Medycyna Wet. 2009, 65 (1) 12
Babeszjoza jest transmisyjn¹ chorob¹ zwierz¹t i ludzi, wywo³ywan¹ przez pierwotniaki z rodziny Babesidae (22). Obecnie wyró¿nia siê ponad 100 gatunków tych paso¿y-tów izolowanych od ssaków. Po raz pierwszy zosta³y one wykazane w erytrocytach krwi przez Viktora Babesa pod koniec dziewiêtnastego wieku (19), za pierwsze dane literaturowe na temat babeszjozy u byd³a w Ameryce przedstawili Smith i Kilbourne (19, 20). Choroba wystê-puje na ca³ym wiecie u ró¿nych gatunków zwierz¹t i sta-nowi powa¿ny problem zarówno dla lekarzy weterynarii, jak i hodowców. Stosunkowo szybki przebieg choroby, z³o¿ona patogeneza, ró¿norodnoæ objawów klinicznych towarzysz¹cych zara¿eniu pierwotniakami oraz ciê¿kie po-wik³ania po przebytej babeszjozie dotycz¹ce g³ównie w¹t-roby oraz nerek powoduj¹, ¿e jej rozpoznawanie i lecze-nie stanowi¹ powa¿ne wyzwalecze-nie dla s³u¿b weterynaryj-nych (1, 8, 9, 21). Wydawa³oby siê, ¿e najskuteczniejsz¹ metod¹ walki z chorob¹ mog¹ byæ szczepienia profilak-tyczne osobników nara¿onych na kontakt z kleszczami, pochodz¹cych z terenów, gdzie babeszjoza wystêpuje en-demicznie. Próby immunizowania zwierz¹t przeciwko zara¿eniom pierwotniakami prowadzone s¹ ju¿ od wielu lat, przy czym ich skutecznoæ w wielu przypadkach jest dyskusyjna (18). Trudnoci w przygotowaniu immuno-preparatów wynikaj¹ z problemów w uzyskaniu odpo-wiedniej iloci antygenów lub te¿ ze stosunkowo du¿ej zmiennoci pierwotniaków w obrêbie gatunku. Zmiennoæ tych paso¿ytów ³atwo przeledziæ na przyk³adzie Babe-sia canis. Zastosowanie technik biologii molekularnej pozwoli³o na wykazanie w obrêbie tego gatunku trzech podgatunków: Babesia canis canis, Babesia canis rossi i Babesia canis vogeli (23). Najnowsze badania autorów (2) wskazuj¹, i¿ nie jest to koniec ró¿nicowania pierwot-niaków, gdy¿ na podstawie analizy molekularnej genu 18S
RNA mo¿na w obrêbie podgatunku Babesia canis canis wykazaæ dwie grupy monofiletyczne, które w badaniach w³asnych okrelono mianem A i B. Tak du¿a zmiennoæ obserwowana w obrêbie struktury genetycznej tylko jed-nego gatunku z pewnoci¹ nie pozostaje bez wp³ywu na strukturê antygenow¹ pierwotniaków i mo¿e przek³adaæ siê na ma³¹ skutecznoæ stosowanych szczepionek. Inny-mi czynnikaInny-mi wp³ywaj¹cyInny-mi na mo¿liwoæ uzyskania skutecznych w walce z babeszjoz¹ biopreparatów s¹ trud-noci w prowadzeniu hodowli pierwotniaków in vitro, a tym samym w uzyskaniu odpowiedniej iloci antygenu szczepionkowego. W znacznej mierze wynikaj¹ one z charakteru komórek, na których paso¿yty s¹ kultywo-wane. Erytrocyty s¹ komórkami pozbawionymi j¹dra, nie ulegaj¹cymi podzia³om. Wraz z wiekiem hodowli ulega-j¹ one degeneracji, skutkiem czego w czasie jej prowa-dzenia konieczna jest okresowa wymiana komórek zu-¿ytych na wie¿e (14). Ponadto, w przeciwieñstwie do hodowli stacjonarnych, w przypadku krwinek czerwo-nych, przez ca³y czas utrzymywania hodowli s¹ one za-wieszone w odpowiednich p³ynach od¿ywczych, w sk³a-dzie których brak jest jonów wapnia i magnezu umo¿li-wiaj¹cych przyklejanie siê komórek do cian naczyñ. P³yn w naczyniach powinien byæ w sta³ym ruchu (mieszad³a magnetyczne lub wytrz¹sarki), tak aby nie dochodzi³o do sedymentacji komórek. Erytrocyty przeznaczone do ho-dowli uzyskiwane s¹ z pe³nej krwi, po jej odwirowaniu i przep³ukaniu najczêciej roztworem PBS lub p³ynem fizjologicznym, a nastêpnie zawieszane w odpowiednich p³ynach od¿ywczych (19). Tabela 1 przedstawia komer-cyjne p³yny od¿ywcze, wykorzystywane do hodowli okre-lonych gatunków Babesia. Decyduj¹ce znaczenie dla ich jakoci ma woda, która musi byæ pozbawiona wszelkich zanieczyszczeñ, a szczególnie jonów metali ciê¿kich przez
Artyku³ przegl¹dowy Review
Hodowle in vitro pierwotniaków Babesia
izolowanych od zwierz¹t
£UKASZ ADASZEK, STANIS£AW WINIARCZYK, JERZY ZIÊTEK
Katedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
Adaszek £., Winiarczyk S., Ziêtek J.
In vitro cultivation of Babesia organisms isolated from animals
Summary
Babesia organisms are hemoprotozoa isolated from people and animals. Their in vitro cultivation supplies information about the morphology and ultrastructure of these parasites. They make it possible to obtain the genetic material for diagnostic elaborations and for detections of phylogenetic relationships between various species of Babesia. Protozoa cultivated on red blood cells can be a source of parasite antigen or attenuated strains of protozoa which can be used for vaccinations. The cultures of Babesia species are kept in an erythro-cytes host, taken from the animals from which Babesia is most frequently isolated, suspended in tissue culture media with the addition of sera, in microaerophil conditions at 37°C. The specific circumstances and factors that are needed to obtain an effective Babesia culture are very often the reason of the failure of these investigations.
Medycyna Wet. 2009, 65 (1) 13 podwójn¹ destylacjê, a nastêpnie dejonizacjê.
Izotonicz-noæ p³ynów zapewniaj¹ roztwory chlorku sodu i potasu. Poniewa¿ produkty przemiany materii pierwotniaków hodowanych na erytrocytach in vitro nie s¹ neutralizowa-ne i usuwaneutralizowa-ne, jak ma to miejsce w ¿ywym organizmie, w sk³ad wiêkszoci p³ynów hodowlanych wprowadzono uk³ady buforowe, zawieraj¹ce fosforany sodu i potasu chroni¹ce ca³y uk³ad przed degeneracj¹. W sk³ad p³ynów od¿ywczych wchodz¹ tak¿e aminokwasy, których komórki znajduj¹ce siê poza organizmem nie s¹ w stanie syntety-zowaæ. Istnieje 12 aminokwasów bezwzglêdnie koniecz-nych do prawid³owego funkcjonowania komórek poza ustrojem. S¹ to: lizyna, tryptofan, fenyloalanina, metio-nina, treometio-nina, walina, leucyna, izoleucyna, cystyna, ar-ginina, histydyna i tyrozyna. Do prawid³owych przemian metabolicznych zachodz¹cych w hodowlach komórko-wych konieczne s¹ tak¿e wêglowodany, witaminy oraz prekursory kwasów nukleinowych (12). Analizuj¹c sk³ad p³ynów od¿ywczych wykorzystywanych do hodowli pier-wotniaków Babesia ³atwo mo¿na stwierdziæ, i¿ stanowi¹ one doskona³¹ po¿ywkê dla bakterii i grzybów. W zwi¹z-ku z tym koniecznym dodatkiem do ich sk³adu s¹ anty-biotyki, których zadaniem jest eliminacja przypadkowych zaka¿eñ. Z badañ Holmana (11) wynika, ¿e dodatek do p³ynów od¿ywczych penicyliny, streptomycyny, garamy-cyny czy amfoterygaramy-cyny B nie wykazywa³ cytotoksyczne-go oddzia³ywania na erytrocyty ani na rozwój i namna¿a-nie pierwotniaków Babesia.
Kolejnym koniecznym dodatkiem do p³ynów jest surowica. Jest ona ród³em bia³ka, soli mineralnych, hormonów wzrostowych oraz takich pierwiastków, jak: kobalt, nikiel, mied, ¿elazo. Surowica u³atwia tak¿e wymianê tych zwi¹zków miêdzy komórkami a p³ynem. Rodzaj i stê¿enie surowicy w p³ynach od¿ywczych do-biera siê odpowiednio do gatunku hodowanych pierwot-niaków. I tak Babesia canis hodowana jest w p³ynach z dodatkiem 20-40% surowicy psiej, natomiast Babesia microti w p³ynach z dodatkiem 30-40% p³odowej suro-wicy bydlêcej (tab. 1).
Hodowle in vitro Babesia spp. inkubuje siê w tempe-raturze 37-38°C, w atmosferze o zawartoci 5% CO2, za wymianê p³ynów od¿ywczych oraz uzupe³nianie uk³adu w wie¿e erytrocyty dokonuje siê co 2-7 dni (16, 20). W przypadku niektórych gatunków pierwotniaków, jak Babesia divergens czy Babesia major mo¿liwe jest prze-trzymywanie zara¿onych uk³adów erytrocytów w tempe-raturze pokojowej. Z badañ Konrad i wsp. (13) wynika, ¿e oba te gatunki utrzymywano w temperaturze 21°C przez okres 5 dni, bez uzupe³niania wie¿ych erytrocytów. Wraz z up³ywem czasu mo¿na obserwowaæ zmianê barwy za-ra¿onych hodowli. Te, w obrêbie których dochodzi do namna¿ania pierwotniaków, uzyskuj¹ kolor ciemnoczer-wony do czarnego na skutek zwiêkszonego zu¿ycia tlenu przez Babesia oraz zwiêkszonej deoksygenacji hemoglo-biny. W przypadku jasnoczerwonej barwy hodowli przyj-muje siê, ¿e w jej obrêbie nie dochodzi do namna¿ania paso¿ytów (16). Okresowe badania mikroskopowe roz-mazów pochodz¹cych z prawid³owo prowadzanych ho-dowli pierwotniaków pozwalaj¹ na wykazanie obecnoci w obrêbie erytrocytów tak trofozoitów, jak i merozoitów (6). Uzyskiwany stopieñ parazytemii jest bardzo ró¿ny i waha siê od 1% dla hodowli Babesia canis i Babesia
gibsoni (17, 25), 38-40% dla Babesia equi i Babesia bo-vis (15, 24) do ponad 60% dla Babesia divergens (7).
Poszczególne gatunki pierwotniaków Babesia charak-teryzuj¹ siê specyficznymi wymaganiami hodowlanymi, które w przypadkach ich niespe³nienia przyczyniaj¹ siê do hamowania namna¿ania tych paso¿ytów in vitro. W przypadku B. bovis czynnikiem krytycznym, decydu-j¹cym o powodzeniu hodowli jest pH. Przesuniêcia pH powy¿ej 7,3 oraz poni¿ej 6,7 znacz¹co hamuj¹ namna¿a-nie Babesia (5). Stwierdzono natomiast, ¿e Babesia bovis jest stabilna w rodowisku wiêkszoci p³ynów wykorzy-stywanych do hodowli erytrocytów. Co wiêcej, pierwot-niaki te ulega³y tak¿e podzia³om w krwinkach zawieszo-nych nawet w p³ynie Hanksa, z dodatkiem 40% surowicy bydlêcej, przy czym ich namna¿anie przebiega³o s³abiej ani¿eli w komercyjnych p³ynach od¿ywczych, takich jak np. RPMI 1640.
W przypadku Babesia divergens czynnikiem wp³ywa-j¹cym na stopieñ parazytemii jest odpowiednia zawartoæ frakcji lipidowych w medium. Grande i wsp. (7) zaadap-towali ten gatunek pierwotniaków do pod³o¿y bez suro-wicy. Wi¹za³o siê to jednak z obni¿eniem stopnia parazy-temii z 50% do 3%. Surowicê w p³ynach od¿ywczych sta-rano siê zast¹piæ preparatem Albumax I oraz BSA (bovi-ne serum albumin). Uzyska(bovi-ne w ten sposób pod³o¿e nie tylko nie stymulowa³o podzia³ów paso¿ytów w hodowli, lecz doprowadza³o do lizy zawieszonych w niej erytrocy-tów. Dopiero dodatek do BSA frakcji lipidowej spowo-dowa³ wyrany skok stopnia parazytemii. W przypadku Babesia caballi adaptacjê tego paso¿yta do pod³o¿a HL-1 pozbawionego surowicy przeprowadzono poprzez jej za-st¹pienie wzbogaconym w t³uszcze preparatem Albumax I. Dodatek BSA z lipidami do p³ynów od¿ywczych nie wp³ywa³ na stopieñ parazytemii, podobnie jak zmiana pod-³o¿a HL-1 na RPMI 1640 czy p³yn Eagle (26).
Z badañ Holmana i wsp. (10) wynika, ¿e pierwotniaki Babesia equi najlepiej namna¿aj¹ siê, podobnie jak Ba-Tab. 1. Przyk³adowe p³yny od¿ywcze przeznaczone do hodowli wybranych gatunków pierwotniaków Babesia oraz stopieñ pa-razytemii uzyskiwany w hodowlach in vitro tych paso¿ytów
k e n u t a G a i s e b a B Rhooddozwajlapn³yenguo y c i w o r u s j a z d o R æ o tr a w a z ( ) % e i n y ³ p w ñ e i p o t S ii m e t y z a r a p s i v o b . B zbMufeodreiummH1E9P9ES Surow(i4c0a%b)ydlêca 38% i e li o c o d o . B zMbuedfoiruemm1T9E9S Surow(i4c0a%b)ydlêca 31% il a b a c . B zbuPfo³ryenmHHL-E1PES Bsruapklseumroewntiaccyja i m a d i p il u n y ³ p 6% i u q e . B HL-1 P³boyddolwêcaas(u2r0o%wi)ca >15% i n o s b i g . B HL-1 Suro(w20ic%a)psia 1-6% s i n a c . B zbuRfPorMem-I16H4E0PES S(u2ro0w%i-c4a0p%s)ia 0,1-1% it o r c i m . B RPM-I1640 Pb³yoddlêocwaa(s3u0r-o4w0%ic)a Dwupakrroaztnyytewmzriiost s n e g r e v i d . B zbuRfPorMem-I16H4E0PES Surow(1ic0a%l)udzka >60%
Medycyna Wet. 2009, 65 (1) 14
besia caballi, na pod³o¿u HL-1. Pocz¹tkowo jako dodat-ku do HL-1 autorzy u¿ywali p³odowej surowicy bydlê-cej, by po ustabilizowaniu siê hodowli zamieniæ j¹ na su-rowicê koñsk¹. Najintensywniejsze podzia³y pierwotnia-ków uzyskano przygotowuj¹c pod³o¿e w³asne oparte na HL-1 z dodatkiem insuliny, transferyny oraz nasyconych i nienasyconych kwasów t³uszczowych, czynników nie wystêpuj¹cych w komercyjnych p³ynach od¿ywczych.
Bautista i wsp. (3) przeprowadzali hodowlê Babesia microti w uk³adzie, w sk³ad którego wchodzi³y erytrocy-ty chomika oraz p³odowa surowica bydlêca. Stopieñ uzy-skanej parazytemii wynosi³ 3-9%. Zast¹pienie FBS (fetal bovine serum) surowic¹ chomicz¹ lub szczurz¹ nie wp³y-nê³o na zmianê stopnia parazytemii, natomiast zamiana w hodowli krwinek chomika erytrocytami szczura zaha-mowa³o hodowlê paso¿ytów. Wskazuje to na fakt, ¿e o po-wodzeniu hodowli decyduje przede wszystkim typ komó-rek u¿ytych do jej prowadzenia, w mniejszym za stop-niu rodzaj u¿ytej surowicy. Zdolnoæ zara¿ania krwinek czerwonych przez pierwotniaki Babesia uwarunkowany jest obecnoci¹ odpowiednich receptorów zarówno na po-wierzchni paso¿yta, jak i erytrocytu. W przypadku zgod-noci obu tych struktur dochodzi do wnikania merozo-itów Babesia do komórki. Obecnie prowadzone s¹ inten-sywne badania nad w³aciwociami antygenowymi gli-kozyl-fosfatydyloinozytolu zakotwiczonego w powierzch-niowym bia³ku merozoitów (GPI-anchor MSA). Bia³ko to cechuje siê stosunkowo du¿ym polimorfizmem, umo¿-liwia zara¿anie krwinek oraz warunkuje prze¿ywalnoæ pierwotniaków w organizmach zwierz¹t, które mia³y wczeniej kontakt z paso¿ytami Babesia i wytworzy³y swoiste przeciwcia³a. Sugeruje siê istnienie w obrêbie cz¹steczki tego bia³ka wspólnych domen antygenowych, reaguj¹cych krzy¿owo pomiêdzy ró¿nymi szczepami Ba-besia, w zwi¹zku z czym mog³oby byæ ono wykorzysty-wane do produkcji szczepionek (4).
Hodowla pierwotniaków Babesia izolowanych od psów przeprowadzana jest najczêciej na p³ynach HL-1 lub RPMI-1640 w warunkach mikroaerofilnych. Yamasaki i wsp. (23) donosz¹ o mo¿liwoci wykorzystania do tego celu p³ynu Eaglea. Z badañ tych autorów wynika, ¿e na-mna¿anie paso¿ytów na komórkach bogatych w potas przebiega znacznie wydajniej, je¿eli p³yn od¿ywczy wzbo-gacany jest glutationem. Babesia canis, jak i Babesia gib-soni do swego rozwoju potrzebuj¹ stosunkowo du¿ej za-wartoci surowicy w hodowli siêgaj¹cej rzêdu 40% (17). Obserwacje w³asne potwierdzaj¹ doniesienia innych au-torów odnonie do rodzajów p³ynów u¿ytych do hodowli Babesia canis. W pilota¿owych badaniach w³asnych prze-prowadzonych nad hodowlami tych pierwotniaków uzy-skano ich wzrost tak na erytrocytach psich utrzymywa-nych w p³ynie HL-1, Eaglea, jak i w mieszaninie p³ynu Eaglea z PWE. We wszystkich tych przypadkach p³yny od¿ywcze wzbogacano surowic¹ psi¹ lub p³odow¹ suro-wic¹ bydlêc¹.
W ostatnim czasie notuje siê zwiêkszone zaintereso-wanie metodami hodowli pierwotniaków Babesia. Bada-nia te, jakkolwiek w wielu przypadkach trudne do prze-prowadzenia, mog¹ dostarczaæ cennych informacji na te-mat morfologii i ultrastruktury tych organizmów (14). Hodowle in vitro pozwalaj¹ na uzyskanie materia³u ge-netycznego pierwotniaków wykorzystywanego tak dla
diagnostyki zara¿eñ, jak i w celu badania zwi¹zków filo-genetycznych pomiêdzy ró¿nymi gatunkami paso¿ytów Babesia. Ponadto namno¿one na krwinkach pierwotniaki mog¹ stanowiæ ród³o antygenów szczepionkowych lub atenuowanych szczepów wykorzystywanych w celu im-munizacji.
Pimiennictwo
1.Abramowicz B.: Zaburzenia funkcji nerek i w¹troby w przebiegu babeszjozy psów. Ann. UMCS, sec. DD 2007, 62, 80-86.
2.Adaszek £., Winiarczyk S.: Molecular characterization of Babesia canis canis iso-lates from naturally infected dogs in Poland. Vet. Parasitol. 2008, 152, 235-241. 3.Bautista C. R., Kreier J. P.: Effect of immune serum on the growth of Babesia microti in hamster erythrocytes in short term culture. Infect. Immun. 1979, 25, 470-472.
4.Carcy B., Precigout E., Schetters T., Gorenflot A.: Genetic basis for GPI-anchor merozoite surface antigen polimophism of Babesia and resulting antigenic diver-sity. Vet. Parasitol. 2006, 138, 33-49.
5.Erp E. E., Smith R. D., Ristic M., Osorno B. M.: Optimization of the suspension culture forin vitro culivation of Babesia bovis. Am. J. Vet. Res. 1980, 41, 2059--2062.
6.Golf W. L., Yunker C. E.: Babesia bovis: increased percentage parasitized erythro-cytes in cultures and assessment of growth by incorporation of [3H] hypoxanthine.
Exp. Parasitol. 1986, 62, 202-210.
7.Grande N., Precigout E., Ancelin L., Moubri K., Carcy B., Lemesre J. L., Vial H., Gorenflot A.: Continous in vitro culture of Babesia divergens in serum free me-dium. Parasitol. 1997, 115, 81-89.
8.Gund³ach L. J., Sadzikowski A. B., Tomczuk K.: Babeszjoza psów. Medycyna Wet. 1995, 51, 584-588.
9.Hailat N. Q., Lafi S. Q., al-Darraji A. M., al-Ani F. K.: Equine babesiosis associa-ted with strenuous exercise: clinical and pathological studies in Jordan. Vet. Para-sitol. 1997, 69, 1-8.
10.Holman P. J., Chieves L., Frerichs M., Olson D., Wagner G. G.: Babesia equi erythrocytic stage continously cultured in an enriched medium. J. Parasitol. 1994, 31, 232-236.
11.Holman P. J., Waldrup K. A., Wagner G. C.: In vitro cultivation of a Babesia isolated from a white-tailed deer (Odocoileus virginianus). J. Parasitol. 1988, 74, 111-115.
12.Kandefer-Szerszeñ M.: Æwiczenia z wirusologii. Wydawnictwo UMCS, Lublin 1997.
13.Konrad J., Canning E. U., Phipp L. P., Donelly J.: Maintenance of in vitro cultu-res of Babesia divergens and Babesia major at low temperatucultu-res. Z. Parasitenkde 1985, 71, 313-316.
14.Lehtinen L. E., Birkenheuer A. J., Droleskey R. E., Holman P. J.: In vitro cultiva-tion of a newly recognized Babesia sp. in dogs in North Carolina. Vet. Parasitol. 2008, 151, 150-157.
15.Levy M. G., Ristic M.: Babesia bovis continuous cultivation in a microaerophilus stationary phase culture. Science 1980, 207, 1218-1220.
16.Levy M. G., Ristic M.: Cultivation and in vitro studies on Babesia, [w:] Jensen J. B. (ed.): In vitro Cultivation of Protozoan Parasites CRC Press, Boca Raton 1983, 221-224.
17.Schetters T., Kleuskens J., Scholtes N., Pasman J. W., Bos H. J.: Vaccination of dogs against Babesia canis infection using antigens from culture supernatants with emphasis on clinical babesiosis. Vet. Parasitol. 1994, 52, 219-233. 18.Schetters Th. P. M., Kleuskens J. A. G. M., Scholtes N. C., Gorenflot A., Moubri K.,
Vermeulen A. N.: Vaccination of dogs against heterologous Babesia canis infec-tion using antigen from culture supernatants. Vet. Parasitol. 2001, 100, 75-86. 19.Schuster F. L.: Cultivation of Babesia and Babesia-like blood parasites: agents of
an emerging zoonotic disease. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15, 365-373. 20.Smith T., Kilborne F. L.: Investigations into the nature, causation, and prevention
of Texas or southern cattle fever, 8th and 9th Repts. Bur. Anim. Industr., U.S. Dept.
Agric. 1893, 177-304.
21.Tassi P., Carelli G., Ceci L.: Tick-borne diseases (TBDs) of dairy cows in a Medi-terranean environment: a clinical, serological, and hematological study. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002, 969, 314-317.
22.Uilenberg G.: Babesia a historical overview. Vet. Parasitol. 2006, 138, 3-10. 23.Yamasaki M., Asano H., Otsuka Y., Yamato O., Tajima M., Maede Y.: Use of
canine red blood cellswith high concentrations of potassium reduced glutathione and free amino acid as host cells for in vitro cultivation of Babesia gibsoni. Am. J. Vet. Res. 2000, 61, 1520-1524.
24.Zahler M., Schein E., Rinder H., Gothe R.: Characteristic genotypes discriminate between Babesia canis isolates of differing vector specificity and pathogenicity to dogs. Parasitol. Res. 1998, 84, 544-548.
25.Zweygarth E., Just M. C., Waal D. T.: In vitro cultivation of Babesia equi: detec-tion of carrier animals and isoladetec-tion of parasites. Onderstepoort J. Vet. Res. 1997, 64, 51-56.
26.Zweygarth E., Lopez-Rebolla L. M.: Continuous in vitro cultivation of Babesia gibsoni. Parasitol. Res. 2000, 86, 905-907.
27.Zweygarth E., van Niekerk C. J., de Waal D. T.: Continuous in vitro cultivation of Babesia cabali in serum free medium. Parasitol. Res. 1999, 85, 413-416.
Adres autora: dr £ukasz Adaszek, ul G³êboka 30, 20-612 Lublin; e-mail: ukaszek0@wp.pl
