Fabrieksschema over de bereiding van vitamine B2 (riboflavine)

I ' FABRIEKSSCHEIVIA OVER A.H.Besier Klaverstraat 16 , s-Gravenhage

- - - . _- - - _.

-1-I. Inleiding

Reeds aan het eind van de

1g

e eeuw werd melding gemaakt van de isolering van een gele kleurstof uit melk.(1) Een zelfde stof werd gevonden in

eiwit, lever, nier, urine, spierweefsel, gist en zekere plantenmaterlalen. (2). De stof bleek bestendig te zijn tegen hitte. De onderzoekers

P Kuhn, G.GyErgy en T.Wagner-Jauregg toonden aan dat de uit eiwit ge-isoleerde stof bij voeding aan ratten met een hoeveelheid van 10~g/dag

een grmei veroorzaakten van 10 g/week.

Later ging men verwantschap veronderstellen tussen dit pigment en het gele ademhalingsferment van Warburg, (3) , een enzym met een oxydatie-reductie systeem, dat voor de waterstofoverdraging in het lichaam zorg draagt. Dit ferment bleek aanwezig te zijn in alle levende cellen. Het kristallijne product bestaat uit lange oranje-gele naalden • Ze zijn stabiel wanneer ze beschermd worden tegen de invloed van het licht Licht veroorzaakt een langzame inactivering. In oplossing is het pro-duct niet stabiel. Beinvloeding treedt op van licht, temperatuur en PH ( alkalisch milieu bevordert de ontleding). Het product is oplosbaar

in water, matig in alc9hOI. De waterige oplossing is geel-groen van

k~eur en fluoresceert sterk. Het riboflavine met formule:

CH20H

,

HOCH

_,

HeeR t HOOR H _HCH

,

Groeiproeven werden eveneens genomen met stoffen die zeer

is in het ademhalingsferment aanwezig als phosphorzure ester gebonden aan eiwit:

, OH / CH

-o-p

'._--

0 , 2 " Hö6H

_,

OH HOCR

_,

HOÇH f HCH H eiwit

verwant zijn met riboflavine, maar geen van allen gaven een activiteit als het vitamine zelf. Onderzocht werden stoffen waarvan de riboserest van het flavihe vervangen waren door suikerresten en verder de stoffen:

' ,.

7 Me-9-(d,l' ribityl)-isoalloxazine 6 Me-9-(d,l' ribityl)-isoalloxazine

6 Et-7 Me -9-(d,l' ribityl)-isoalloxazine

-2-(De systematische naam van riboflavine is 6,7 di-Me-9-(d.l'ribit~l)

isoalloxazine }.

11. Bereiding van vitamine B₂

Na vele pogingen slaagden tegelijkertijd de o~derzoekers Kuhn en Karrer er in het riboflavine synthetisch te bereiden. (4,5,6). Als een van de producten nodig voor de synthese moet genoemd worden het ribose, dat eerst zelf gesynthetiseerd moet worden.

COOR t RÇOH HOOH t HOOR f HO OH t CH20H D-.gluconzuur

>

H OH H Br

""

, , / C ç~

HOC~

ACO~H

,

HCJOH 0 __ ~ HOOAc 0 ~

He)

j

H~

~

t CH20H D-arabinose CH"NH2 , c-HOOE CH 20Ac Acetobroom-D-arabinose f _---"~ .... ~ HOOH t HO OH

_,

OH OH D-rib~mine CH~ ~H I H~OH 0 ~

mJ __

-

J

D .... arabinal

Het ribamine laat men reageren met 1,2 di Me, 4,5 dinitro benzeen. Uit het reactieproduct wordt door reductie 2-amino-4,5

qiMe-plienyl-D-ribamine gemaakt.

Koppeling van dit laatste produciAgeeft vorming van riboflavine.

I I .

..

I

·

l a

-3-De moeilijkheid bij al deze methoden is het gebruik van ribose als uit-gangsproduct. Dit moet zelf worden gesynthetiseerd. Er zijn ook wel enkele

processen ontwikkeld, waarbij geen ribose nodig is. Ze verlopen alle over

vele trappen en geven een laag rendement.

Vandaar dat men dus voor de vervaardiging van riboflavine is gaan zoeken naar een biologisch proces .

Zeer veel microorganismen blijken in staat het vitamine te synthetisgre~,

zoals gisten, schimme~ls en bacterien (zie de tabel op de bladzijden)Ys' en 4 van dit verslag). De prOductie ~an de meeste microben is echter te

laag om een bereiding van het vitamine langs deze weg lonend te maken.

In de industrie wordt gebruik gemaakt van twee soorten schimmels nl. Eremothecium ashbyii en Ashbya gossyppii, die beiden een goede opbrengst

geven. Van Eremothecium ashbyii wordt zelfs in de litt. (7) een productie genoemd van 2480

Ó

Iml in 7 dagen. Vandaar dan ook dat dit organisme

werd gekozen voor het schema.

111. ractoren, die de productie van het

B

_{2 beinvloeden}

Bij de prOductie van vitamine B2 met behulp van de schimmel Eremothecium ashbyii heeft men met vele factoren rekening te houden, van invloed op

de grootte van de productie. Deze zijn:

A. ~~_g~~1!~~~!~y~_~~_~~~~!~~~!~y~_~~~~~~!!!~g_y~_g~~_~~~!~~

In de media is nodig een geschikte koolhydraat, een stikstofverbinding, zouten en eventueel bijzondere bestanddelen.

1~ Als koolhydraat werd in het begin genomen glucose of verstijfseld zetmeel. Later zijn deze door goedkopere prOducten vervangen

zoals cerelose en melasse. Deze laatste stof bevat nog een groot gehalte aan vergistbare suiker

(50%)

en nog wat zouten.

2. Voor eiwitvoeding

eN)

nam men in het begin gewoon eiwit en / of aminozuren,bv: pepton, gistextract, bouillon, asparagine, glycine. Ook deze producten zijn later door goedkopere vervangen, nl. door: Corn

· .

.

.

. . .

Steep Liquor, een aftreksel van maisafval (zemelen,stofmeel )

_.

.

.

. .

.

met een hoog gehllte aan aminozuren en zouten (8)

Animal

·

. . .

.

Stick Liquor, een afvalproduct van de slachthuizen. De afval

.

. .

. . .

.

.

.

.

.

wordt gekookt, het kooksel gefiltreedd en ingedikt.

Distiller's stillage, het residu dat

· .

. . .

. .

. .

.

. .

.

.

_.

.

men krijgt na het afdestil-leren van de alcohol en waaruit de vaste stof is afgefiltreerd.

] WR icum I

4"

llIll srne i verstijfse ~raan Ik SUCrose zo en 1 b ] + • • I.

=

Corn ) 10 6 n 4 en 8 7 (11 ) (11 ) (12) (13) (14) (15) (15) (17) (1 1 )

2. ₅ ( 2. I _1. Lf'\ I 1 ₉ n (2 1 _à

7

₍ ) 5 ) ]

₇

₎ s ( ) (25) g) 3 à 4 ) ]4 _{( )}

"

•

-6-2.:.

De zouten kunnen apart worden toegevoegd. Bij gebruik echter van '

C.S.L. en andere afvalstoffen is dit niet nodig.

4. Toevoeging van bijzondere bestanddelen kunnen de opbrengst zeer vergroten. Te vermelden zijn o.a. biotine (28) en inositol (27).

B. De sterilisatie van het medium

---Lang verhitten van het medium bij sterilisatie heeft een ongunstige invloeë op de B2 productie (8) :

methode van sterilisatie tempgratuur duur ster. opbrengst in! in F in min. mg/L 1 ."y' batch ster. 250 0 45 5 I 2500 ",/ batch ster. 25 88 continue ster. 2750 5 408

Het beste is een zg ttflashtl _{sterilisatie, dwz een sterilisatie op hoge}

temperatuur en gedurende korte tijd. Toch is goede sterilisatie noodzake"

-Djk daar Eremothecium ashbyii zeer gevmelig is voor infectie • Bovendien

loopt bij infectie de productie van _B2 sterk achteruit. Bij de nflash"

\/ sterilisatie wordt gebruik @Smaakt van de continue sterilisatie, die

I

gunstiger resultat\ln oplevert dan de "batchn-sterilisatie. Q.:. Q~_~~~E~E~~~_Y~_~~~_~~~!~

Voor de gisting is een hele serie van temperat~en geprobeerd; de beste opbrengst werd verkregen bij een tempeDatuur van

28

0 C.

(23,29,30).

Met

behulp van een watermantel moet de temperatuur gedurende de gistingstijd constant hierop gehouden worden.

D. De aeratie en het roeren

Een zeer sterke aeratie is nodig voor een gunstige B₂ opbrengst, nl van

1/4 m3 lucht / m3 vloeistof / minuut. Hierdoor wordt tevens een goede roering van de ketelinhoud verkregen.

~!_~~_E~_!~_~~~_~~~~~~

De PH voor de sterilisatie van het medium bedraagt 4.5. Dit gaf goede resultaten. Voor de gisting wordt daarna de PH gebracht op 6.0. Deze laatste

PH

wordt de hele duur van de gisting zo gehouden. Dit gebeurt~

door van tijd tot tijd wat loog toe te voegen.

(8,23).

Uit al deze gegevens werd het volgende gehaald voor het s:chema: 1. Gebr$t wordt de schimmel Eremothecium ashbyii

2. Als medium wordt genomen

2.5%

melasse(waarin

50%

droge stof) 2.5% C.S.L. (met 5ryfo droge stof)

-7-3. Continue sterilisatie gebeurt gedurende 5 minuten op 2750 C.

4. De temperatuur wordt gedurende de gisting constant gehouden op 280C.

5.

Een goede aeratie

Voor het · _{schema werd aangenomen een B2 prmductie van 1800 mg/L, een}

opbrengst die door verschillende auteurs opgegeven werd en die toch niet de hoogste waarde is die in de litt. gevonden werdt.

IV. BesChrijving van het gebruikte organisme

De gebruikte schimmel Eremothecium ashbyii werd geisoleerd in de Cong~

door de Engelse phytopathologist R.E.Massey, van een katoenvrucht • De schimmel is namelijk een plantenparasiet levend op katoen, koffie, citrusvruchten, tomaten en verschillende groenten. Op de katoen komt het voor, grote schade verooraakend aan de katoenoogst. Hier geeft het de ft internal boll rot" en de tt cotton staining". (31) (32)

Op vaste media vormt de schimmel kolonies die er gelatineus en geel uit-zien. Het mycelium. groeit ~Ch;tOarn-~ meer of minder regelmatig. In het begin ziet men geen tussenwanden in het mycelium, later treden ze echter regelmatig op, stukken van ongelijke grootte VOrmend. (33)

De voortplanting gebeurt door middel van sporangien die na 48 uur ge-vormd worden, bijna aan het eind van de myceliumdraden. In deze

sporan-sporen

gien vormen zich de Sporen. De~zijn langwerpig, aan een zijde afge-rond of als het ware scheef afgesneden, aan de andere zijde spits toe-lopend. De spore - afmeting is:29-31.~ lang en 2-2.~breed. In een sporandium. vormen zich 4-32 sporen, meestal 12-16. Op een nieuw medium. gebracht, ontkiemen deze sporen onder vorming van mycelium.

In de delen van het mycelium waar de groei vermindert ziet men een gele kleurstof verschijnen, die in oplossing gaat in de vacuolen.

V. Afscheiding van het product uit het medium

Vóór de eigenlijke isolering uit de waterige phase van het medium moet de schimmel worden verwijderd, hetgeen gebeuren kan door afcentrifugeren of affiltreren.

Voor de afscheiding zijn verschillende methoden in gebruik:

_..

1~ ~~~~t~~ met alcoholen (o.a. butanol), alcohol-water mengsels etc.,

, - - - -- - --..

franconiet,kaolien, silicagel, kieselguhr e.a. Elutie hieruit en daarop volgende omkristallisatie levert een zuiver product.

-8-Voor het verwerken van grotere porties is deze methode niet geschikt, dan neemt men liever de reductie met de daarmee gepaard gaande praeci-• pitatie van de leucoverbinding •

. ;

..

•

,

CH2 H f I N C/N-C- 0 \: \ , N ()"Q. N H (5 f H riboflavine leucoverbinding 2. ~~_~~uc~~~ kan op twee manieren worden uitgevoerd

a. Mbv reduc;tïiemiddelen

.

.

. . .

.

_.

.

.

.

.

Hiervoor gebruikt men Na~S~04·2 _{H20, stannochloride, vanadosulfaat}

c:. c:. •

of chloride, chromosulfaat,titaniumtrichloride.(34,35). Van al deze stoffen wordt alleen de eerste in de industrie gebruikt. Met behulp hiervan krijgt men een rendement van 90.5

%.

De "praecipitatie gaat zeer snel, sneller dan met de microbiologische praecipitatie, maar deze methode is ook duurder.

b. Mbv bacterien

_.

.

_.

. .

_{. .}

.

_.

In de litt. worden verschillende soorten genoemà, die in staat zijn het vitamine over te voeren in de leucoverbinding,(36,37), nl

Streptococcus faecalis, Streptococcus liquefaciens, Streptococcus cremoris, streptococcus zymogenes, Streptococcus lactis, Escherichia coli, Serratia plymouthensis en enige Clostridia. Meestal wordt in het laboratorium en in de industrie gebruikt Streptococcus faecalis.

Met deze methode slaat ongeveer 90% van de vitamine als leucoverbin-ding neer. Een voorwaarde voor het gebruik hiervan is een minimum-concentratie van B₂ in de vloeistof van 65 rog/L.

De voorwaarden voor deze reductie zijn verder:

Een temperatuur van ongeveer 250 C. Bij lage temperatuur krijgt men een verlangzaamde groei en geen neerslagvorming.

Een begin PH van 6-7·5· De PH mag niet te hoog oplopen, daar dan een ontleding van het vitamine plaats vmndt.

~---

-

-9-Geen aeratie. Het beste is te werken in een inert gas. Aeratie werkt de reductie tegen, waardoor er geen praecipitatie kan optreden.

Voor deze neerslagmethode gebruikt men het liefst een jonge cultuur van de 3e of 4e generatie.

Aan deze bacteriologische reductie gaat vooraf een sterilisatie van het van de schimmel bevrijdde medium. Sterilisatie door stoominjectie is niet gewenst, daar dit nog een concentratievermindering van de aanwezige voedingsstoffen in het medium geeft, waardoor de groei van het micro-organisme en de reductie geremd worden.

Voor de sterilisatie is hier genomen een werking met behulp van U.V.

stralen.(38). Een U.V. vloeistofsterilisator is genomen zoals uitgevoerd is doorttPhilips" te Eindhoven. Bij dit apparaat stroomt de

te

steriliseren vloeistof in een dunne film langs de U.V.lampen, in een tijd lang genoeg om de microben te doden. Temperatuurverhoging wordt tegengegaan door een

\}. aan de buitenkant aangebrachte watermantel. Dit laatste is zeer

voor-,\ delig, daar bij deze handelwijze geen achteruitgang van de B₂

concentra-I

:1

\~ _{, tie optreedt.}

\ ~ ,Jo"'"

\" ~'

t VI.De bepaling van het B

2-gehalte

Voor de fabriekscontrole is een bepaling van het gehalte aan B

2

nood-zakelijk. Hiervoor zijn een tweetal methoden in gebruik:

~~ Q~_~!2~~~~!~S!~~~~ volgens Snell en Strong (39,40,41). Het is ge-bleken dat vitamine B

2 een essentieel bestanddeel is voor de groei van

Lactobacillus casei. Men nam nu een medium vrij van riboflavine

(behan-• delde pepton 0.5%, glucose 1%, Natriumacetaat 0.6%, cystine 0.01%,

anorganische zouten, B₂-vrije gist). Hieraan wordt een monàter toegevoegd van het me di urn waarvan de B₂ concentratie bepaald moet worden. Na steri-lisatie wordt dit geent met een suspensie van Lactobacillus casei.

De rest van de bepaling kan nog op twee manieren worden uitgevoerd, nl nephelometrisch en titrimetrisch. Bij de nephelometrische methode meet men de troebeling na 24 uur groeien, de grmei is dan optimaal. De

titrimetrische methode is gevoeliger, deze wordt dan ook meestal gebruikt. Na

72

uur groeien wordt de zuurproductie bepaald.

Een standaardcurve is bij beide methoden nodig. De methode is nauwkeurig maar duurt te lang.

Voor directe controle gebruikt men dan liever de methode

~~ ~~_~~~~~f1~2E~~2~~!!~~~~g~~~ (40,42,43)

fluores-I

'"

•

..

~---

-

-10-centie geeft, waarvan de sterkte even~edig is met de concentratie van het B₂0

In het medium is meestal nog pigment aanwezig, dat eveneens een fluores-centie kan geven. Met Na_{2S204 worden somm.ige pigmenten gereduceerd} en daarbij overgevoerd in een nie-t fluorescerende verbinding evenals het riboflavine zelf. Het B₂ heeft echter de eigenschap door schudden met lucht weer in het vitamine zel~ overgevoerd te worden, hetgeen niet mogelijk is voor gereduceerd pigment.

Pigment, wat niet gereduceerd kan worden, wordt verrekend door nog een fluorescentiemeting te doen na toevoeging van een bekende hoeveelheid B2 •

De bepaling berust op de volgende feiten:

De sterkte van de fluorescentie is evenredig met de B₂-concentratie

Het B₂ wordt niet vernietigd door zwakke oxydatie of reductie

Met NaiS204 treedt reductie tot de niet fluorescerende leucoverbin-ding op, waaruit door schudden met lucht weer B2 gevormd wordt

Met SnC1₂ treedt geen reductie op

5.

De sterkte kan gemeten worden met een photoelectrische lamp

Bij de bepaling wordt dus eerst het onstabiele pigment verwijderd door reductie. D~olgend~. metingen worden verricht:

A. van de onbekende oplossing

b. Van de onbekendepplossing na toevoeging van een bekende hoeveelheid riboflavine

c. Na reductie met natriumhydrosulfietoplossing van de oplossing onder b. genoemd.

d. Een oplossing met zelfde hoeveelheid water als men monster gebruikte, met toevoeging van de zelfde hoeveelheid bekende riboflavineoplossing

-10-I '>, BEREKENING VAN EEN KOELER

,.1

L ' -- .. _-+ _{Q~~È~~~_È~!~!~~!~~!}

o 6 6 0

~t

=

35.38 C = 3. 8 F

;. ,'0' _

Hoeveelheid warmte die

~

=

=

18333 x 107 x 1

=

1961631 kcal

=

= 7846524 BTU

Wanneer voor de U genomen wordt 266, vindt men voor A 7846524

=

200

x

63.68

Bij gebrlitik van buizen vqn i nwendig 1" en uitwendig 3/4" (B.G.W. 14) heeft men een capaciteit per buis van 850.5 lb/hr

In het geheel wordt doorgevoerd 40416 Ibs

Het aantal buizen wordt dus

~~6~~

=

48

A

Daar de lengte van de koeler dan erg lang wordt 48 x 0.2183 x 3.048 Korden hier 4 passes genomen.

Het aantal buizen voor de diameter van de koeler wordt 192 In tabel gevonden B.W.~. 14 : ~= 22", 212 buizen

Aan hoeveelheid koelwater gaat door 107 ~518333 = 43592 kg = Het vrije doorstroomde oppervlak

=

d~arsdoorsnede v.d.cylinder

d d d d · j i' x 22 '21 2 ( 0 . 2391 )

- wars oorsne e van e ~~pen:4 'x ~44- 144 + 0.00379

=

2.640 - 1.155

=

1.485 ft

=

13.80 dm

De bevochtigde omtrek = Omtrek cylinder. omtrek buizen =

\ \x 22 ..JL. 2

- 12 • 212 T2

=

58.34 ft 4 x 1.485

De

=

58.34

De snelheid van het koelwater = 43592

13.80 x 3600

=

0.87 dm = 0.288 ft

Re( 350C )

=

De x v x

J

=

=

3880 (goede turbulentie)

, ' I

.

, ,/ .,t.. •

4

x 1.485 x 61.99 x 0.288 x 3600

1.

65 x 58.34

=

~!j_È~~~~2~~g_y~g_~~_È~!~: tw

=

135

•

60 91 .• 50C 1352• 97.5

=

_{116°c =241}0 F t f

.=

2

=

J. tf

=

60 + ₂ 97.5 = 7900

₌

1740F 0

Voor het bepalen van h_i (241°F) kan men de volgende waarden invullën v

=

192/212 x 3600 fti hr ; D

=

0.834/12 ft ; k

=

0.396 BTU/ft2,hr,8F,

..

•

-11-,'-'-

=

0.59 lb/hr, f t ,v

=

h 0 0225 0.396 X 12 59.09 " = 1.5 0 8 0 3 ( 192 x 3600 x"0.834 x 59.09' . i

= .

x 0.834 212 x 12 x 0.59 ) (1.5)

=

=

442

Voor h kan men invullen( 174°F)

°

\ = 60.71 v = 0.288 x 3600 k

=

0.387 D

=

1/12 /1.= 0.88 2.3 i 0.387( 1/12 x 0.288 x 3600 x 60 71 0.8 0.3 ho

=

O. 0225 x 1/1 2 0 . 88 ' ) ( 2 • 3 ) = = 153 1 ,:' 1 UA. =(~ + 1 1 .--<\' d

=

\'

~4-x~1-:4~4

xl

_A. 1

=

0.0024 ft2

Als materiaàl voor de koeler genomen een legering van 70% Ou 29% Zn 1% Sn Hiervoor is de k practisch constant.

1 1 0.0024 x 0.2183 0.2183

u=

~ + 60 x 0.2400 + 153 x 0.2618

=

0.00776 U1 = 129 , ! , , / , ~!j-y~~!~~~~-y~~-~~-~~!~! tw

=

28

2

15

=

21.5°0

=

t _f

.=

21.5 ₂ + ~ ~, . 1 /

"

r

_{t f = 21.5 +} 2 0 h.

=

6.6225 1

=

213

Voor ho kan worden ingevuld (64.40F)

S

=

62.31 v

=

0.288 x 3600 D

=

1/12 28

=

15 = 25°0 = 18°0

₌

Lv = , 1 77°F 64.40F 2.17 I(

=

2.57 k

=

0.346 0 8 0 4 h _o

=

A.0225 _{v "'"} ~ 0.346(1/12 x 0.288 x 3600 x 62.31) • (7 5) . _ _{1/12 2.57 .}

-=

95

; •

•

- -- - - -1 1 0.0024 x 0.2183 0.2183

u=

~ 57 x 0.2400 + 95 x 0.2618

=

0.01352 U

=

77

Q

=

A t ₁x _{U2 -} t₂ x _U1

=

2.3 log t1

xU

2 t 2xU1

74

x 13

A

=

7846524

x

2.3 log 129 x 75

129

x

75 -

74 x

13

=

2076 ft 2

-12-, - - - -12-, -12-, - - - - -- - -

-..

LIJIIT VAN DE APPARATEN

1. pompen voor aanvoer en menging van de voedingsstoffen

2. Sterilisator- 1-9 Dl, 2r-1 Dl - één pass 3. Koeler - 1-2.5 ., 2r-Q.45 Dl - 4 paases 4. lfermentor 1- Inhoud 20

.3 -

h- 4m. 2r- , .

5.

Centrifuge 6. Opslagtank - Inhoud 18

.3 -

h-2.6 m, 2r-3 Ja

7.

Ultra-Violet sterilisator

8. Fermentor 11 - Inhoud 20

~

- ha4 Dl, 2r-, Dl

9.

Centrifuge

10. Droogstoof

11. Mixer - Inhoud 3.50 1 - h-1 Dl, 2r-Q.8 Dl

12. Kookpan - Inhoud 4.50 1 - haQ.85 IR

,2r-O.9

lil

1'.

Sharpies

centrifuge

14. Koeler - 1-1 Dl, 2r-0.15 Dl - 'én pass

15- Aerator - Inhoud 450 1 - h-1.5 m, 2r-0.6 Dl

16. Centrifuge

17.

Verdamper -

IDhooo

1 - h-o.

9m

,21".8.7

JA

18. lI1xer voor alcohol, water - Inhoud 350L - h-O.9 .,21'*0.7 la

19. Opslagtank alcohol - Inhoud 2000 1 - h-1.3 m, 2r-1.4 m

20. Droogstoof voor de ru.we en de zuivere vitamine B₂

.

.

-...00 'atïuur1ijst

1. A.W.Blyth, J.Ohem.Soc., London

22,

530,(1879)

2. R.Kuhn, P.Gyorgy, T.Vlagner-Jauregg, Natuswiss. 21, 560, (1)33) 3. O.Warburg, 'N.Ohristian, Biochem.Z.254, 438, (1932)

4. P.Karrer, H •. F.Meerwein, Hel v.Chim.Acta 12., 274, (1937)

5. P.Karrer, B.Becker, F.Benz, P.Frei, H.Salomon, K.Schopp,

He1v.Chim.Acta 18, 1435, (1935)

6. R.Kuhn, K.Reinemund, F.Weygand, R.Strobe1e, Ber.d.deut.chem.Ges. 68,1765, (1935) 7. 8. 9· 10. 11. 12. 13· 14. 15· 16. 17· 18 • 19· 20. 21. 22. 23· 24. 25· 26. 27. 28. 29· 30. 31. Roche Products Ltd, B.P.615847 (1948)

V.F.Pfeiffer, F.W.'ranner, Ch.Vojnovich, D.H. 'I'rauf1er Ind. and Eng.Chem.42, 1776,(1950)

Commercial Solvents Corp., B.P. 623082 (1949)

G.J .de Becze, H.n • Moore , E .Schraffenburger U.S .P. 2543897 (1951)

I.Yamasaki, W.Yositome, Biochem.~ .297, 398, (1938) A.H.stevens, Western Condensing Co, B.P.602031 (1948) R.L.May.er, M.Rodbart, Arch.of Biochem.11 , 49, (1946) P.R. Burkholder, Arch.of Biochem,i, 121, (1943)

H.Levine, J.E.Oyaas, L.Wasserman, J.O.Hoogerheide, R.M.Stern,

Ind.Eng.Chem.41, 1665, (1949)

L.J. Wickerham, M.H .F1ickinger, R .l.!. Johnston, Arch. of Biochem.

a,

95(194

2"

95 , ( 1946 )

F. W • Tanner , J .M.v.Lanen, J • Bact .,2i, 38, (1947)

F.W.Tanner, J.Wickerham, J.M.v.Lanen, U.S.P. 2445128 (1947)

Koninklijke Nederlandsche Gist en Spirituà Fabriek, D.P.68936 (1951)

G.Pridham, U.S.P. 2578738 (1951) H.D.Piersma, U.S.P. 2400710 (1946)

Merck en Co, B.P. 593027 (1947) Pfizer & 00 Inc. B.P. 593953 (1947)

Soc. des Usines Chimiques Rhone Poulene, B.P.594015 (1947) Roche Products.Ltd. B.P. 615847 (1949)

U.S.P. 2 498 549 (1950)

Roche Products Ltd., B.P.651671 (1951)

F.A.Robinson. The vitamin B complex. London (1951)

H.N.t"loore, G.de Becze, E.Schraffenberger, J.Bact.,2i,

F.W.'ranner, C.Vojnovich, J.]\I.v.Lanen, J.Bact.2Q, 737, (1949) J .B.Routien, Mycologia 41, 183 (1949)

33. A.Guillermond. Compt.Rend.200(1935)1556 34. G.E.Hines. T.Haute. U.SP.2 367 644(1945) 35. Commeroial Solvents Corp. B.p.621552 (1949) 36. G.B.Hines. U. S.P. 2 387 023 (1945)

37. R.J.Hickley. Arch.of Biochem. 11(1946)259

38. H.C.Rentsohle~. R.Nagy. U.S.P. 2 482 507(1949) 39. E.E.Schnell. F.M.Strong. I.EC. An.Ed.1l(1939)346 40. R.E.Johnson. F.Sargent. P.F.Robinson. F.C.Consolasio

I.E.C.An.Ed. 11(1945)384

41. F.M.Strong. L.E.Carpenter. r .E C. An.Ed.l!(1942)909 42. A.Z.Hodson. L.C.Norris. JJBiol.Chem.131(1939)621 43. M.L.Scott. F W.Hill. L.C.Norris. G.F.Hensen.

J Biol.Chem.165(1946)65