Artyku³ przegl¹dowy Review
Odczytanie genomu psa stanowi prze³om w bada-niach dotycz¹cych tego gatunku zwierz¹t, a poniewa¿ psy od dawna by³y wykorzystywane jako model do badañ dotycz¹cych niektórych chorób wystêpuj¹cych u ludzi, ma tak¿e bezporedni wp³yw na zdrowie cz³o-wieka. Poza tym daje podstawy do okrelenia rzeczy-wistych ró¿nic miêdzy ró¿nymi rasami psów i przy-czyn tak wielkiej zmiennoci rasowej w obrêbie tego gatunku.
Genom psa
Genom psa zosta³ zsekwencjonowany pod koniec 2005 r., za materia³ genetyczny bêd¹cy podstaw¹ pro-wadzonych badañ pochodzi³ od suki rasy bokser o imieniu Tasha (11). Badacze poza zsekwencjonowa-niem genomu tej suki wykonali zakrojone na mniej-sz¹ skalê badania genetyczne 10 innych ras psów i zi-dentyfikowali ponad 2,5 miliona specyficznych poli-morfizmów genowych, które mog¹ decydowaæ o ró¿-norodnoci genetycznej w obrêbie tego gatunku. Do-tycz¹ one nie tylko podstaw zró¿nicowania fizyczne-go i behawioralnefizyczne-go psów, ale tak¿e pod³o¿a genetycz-nego wielu chorób wystêpuj¹cych powszechnie u psów. Porównanie genomu psa z genomem cz³owieka i my-szy wykaza³o, ¿e w genomie ludzkim wystêpuje wiê-cej sekwencji wspólnych z genomem psów ni¿ myszy, co mo¿e uzasadniaæ wykorzystywanie psów jako
mo-delu do badañ chorób o pod³o¿u genetycznym wystê-puj¹cych u ludzi (10).
Zsekwencjonowanie genomu daje podstawê do roz-woju pe³nych bibliotek genowych psa, co u³atwia ich wykorzystanie w genomice funkcjonalnej i struktural-nej psów. Jeszcze przed og³oszeniem sekwencji geno-mu psa istnia³y ogólnie dostêpne biblioteki genowe m.in. mózgu i siatkówki psa, które stanowi³y podsta-wê do opracowania kilku komercyjnie dostêpnych mikromacierzy cDNA i oligonukleotydowych, wyko-rzystywanych w badaniach genomicznych u psów.
Konstruowanie i wykorzystanie mikromacierzy DNA do badania chorób nowotworowych u psów Badania dotycz¹ce konstruowania oraz wykorzysta-nia mikromacierzy DNA u psów pod¹¿a³y dotychczas w kilku kierunkach. Jako jedne z pierwszych przepro-wadzone zosta³y badania dotycz¹ce ekspresji genów w nowotworach. Thomas i wsp. (20) stworzyli mikro-macierz do badania zmian w genomie psów zwi¹za-nych z nowotworzeniem. Zbudowana ona zosta³a z wy-korzystaniem klonów 24 genów pochodz¹cych z 18 chromosomów oraz dodatkowo klonów reprezentuj¹-cych chromosomy 11, 13, 14 i 31, które czêsto wyka-zuj¹ zmiany u psów z ch³oniakiem wieloogniskowym. Wyniki kolejnych badañ nad wykorzystaniem macie-rzy DNA do diagnostyki nowotworów u psów
opubli-Genom psa i jego wykorzystanie
w badaniach mikromacierzy u psów
MAGDALENA ¯MUDZKA, MICHA£ JANK*, ROMAN LECHOWSKI, JACEK MICUÑ
Katedra Nauk Klinicznych, *Katedra Nauk Fizjologicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159C, 02-787 Warszawa
¯mudzka M., Jank M., Lechowski R., Micuñ J.
Canine genome research using the DNA microarray technique
Summary
The review presents a summary of knowledge on canine genome research using the DNA microarray technique a new tool in molecular biology. Canine genome was sequenced in 2005, and since then numerous studies on gene expression in various tissues and organs as well as in different physiological or pathological conditions have been published. Canine DNA microarray has been used in research on neoplastic diseases (e.g. brain tumor), kidney diseases (Alport syndrome, hypertension in obese dogs), cardiac diseases (atrial fibrillation, dilation of the heart) and cartilage diseases. This technique has also enabled the analysis of gene expression in acute phase response and in renal tubular epithelial cell line (MDCK) stimulated by hepatocyte growth factor.
kowali Von Euler i wsp. (6). Dotyczy³a ona oceny trwa-³oci materia³u pobranego ródoperacyjnie od psów i mo¿liwoci jego wykorzystania do badañ za pomoc¹ mikromacierzy. Badaniom podlega³y wycinki nowo-tworów gruczo³u mlekowego oraz ch³oniaka. Ustalo-no, ¿e degradacja RNA w guzach sutka rozpoczyna siê po 30 minutach od pobrania, natomiast w ch³onia-ku degradacja przebiega du¿o szybciej i ju¿ po 30 mi-nutach dochodzi do ca³kowitego zniszczenia RNA. Te wyniki podwa¿aj¹ wczeniejsze doniesienia o du¿o wy-¿szej trwa³oci materia³u przeznaczanego do badañ z wykorzystaniem mikromacierzy DNA (10, 15). Au-torzy rekomenduj¹ umieszczanie pobranych wycinków w p³ynie wolnym od RNA-az tak szybko, jak to mo¿-liwe, nie póniej ni¿ po 15 minutach od pobrania.
Inna grupa naukowców (21) skupi³a siê na badaniu zmian ekspresji genów towarzysz¹cych nowotworom pierwotnym mózgu psów. Zainteresowanie t¹ tematy-k¹ wynika z podobieñstwa procesów nowotworowych dotycz¹cych orodkowego uk³adu nerwowego psa i cz³owieka, i zwi¹zanych z tym mo¿liwoci wykorzy-stania modelu psiego w badaniach chorób nowotwo-rowych orodkowego uk³adu nerwowego ludzi. Stwo-rzona zosta³a mikromacierz zawieraj¹ca 4000 klonów genów pochodz¹cych z biblioteki genowej psa, z któ-rych 2161 to znane geny zwi¹zane z funkcjonowaniem mózgu oraz 25 genów zaanga¿owanych w rozwój pro-cesu nowotworowego. Za pomoc¹ tego narzêdzia mo-lekularnego przebadanych zosta³o 16 nowotworów (m.in.: meningioma, ependymoma, glejak) pochodz¹-cych od psów ró¿nych ras. Wyniki badania potwier-dzaj¹ du¿e podobieñstwo patogenezy nowotworów mózgu u obu gatunków na poziomie ekspresji genów, co mo¿e wskazywaæ na przydatnoæ psa jako modelu do badañ nad identyfikacj¹ genów odpowiadaj¹cych za rozwój procesu nowotworowego w mózgu cz³o-wieka.
Rao i wsp. (16) przeprowadzili badania z wykorzy-staniem mikromacierzy DNA dotycz¹ce nowotworów gruczo³u mlekowego u psów. Tê oraz inne publikacje zwi¹zane z wykorzystaniem mikromacierzy do badañ nowotworów gruczo³u sutkowego u suk omówiono szczegó³owo we wczeniejszej pracy (10).
Konstruowanie i wykorzystanie mikromacierzy DNA do badania ekspresji genów w komórkach mózgu
i siatkówki oka
Paez i wsp. (15) postawili sobie za cel stworzenie mikromacierzy do badania ekspresji genów w mózgu oraz siatkówce oka. Materia³em do ustalenia sk³adu genowego tej mikromacierzy by³y siatkówki i fragmen-ty mózgów trzech 16-fragmen-tygodniowych psów rasy beagle oraz dwóch 16-tygodniowych mieszañców. Z tkanek wyizolowano RNA, który po przepisaniu na DNA poddany zosta³ amplifikacji. Na tej podstawie wyse-lekcjonowano 4500 klonów do konstrukcji mikroma-cierzy referencyjnej do badania zmian ekspresji ge-nów w chorobowo zmienionej siatkówce oka.
Konstruowanie i wykorzystanie mikromacierzy DNA do badania ekspresji genów w nerce
Narz¹dem, który zosta³ szczegó³owo przebadany z wykorzystaniem techniki mikromacierzy, by³a ner-ka. Greer i wsp. (7) porównywali ekspresjê genów w nerkach psów zdrowych oraz z zespo³em Alporta. Jest to choroba dziedziczna, recesywna, sprzê¿ona z chromosomem X, wywo³ana mutacj¹ kilku genów odpowiadaj¹cych za syntezê kolagenu, co prowadzi do atrofii k³êbków nerkowych, zw³óknienia narz¹du i postêpuj¹cej niewydolnoci nerek. Badania mia³y na celu wykrycie genów zwi¹zanych ze zmianami zacho-dz¹cymi w chorych nerkach (zapaleniem, zmianami immunologicznymi, zw³óknieniem). Autorzy porów-nali ekspresjê genów w nerkach szczeni¹t z jednego miotu zdrowych i chorych, co pozwoli³o na identy-fikacjê 133 genów bior¹cych udzia³ w rozwoju zmian chorobowych. Wysoka ekspresja genów zwi¹zanych z uk³adem immunologicznym potwierdzi³a kluczow¹ rolê tego uk³adu w rozwoju choroby. Ekspresja genu HLA-DRBI zwi¹zanego miêdzy innymi z procesem prezentacji antygenów oraz z odpornoci¹ humoraln¹ wzros³a ponad jedenastokrotnie, genu HLA-DRA od-powiedzialnego za ró¿nicowanie limfocytów T, kata-bolizm bia³ek, rozpoznawanie antygenów bakteryjnych oraz rozwój zapalenia ponad dziesiêciokrotnie, podob-nie jak genu HLA-DQBI bior¹cego udzia³ w powsta-waniu odpowiedzi immunologicznej, zwalczaniu bak-terii oraz ró¿nicowaniu siê komórek.
Zwiêkszona ekspresja genów COL4A1 i TIMP-1 w koñcowej fazie choroby potwierdza udzia³ tych ge-nów w procesach postêpuj¹cego w³óknienia tkanek. Zidentyfikowano równie¿ bia³ka (np. klusterynê ko-dowan¹ przez gen CLU) mog¹ce braæ udzia³ w obro-nie kory nerki w przebiegu choroby. W zwi¹zku ze znacznym wzrostem ekspresji genów, takich jak SOD1, ACO1, FDXR oraz GPX1 potwierdzono tak¿e wa¿n¹ rolê stresu oksydacyjnego towarzysz¹cego zmianom patologicznym. Przeprowadzone badania pozwoli³y na lepsze zrozumienie patogenezy zw³óknienia mi¹¿szu nerki oraz da³y szansê wykrycia wczesnych markerów tego procesu, nie tylko w przypadku zespo³u Alporta, co mo¿e mieæ kluczowe znaczenie dla wczeniejsze-go rozpoznawania oraz skuteczniejszewczeniejsze-go leczenia prze-wlek³ej niewydolnoci nerek.
Za pomoc¹ techniki mikromacierzy dokonano tak-¿e porównania procesów zachodz¹cych w nerkach zwierz¹t oty³ych z nadcinieniem w porównaniu do psów o prawid³owej masie cia³a (8). O przeprowadze-niu tego rodzaju badañ zdecydowa³ brak jednoznacz-nego zwi¹zku pomiêdzy zaburzeniem pracy nerek i nadcinieniem spowodowanym oty³oci¹. Badaniom poddano po 4 psy o prawid³owej masie cia³a i 4 oty³e, karmione diet¹ wysokot³uszczow¹. Psy oty³e by³y red-nio o 57% ciê¿sze i mia³y o 24 mm Hg wy¿sze cinie-nie ni¿ psy o prawid³owej masie cia³a. Ekspresja by³a odmienna w obydwu badanych grupach. W
przypad-ku kory nerek u psów oty³ych wzros³a ekspresja 12 genów (FGR-14 o 68%, Endothelin-3 o 61%, GFR-á3 o 47%, STRL33 o 95%, IL-13Rá2 o 52%, P-selectin o 45%, ENA-78 o 49%, TGF-â1 o 60%, TGF-á o 98%, VEGF-B o 37%), za zmala³a o 72% w przypadku genu MMP-3, a w przypadku rdzenia nerek do 11 genów. By³y to geny zwi¹zane cile z fizjologi¹ nerki akty-wacj¹ uk³adu wspó³czulnego, odpowiedzi¹ zapaln¹, przebudow¹ macierzy komórkowej, neowaskularyza-cj¹, zaburzeniami pracy ródb³onka, zmniejszeniem aktywnoci leptyn i skróconym czasem prze¿ycia ko-mórek. Poznanie tych procesów pozwoli³o na lepsze zrozumienie wp³ywu nadcinienia na pracê nerek u oty-³ych psów.
Kolejne badania z u¿yciem mikromacierzy dotyczy³y odpowiedzi genowej linii komórkowej MDCK (ko-mórki nab³onka kanalików nerkowych) jednej z naj-czêciej u¿ywanych do badañ i najlepiej poznanych linii komórek nab³onkowych na stymulacjê czyn-nikiem wzrostu hepatocytów (HGF), wp³ywaj¹cym miêdzy innymi na ró¿nicowanie siê komórek nab³on-kowych (2). Potwierdzono udzia³ omiu genów, ju¿ wczeniej rozpoznanych jako zwi¹zane ze cie¿k¹ syg-na³ow¹ HGF, a tak¿e zidentyfikowano 117 nowych, dotychczas nie wi¹zanych z jego wp³ywem. Najbar-dziej interesuj¹ce geny uaktywniane w komórkach li-nii MDKC przez czynnik wzrostu hepatocytów to geny koduj¹ce GTP-azy, bia³ka zwi¹zane z translacj¹ w sia-teczce ródplazmatycznej, bia³ka cytoszkieletu, ma-cierzy pozakomórkowej oraz bia³ka bior¹ce udzia³ w krwiotworzeniu i regulacji wydzielania prostaglan-dyn. Informacje te s¹ szczególnie cenne ze wzglêdu na bardzo szerokie wykorzystanie linii komórkowej MDCK w badaniach, a szczególnie z powodu zwi¹z-ku ró¿nicowania siê komórek nab³onka pod wp³ywem HGF z regeneracj¹ tkanek oraz rozwojem nowotwo-rów wywodz¹cych siê z komórek nab³onkowych np. w w¹trobie, skórze, gruczole mlekowym i tkance miê-niowej.
Konstruowanie i wykorzystanie mikromacierzy DNA do badania ekspresji genów w kardiomiocytach psów
Inna grupa naukowców (4), wykorzystuj¹c mikro-macierze DNA, przeprowadzi³a badania dotycz¹ce zja-wiska migotania przedsionków u psów. Dowiadcze-nie dotyczy³o porównania ekspresji genowej w przy-padku migotania przedsionków spowodowanego cho-rob¹ serca oraz migotania spowodowanego przebudo-w¹ przedsionka w wyniku czêstoskurczu przedsion-kowego z innych przyczyn. Klinicznie obie postaci tego zjawiska s¹ trudne do rozró¿nienia, natomiast na po-ziomie molekularnym stwierdzono miêdzy nimi wie-le ró¿nic. Porównywano ekspresjê genów po 24 h oraz po 1 lub 2 tygodniach trwania zjawiska migotanie wywo³ywano za pomoc¹ rozrusznika wszczepionego w cianê przedsionka lub komory. Wyniki eksperymen-tu uwypukli³y g³ówne ró¿nice pomiêdzy dwoma ro-dzajami migotania przedsionków. Psy z migotaniem
przedsionków wywo³anym ich elektrostymulacj¹ wy-kazywa³y tendencjê malej¹c¹ w zakresie zmian eks-presji genów w czasie, natomiast migotanie zwi¹zane z elektrostymulacj¹ komór powodowa³o narastanie zmian ekspresji genów (dotyczy³o to zarówno zwiêk-szenia, jak i obni¿enia ekspresji) w miarê trwania zja-wiska. Zmiany ekspresji dotyczy³y w najwiêkszym stopniu genów odpowiedzialnych za syntezê i degra-dacjê DNA i RNA oraz za przewodnictwo sygna³ów. Badania te s¹ szczególnie cenne ze wzglêdu na brak mo¿liwoci przeprowadzenia ich w takiej formie w medycynie cz³owieka, za ich wyniki mog¹ w du-¿ym stopniu przyczyniæ siê do lepszego poznania pro-cesów towarzysz¹cych temu zjawisku, a tym samym u³atwiæ rozpoznanie i usprawniæ leczenie migotania przedsionków u ludzi.
Oyama i Chittur (14) przeprowadzili natomiast ba-dania dotycz¹ce zmian w ekspresji genowej u psów z kardiomiopati¹ rozstrzeniow¹. Próbki do badañ po-chodzi³y z lewej komory serca od dwóch psów rasy doberman dotkniêtych t¹ chorob¹, za kontrolê sta-nowi³y próbki od 5 zdrowych zwierz¹t. Czterysta sie-demdziesi¹t osiem genów wykaza³o ponad 2,5-krotn¹ zmianê ekspresji, w tym 173 wzrost, a 305 spadek. Obni¿eniu ekspresji uleg³y g³ownie transkrypty genów odpowiedzialnych za komórkow¹ produkcjê energii, przep³yw informacji miêdzy poszczególnymi komór-kami, strukturê komórki. Podwy¿szenie ekspresji stwierdzono przede wszystkim wród genów zwi¹za-nych z odpowiedzi¹ komórkow¹ i obron¹ przeciwstre-sow¹. Otrzymane wyniki rozszerzy³y wiedzê na temat procesów towarzysz¹cych kardiomiopatii rozstrzenio-wej i mog¹ stanowiæ punkt wyjcia do dalszych po-szukiwañ przyczyn tej choroby.
Asakura i wsp. (1) porównywali natomiast ekspre-sjê 63 genów zwi¹zanych z uk³adem sercowo-naczy-niowym w przebiegu niedokrwienia miênia sercowe-go (w wyniku 50% redukcji przep³ywu przez têtnicê wieñcow¹) oraz w przebiegu martwicy miênia ser-cowego (spowodowanej ca³kowitym zamkniêciem têtnicy wieñcowej) w stosunku do ekspresji genów u zdrowego zwierzêcia. Dokonano tego dziêki stwo-rzeniu biblioteki genów zwi¹zanych z procesami za-chodz¹cymi w uk³adzie kr¹¿enia u psów. Okaza³o siê, ¿e nieodwracalne uszkodzenie miocardium bez mar-twicy kardiomiocytów powoduje du¿o istotniejsze zmiany w ekspresji genów ni¿ ca³kowite zniszczenie komórek. Wyniki badañ potwierdzi³y tezê, ¿e psia mi-kromacierz DNA mo¿e byæ u¿ytecznym narzêdziem w ocenie procesów fizjopatologicznych zachodz¹cych w kardiomiocytach.
Ostatnio opublikowane badania zwi¹zane z uk³adem sercowo-naczyniowym dotycz¹ obni¿enia ekspresji genów koduj¹cych niekolagenowe sk³adniki macierzy zewn¹trzkomórkowej oraz czynnik wzrostu fibrobla-stów w miêniu sercowym lewej komory serca, które towarzyszy niedomykalnoci zastawki trójdzielnej (22). Ekspresja genów zosta³a zbadana u 4 psów przed
oraz 4 miesi¹ce po wyst¹pieniu nieprawid³owoci. Metaloproteinaza-1 wykaza³a 5-krotny, za metalopro-teinaza-5 10-krotny wzrost ekspresji. Dekoryna, fibu-lina 1 i fibrifibu-lina 1 niekolagenowe sk³adniki macie-rzy zewnatrzkomórkowej wykaza³y znaczne zmniej-szenie ekspresji. Dodatkowo obni¿eniu ekspresji uleg-³y: czynnik wzrostu tkanki ³¹cznej, aktywator plazmi-nogenu oraz wiele genów z linii czynnika wzrostu beta1. Otrzymane wyniki pozwoli³y na ustalenie prze-biegu procesów posttranslacyjnych, prowadz¹cych do utraty kolagenu w cianie lewej komory przy niedo-mykalnoci zastawki trójdzielnej.
Inne zastosowania mikromacierzy DNA do badañ psów
Kolejne badania (9) z u¿yciem mikromacierzy prze-prowadzone u psów dotyczy³y analizy ekspresji ge-nów podczas trwania odpowiedzi ostrej fazy. Na pod-stawie dotychczasowych badañ mo¿na stwierdziæ, ¿e ocena toksycznoci leków dla cz³owieka jest bardziej wiarygodna w przypadku oceny u psa ni¿ w przypad-ku szczura lub myszy. Jednak¿e dotychczas nie zosta-³y ustalone markery toksycznoci, które pozwalazosta-³yby na ³atw¹ i szybk¹ interpretacjê wp³ywu ksenobiotyków na organizm. Ocena ekspresji genowej w trakcie od-powiedzi ostrej fazy, która wystêpuje w przypadku toksycznego wp³ywu leku na zwierzê, daje tak¹ szan-sê. Badania przeprowadzono wykorzystuj¹c mikroma-cierz Affimetrix. Porównano ekspresjê genów w zdro-wej w¹trobie psa oraz w 4. i 24. godzinie po podaniu lipopolisacharydu (endotoksyny bakteryjnej). Ró¿ni-cê wykazano w odniesieniu do stê¿enia transkryptów wielu cytokin, bia³ek ostrej fazy, genów zwi¹zanych z homeostaz¹ glukozy, biotransformacj¹, przebudow¹ macierzy zewn¹trzkomórkowej. Dodatkowo zidenty-fikowano kilka potencjalnych markerów zapalenia w¹troby oraz ustalono zwi¹zki pomiêdzy zmianami ekspresji genów a wzrostem takich parametrów bio-chemicznych, jak albuminy, fosfataza zasadowa czy amyloid A. Badania te pozwoli³y na wykrycie nowych biomarkerów odpowiedzi ostrej fazy u psów oraz lep-sze poznanie procesów le¿¹cych u podstaw zapalenia. Tak¿e Enerson i wsp. (5) zainteresowali siê mo¿li-wociami wykorzystania badañ z mikromacierz¹ DNA do oceny toksycznoci leków. Ostre uszkodzenie na-czyñ prowadz¹ce do ich zapalenia to czêsty efekt dzia-³ania leków testowanych na psach i szczurach. Choæ nie zawsze toksycznoæ u tych gatunków zwierz¹t wywo³uje podobne efekty u ludzi, to jednak poznanie zjawisk zwi¹zanych z tym rodzajem reakcji poleko-wej znacznie przyspieszy³oby ocenê bezpieczeñstwa nowych leków. Ocenê ekspresji przeprowadzono w tkance naczyñ wieñcowych u psów rasy beagle po podaniu toksycznej dawki CI-947 (agonista receptora adenozynowego) i skorelowano z wynikami badania histopatologicznego. Materia³ pobrano pomiêdzy 16. a 24. godzin¹ po zastosowaniu toksyny. Wyniki wska-zuj¹ na bardzo szybkie wyst¹pienie zmiany ekspresji
genów w odpowiedzi na uszkodzenie, zw³aszcza w za-kresie inicjacji odpowiedzi immunologicznej, pobu-dzenia przebudowy macierzy zewn¹trzkomórkowej i stresu tlenowego.
Burton-Wurster i wsp. (3) podjêli badania nad od-powiedzi¹ genow¹ chrz¹stki stawowej w wyniku jej uszkodzenia mechanicznego. Postawili oni hipotezê, ¿e zmiany ekspresji genów w chrz¹stce stawowej po urazie prowadz¹ do zwyrodnienia, którego etiopato-geneza nie zosta³a do koñca poznana. Opracowany zosta³ model mechanicznego uszkodzenia chrz¹stki in vitro, a badania zosta³y przeprowadzone z u¿yciem mikromacierzy Affimetrix. Okaza³o siê, ¿e 528 genów wykazuje takie zmiany ekspresji (obni¿enie i podwy¿-szenie), a w przypadku 172 s¹ to zmiany statystycznie istotne. Wiele z tych genów nie by³o dotychczas wi¹-zanych z wystêpowaniem osteoarthritis, co poszerza dotychczasow¹ wiedzê na temat tego zjawiska. Bada-cze przyznaj¹, ¿e badania z u¿yciem mikromacierzy mog¹ byæ bardzo owocne, jednak¿e trzeba pamiêtaæ, ¿e nie zawsze poszczególne formy pokrewnych genów s¹ przy u¿yciu tej techniki mo¿liwe do odró¿nienia.
Kolejne badania zwi¹zane z zagadnieniami z zakresu ortopedii przeprowadzili Sakai i wsp. (18). Przepro-wadzili oni ocenê ekspresji genów w j¹drach mia¿d¿y-stych oraz piercieniach w³óknimia¿d¿y-stych dysków miêdzy-krêgowych u psów rasy beagle. Tematyka badañ doty-czy³a ró¿nic w ekspresji genów w obu tkankach oraz ich porównania do chrz¹stki stawowej. Czterdzieci piêæ genów wykaza³o istotne statystycznie ró¿nice ekspre-sji w poszczególnych tkankach: alfa-2-makroglobuli-na, cytokeratyna-18 oraz moleku³a CD58 w j¹drze mia¿d¿ystym wykazywa³y ekspresjê wy¿sz¹ ni¿ w po-zosta³ych dwóch tkankach, za desmokolina-2 mia³a wy¿sz¹ ekspresjê w j¹drze mia¿d¿ystym ni¿ w pier-cieniu w³óknistym. Badania te pozwalaj¹ na g³êbsze zastosowanie poznanie procesów zwyrodnieniowych zachodz¹cych w dyskach miêdzykrêgowych, zw³asz-cza, ¿e beagle jako psy chondrodystroficzne s¹ na ta-kie zwyrodnienia nara¿one bardziej ni¿ psy innych ras. Techniki z wykorzystaniem mikromacierzy pos³u-¿y³y tak¿e do badañ nad ekspresj¹ genów w skórze, w przebiegu atopowego jej zapalenia (13). Materia-³em do badañ by³y bioptaty skóry pozyskane od 42 psów 16 próbek skóry uszkodzonej, 17 próbek skó-ry nieuszkodzonej oraz 9 próbek kontrolnych od zwie-rz¹t zdrowych. Czterdzieci piêæ genów wykaza³o istot-n¹ ró¿nicê w ekspresji pomiêdzy grupami badanymi i kontroln¹, 16 genów zmieni³o ekspresjê zarówno w skórze uszkodzonej, jak i nieuszkodzonej, 26 tylko w skórze nieuszkodzonej, a 12 tylko w skórze uszko-dzonej. Geny, których ekspresja uleg³a zmianie, od-powiada³y za inicjowanie odpowiedzi immunologicz-nej i zapalimmunologicz-nej, regulacjê cyklu komórkowego, apop-tozê oraz regulacjê transkrypcji. Najwy¿szy, ponad 23-krotny wzrost aktywnoci, wykaza³ gen S100A8, od-powiedzialny za syntezê cytokiny prozapalnej w war-stwie wytwórczej naskórka.
Podsumowanie
Metoda badania ekspresji genów psa z u¿yciem mikromacierzy DNA daje niezwykle wiele mo¿liwo-ci i w najbli¿szych latach niew¹tpliwie bêdzie wyko-rzystywana w coraz wiêkszej liczbie badañ zwi¹za-nych z poznawaniem procesów genetyczzwi¹za-nych u tych zwierz¹t. Zsekwencjonowanie ca³ego genomu psa daje mo¿liwoæ opracowania bardzo dok³adnych mikro-macierzy, specyficznych tkankowo lub narz¹dowo, lub przeznaczonych do badania ekspresji genów w kon-kretnych chorobach psów i kotów. Znajomoæ ca³ego genomu psa pozwala tak¿e na wykonywanie badañ maj¹cych na celu okrelenie pochodzenia filogenetycz-nego poszczególnych ras psów i ustalenie ich pokre-wieñstwa genetycznego. Poznanie zale¿noci pomiê-dzy ekspresj¹ genów a poszczególnymi chorobami pozwoli³oby na podstawie badañ z u¿yciem mikroma-cierzy DNA na wczeniejsze rozpoznanie, bardziej precyzyjne prognozowanie oraz skuteczniejszy dobór leczenia.
Pimiennictwo
1.Asakura M., Takashima S., Asano Y., Honma T., Asanuma H., Sanada S., Shintani Y., Liao Y., Kim Y., Ogita H., Node K., Minamino T., Yorikane R., Agai A., Kitamura S., Tomoike H., Hori M., Kitakaze M.: Canine DNA array as a potential Tool for combining physiology and molecular biology. Circ. J. 2003, 67, 788-792.
2.Balkovetz D. F., Gerrard E. R., Li S., Johnson D., Lee J., Tobias J. W., Rogers K. K., Snyder R. W., Lipshutz J. H.: Gene expression alterations during HGF-induced dedifferentiation of renal tubular epithelial cell line (MDCK) using a novel canine DNA microarray. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2004, 286, 702-710.
3.Burton-Wurster N., Mateescu R. G., Todhunter R. J., Clements K. M., Sun Q., Scarpino V, Lust G.: Genes in Canine Articular Cartilage That Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies With Affymetrix canine GeneChip. J. Hered. 2005, 96, 821-828.
4.Cardin S., Libby E., Pelletier P., Le Bouter S., Shiroshita-Takeshita A., Le Meur N., Leger J., Demolombe S., Ponton A., Glass L., Nattel S.: Contra-sting gene expression profiles in two canine models of atrial fibrillation. Cir-culation Res. 2007, 100, 425-441.
5.Enerson B. E., Lin A., Lu B., Zhao H., Lawton M. P., Floyd E.: Acute drug--induced vasxular injury in beagle dogs: pathology and correlating genomic expression. Toxicol.Pathol. 2006, 34, 27-32.
6.Euler H. Von, Khoshnoud R., He Q., Khoshnoud A., Fornander T., Rut-qvist L. E., Skog S.: Time-dependent RNA degradation affecting cDNA
array quality in sponteneus canine tumours sampled using standard surgical procedures. Int. J. Mol. Med. 2005, 16, 979-985.
7.Greer K. A., Higgins M. A., Cox M. L., Ryan T. P., Berridge B. R., Kash-tan C. E., Lees G. E., Murphy K. E.: Gene expression analysis in canine model of X-linked Alport Syndrome. Mamm. Genome 2006, 17, 976-990. 8.Gu J. W., Wang J., Stockton A., Lokitz B., Henegar L., Hall J. E.: Cytokine
gene expression profiles in kidney medulla and cortex of obese hypertensive dogs. Kidney Int. 2004, 66, 713-721.
9.Higgins M. A., Berridge B. R., Mills B. J., Schultze A. E., Gao H., Sear-foss G. H., Baker T. K., Ryan T. P.: Gene expression analysis of the acute phase response using a canine microarray. Toxicol. Sci. 2003, 74, 470-484. 10.Król M., Paw³owski K. M., Motyl T.: Mikromacierze DNA w onkologii
wete-rynaryjnej. Medycyna Wet. 2009, 65, 377-380.
11.Lee Z., Hever A., Willhite D., Zlotnik A., Hevezi P.: Effects of RNA degrada-tion on gene expression analysis of human postmortem tissues. FASEB J. 2005, 19, 1356-1358.
12.Lindblad-Toh K.: Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature 2005, 438, 803-819.
13.Merryman-Simpson A. E., Wood S. H., Fretwell N., Jones P. G., McLaren W. M., McEwan N. A., Clements D. N., Carter S. D, Ollier W. E., Nuttal T.: Gene (mRNA) expression in canine atopic dermatitis: microarray analysis. Vet. Dermatol. 2008, 19, 59-66.
14.Oyama M. A., Chittur S.: Genomic expression patterns of cardiac tissues from dogs with dilated cardiomyopathy. Am. J. Vet. Res. 2005, 66, 1140--1155.
15.Paez G. L., Sellers K. F., Band M., Acland G. M., Zangerl B., Aquirre G. D.: Characterization of gene expression profiles of normal canine retina and brain using a retinal cDNA microarray. Mol. Vision 2006, 12, 1048-1056. 16.Rao N. A., van Wolferen M. E., van der Ham R., van Leenen D., Groot
Koer-kamp M. J., Holstege F. C., Mol J. A.: cDNA microarray profiles of canine mammary tumor cell lines reveal deregulated pathways pertaining to their phenotype. Anim. Genet. 2008, 39, 333-345.
17.Sadkowski T., Motyl T.: Mikromacierze DNA nowe narzêdzie badawcze w fizjologii i patologii. Medycyna Wet. 2007, 63, 1421-1426.
18.Sakai D., Nakai T., Mochida J., Alini M., Grad S.: Differential phenotype of intervertebral disc cells: microarray and immunohistochemical analysis of canine nucleus pulposus and annulus fibrosus. Spine 2009, 34, 1448-1456. 19.Stan A. D., Ghose S., Gao X. M., Roberts R. C., Lewis-Amezcua K., Hatan-paa K. J., Tamminga C. A.: Human postmortem tissue: what quality markers matter?, Brain Res. 2006, 1123, 1-11.
20.Thomas R., Fiegler H., Ostrander E. A., Galibert F., Carter N. P., Breen M.: A canine cancer-gene microarray for CGH analysis of tumors. Cyt. Gen. Res. 2003, 102, 254-260.
21.Thomson S. A. M., Kennerly E., Olby N., Mickelson J. R., Hoffmann D. E., Dickinson P. J., Gibson G., Breen M.: Microarray analysis of differentially expressed genes of primary tumors in canine central nervous system. Vet. Pathol. 2005, 42, 550-558.
22.Zheng J., Chen Y., Pat B., Dellitalia L. A., Tillson M., Dillon A. R., Powell P. C., Shi K., Shan N., Denney T., Husain A., Dellitalia L. J.: Microarray identi-fies extensive downregulation of noncollagen extracellular matrix and pro-fibrotic growth factor genes in chronic isolated mitral regurgitation in the dog. Circulation 2009, 119, 2086-2095.
Adres autora: dr Magdalena ¯mudzka, ul. Nowoursynowska 159c, 02-787 Warszawa; e-mail: magdalena.zmudzka@gmail.com
