego i, co istotne, wiarygodnego wyniku bada-nia (9, 27).
Istota LAMP
Reakcja LAMP polega na amplifikacji okrelonych odcinków DNA przy wykorzystaniu polimeraz: Bst,
Bcm lub GspSSD® posiadaj¹cych aktywnoæ syntezy
oraz wymiany nici (strand displacement), co eliminuje koniecznoæ stosowania cyklu denaturacji matrycy (26, 27). W reakcji stosuje siê dwie lub trzy pary starterów komplementarnych odpowiednio do szeciu i omiu miejsc amplifikowanej sekwencji genu: parê starterów wewnêtrznych, FIP (Forward Inner Primer) oraz BIP (Backward Inner Primer), których sekwencje s¹ kom-plementarne do dwóch ró¿nych miejsc w sekwencji matrycy zarówno na nici sensownej, jak i antysensow-nej oraz parê starterów zewnêtrznych F3 (Forward) i B3 (Backward), które komplementarne s¹ do wnêtrznych koñców matrycy (ryc. 1). Startery ze-wnêtrzne s¹ krótsze od starterów wewnêtrznych, a tak¿e ich koñcowe stê¿enie w reakcji jest mniejsze, co powoduje, ¿e wolniej hybrydyzuj¹ do matrycy, inicjuj¹c reakcjê zastêpowania nici (13, 24, 27, 28). Udowodniono, ¿e dla uzyskania w krótszym czasie bardziej specyficznego produktu reakcji mo¿na zasto-sowaæ parê starterów LoopF i LoopR (26).
Odpowiednie zaprojektowanie starterów do reakcji jest istotnym etapem poprawnego przeprowadzenia reakcji LAMP. Obecnie dostêpne s¹ dwa narzêdzia bioinformatyczne przeznaczone do tego celu: Primer-Explorer V4 darmowe oprogramowanie dostêpne na stronie internetowej Eiken Chemical Company oraz
LAMP Designer p³atne oprogramowanie dostarcza-ne przez OptiGedostarcza-ne Limited, uruchamiadostarcza-ne z komputera. W sk³ad typowej mieszaniny reakcyjnej o objêtoci 25 µl wchodz¹: bufor utrzymuj¹cy odpowiednie pH i stê¿enie jonów magnezu (4-8 mM), 1 M Betanina, 1,6 mM trifosforanów nukleotydów, 0,8 µM starterów FIP i BIP, 0,2 µM starterów F3 i B3 oraz 8 U polime-razy DNA i matryca zawieraj¹ca powielan¹ sekwen-cjê (27, 28).
W przebiegu reakcji LAMP mo¿na wyró¿niæ dwa zasadnicze etapy: tworzenie struktury starterowej oraz cykliczn¹ amplifikacjê i elongacjê. Pierwszy etap roz-poczyna siê, gdy obecne w roztworze dsDNA osi¹gnie stan równowagi dynamicznej (65°C) wówczas pierw-szy ze starterów wewnêtrznych mo¿e przy³¹czyæ siê do komplementarnej sekwencji matrycy, inicjuj¹c syn-tezê nowej nici DNA 5-> 3. Nastêpnie hybrydyzuje starter zewnêtrzny F3 do matrycy i rozpoczyna siê jego wyd³u¿enie z jednoczesn¹ dysocjacj¹ wczeniej po-wsta³ej nici i utworzeniem na jej 5koñcu struktury typu ³odyga-pêtla. Od³¹czona niæ jest teraz matryc¹ dla kolejnych z pary starterów wewnêtrznych BIP i ze-wnêtrznych B3. Po kolejnych etapach hybrydyzacji starterów i dysocjacji nici powstaje ssDNA o struk-turze przypominaj¹cej hantle (dumbbell-like DNA) (ryc. 2). Tak powsta³a struktura stanowi matrycê dla kolejnego etapu reakcji cyklicznej amplifikacji, w czasie której ma miejsce hybrydyzacja starterów we-wnêtrznych, elongacja i uwalnianie nici. Ka¿da z uwol-nionych nici staje siê matryc¹ do kolejnych
amplifi-Ryc. 1. Schemat po³o¿enia starterów na matrycy. Startery zewnêtrzne F3 i B3, startery zewnêtrzne FIP i BIP sk³adaj¹ce siê, odpowiednio, z odcinków F1c, F2 oraz B1c, B2 matrycy Opracowano na podstawie http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/ index.html
Ryc. 2. Struktura starterowa, przypominaj¹ca hantle (dumb-bell-like DNA), powsta³a po pierwszym etapie reakcji LAMP Opracowano na podstawie http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/ index.html
kacji. W rezultacie powstaj¹ ró¿nej d³ugoci produkty o strukturze podobnej do kalafio-ra (cauliflower-like structure), sk³adaj¹ce siê z na przemian odwróconych powtórzeñ sekwencji matrycowej (ryc. 3). Reakcja przebiega w warunkach sta³ej temperatury, najczêciej w zakresie 60-65°C i pozwala uzyskaæ do 109 kopii DNA w czasie
krót-szym ni¿ 60 minut (27, 28, 32).
Produkty LAMP mo¿na wizualizowaæ ró¿nymi technikami. Powstaj¹cy w trakcie reakcji pirofosforan magnezu pozwala na ocenê wyniku LAMP w wietle widzialnym poprzez analizê zmêtnienia próbki. Zmêt-nienie w probówce jest widoczne, kiedy stê¿enie pirofosforanu magnezu przekracza 0,5 ppm, co odpowiada wytworzeniu 4 µg DNA w 25 µl mieszany reakcyjnej. W
re-akcji LAMP uzyskuje siê ok. 10 µg DNA/25 µl mie-szaniny. Dla porównania: w reakcji PCR otrzymuje siê ok. 0,2 µg DNA/25 µl, a stê¿enie pirofosforanu mag-nezu wynosi wówczas 0,02 mM, co nie pozwala na zaobserwowanie bia³ego osadu. Dodatkowo warunki termiczne (podgrzewanie) w reakcji PCR powoduj¹, ¿e jony pirofosforanowe s¹ hydrolizowane do jonów fosforanowych (23, 26, 28). Analiza fluorymetryczna mo¿liwa jest po zwi¹zaniu siê cz¹steczki fluorochro-mu (bromek etydyny, SYBR Green I, kalceina) z dwu-niciowym DNA. Zmianê koloru próby mo¿na obser-wowaæ zarówno w wietle widzialnym jak i w wietle UV. Podobnie jak w klasycznej reakcji PCR, produkty LAMP mo¿na rozdzielaæ w ¿elach agarozowych z t¹
ró¿nic¹, ¿e nie otrzymujemy pojedynczego pr¹¿ka tyl-ko produkt w postaci drabinki tzw. smearu (ryc. 4). Przy zastosowaniu odpowiedniego sprzêtu dedykowa-nego do reakcji LAMP w czasie rzeczywistym (Genie II), jak równie¿ termocyklerów do reakcji Real-time PCR mo¿liwe jest monitorowanie w czasie rzeczywi-stym powstaj¹cego produktu reakcji oraz jego analiza ilociowa (24, 27, 28).
Zastosowanie LAMP w diagnostyce babeszjoz u zwierz¹t
Po raz pierwszy w diagnostyce babeszjozy metodê LAMP wykorzystano w rozpoznawaniu inwazji Ba-besia gibsoni u psów w Japonii (18). Sporód przeba-danych t¹ technik¹ 1082 psów obecnoæ pierwotnia-ków wykryto w organizmie 52 osobnipierwotnia-ków. Jako ma-teria³u do badañ autorzy u¿yli pe³nej krwi, a nie wyizolo-wanego DNA, co znacznie skróci³o czas oczekiwania na wyniki. Wszystkie uzyskane produkty amplifikacji mo¿na by³o poddaæ sekwencjonowaniu, a uzyskane sekwencje genu 18S RNA Babesia gibsoni, by³y czy-telne i wykazywa³y wzajemn¹ 100% homologiê, jak i pe³ne podobieñstwo z ju¿ opublikowanymi sekwen-cjami tego genu. W przedstawionych badaniach czu-³oæ reakcji LAMP by³a podobna jak klasycznego PCR, a obie techniki umo¿liwia³y wykrycie DNA paso¿y-tów przy parazytemii wynosz¹cej zaledwie 0,0005%. Sporód 52 próbek krwi pozytywnych w klasycznym PCR oraz w metodzie LAMP obecnoæ pierwotnia-ków B. gibsoni badaniem mikroskopowym potwier-dzono jedynie w 28, co przemawia za tym, i¿ obie tech-niki cechuje wy¿sza czu³oæ w rozpoznawaniu inwa-zji i to one powinny byæ rekomendowane jako metody diagnostyczne zara¿eñ Babesia gibsoni u psów.
Kolejne badania dotycz¹ce rozpoznawania babeszjo-zy u psów z wykorbabeszjo-zystaniem techniki LAMP przepro-wadzili Müller i wsp. (25). Autorzy ci jako markerem w wykrywaniu zara¿eñ na tle Babesia canis, Babesia rossi oraz Babesia vogeli pos³u¿yli siê genem roptrii (Genbank no M91168). Odpowiednio zaprojektowa-Ryc. 3. Produkty ró¿nej d³ugoci z³o¿one z naprzemiennie odwróconych powtórzeñ sekwencji matrycowych powsta³e w reakcji LAMP
Opracowano na podstawie http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/index.html
Ryc. 4. Elektroforeza produktów amplifikacji genu 18S RNA Babesia canis uzyskanych w reakcji LAMP
ne startery dla wspomnianego genu pozwala³y na am-plifikacjê DNA wy³¹cznie trzech wy¿ej wymienionych gatunków Babesia, co zapewnia³o swoistoæ reakcji (próby amplifikacji przy pomocy zastosowanych star-terów DNA B. motasi, B. ovis, B. crassa i B. microti by³y nieskuteczne). Pomimo tego, ¿e reakcja LAMP okaza³a siê swoist¹ i szybk¹ metod¹ diagnostyczn¹, jej czu³oæ w wykrywaniu zara¿eñ pierwotniaczych u psów by³a ni¿sza ni¿ standardowego PCR. Mini-malna iloæ DNA wykrywana przez autorów technik¹ LAMP wynosi³a 25 pg, podczas gdy klasyczny PCR by³ piêciokrotnie czulszy i pozwala³ na wykrycie DNA paso¿ytów w stê¿eniu 5 pg.
W ostatnim czasie izotermiczn¹ reakcjê amplifika-cji opracowano w celu wykrywania zara¿eñ na tle pier-wotniaków Babesia/Theilieria u koni i byd³a. Auto-rom badañ zale¿a³o na opracowaniu metody, która charakteryzowa³aby siê swoistoci¹ i powtarzalnoci¹, pozwala³a na szybkie rozpoznanie inwazji bez koniecz-noci wykorzystania skomplikowanej aparatury ba-dawczej. Kryteria te zosta³y spe³nione. W metodzie LAMP wynik reakcji mo¿e zostaæ oceniony go³ym okiem na podstawie wykazania zmêtnienia mieszani-ny reakcyjnej, wiadcz¹cego o powstaniu nowych ko-pii DNA w probówce (23).
Z badañ Alhassan i wsp. (4) wynika, ¿e LAMP jest niezwykle czu³¹ i swoist¹ metod¹ pozwalaj¹c¹ na wykazanie DNA paso¿ytów Babesia caballi oraz Thei-leria equi we krwi koni zara¿onych zarówno ekspe-rymentalnie, jak i naturalnie. Metoda ta umo¿liwia zarówno wczesn¹ diagnozê choroby, jak i mo¿e byæ wykorzystywana w badaniach post mortem celem ustalenia przyczyny upadków zwierz¹t (5). Dodatnie wyniki LAMP autorzy uzyskiwali ju¿ w drugim dniu po eksperymentalnym zara¿eniu koni T. equi, podczas gdy w rozmazach krwi obecnoæ paso¿ytów wykazaæ mo¿na by³o dopiero 4 dni p.i., za testem ELISA obec-noæ swoistych przeciwcia³ dla pierwotniaków w su-rowicy krwi stwierdzano po 6. dniu p.i. Kolejn¹ zalet¹ tej techniki jest fakt, i¿ reakcja przebiega ju¿ w wa-runkach, gdy matrycê stanowi³o zaledwie 6 kopii DNA paso¿ytów co wiadczy o jej wysokiej czu³oci. Gdy jako materia³ do badañ wykorzystano pe³n¹ krew, czu³oæ metody LAMP znacznie przewy¿sza³a czu³oæ klasycznego PCR. Prawdopodobn¹ przyczyn¹ takie-go stanu rzeczy jest obecnoæ w pe³nej krwi inhi-bitorów Taq polimerazy (mioglobina, hemoglobina, immunoglobuliny G), obni¿aj¹cych jej aktywnoæ, na-tomiast nie wp³ywaj¹cych na aktywnoæ polimerazy Bst wykorzystywanej w izotermicznej reakcji ampli-fikacji (14).
Poniewa¿ LAMP okaza³a siê prost¹ i czu³¹ metod¹ diagnostyczn¹, zyskuj¹c¹ wci¹¿ nowych zwolenników, w dalszym ci¹gu trwaj¹ prace nad jej udoskonaleniem. Zaowocowa³y one m.in. opracowaniem reakcji multi-pleks LAMP wykorzystywanej w jednoczesnym roz-poznawaniu inwazji Babesia bovis i Babesia bigemi-na u byd³a (19). Startery do reakcji zaprojektowano
dla genu roptrii obu paso¿ytów, a odpowiedni dobór warunków amplifikacji skutkowa³ zwiêkszeniem jej czu³oci. Porównanie czu³oci reakcji nested PCR z opracowan¹ przez autorów metod¹ multipleks LAMP wykaza³o, i¿ o ile dodatnie wyniki pierwszej z wy-mienionych uzyskiwane s¹ przy parazytemii wynosz¹-cej 0,0001% dla B. bovis i 0,00001% dla B. bigemina, to w multipleks LAMP próg wykrywalnoci DNA paso¿ytów ulega obni¿eniu do parazytemii rzêdu 0,000001%. Wynika z tego, i¿ izotermiczna reakcja amplifikacji jest 10-100-krotnie bardziej czu³a w wy-krywaniu zara¿eñ na tle Babesia u byd³a ani¿eli nested PCR. Potwierdzeniem tego s¹ tak¿e wyniki badañ prowadzonych przez Liu i wsp. (20). Wed³ug tych autorów, minimalna iloæ DNA B. bigemina oraz B. bovis, która mo¿e zostaæ wykryta za pomoc¹ tech-niki LAMP, jest znacznie ni¿sza ni¿ w klasycznym PCR i wynosi zaledwie 0,1 pg. Odpowiedni dobór star-terów do reakcji zapobiega ponadto niespecyficznej amplifikacji materia³u genetycznego innych patogenów czêsto spotykanych u byd³a, jak: B. ovate, B. major, nienazwane Babesia, Theileria spp., i Anaplasma marginale, co wiadczy o swoistoci reakcji i wska-zuje na jej wysoki potencja³ kliniczny w rozpoznawa-niu zara¿eñ pierwotniaczych i ró¿nicowarozpoznawa-niu gatunków Babesia stwierdzanych u byd³a, zw³aszcza w rejonach, gdzie babeszjoza u tego gatunku zwierz¹t wystêpuje endemicznie.
W ostatnim czasie pojawi³y siê doniesienia doty-cz¹ce wykorzystywania LAMP w rozpoznawaniu in-wazji Babesia u owiec, kóz oraz bawo³ów (15, 16). Potwierdzaj¹ one wysok¹ swoistoæ i czu³oæ tej tech-niki, przewy¿szaj¹c¹ czu³oæ nested PCR. Poniewa¿ by przeprowadziæ reakcjê izotermicznej amplifikacji w najprostszej formie konieczne jest posiadanie jedy-nie ³ani wodnej lub termobloku, obok jedy-niew¹tpliwego zastosowania do celów naukowych prowadzenia badañ nad epidemiologi¹ babeszjoz u zwierz¹t, LAMP znajduje coraz szersze zastosowanie w praktyce kli-nicznej do wczesnej diagnozy chorób, co z kolei umo¿-liwia szybkie rozpoczêcie odpowiedniego leczenia. Nale¿y przypuszczaæ, ¿e w ci¹gu najbli¿szych lat tech-nika ta stanie siê rutynowym badaniem wykonywanym w klinikach weterynaryjnych.
Pimiennictwo
1.Adaszek £., Górna M., Milczak A., Ziêtek J., Winiarczyk S.: Babeszjoza byd³a. ¯ycie Wet. 2010, 85, 37-41.
2.Adaszek £., Wernicka-Furmaga R., Winiarczyk S.: Zastosowanie real-time PCR w wykrywaniu zara¿eñ subklinicznych Babesia canis u psów ocena wp³ywu ró¿nych metod izolacji DNA na czu³oæ PCR. Bull. Vet. Inst. Pula-wy 2012, 56, 145-148.
3.Adaszek £., Winiarczyk S., Górna M.: From piroplasmosis to babesiosis problems with classification of Babesia protozoa isolated from dogs. Wiad. Parazytol. 2010, 56, 111-115.
4.Alhassan A., Govind Y., Tam N. T., Thekisoe O. M., Yokoyama N., Inoue N., Igarashi I.: Comparative evaluation of the sensitivity of LAMP, PCR and in vitro culture methods for the diagnosis of equine piroplasmosis. Parasitol. Res. 2007, 100, 1165-1168.
5.Alhassan A., Thekisoe O. M., Yokoyama N., Inoue N., Motloang M. Y., Mbati P. A., Yin H., Katayama Y., Anzai T., Sugimoto C., Igarashi I.: Development
of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for diagnosis of equine piroplasmosis. Vet. Parasitol. 2007, 143, 155-160.
6.Ano H., Makimura S., Harasawa R.: Detection of Babesia species from infected dog blood by polymerase chain reaction. J. Vet. Med. Sci. 2001, 63, 111-113.
7.Casapulla R., Baldi L., Avallone V., Sannino R., Pazzanese L., Mizzoni V.: Canine piroplasmosis due to Babesia gibsoni: clinical and morphological aspects. Vet. Rec. 1998, 142, 168-169.
8.Conrad P., Thomford J., Yamane I., Whiting J., Bosma L., Uno T., Holshuh H. J., Shelly S.: Hemolytic anemia caused by Babesia gibsoni infection in dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1991, 199, 601-605.
9.Criado-Fornelio A.: A review of nucleic-acid-based diagnostic tests for Babesia and Theileria, with emphasis on bovine piroplasms. Parassitologia 2007, 49, 39-44.
10.Ewing S. A.: Observations on leukocytic inclusion bodies from dogs infected with Babesia canis. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1963, 143, 503-506. 11.Farwell G. E., LeGrand E. K., Cobb C. C.: Clinical observations on Babesia
gibsoni and Babesia canis infections in dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1982, 180, 507-511.
12.Foldvari G., Hell E., Farkas R.: Babesia canis canis in dogs from Hungary: detection by PCR and sequencing. Vet. Parasitol. 2005, 127, 221-226. 13.Fu S., Qu G., Guo S., Ma L., Zhang N., Zhang S., Gao S., Shen Z.:
Applica-tions of loop-mediated isothermal DNA amplification. Appl. Biochem. Bio-technol. 2011, 163, 845-850.
14.Grab J. D., Lonsdale-Eccle J., Inoue N.: LAMP for tadpoles. Nat. Methods 2005, 2, 635.
15.Guan G., Chauvin A., Luo J., Inoue N., Moreau E., Liu Z., Gao J., Thekisoe O. M., Ma M., Liu A., Dang Z., Liu J., Ren Q., Jin Y., Sugimoto C., Yin H.: The development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplifica-tion (LAMP) method for detecamplifica-tion of Babesia spp. infective to sheep and goats in China. Exp. Parasitol. 2008, 120, 39-44.
16.He L., Zhou Y. Q., Oosthuizen M. C., Zhao J. L.: Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) detection of Babesia orientalis in water buffalo (Buba-lus bubalis, Linnaeus, 1758) in China. Vet. Parasitol. 2009, 165, 36-40. 17.Homer M. J., Aguilar-Delfin I., Telford S. R. 3rd, Krause P. J., Persing D. H.:
Babesiosis. Clin. Microbiol. Rev. 2000, 3, 451-469.
18.Ikadai H., Tanaka H., Shibahara N., Matsuu A., Uechi M., Itoh N., Oshiro S., Kudo N., Igarashi I., Oyamada T.: Molecular evidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 2465-2469.
19.Iseki H., Alhassan A., Ohta N., Thekisoe O. M., Yokoyama N., Inoue N., Nambota A., Yasuda J., Igarashi I.: Development of a multiplex loop-media-ted isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detec-tion of bovine Babesia parasites. J. Microbiol. Methods 2007, 71, 281-287. 20. Liu A., Guan G., Du P., Gou H., Liu Z., Liu J., Ma M., Yang J., Li Y., Niu Q., Ren Q., Bai Q., Yin H., Luo J.: Loop-mediated isothermal amplification
(LAMP) method based on two species-specific primer sets for the rapid iden-tification of Chinese Babesia bovis and B. bigemina. Parasitol. Int. 2012, 61, 658-663.
21.Macintire D. K., Boudeaux M. K., West G. D., Bourne C., Wright J. C., Con-rad P. A.: Babesia gibsoni infection among dogs in the southwestern United States. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2002, 220, 325-329.
22.Meinkoth J. H., Kocan A., Loud S. D., Lorenz M. D.: Clinical and hemato-logic effects of experimental infection of dogs with recently identified Babesia gibsoni-like isolates from Oklahoma. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2002, 220, 185-189.
23.Mori Y., Nagamine K., Tomita N., Notomi T.: Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, 289, 150-154.
24.Mori Y., Notomi T.: Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J. Infect. Chemother. 2009, 15, 62-69.
25.Müller H., Aysul N., Liu Z., Salih D. A., Karagenc T., Beyer D., Kullmann B., Ahmed J. S., Seitzer U.: Development of a loop-mediated isothermal amplifi-cation (LAMP) assay for rapid diagnosis of Babesia canis infections. Trans-bound. Emerg. Dis. 2010, 57, 63-65.
26.Nagamine K., Hase T., Notomi T.: Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol. Cell. Probes 2002, 16, 223-229.
27.Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T.: Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 63.
28.Parida M., Sannarangaiah S., Dash P. K., Rao P. V., Morita K.: Loop media-ted isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev. Med. Virol. 2008, 18, 407-421.
29.Schuster F. L.: Cultivation of Babesia and Babesia-like blood parasites: agents of an emerging zoonotic disease. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15, 365-373. 30.Sobczyk A. S., Kotomski G., Górski P., Wêdrychowicz H.: Usefulness of
touch-down PCR assay for the diagnosis of atypical cases of Babesia canis canis infections in dogs. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2005, 49, 403-406. 31.Suarez M. L., Espino L., Goicoa A., Fidalgo L. E., Santamarina G.:
Fatal Babesia gibsoni infection in a dog from Spain. Vet. Rec. 2001, 148, 819-820.
32.Tomita N., Mori Y., Kanda H., Notomi T.: Loop-mediated isothermal amplifi-cation (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat. Protoc. 2008, 3, 877-882.
33.Vial H. J., Gorenflot A.: Chemotherapy against babesiosis. Vet. Parasitol. 2006, 138, 147-160.
Adres autora: dr £ukasz Adaszek, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin; e-mail: ukaszek0@wp.pl
