Komórki neuroendokrynne tchawicy u chorych z rakiem krtani

(1)

183 Olszewska M., Chodynicki S., Chyczewski L. i wsp.: Komórki neuroendokrynne tchawicy u chorych z rakiem krtani

Komórki neuroendokr

Komórki neuroendokrynne tchawicy u chor

ynne tchawicy u chor

ynne tchawicy u chor ych z rakiem

ych z rakiem

krtani

Neuroendocrine cells in the trachea of patients with lar

Neuroendocrine cells in the trachea of patients with lar ynx cancer

ynx cancer

M

ONIKA

O

LSZEWSKA1/

, S

TANIS£AW

C

HODYNICKI2/

, L

ECH

C

HYCZEWSKI3/

, M

AREK

R

OGOWSKI2/

, A

LBERT

A

UGUSTYNOWICZ4/

,

M

ACIEJ

C

HODYNICKI5/

1/

Oddzia³ Medycyny Ratunkowej Dzieci SPDSK AM, ul. Waszyngtona 17, 15-269 Bia³ystok 2/

Klinika Otolaryngologii AM, ul. Sk³odowskiej-Curie 24A, 15-264 Bia³ystok 3/

Zak³ad Biologii Molekularnej AM, ul. Waszyngtona 13, 15-269 Bia³ystok 4/

Zak³ad Patomorfologii Lekarskiej AM, ul. Waszyngtona 13, 15-269 Bia³ystok 5/

Department of Psychiatry, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Maryland

Wprowadzenie Wprowadzenie Wprowadzenie Wprowadzenie

Wprowadzenie. Komórki neuroendokrynne znajduj¹ siê w nab³onku dróg oddechowych cz³owieka i nale¿¹ do uk³adu APUD (Amine Precursors Uptake and Decarboxylation). Najbardziej charakterystyczn¹ ich cech¹ jest obecnoœæ ziarnistoœci neurowydzielniczych. Uwa¿ane s¹ one za miejsce syntetyzowa-nia, magazynowania i wydzielania amin i hormonów peptydowych. Cel

Cel Cel Cel

Cel. Ocena morfometryczna komórek neuroendokrynnych (NE) w nab³onku tchawicy u chorych z rakiem krtani.

Materia³ i metody Materia³ i metody Materia³ i metody Materia³ i metody

Materia³ i metody. Wycinki tchawicy pobrano podczas tracheotomii od 30 pacjentów z nowotworami krtani oraz 20 pacjentów, hospitalizowanych na oddzia³ach intensywnej opieki medycznej. Pobrany materia³ zosta³ opraco-wany histologicznie i zabarwiony z wykorzystaniem przeciwcia³ przeciwko chromograninie A, neurospecyficznej enolazie, synaptofizynie i kalcytoninie. Wyniki

Wyniki Wyniki Wyniki

Wyniki. U chorych z rakiem krtani obserwowano komórki neuroendokryn-ne u wszystkich pacjentów (100%), natomiast w grupie porównawczej wykazano obecnoœæ komórek neuroendokrynnych jedynie u 45% pacjen-tów. W grupie pacjentów onkologicznych obserwowano wiêksze zagêsz-czenie komórek NE (œrednio 334 komórki na mm2 _{powierzchni nab³onka}

tchawicy w porównaniu z 20 komórkami na mm2_{w grupie porównawczej)}

oraz wiêksze ich zró¿nicowanie pod wzglêdem wielkoœci. Wnioski

Wnioski Wnioski Wnioski

Wnioski. U chorych z nowotworami krtani obserwuje siê zwiêkszon¹ proli-feracjê i polimorfizm komórek neuroendokrynnych nab³onka tchawicy. Otorynolaryngologia, 2005, 4(4), 183-186

S³owa kluczowe: S³owa kluczowe: S³owa kluczowe: S³owa kluczowe:

S³owa kluczowe: nab³onek tchawicy, komórki neuroendokrynne, rak krtani

Introduction Introduction Introduction Introduction

Introduction. Neuroendocrine cells are localized in the respiratory tract epi-thelium and belong to the APUD (Amine Precursors Uptake and Decarboxy-lation) system. Their most characteristic feature is the presence of neurose-cretory granulations. They synthesize, store and secrete amines and peptide hormones.

Aim Aim Aim Aim

Aim. Morphometric assessment of neuroendocrine cells in the trachea of larynx cancer patients.

Material and methods Material and methods Material and methods Material and methods

Material and methods. Fragments of tracheas were obtained during the tracheostomy from 30 patients with cancer of the larynx and 20 patients hospitalized in intensive care units. Primary antibodies against chromogra-nin A, neurospecific enolase, synaptophizine and calcitochromogra-nine were used in immunohistochemical tissue evaluation.

Results Results Results Results

Results. Increased numbers of neuroendocrine cells in the tracheal epithe-lium were observed in all patients with larynx cancer, while in the control group the neuroendocrine cells were observed only in 45% patients. Hi-gher neuroendocrine cell densities (on average 334 cells per sq.mm of the tracheal epithelium in the cancer patients vs. 20 cells per sq.mm in controls); neuroendocrine cells of the cancer patients were also found to vary conside-rably more in size.

Conclusions Conclusions Conclusions Conclusions

Conclusions. Increased neuroendocrine cell polymorphism and prolifera-tion rates were observed in the larynx cancer patients.

Otorynolaryngologia, 2005, 4(4), 183-186 Key words:

Key words: Key words: Key words:

Key words: Tracheal epithelium, neuroendocrine cells, larynx cancer

Otorynolaryngologia, 2005, 4(2), 183-186 PRACE ORYGINALNE PRACE ORYGINALNE PRACE ORYGINALNE PRACE ORYGINALNE PRACE ORYGINALNE

P³ucne komórki neuroendokrynne zosta³y po raz pierwszy opisane przez Feyerter’a w 1938 i s¹ czêœci¹ rozsianego systemu endokrynnego, zwanego systemem Amine Precursors Uptake Dekarboxilation (APUD) [1]. Termin ten zosta³ wprowadzony przez Pearse’a, dla wyodrêbnionej grupy komórek o szczególnych cechach cytochemicznych i ultrastrukturalnych [2,3]. Komórki te pojawiaj¹ siê oko³o 8 tygodnia ¿ycia p³odowego,

a przez nastêpne 10 tygodni ró¿nicuj¹ siê w pojedyncze komórki lub ich skupiska zwane cia³ami neuroepitelial-nymi [4]. Komórki neuroendokrynne (NE) s¹ bardzo liczne u p³odu i noworodka, a nastêpnie ich liczba znacz-nie siê zmznacz-niejsza [5]. W warunkach fizjologii na jeden centymetr b³ony podstawnej dróg oddechowych (p³uc) obserwowana jest jedna komórka neuroendokrynna [6,7]. Obecnoœæ komórek NE jest charakterystyczna dla wielu

(2)

184 Otorynolaryngologia, 2005, 4(4), 183-186

gruczo³ów dokrewnych w obrêbie przewodu pokarmo-wego, uk³adu moczowo-p³ciopokarmo-wego, nerwowego i dróg od-dechowych. Jedn¹ z cech tych komórek s¹ ziarnistoœci zawieraj¹ce wiele substancji syntetyzowanych, magazy-nowanych i wydzielanych [4]. Wœród nich nale¿y wy-mieniæ substancje biologicznie aktywne, takie jak: sero-tonina, synaptofizyna, kalcysero-tonina, chromogranina, neu-rospecyficzna enolaza, peptyd zwi¹zany z genem kalcy-toniny, enkefalina, endotelina, bombezyna, czyli peptyd uwalniaj¹cy gastrynê, somatostatyna, cholecystokinina i substancja P [4,5,8,9]. Ró¿ne rodzaje peptydów mog¹ byæ umiejscowione w ró¿nych komórkach, ale równie¿ w obrêbie tej samej komórki, a nawet tej samej ziarni-stoœci [5]. Komórki NE wydzielaj¹ wytwarzane przez siebie substancje do podœcieliska, bardzo blisko b³ony miêœniowej oskrzeli i tchawicy, ale równie¿ w pobli¿u innych komórek nab³onkowych i do œwiat³a oskrzela [5]. U ludzi komórki NE obecne s¹ na ca³ej d³ugoœci b³ony œluzowej tchawicy, oskrzeli i oskrzelików, a¿ do pozio-mu przewodów pêcherzykowych. Lokalizuj¹ siê blisko b³ony podstawnej, niekiedy siêgaj¹c œwiat³a dróg odde-chowych [2]. Komórki NE odgrywaj¹ potencjaln¹ rolê w zapaleniu dróg oddechowych, przebudowie œciany oskrzeli oraz przewlek³ym zwê¿eniu dróg oddechowych [9].

M

ATERIA£IMETODY

Wycinki tchawicy pobrane na poziomie 2 i 3 chrz¹stki tchawiczej, pochodzi³y od 30 pacjentów ho-spitalizowanych z powodu nowotworów krtani. Uzyska-ny materia³ w 28 przypadkach (93%) pochodzi³ od mê¿-czyzn, a w 2 przypadkach (7%) od kobiet z rozpozna-nym rakiem p³askonab³onkowym krtani. Œrednia wieku u chorych z rakiem krtani wynosi³a 60,5 roku z czego pacjenci w wieku 47-57 lat stanowili 11 (36,6%), w wie-ku 58-68 równie¿ 11 (36,6%), a pacjentów w przedzia-le wiekowym 69-79 by³o 8 (26,6%). Materia³ porów-nawczy stanowi³y wycinki tchawicy pochodz¹ce od 20 pacjentów w wieku 21-74 lat, hospitalizowanych na oddzia³ach intensywnej opieki medycznej, u których tra-cheotomia wykonywana by³a z powodu przed³u¿onej intubacji. Przyczyny hospitalizacji tych pacjentów by³y bardzo zró¿nicowane, jednak w grupie tej nie by³o pa-cjentów z procesem nowotworowym. Materia³ bezpo-œrednio po pobraniu zosta³ utrwalony w zbuforowanej formalinie, a nastêpnie sporz¹dzane by³y skrawki para-finowe. Preparaty przegl¹dowe barwiono hematoksylin¹ i eozyn¹ (HE), a komórki neuroendokrynne wykrywano za pomoc¹ reakcji immunohistochemicznych. Wykony-wane by³y reakcje z przeciwcia³ami firmy DAKO skie-rowanymi przeciwko bia³kom funkcjonalnym takim jak: chromagranina A, synaptofizyna, kalcytonina, oraz neu-rospecyficzna enolaza. Reakcje wykonano zgodnie z pro-toko³ami zaproponowanymi przez producenta

przeciw-cia³. Gotowe preparaty histologiczne analizowane by³y pod mikroskopem œwietlnym sprzê¿onym z kompute-rem przy wykorzystaniu programu morfometrycznego do oceny komórek neuroendokrynnych. Uzyskane wy-niki opracowano statystycznie przy udziale testu Mann-Whitney’a.

W

YNIKI

W preparatach tchawicy chorych z nowotworami krta-ni, widoczny jest dobrze zachowany nab³onek wielorzê-dowy migawkowy. Nab³onek wykazuje zró¿nicowanie gruboœci zarówno w grupie porównawczej, jak i bada-nej. W grupie 30 pacjentów z rakiem krtani u 17 (56,6%) obserwowano prawid³owy nab³onek wielorzêdowy mi-gawkowy, natomiast w 13 przypadkach (43,3%) nab³o-nek by³ cienki i trudny do oceny, nierzadko z cechami ogniskowej metaplazji p³askonab³onkowej. W grupie po-równawczej spoœród 20 przypadków w 14 (70%) obser-wowany nab³onek by³ prawid³owy, a w 6 przypadkach (30%) by³ bardzo cienki, z cechami ogniskowej metapla-zji p³askonab³onkowej. Barwienia immunohistochemicz-ne wykaza³y obecnoœæ w nab³onku dróg oddechowych komórek neuroendokrynnych w kszta³cie wrzecionowa-tym i sto¿kowawrzecionowa-tym. Komórki te s¹ wyposa¿one w wy-pustki cytoplazmatyczne siêgaj¹ce do b³ony podstawnej i w pobli¿e œwiat³a przewodów oddechowych (ryc. 1a). Oœ d³uga komórek jest prostopad³a do b³ony podstaw-nej, a wypustki rozpoœcieraj¹ siê pomiêdzy s¹siaduj¹cy-mi komórkas¹siaduj¹cy-mi nab³onka tchawicy. Stwierdzono zwiêk-szon¹ liczbê komórek NE w tchawicy u pacjentów z ra-kiem krtani. Chorzy z rara-kiem krtani wykazywali du¿y stopieñ zaawansowania choroby nowotworowej wed³ug klasyfikacji TNM. 47% z nich to by³y raki okreœlane jako T3, 23% jako T4, 20% jako T2, 10% jako T1. Im

wiêksze stadium zaawansowania procesu nowotworowe-go tym wiêksz¹ liczbê komórek NE uda³o siê zaobser-wowaæ (ryc. 1b). U chorych z rakiem krtani obserwowa-no komórki neuroendokrynne u wszystkich pacjentów (100%), natomiast w grupie porównawczej wykazano obecnoœæ komórek neuroendokrynnych jedynie u 45% pacjentów. W grupie pacjentów onkologicznych obser-wowano zdecydowanie wiêksze zagêszczenie komórek

NE - œrednio 334 komórki na mm2_powierzchni

na-b³onka tchawicy, zaœ w grupie porównawczej œrednio 20 komórek na mm2 (p<0,001) (ryc. 2). W grupie pacjen-tów z rakiem krtani stwierdzono wiêksze zró¿nicowanie komórek pod wzglêdem wielkoœci. Obserwowano zde-cydowan¹ przewagê komórek drobnych, o ma³ej

po-wierzchni - w przedziale wielkoœci od 0-10 µm2 oraz

nieliczne komórki bardzo du¿ych rozmiarów o po-wierzchni powy¿ej 140 µm2 _{(ryc. 3, tab. I). W grupie}

porównawczej wystêpowa³y przewa¿nie komórki ma³ej

wielkoœci poni¿ej 30 µm2 _{. W badanej grupie chorzy}

(3)

185 Olszewska M., Chodynicki S., Chyczewski L. i wsp.: Komórki neuroendokrynne tchawicy u chorych z rakiem krtani

Ryc. 2. Liczba komórek neuroendokrynnych przypadaj¹cych na mm2

po-wierzchni b³ony œluzowej nab³onka tchawicy, p<0,0001

numer analizowanego przypadku

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 lic zba k om ór ek N E Grupa badana 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ₁₀ ₁₁ ₁₂ ₁₃ ₁₄ ₁₅ ₁₆ ₁₇ ₁₈ ₁₉ ₂₀

nume r analizowane go przypadku

lic zb a k om ór ek N E Grupa porównawcza

Tabela I. Rozk³ad liczbowy komórek NE w grupie badanej i porównawczej w zale¿noœci od ich wielkoœci

Liczba komórek NE w przedzia³ach wielkoœci

Wielkoœæ komórki w µm2 _{Grupa badana} _{Grupa porównawcza}

0 <x< 10 1141 33 10 <x< 20 931 20 20 <x< 30 410 22 30 <x< 40 232 6 40 <x< 50 113 6 50 <x< 60 82 2 60 <x< 70 42 0 70 <x< 80 43 1 80 <x< 90 26 0 90 <x< 100 23 0 100 <x< 110 13 0 110 <x< 120 10 0 120 <x< 130 9 0 130 <x< 140 10 0 140 <x< 150 3 0 150 <x< 160 4 0 160 <x< 170 5 0 170 <x< 180 2 0 180 <x< 190 1 0 190 <x< 200 1 0 200 <x< 210 1 0 210 <x< 220 1 0 220 <x< 230 0 0 230 <x< 240 1 0 240 <x< 250 0 0 250 <x< 260 0 0 260 <x< 270 0 0 270 <x< 280 0 0 280 <x< 290 1 0 290 <x< 300 0 0 300 <x< 310 0 0 310 <x< 320 0 0 320 <x< 330 1 0 330 <x< 340 0 0 340 <x< 350 0 0 350 <x< 360 1 0

Ryc. 3. Œrednia liczba komórek NE o danej powierzchni w µm2

przypadaj¹-cych na jednego pacjenta, p<0,0001

0 1 2 3 4 5 6 7 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 powierzchnia komórek NE w µm2 r edni a lic zba k om ór ek N E grupa badana grupa porównawcza

tytoniowy, palili od 20 do 40 papierosów dziennie. Fakt ten mo¿e mieæ wp³yw na zwiêkszon¹ proliferacjê komó-rek NE w grupie pacjentów z nowotworami krtani.

Ryc. 1b. Liczne komórki neuroendokrynne u chorego z rakiem krtani Ryc. 1a. Komórka neuroendokrynna w warstwie podstawnej nab³onka u

(4)

186 Otorynolaryngologia, 2005, 4(4), 183-186

D

YSKUSJA

Feyerter opisa³ komórki neuroendokrynne w ludz-kich p³ucach ponad pó³ wieku temu. Nasza wiedza na ten temat do niedawna pozostawa³a niewielka, g³ównie ze wzglêdu na trudnoœci w identyfikacji komórek do-krewnych w barwieniu HE w mikroskopie œwietlnym. Dziêki rozwojowi technik immunohistochemicznych sta³o siê ³atwiejsze badanie systemu komórek neuroen-dokrynnych. W barwieniach tych wykorzystana zosta³a cecha neurowydzielnicza komórek zwi¹zana z produkcj¹ bioaktywnych substancji. Barwienia te pozwalaj¹ na ³atw¹ lokalizacjê komórek NE poœród innych komórek nab³onka [10, 11]. Wielu autorów podejmowa³o bada-nia nad ocen¹ jakoœciow¹ i iloœciow¹ komórek NE w dol-nych drogach oddechowych [1, 4, 6, 7, 8, 12, 13]. Yu i wsp. ocenili wystêpowanie komórek NE w krtani ko-tów [14] natomiast w oparciu o dostêpny przegl¹d pi-œmiennictwa nikt nie podj¹³ siê opisu tych komórek w ludzkiej tchawicy. W warunkach fizjologii komórki NE wystêpuj¹ w drogach oddechowych (w p³ucach) do-ros³ego cz³owieka z niezwyk³¹ rzadkoœci¹: w przybli¿e-niu 1 komórka na 1cm b³ony podstawnej [6, 7, 16].

Przeprowadzono badania wycinków tchawicy od pacjentów z nowotworami krtani. Wykaza³y one obec-noœæ w nab³onku tchawicy licznych komórek NE. Ko-mórki te charakteryzowa³y siê zró¿nicowan¹ wielkoœci¹ z przewag¹ komórek ma³ych i du¿ych w zestawieniu z grup¹ porównawcz¹. Liczba komórek by³a zale¿na od stopnia zaawansowania procesu nowotworowego. W gru-pie porównawczej znajdowano pojedyncze komórki wy-kazuj¹ce ekspresjê chromograniny. W obecnym bada-niu istnieje wyraŸna tendencja do wzrostu liczby komó-rek NE w nab³onku tchawicy u chorych z rakiem krtani.

Piœmiennictwo

1. Gosney JR. Pulmonary neuroendocrine cells in species at high altitude. Anat Rec 1993; 236(1): 105-107, 108-112, 122-128. 2. Fiks T, S³odkowska J. Morfologiczne i czynnoœciowe aspekty komórek rozproszonego uk³adu neuroendokrynnego dróg oddechowych. Pneumonol Pol 1989; 58: 7-9.

3. Rosai J. An evolutionary view of neuroendocrine cells and their tumors. Int J Surg Pathol 2001; 9(2): 87-92.

4. Chyczewski L, Rydzewska-Roso³owska AE, Chyczewska E i wsp. Preneoplastic changes in lungs. (w) Endocrine disrupters and carcinogenic risk assessment. Chyczewski L, Nikliñski J, Pluygers E. (red.) 2002: 147-177.

5. Rowiñska-Zakrzewska E. Neuroendokrynne komórki uk³adu oddechowego i neuroendokrynne raki p³uca. Pneumonol Alergol Pol 1995; 63(1-2): 99-103.

6. Boers JE, Brok JLM, Koudstaal J, Arends JW, Thunnissen FBJM. Number and proliferation of neuroendocrine cells in normal human airway epithelium. Am J Respir Crit Care Med 1996; 154: 758-753.

7. Gubbelmans HLL, Maesen BLP, Koudstaal J, Thunnissen FBJM. Neuroendocrine cells in anthracosilicotic lungs. Eur Respir J 1991; 4(7): 824-828.

8. Adriaensen D, Scheuermann D. Neuroendocrine cells and nerves of the lung. The Anatomical Record 1993; 236: 70-85.

9. Siemiñska A, Olszewska A. Role of neuroendocrine cells and bombesine-like neuropeptides in the pathogenesis of smoking related diseases, especially chronic obstructive pulmonary disease. Pneumonol Alergol Pol 1997; 65(1-2): 123-128.

10. Takaaki I. Differentiation and proliferation of pulmonary neuroendocrine cells. Prog Histochem Cytochem 1999; 34(4): 247-322.

11. Wilson BS, Lloyd RV. Detection of chromogranin in neuroendocrine cells with a monoclonal antibody. Am J Pathol 1984; 115: 458-468.

12. Ghatei MA, Sheppard MN. Bombesine and vasoactive intestinal polypeptide in the developing lung: marked changes in acute respiratory distress sindrome. J Clin Endocrinol Metab 1983; 57: 1226-1232.

13. Nylen ES, Linnoila RI, Becker KL. Prenatal cholinergic stimulation of pulmonary neuroendocrine cells by nicotine. Acta Physiol Scant 1988; 132(1): 117-118.

14. Yu YC, Miyazaki J, Shin T. Neuroendocrine cells in the cat laryngeal epithelium. Eur Arch Otorhinolaryngol 1996; 253(4-5): 287-293. 15. Aguayo SM. Determinants of susceptibility to cigarette smoke.

Am J Respir Crit Care Med 1994; 149(6): 1692-1698. 16. Johnson DE, Georgieff MK. Pulmonary neuroendocrine cells.

Am Rev Respir Dis 1989; 140: 1807-1812.

Mo¿e mieæ na to wp³yw dym tytoniowy oraz hipoksja, która nasila siê wraz ze wzrostem stadium zaawansowa-nia nowotworowego. W materiale pochodz¹cym od pa-cjentów z rakiem krtani obserwowaliœmy znacznie wiêk-szy odsetek hipertroficznych komórek NE. Wyniki na-szych badañ wskazuj¹ na prawdopodobny zwi¹zek pro-cesu nowotworowego z hipertrofi¹ i proliferacj¹ komó-rek neuroendokrynnych. Badania dowodz¹, ¿e w prze-biegu tocz¹cych siê procesów patologicznych w obrêbie dróg oddechowych komórki NE ulegaj¹ proliferacji i hi-pertrofii [6, 10]. Dotyczy to g³ównie chorób tytonioza-le¿nych takich jak: przewlek³a obturacyjna choroba p³uc, rak p³uca, ziarniniak kwasoch³onny, czy zapalenie oskrze-lików [3, 9, 13, 15]. Mo¿na przypuszczaæ, ¿e wzrost liczby komórek NE zwi¹zany jest z reakcj¹ organizmu na szereg czynników , które doprowadzaj¹ do kancero-genezy w obrêbie krtani. Na nab³onek tchawicy wywie-raj¹ wp³yw ró¿ne czynniki œrodowiskowe oraz czêsto substancje zawarte w dymie tytoniowym. Wyniki ba-dañ wskazuj¹, ¿e zwi¹zki chemiczne zawarte w dymie tytoniowym oraz miejscowa hipoksja mo¿e prowadziæ do wzrostu liczby komórek NE w tchawicy u chorych z nowotworami górnych dróg oddechowych. W nab³on-ku dochodzi do metaplazji p³askonab³onkowej, natomiast rzadko wystêpuje rak tchawicy. Byæ mo¿e komórki NE stanowi¹ jeden z mechanizmów obronnych tego narz¹du. Reasumuj¹c, uzyskane wyniki wskazuj¹, ¿e w na-b³onku tchawicy chorych z rakiem krtani obserwuje siê zwiêkszon¹ liczbê komórek neuroendokrynnych. Ko-mórki neuroendokrynne w tchawicy u chorych z rakiem krtani wykazuj¹ wiêksze zró¿nicowanie morfologiczne dotycz¹ce kszta³tu i wielkoœci. Liczba komórek neuro-endokrynnych wzrasta wraz ze stopniem zaawansowa-nia raka krtani.