Artyku³ przegl¹dowy Review
Poziom dojrza³oci j¹drowej oraz cytoplazmatycznej oocytów tu¿ przed zap³odnieniem jest jednym z najwa¿-niejszych czynników okrelaj¹cych jakoæ zarodków oraz ich zdolnoæ do prawid³owego rozwoju. Zaburze-nie przebiegu tych procesów podczas d³ugiego okresu rozwoju pêcherzykowego oocytów ssaków jest jedn¹ z g³ównych przyczyn obni¿onej zdolnoci do zap³od-nienia i niew³aciwego rozwoju zarodków.
Proces folikulogenezy i oogenezy u wiñ kontro-lowany jest przez wiele czynników. Nale¿¹ do nich wydzielane przez przysadkê hormony FSH, LH oraz hormony steroidowe i bia³kowych, które oddzia³uj¹ na komórki pêcherzykowe, indukuj¹c ich wzrost i ró¿ni-cowanie. Synteza czynników maj¹cych znacz¹cy wp³yw na rozwój oocytu oraz na formowanie i aktywnoæ pê-cherzyka jajnikowego odbywa siê tak¿e w komórce jajowej. Do najwa¿niejszych z nich nale¿¹ bia³ka z ro-dziny TGF-â (BMP bia³ka morfogenetyczne koci, GDF9 ró¿nicuj¹cy czynnik wzrostu, TGF-á trans-formuj¹cy czynnik wzrostu alfa). Kontrola funkcji ko-mórek ziarnistych i os³onkowych w pêcherzyku przez
oocyt odbywa siê na drodze lokalnych sprzê¿eñ zwrot-nych pomiêdzy oboma typami komórek.
Morfologia oocytów, wiek zwierz¹t czy wielkoæ pê-cherzyków jajnikowych nale¿¹ do czynników maj¹cych znacz¹cy wp³yw na procesy dojrzewania komórek jajo-wych, zap³odnienia in vitro czy prawid³owego rozwoju zarodka.
Specyfika folikulogenezy u wini domowej
Jajniki u wiñ formuj¹ siê we wczesnych etapach roz-woju zarodkowego. Pierwsze pêcherzyki jajnikowe po-jawiaj¹ siê oko³o 40 dnia po zap³odnieniu (19). Proces rozwoju jajnika zbiega siê w czasie z rozpoczêciem mejozy w oogoniach i formowaniem oocytu. Komórka jajowa stanowi centrum, do którego przemieszczaj¹ siê somatyczne elementy pêcherzyka. Pierwszy kszta³tuje siê pêcherzyk pierwotny, otoczony pojedyncz¹ warstw¹ komórek ziarnistych, na zewn¹trz której tworzy siê b³o-na podstawb³o-na. Zb³o-naczb³o-na pula oocytów (oko³o 60%) nie zostaje przemieszczona do pêcherzyków i ulega dege-neracji jeszcze w ¿yciu p³odowym (16). W jajnikach nowo narodzonych samic zaobserwowaæ mo¿na pêche-rzyki pierwotne, pierwszorzêdowe (ok. 0,12 mm) i
dru-Mechanizmy reguluj¹ce oogenezê, folikulogenezê
oraz zap³odnienie u wiñ*
)
BARTOSZ KEMPISTY, MARTA JACKOWSKA*, DOROTA BUKOWSKA*, PAWE£ ANTOSIK*, MAGDALENA WONA*, HANNA PIOTROWSKA**,
MONIKA WIERCZEWSKA, JÊDRZEJ M. JAKOWSKI*
Katedra i Zak³ad Histologii i Embriologii Wydzia³u Lekarskiego II UM, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ *Katedra Weterynarii Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t UP, ul. Wojska Polskiego 52, 60-628 Poznañ
**Katedra Toksykologii Wydzia³u Farmaceutycznego UM, ul. Dojazd 30, 60-631 Poznañ
Kempisty B., Jackowska M., Bukowska D., Antosik P., Wona M., Piotrowska H., wierczewska M., Jakowski J. M.
Mechanisms regulating oogenesis, folliculogenesis and fertilization in pigs Summary
This review presents the molecular basis of mechanisms regulating oogenesis and folliculogenesis, as well as the species specificity of these mechanisms and genetic determinants of successful fertilization in pigs.
Oogenesis and folliculogenesis are species-specific processes, although several features are common to all mammals. These features are especially visible in the molecular basis of these processes. The most important genetic factors regulating normal oogenesis and folliculogenesis include the transforming growth factor beta (TGFâ) and several other proteins from the TGFâ family. Several experiments have indicated the influence of this genes expression on the ability of oocytes to mature, be successfully fertilized, and form a zygote and a blastocyst. However, the regulation of this genes expression shows a considerable species specificity. Similarly, mechanisms regulating the fertilization process have several features common to all mammalian species, which is especially conspicuous in the structure of genes that are responsible for fertilization. Two important determinants of fertilization ability are oocyte morphology and follicular size.
Keywords: transforming growth factor beta, oogenesis, folliculogenesis
*) Praca finansowana z grantu nr NN 308 588 040 Ministerstwa Nauki
gorzêdowe (do 0,4 mm), których ³¹czna pula szacowana jest w przybli¿eniu na 500 tys. Po urodzeniu na po-wierzchni 90-dniowych jajników pojawiaj¹ siê pierw-sze pêcherzyki antralne, nastêpuje znaczna proliferacja komórek ziarnistych od 10 do 30 warstw oraz ró¿nico-wanie komórek os³onkowych (28). Po 4 tygodniach na powierzchni jajnika pojawiaj¹ siê pêcherzyki o redni-cy 1 mm. Przez nastêpne 2-3 tygodnie pêcherzyki te osi¹-gaj¹ rednicê oko³o 7 mm, natomiast w stadium przed-owulacyjnym ich rednica wynosi 8-10 mm. Faza ta trwa krótko oko³o 4-6 dni. Ze stu pêcherzyków osi¹gaj¹-cych rednicê do 4 mm rekrutowana jest pula ok. 50, z których zaledwie 10-25 ulega owulacji, podczas gdy pozosta³e ulegaj¹ atrezji. W momencie osi¹gniêcia przez pêcherzyk rednicy 1 mm dalszy jego wzrost staje siê zale¿ny od sekrecji hormonów gonadotropowych (fo-likulotropiny FSH, hormonu luteinizuj¹cego LH) (7). Wykszta³cenie odpowiedniej iloci receptorów dla FSH prowadzi do aktywacji enzymów z rodziny aromataz, przekszta³caj¹cych testosteron w estradiol. Wzrost po-ziomu estradiolu w komórkach ziarnistych prowadzi do powiêkszenia siê liczby receptorów dla LH (4).
Cysty jajnikowe przyczyna zaburzeñ w aktywnoci pêcherzyków jajnikowych trzody chlewnej
Pêcherzyki jajnikowe o rednicy 12-50 mm okrelane s¹ mianem cyst. U loch wyró¿nia siê kilka rodzajów cyst: pêcherzykowe, luteinowe, pojedyncze oraz mnogie (23). W obrazie ultrasonograficznym struktury te cechuj¹ siê znaczn¹ wielkoci¹, nieechogennoci¹ oraz regularnym, owalnym kszta³tem (40).
Ma³o echogenne cysty powstaj¹ce z nieowuluj¹cych pêcherzyków przyjmuj¹ postaæ du¿ych torbieli (10-40 mm), pojedynczych lub mnogich, czêsto wykazuj¹cych objawy cyklicznoci. Cysty luteinowe powstaj¹ z owu-luj¹cych pêcherzyków lub cia³ek ¿ó³tych, a mo¿liwoæ ich wykrycia pojawia siê dopiero w okresie miêdzy-rujowym kolejnego cyklu. Posiadaj¹ one grube ciany, a echogennoci¹ zbli¿one s¹ do stromy jajnika, przez co trudniej je zdiagnozowaæ ni¿ cysty pêcherzykowe. Ta patologia jajników jest czêsto spotykan¹ przypad³oci¹ u wiñ i stanowi w zale¿noci od fermy 1,1-37% w gru-pie wiñ inseminowanych, a odsetek zwierz¹t z dege-neracj¹ torbielowat¹ wynosi 0,6-4,3% (45). Obecnie 20% wszystkich przyczyn zaburzeñ rozrodu trzody chlewnej stanowi¹ tego typu patologie. Lochy z wielo-ma cystami na jajnikach pozostaj¹ zazwyczaj ja³owe lub niep³odne, a ruje przejawiaj¹ siê w nieregularnych od-stêpach czasu. Diagnostyka ultrasonograficzna u³atwia wczeniejsze wybrakowanie samic dotkniêtych tym schorzeniem. Rozwój badañ nad przyczynami tego typu patologii jajników mo¿e w znacz¹cy sposób zmniejszyæ odsetek brakowanych zwierz¹t w hodowli.
Czynniki wp³ywaj¹ce na wzrost, ró¿nicowanie i aktywnoæ steroidogenn¹ pêcherzyków jajnikowych
Na wzrost, ró¿nicowanie i aktywnoæ steroidogenn¹ pêcherzyków jajnikowych oprócz FSH i LH wp³yw maj¹ tak¿e: prolaktyna, oksytocyna, hormony steroidowe i bia³kowe syntetyzowane bezporednio w pêcherzyku,
które na drodze auto- i parakrynowej oddzia³ywuj¹ na komórki pêcherzykowe (32). Do wa¿nych regulatorów pêcherzykowych nale¿¹ liczne bia³ka z rodziny cytokin i interleukin (28). Na uwagê zas³uguj¹ tak¿e hormony metaboliczne (insulina, glukokortykosteroidy, leptyna, hormony tarczycy oraz hormon wzrostu), oddzia³ywu-j¹ce bezporednio na oocyt lub na o podwzgórzowo-przysadkow¹, reguluj¹c czynnoæ jajników (32). Funk-cja pêcherzyka jajnikowego uzale¿niona jest tak¿e od znajduj¹cego siê w nim oocytu. Komórka jajowa synte-tyzuje czynniki maj¹ce istotny wp³yw na rozwój samego oocytu, jak i na formowanie i aktywnoæ pêcherzyków jajnikowych (15). Komunikacja oocytkomórka soma-tyczna jest dwukierunkowa i istotna dla obu struktur (30). Wydzielane s¹ g³ównie bia³ka nale¿¹ce do du¿ej rodziny transformuj¹cych czynników wzrostu TGF-â, jak bia³ko morfogenetyczne koci (BMP), ró¿nicuj¹cy czynnik wzrostu (GDF-9) czy transformuj¹cy czynnik wzrostu alfa (TGF-á). Kontrola funkcji komórek ziar-nistych i os³onkowych przez oocyt odbywa siê na zasa-dzie sprzê¿eñ zwrotnych pomiêdzy tymi typami komó-rek (20).
Oogeneza
Oogeneza to proces polegaj¹cy na ró¿nicowaniu siê ¿eñskich pierwotnych komórek linii p³ciowej w dojrza-³e gamety. Proces ten najintensywniej przebiega w fazie diplotenu, kiedy dochodzi do gromadzenia zsyntetyzo-wanych RNA i bia³ek, niezbêdnych dla przysz³ego roz-woju zarodka (24). Matczyny mRNA wyprodukowany podczas wczesnych etapów oogenezy stanowi równie¿ matrycê dla puli bia³ek, których ekspresja zachodzi w pocz¹tkowym stadium rozwoju zarodkowego (9, 24). Oocyty nale¿¹ do grupy komórek o wysokiej specjali-zacji. Ich ró¿nicowanie wp³ywa na wytworzenie orga-nelli wspólnych dla wszystkich komórek eukariotycz-nych, jak i specyficznych tylko dla oocytu. Proces po-dzia³u komórkowego oocytu podlega specyficznym mechanizmom regulacji ekspresji genów. Wiedza na temat profilu transkrypcyjnego komórek jajowych czy mechanizmów ich regulacji jest nadal niewystarczaj¹-ca (46). Sugeruje siê, ¿e bardzo du¿y wp³yw na jakoæ komórek jajowych, okrelonych zdolnoci¹ do dojrze-wania i zap³odnienia, maj¹ takie czynniki, jak: wiek samicy, masa cia³a, ciê¿ar jajników, obecnoæ ró¿nych tworów funkcjonalnych jajników (tzn. obecnoæ cia³ek ¿ó³tych, widoczne pêcherzyki jajnikowe) oraz pojawia-j¹ce siê zmiany patologiczne jajników lub macicy (8).
Transformuj¹ce czynniki wzrostu TGF-â
Rodzina transformuj¹cych czynników wzrostu TGF-â stanowi grupê cytokin odpowiedzialnych za wiele zna-cz¹cych funkcji w organizmie, jak: wzrost, ró¿nicowa-nie, migracje komórek, formowanie i degradacja sk³ad-ników macierzy komórkowej, procesy chemotaksji i apoptozy (39). W sk³ad TGF-â wchodz¹: 3 izofromy TGFâ: 1, 2, 3 (syntetyzowane u ssaków), hormon anty-milleroski (anty-müllerian hormon AMH), 2 inhibiny (A i B), 3 aktywiny (A, B i AB), 20 bia³ek morfogene-tycznych koci (BMP1-20) i 9 ró¿nicuj¹cych
czynni-ków wzrostu (GDF1-9) (27, 33). Ekspresja tych czyn-ników zachodzi tak¿e w pêcherzyku jajnikowym, tj. komórkach tekalnych (os³onkowych), komórkach ziar-nistych oraz w samym oocycie. Odpowiadaj¹ one za ró¿nicowanie pêcherzyków, proliferacjê lub atrezjê ko-mórek ziarnistych i os³onkowych, steroidogenezê, doj-rzewanie oocytu czy luteinizacjê pêcherzyka. W wielu schorzeniach stwierdzono zaburzenia w ekspresji TGF-â, w chorobach autoimmunologicznych (TGF-â1) czy no-wotworach, m.in. jajników (inhibina). Przemawiaæ to mo¿e za korzyci¹ zastosowania tych czynników jako markerów molekularnych do detekcji anomalii rozwo-jowych wielu struktur zarówno w komórkach somatycz-nych, jak i w komórkach linii p³ciowej (12).
Szlak transdukcji sygna³u z udzia³em TGF-â
W przekazywanie sygna³u z udzia³em transformuj¹-cych czynników wzrostu zaanga¿owane s¹ 3 typy re-ceptorów b³onowych, TâR -I, -II, -III, wystêpuj¹ce we wszystkich typach komórek. Zidentyfikowano 7 recep-torów typu TâR-I (Alk 1-7) oraz 5 receprecep-torów TâR-II (TGF-R-II, ActRII-A, ActRII-B, BMPR-II, AMHR-II). Nale¿y podkreliæ, ¿e wspomniane trzy receptory TâR u ssaków charakteryzuje wysokie podobieñstwo w bu-dowie, u ludzi, myszy czy szczurów wykazano > 98% homologii w ich sekwencji aminokwasów (3, 47). W swojej strukturze receptory zawieraj¹ domenê, która wykazuje aktywnoæ kinazy serynowo-treoninowej, re-gion transb³onowy oraz domenê wi¹¿¹c¹ ligand (27). Jako pierwszy w wyniku przy³¹czenia ligandu ulega aktywacji TâR-II, który z kolei aktywuje TâR-I poprzez transfosforylacjê jego zewn¹trzb³onowej glicynowo-se-rynowej domeny (domeny GS). TâR-III jest transb³o-nowym proteoglikanem o wysokim stopniu glikozyla-cji. Zasadnicza rola tego receptora polega na u³atwianiu dostêpu liganda do TâR-I i TâR-II (10). Aktywacja re-ceptora b³onowego TâR-I powoduje aktywacjê bia³ek Smad w cytoplazmie, które dzia³aj¹ na ró¿ne czynniki transkrypcyjne w j¹drze komórkowym, indukuj¹c eks-presjê wybranych genów. Wród bia³ek przekazuj¹cych sygna³ do j¹dra komórkowego wyró¿niamy tzw. R-Smad (nale¿¹ do nich Smad 1, 2, 3, 5, 8) oraz wspó³uczest-nicz¹ce w tym procesie Co-Smad (Smad 4). Bia³ka R-Smad znajduj¹ siê g³ównie w cytoplazmie, a po akty-wacji przez TâR-I transportowane s¹ do j¹dra komórki (34). Istnieje tak¿e grupa bia³ek j¹drowych anty-Smad, o dzia³aniu antagonistycznym do R-Smad i Co-Smad, do której nale¿¹ izoformy Smad 6, 7. Do antagonistów bia³ek Smad nale¿¹ tak¿e hamuj¹ce ekspresjê w j¹drze onkoproteiny: c-Ski, c-Sno, które wi¹¿¹ bia³ka R-Smad i Co-Smad (35).
Rola wybranych czynników w zap³odnieniu u wiñ
W ci¹gu ostatnich 20 lat odkryto wiele zwi¹zków oraz bia³ek aktywnie uczestnicz¹cych w procesie zap³odnie-nia. Do g³ównych zwi¹zków odgrywaj¹cych kluczow¹ rolê w interakcji pelmnika z komórk¹ jajow¹ nale¿¹ wêglowodany. W momencie, gdy wykazano, ¿e fukoi-dany (zwi¹zki z grupy sulfonowanych polisacharydów) hamuj¹ proces interakcji plemnika z ocytem u wiñ (42),
zaczêto poszukiwania potencjalnych receptorów dla os³onki przejrzystej (zona pellucida) na powierzchni plemników knura. Badania ultrastrukturalne wykaza³y, ¿e w wie¿o ejakulowanych plemnikach knura miejsca wi¹zania fukozy by³y szczególnie widoczne w szczyto-wym regionie g³ówki plemników, podczas gdy po in-dukcji reakcji akrosomowej nastêpowa³o gwa³towne ods³oniêcie wszystkich miejsc wi¹¿¹cych (13, 15, 42). Wykazano tym samym, ¿e komponenty wi¹¿¹ce fuko-idy stanowi¹ g³ówne bia³ka reguluj¹ce proces wi¹zania siê plemnika do os³onki przejrzystej oocytu. Ma³ocz¹s-teczkowe bia³ka powierzchniowe o masie od 12 do 16 kDa stanowi¹ now¹ grupê moleku³ okrelanych jako adhezyny plemnikowe (44). Udowodniono równie¿ ist-nienie wewn¹trzakrosomowego bia³ka bêd¹cego pro-teinaz¹ serynow¹, okrelan¹ jako pro/akrozyna, o masie cz¹steczkowej 53-55 kDa (43). Lokalizacja bia³ek wi¹-¿¹cych siê z os³onk¹ przejrzyst¹ (adhezyn plemnikowych oraz pro/akrozyny) w ró¿nych kompartmentach komór-kowych plemnika dowodzi, ¿e mog¹ one regulowaæ pro-ces interakcji plemnika z komórk¹ jajow¹ na ró¿nych etapach zap³odnienia. Dowodem na to jest fakt, ¿e adhezyny plemnikowe oraz proakrozyna uczestnicz¹ w sekwencji przemian z udzia³em wêglowodanów w ja-jowodzie u wiñ.
Innym bia³kiem uczestnicz¹cym w tym procesie jest P47, cz¹steczka izolowana z b³ony komórkowej plem-ników, wykazuj¹ca wysokie podobieñstwo w budowie do globuliny wystêpuj¹cej w mleku wiñ (laktadhery-ny). Bia³ko to ulega ekspresji w j¹drach i naj¹drzu wiñ i wielu innych gatunków ssaków (11). Cz¹steczka ta tworzy mozaikow¹ strukturê sk³adaj¹c¹ siê z jednego N-terminalnego motywu EGF poprzedzonego przez dwie domeny diskoidynowe/F5/8. Wykazano, ¿e mysi homolog tego bia³ka okrelony jako SED1 pe³ni istotn¹ rolê w procesie adhezji gamet u tego gatunku (36).
Podstawowy proces polegaj¹cy na rozpoznaniu ga-met nale¿y do mechanizmów wykazuj¹cych wysok¹ konserwatywnoæ ewolucyjn¹ pocz¹wszy od krêgow-ców wodnych, a skoñczywszy na ³o¿yskowcach. Pole-ga on na rozpoznaniu przez powierzchniowe receptory zwi¹zane z plemnikiem oligosacharydowych ligandów tworz¹cych strukturê glikoprotein w os³once przejrzy-stej oocytu. Otoczka witelinowa u ni¿szych krêgowców oraz os³onka przejrzysta u ssaków s¹ zbudowane z trzech do omiu glikoprotein, które wspó³tworz¹ trójwymiaro-w¹ matriks otaczaj¹c¹ komórkê jajotrójwymiaro-w¹. Glikoproteiny os³onki przejrzystej kodowane s¹ przez oko³o siedem grup genów, które powsta³y przez duplikacje pojedyn-czego genu dziedziczonego przez kolejne pokolenia podczas ewolucji krêgowców (18, 38). Wszystkie bia³-ka z grupy ZP (zona pellucida proteins) posiadaj¹ wspól-n¹ domenê zbudowawspól-n¹ z 260 aminokwasów, która, jak wykaza³y badania, odgrywa kluczow¹ rolê w procesie polimeryzacji glikoprotein ZP do filamentów tworz¹-cych pow³okê komórki jajowej (6, 31). Bia³ka os³onki przejrzystej poza ochronn¹ funkcj¹ dla samej os³onki pe³ni¹ równie¿ wa¿n¹ rolê podczas zap³odnienia, pole-gaj¹c¹ na modulowaniu funkcji plemników oraz ochro-nie przed polispermi¹. U wiñ, podobochro-nie jak u innych
zwierz¹t udomowionych, os³onka przejrzysta jest zbu-dowana z trzech glikoprotein, które s¹ produktem eks-presji genów ZP, okrelanych jako ZPA, ZPB, ZPC (17). Na podstawie badañ immunohistochemicznych oraz hybrydyzacji in situ wykazano udzia³ zarówno bia³ek ZPB, ZPC, jak i samego oocytu oraz otaczaj¹cych ko-mórek pêcherzykowych w tworzeniu matriks otaczaj¹-cego komórkê jajow¹. Podczas pocz¹tkowej fazy roz-woju pêcherzykowego (rozwój pierwotnych oraz g³ów-nych pêcherzyków) bia³ka z grupy ZP produkowane s¹ przez oocyt. Podczas pónych stadiów ich rozwoju udzia³ komórek pêcherzykowych w syntezie bia³ek ZP znacz¹co wzrasta, a obni¿a siê udzia³ komórki jajowej w tym procesie (37). Niedojrza³e oocyty izolowane z pê-cherzyków trzeciorzêdnych (3-5 mm) po dojrzewaniu in vitro s¹ wykorzystywane do zap³odnienia pozaustro-jowego (IVF) u wiñ. Synteza i sekrecja bia³ka ZPA w tych oocytach jest znacznie opóniona. Badania z wy-korzystaniem mikroskopii konfokalnej wykaza³y wystê-powanie bia³ka ZPA w cytoplazmie oocytu, podczas gdy ZPB oraz ZPC by³y zlokalizowane w matriks os³onki przejrzystej (41). W otaczaj¹cych oocyt komórkach pê-cherzykowych wykazano natomiast ekspresjê wszyst-kich trzech bia³ek z rodziny ZP. Przytoczone wyniki badañ dowodz¹, ¿e ekspresja bia³ek ZP u wiñ jest skorelowana ze cile okrelon¹ lokalizacj¹ tych bia³ek w komórce, co wiadczy, ¿e procesy te podlegaj¹ ró¿-nym regulacjom podczas follikulogenezy.
Bia³ko ZPA uczestniczy w pónych stadiach procesu zap³odnienia, powoduj¹c swoiste usztywnienie os³onki przejrzystej (zona hardening), chroni¹c komórkê jajo-w¹ przed polispermicznym zap³odnieniem. Dojrza³a forma tego bia³ka jest najwiêksz¹ glikoprotein¹ z grupy ZP, które powstaje z przed³u¿enia polipeptydu zbudo-wanego z 330 aminokwasów. Proces proteolitycznego przeciêcia cz¹steczki ZPA w pozycjach A168 i D169 pro-wadzi do indukcji zmian w strukturze os³onki przejrzy-stej skutkuj¹cych jej znacznym usztywnieniem. Bada-nia Iwamoto i wsp. (21) wykaza³y, ¿e u byd³a proces zap³odnienia jest cile zwi¹zany z formowaniem intra-i intra-intercz¹steczkowych mostków dintra-isintra-iarczkowych. Wyka-zano równie¿, ¿e proces ten jest specyficzny równie¿ dla wiñ. Badania z wykorzystaniem skaningowej mikro-skopii konfokalnej z fluorescencyjnym wyznakowaniem wolnych grup tiolowych wykaza³y brak reszt cysteino-wych w mostkach disiarczkocysteino-wych w nienaruszonej strukturze os³onki przejrzystej w oocytach dojrza³ych i niedojrza³ych (41). Podczas zap³odnienia in vitro inten-sywnoæ fluorescencji tych komórek znacz¹co spada³a. Obni¿enie siê liczby wolnych grup tiolowych t³umaczy siê przez formowanie nowych mostków disiarczkowych oraz stabilizacjê zmienionej konformacji bia³ka, skut-kuj¹c¹ usztywnieniem os³onki przejrzystej.
Bia³ka ZPB orz ZPC ulegaj¹ posttranslacyjnym mody-fikacjom, które skutkuj¹ dojrza³¹ form¹ tych glikopro-tein zbudowanych, odpowiednio, z 330 i 326 amino-kwasów. ZPB posiada dodatkow¹ domenê trefoilow¹, która zwiêksza opornoæ tego bia³ka na proteolityczn¹ degradacjê (5). Sugeruje siê, ¿e w³anie to bia³ko pe³ni funkcjê g³ównego receptora dla plemników z uwagi na
obecnoæ w tej strukturze biologicznie aktywnych ³añ-cuchów wêglowodanowych (29), aczkolwiek najsilniej-sze wi¹zanie plemnika do os³onki przejrzystej nastêpuje po utworzeniu heteromultimerycznego kompleksu po-miêdzy bia³kami ZPB i ZPC, co powoduje indukcjê zmian konformacyjnych w cz¹steczce ZPB, skutkuj¹-cych maksymalnym ods³oniêciem miejsc wi¹zania siê plemnika (48). Przytoczone wyniki badañ wskazuj¹ na wyrany zwi¹zek pomiêdzy konfiguracj¹ ligandów wê-glowodanowych wystêpuj¹cych w supramolekularnej architekturze os³onki przejrzystej ze zdolnoci¹ plem-nika do wi¹zania do tej struktury.
Morfologia oocytów w znacz¹cy sposób wp³ywa na ich zdolnoæ do dojrzewania, osi¹gniêcia stadium blas-tocysty, rozwój zarodków w stadium przedimplantacyj-nym oraz skuteczn¹ implantacjê. Sugeruje siê tak¿e, ¿e czynnik ten mo¿e wp³ywaæ na skuteczne zap³odnienie, jednak¿e molekularny mechanizm kieruj¹cy tym proce-sem nie by³ do tej pory poznany (26). Badania Jackow-skiej i wsp. (22) wykaza³y cis³y zwi¹zek pomiêdzy eks-presj¹ genów koduj¹cych bia³ka os³onki przejrzystej a morfologi¹ dojrza³ych oocytów wiñ. Sugeruje siê tym samym, ¿e morfologia komórki jajowej mo¿e wp³ywaæ na skutecznoæ procesu zap³odnienia (aktywuj¹c bia³ka ZPA, ZPB, ZPC) poprzez wzrost ekspresji genów z gru-py ZP. Ponadto, Antosik i wsp. (2) analizowali ekspre-sjê bia³ek ZP3 oraz integryny â2 w ró¿nych grupach morfologicznych oocytów wiñ. Wyniki badañ z wy-korzystaniem mikroskopii konfokalnej wykaza³y, ¿e wy¿sza ekspresja tych bia³ek zwi¹zana by³a z oocytami wysokiej jakoci, okrelonej 4-stopniow¹ skal¹ (22). Przytoczone wyniki wskazuj¹, ¿e mechanizm skutecz-nego zap³odnienia jest regulowany ekspresj¹ bia³ek ZP3 i integryny â2 oraz jest cile zwi¹zany z morfologi¹ oocytów wiñ.
Inne badania tego zespo³u dotyczy³y wp³ywu wieku samic wiñ na ekspresjê genów odpowiedzialnych za zap³odnienie. Analiza ekspresji genów ZP1, ZP2, ZP3, ZP3á, integryny (áL, áM, â1, and â6) oraz bia³ek ad-hezyjnych CD9 i CD18 wykaza³y znacz¹cy wzrost ich ekspresji w dojrza³ych oocytach u wiñ pierwiastek w porównaniu do wiñ wieloródek. Wykazano tym sa-mym, ¿e skutecznoæ zap³odnienia jest cile determi-nowana wiekiem samic. Ponadto sugeruje siê, ¿e wy-mienione wy¿ej geny i ich w³aciwa ekspresja mo¿e byæ markerem skutecznego zap³odnienia (25).
Kolejnym czynnikiem, który w znacz¹cy sposób wp³y-wa na zdolnoæ oocytów do dojrzewp³y-wania, skutecznego zap³odnienia oraz osi¹gniêcia stadium blastocysty jest wielkoæ pêcherzyków jajnikowych, z jakich s¹ one izo-lowane. Badania Antosika i wsp. (1) dotyczy³y wp³ywu wielkoci pêcherzyków jajnikowych na ekspresjê genów odpowiedzialnych za zap³odnienie u wiñ. Przeprowa-dzone analizy western blot oraz mikroskopii konfokal-nej wykaza³y wzrost ekspresji genów ZP1, ZP2, ZP3, ZP3á, integryny â1, â2 oraz bia³ek ZP3 i integryny â2 w dojrza³ych oocytach wiñ pozyskanych z du¿ych pê-cherzyków jajnikowych (> 5 mm) w porównaniu do rednich (3-5 mm) oraz ma³ych (< 3 mm).
Podsumowanie
Podsumowuj¹c, w artykule przedstawiono mechaniz-my reguluj¹ce oogenezê oraz folikulogenezê u wiñ. Zastosowanie metod stosowanych w genetyce moleku-larnej oraz biologii komórki mo¿e w znacz¹cy sposób wp³yn¹æ na rozwój technik wspomaganego rozrodu. Poznanie mechanizmów odpowiadaj¹cych za regulacjê folikulo- i oogenezy ma na celu dok³adniejsze scharak-teryzowanie kompetencji rozwojowej oocytów z jednej strony, z drugiej zaburzeñ funkcji jajników, jakimi s¹ cysty. Czynniki wchodz¹ce w sk³ad transformuj¹cych czynników wzrostu stanowiæ mog¹ skuteczny marker prawid³owego ró¿nicowania siê pêcherzyków, prolife-racji, atrezji komórek ziarnistych i os³onkowych, doj-rzewania oocytu.
Na zdolnoæ oocytów do dojrzewania in vitro, sku-tecznego zap³odnienia i osi¹gniêcia stadium blastocy-sty wp³yw maj¹ wiek samic oraz wielkoæ pêcherzyków jajnikowych, z jakich s¹ one izolowane. Wykazano, ¿e ekspresja genów koduj¹cych bia³ka os³onki przejrzy-stej, integryny czy bia³ka adhezyjne na poziomie mRNA i bia³ka jest wy¿sza u loszek dojrza³ych p³ciowo w po-równaniu do loch wieloródek. Wzrost ekspresji powy¿-szych bia³ek zaobserwowano równie¿ w dojrza³ych oocytach wiñ pozyskanych z du¿ych pêcherzyków jaj-nikowych w porównaniu do rednich i ma³ych.
Pimiennictwo
1.Antosik P., Kempisty B., Bukowska D., Jackowska M., W³odarczyk R., Budna J., Brüssow K. P., Lianeri M., Jagodziñski P. P., Jakowski J. M.: Follicular size is associated with the levels of transcripts and proteins of selected molecules responsible for the fertilization ability of oocytes of puberal gilts. J. Reprod. Dev. 2009, 55, 588-593.
2.Antosik P., Kempisty B., Jackowska M., Bukowska D., Lianeri M., Brüssow K. P., Wozna M., Jaskowski J. M.: The morphology of porcine oocytes is associated with zona pellucida glycoprotein 3 and integrin beta 2protein levels. Vet. Med. 2010, 55, 154-162.
3.Bierie B., Moses H. L.: TGF b: the molecular Jekyll and Hyde of cancer. Nat. Rev. Cancer 2006, 6, 506-520.
4.B³aszczyk B.: Specyfika folikulogenezy i steroidogenezy jajnikowej wini do-mowej (sus scrofa f. domestica). Kosmos Probl. Nauk Biol. 2008, 57, 157-163. 5.Bork P.: A trefoil domain in the rabbit zona pellucida protein. Protein Sci. 1993,
2, 669-670.
6.Bork P., Sander C.: A large domain common to sperm receptors (Zp2 and Zp3) and TGF-beta type III receptor. FEBS Lett. 1992, 300, 237-240.
7.Brüssow K. P., Torner H., Rátky J., Schneider F., Kanitz W., Kochling W.: Aspects of follicular development and intrafollicular oocyte maturation in gilts. Reprod. Domest. Anim. 1996, 31, 555-563.
8.Bukowska D., Kempisty B., Antosik P., Jackowska M., Wona M., Lianeri M., Jakowski J. M.: Association between the number and quality of bitch COCs and selected donor factors. Medycyna Wet. 2010, 66, 433-504.
9.Bukowska D., Kempisty B., Antosik P., Jakowski J. M., Olechnowicz J.: Selec-ted aspects of canine oocytes maturation, fertilization and embryo development in dogs. Medycyna Wet. 2008, 64, 617-736.
10.Caestecker M. de: The transforming growth factor-b superfamily of receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 2004, 15, 1-11.
11.Ensslin M., Vogel T., Calvete J. J., Thole H. H., Schmidtke J., Matsuda T., Töpfer--Petersen E.: Molecular cloning and characterization of P47, a novel boar sperm--associated zona pellucida-binding protein homologous to a family of mamma-lian secretory proteins. Biol. Reprod. 1998, 58, 1057-1064.
12.Flanders K. C., Burmester J. K.: Medical applications of TGF-b. Clin. Med. Res. 2003, 1, 13-20.
13.Friess A. E., Toepfer-Petersen E., Nguyen H., Schill W. B.: Electron microsco-pic localization of a fucose-binding protein in acrosome reacted boar spermato-zoa by the fucosyl-peroxidase-gold method. Histochemistry 1987, 86, 297-303. 14.Friess A. E., Toepfer-Petersen E., Schill W. B.: Fracture labelling of boar sperma-tozoa for the fucose-binding-protein (FBP). Histochemistry 1987, 87, 181-183. 15.Gilchrist R. B., Ritter L. J., Armstrong D. T.: Oocyte-somatic cell interactions during follicle development in mammals. Anim. Reprod. Sci. 2004, 82-83, 431--446.
16.Guthrie H. D., Garrett W. M.: Apoptosis during folliculogenesis in pigs. Repro-duction suppl. 2001, 58, 17-29.
17.Harris J. D., Hibler D. W., Fontenot G. K., Hsu K. T., Yurewicz E. C., Sacco A. G.: Cloning and characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a variety of mammalian species: the ZPA, ZPB and ZPC gene families. DNA Seq. 1994, 4, 361-393.
18.Hughes D. C.: ZP genes in avian species illustrate the dynamic evolution of the vertebrate egg envelope. Cytogenet. Genome Res. 2007, 117, 86-91. 19.Hunter M. G.: Oocyte maturation and ovum quality in pigs. Rev. Reprod. 2000,
5, 122-130.
20.Hunter M. G., Brankin V., Quinn R. L., Ferguson E. M., Edwards S. A., Ashworth C. J.: Oocyte-somatic cellendocrine interactions in pigs. Domest. Anim. Endocrinol. 2005, 29, 371-384.
21.Iwamoto K., Ikeda K., Yonezawa N., Noguchi S., Kudo K., Hamano S., Kuwa-yama M., Nakano M.: Disulfide formation in bovine zona pellucida glycoprote-ins during fertilization: evidence for the involvement of cystine cross-linkages in hardening of the zona pellucida. J. Reprod. Fertil. 1999, 117, 395-402. 22.Jackowska M., Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Budna J., Lianeri M.,
Rosiñska E., Wona M., Jagodziñski P. P., Jakowski J. M.: The morphology of porcine oocytes is associated with zona pellucida glycoprotein transcript contents. Reprod. Biol. 2009, 9, 79-85.
23.Kauffold J., Rautenberg T., Richter A., Waehner M., Sobiraj A.: Ultrasonogra-phic characterization of the ovaries and the uterus in prepubertal and pubertal gilts. Theriogenology 2004, 61, 1635-1648.
24.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Analysis of selected transcript levels in porcine sperma-tozoa, oocytes, zygotes and two-cell stage embryos. Reprod. Fertil. Dev. 2008, 20, 513-518.
25.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Assessment of zona pellucida glycoprotein and integrin transcript contents in porcine oocytes. Reprod. Biol. 2009, 9, 71-78. 26.Kempisty B., Bukowska D., Wona M., Sikora J., Jakowski J. M.: Molecular
aspects of sperm-egg fusion in mammals. Medycyna Wet. 2010, 66, 544-547. 27.Knight P. G., Glister C.: Local roles of TGF-â superfamily members in the
control of ovarian follicle development. Anim. Reprod. Sci. 2003, 78, 165-183. 28.Knox R. V.: Recruitment and selection of ovarian follicles for determination of
ovulation rate in the pig. Domest. Anim. Endocrinol. 2005, 29, 385-397. 29.Kudo K., Yonezawa N., Katsumata T., Aoki H., Nakano M.: Localization of
carbohydrate chains of pig sperm ligand in the glycoprotein ZPB of egg zona pellucida. Eur. J. Biochem. 1998, 15, 252, 492-499.
30.Li H. K., Kuo T., BYang H. S., Chen L. R., Shoei-Lung Li S., Huang H. W.: Differential gene expression of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 during in vitro maturation of porcine oocytes and early embryos. Anim. Reprod. Sci. 2008, 103, 312-322.
31.Litscher E. S., Wassarman P. M.: Egg extracellular coat proteins: from fish to mammals. Histol. Histopathol. 2007, 22, 337-347.
32.Madej A., Lang A., Brandt Y., Kindahl H., Madsen M. T., Einarsson S.: Factors regulating ovarian function in pigs. Domest. Anim. Endocrinol. 2005, 29, 347--361.
33.Massague J., Wotton D.: Transcriptional control by the TGF-beta/Smad signa-ling system. Embo. J. 2000, 19, 1745-1754.
34.Moustakas A., Souchelnytskyi S., Heldin C. H.: Smad regulation in TGF-b signal transduction. J. Cell. Sci. 2001, 114, 4359-4369.
35.Niemczyk M., Foroncewicz B., Mucha K.: Rola TGF b. Pol. Arch. Med. Wew. 2005, 113, 401-408.
36.Shur B. D., Ensslin M. A., Rodeheffer C.: SED1 function during mammalian sperm-egg adhesion. Curr. Opin. Cell Biol. 2004, 16, 477-485.
37.Sinowatz F., Töpfer-Petersen E., Kölle S., Palma G.: Functional morphology of the zona pellucida. Anat. Histol. Embryol. 2001, 30, 257-263.
38.Spargo S. C., Hope R. M.: Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family. Biol. Reprod. 2003, 68, 358-362.
39.Stêpieñ-Wyrobiec O., Hrycek A., Wyrobiec G.: Transforming growth factor beta (TGF-beta): Its structure, function, and role in the pathogenesis of systemic lupus. Postêpy Hig. Med. Dow. 2008, 62, 688-693.
40.Szczebiot A., Janowski T.: Badanie ultrasonograficzne jajników u wiñ. Medy-cyna Wet. 2008, 64, 395-399.
41.Töpfer-Petersen E., Ekhlasi-Hundrieser M., Tsolova M.: Glycobiology of fertilization in the pig. Int J. Dev. Biol. 2008, 52, 717-736.
42.Töpfer-Petersen E., Heissler E., Schill W. B.: The kinetic of acrosome reaction an additional sperm parameter? Andrologia 1985, 17, 224-227.
43.Töpfer-Petersen E., Henschen A.: Acrosin shows zona and fucose binding, novel properties for a serine proteinase. FEBS Lett. 1987, 226, 38-42. 44.Töpfer-Petersen E., Romero A., Varela P. F., Ekhlasi-Hundrieser M., Dostàlovà Z.,
Sanz L., Calvete J. J.: Spermadhesins: a new protein family. Facts, hypotheses and perspectives. Andrologia 1998, 30, 217-224.
45.Waberski D., Kunz-Schmidt A., Borchard Neto G., Richter L., Weitze K.: Real--time ultrasound diagnosis of ovulation and ovarian cysts in sows and its impact on artifical insemination efficiency. Proc. Am. Soc. Anim. Sci. 1999, 1-8. 46.Wassarman P. M., Kinloch R. A.: Gene expression Turing oogenesis in mice.
Mutat. Res. 1992, 296, 3-15.
47.Woodruff T. K.: Regulation of cellular and system function by activin. Biochem. Pharmacol. 1998, 55, 953-963.
48.Yurewicz E. C., Sacco A. G., Gupta S. K., Xu N., Gage D. A.: Hetero-oligomeri-zation-dependent binding of pig oocyte zona pellucida glycoproteins ZPB and ZPC to boar sperm membrane vesicles. J. Biol. Chem. 1998, 273, 7488-7494.
Adres autora: dr Bartosz Kempisty, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ; e-mail: etok@op.pl
