Praca oryginalna Original paper
Rodokokoza jest bakteryjn¹ chorob¹ uk³adu odde-chowego rebi¹t, która wystêpuje najczêciej u zwie-rz¹t w wieku od 1. do 6. miesi¹ca ¿ycia. Choroba prze-biega z objawami ropnego zapalenia p³uc, wêz³ów ch³onnych i sporadycznie b³ony luzowej jelit (7, 15). U rebi¹t zaka¿onych w warunkach naturalnych, ob-jawy kliniczne ujawniaj¹ siê zwykle w wieku poni¿ej 4. miesi¹ca ¿ycia (7, 32). Rozwój choroby jest powol-ny, a w pocz¹tkowej fazie zaka¿enia objawy mog¹ byæ s³abo nasilone i ³atwo daj¹ siê przeoczyæ (7, 8). Wczes-ne, przy¿yciowe rozpoznanie zaka¿eñ Rhodococcus equi u rebi¹t ma istotne znaczenie dla podjêcia we w³aciwym czasie specyficznej terapii antybiotykowej oraz zwiêkszenia jej skutecznoci (13, 22). Antybio-tykoterapia przyczynia siê tak¿e do zmniejszenia za-nieczyszczenia rodowiska zewnêtrznego zjadliwymi szczepami R. equi (8, 10) oraz rzutuje na wyniki eko-nomiczne uzyskiwane w stadninach.
Nadzorem lekarsko-weterynaryjnym oraz badania-mi przesiewowybadania-mi winny byæ objête zw³aszcza stad-niny, w których rodokokoza wystêpuje enzootycznie (5, 8). Z uwagi na powszechne wystêpowanie niezjad-liwych szczepów R. equi w rodowisku hodowlanym wiarygodna metoda diagnostyki rodokokozy
powin-na, poza identyfikacj¹ gatunkow¹ zarazka, uwzglêd-niaæ tak¿e okrelenie markerów zjadliwoci (18, 28). Celem badañ by³o okrelenie przydatnoci metody PCR-multiplex i badania hodowlanego do wykrywa-nia zjadliwych szczepów R. equi w pop³uczynie tcha-wiczo-oskrzelowej (PTO) i kale rebi¹t pochodz¹cych ze stadnin z enzootycznie wystêpuj¹c¹ rodokokoz¹.
Materia³ i metody
Badania wykonano w ci¹gu jednego sezonu hodowlane-go. Zwierzêta do badañ pochodzi³y z dwóch stadnin (K, M), zlokalizowanych w ró¿nych regionach geograficznych Pol-ski, w których rodokokoza wystêpuje enzootycznie od wielu lat. redni wspó³czynnik chorobowoci w tych stadninach wynosi³ w ostatnich latach 15-25%, natomiast wspó³czyn-nik miertelnoci by³ zró¿nicowany i wynosi³ rednio 10% dla stadniny K oraz 7% w stadninie M.
Materia³ do badañ stanowi³y próbki ka³u oraz pop³uczy-ny tchawiczo-oskrzelowej, które pobierano losowo od re-prezentatywnej grupy rebi¹t w przedziale wiekowym od 1. do 6. miesi¹ca ¿ycia. Ogó³em próbki do badañ pobrano od 41 rebi¹t.
Do pobierania pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej wy-korzystano metodê aspiracji nosowo-tchawicowej wg
Ha-Przydatnoæ metody PCR i badania hodowlanego
do przy¿yciowej diagnostyki rodokokozy rebi¹t
ZBIGNIEW GR¥DZKI, ANNA ZIÊTEK-BARSZCZKatedra Epizootiologii i Klinika Chorób Zakanych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. G³êboka 30, 20-612 Lublin
Gr¹dzki Z., Ziêtek-Barszcz A.
Suitability of PCR and culture for antemortem diagnosis of rhodococcosis in foals
Summary
The aim of the study was to assess the suitability of multiplex PCR and culture for the detection of virulent R.equi in tracheobronchial aspirate (TBA) and feces of foals from enzootic farms. Fecal and TBA samples were taken randomly from a representative group of foals aged between 1 and 6 months. The solid selective medium NANAT was used for culture examination. Multiplex PCR reaction was performed with the use of two sets of primers complementary to the conservative gene fragment encoding the 16S subunit of ribosomal RNA of R.equi and the plasmid gene encoding virulence associated protein A (VapA), which determines bac-terial virulence. During clinical observations three experimental groups (A, B, C), differing in the intensity of respiratory signs, were selected for further studies. In foals from group A, showing no clinical signs from the respiratory tract, the results of the examinations of TBA and fecal samples were negative irrespective of the method used. In group B, showing moderate respiratory signs, 15 TBA and fecal samples were examined. PCR results were positive for 7 TBA samples and 2 fecal samples, whereas culture examinations were positive for only 3 TBA samples from this group. In group C, consisting of 6 foals with severe respiratory signs, positive PCR and culture results were obtained for all TBA samples and for 3 fecal samples.
shikura i wsp. (12) w modyfikacji w³asnej (31). Ka³ do badañ pobierano z prostnicy od rebi¹t lub ze ció³ki i transportowano do la-boratorium w plastikowych pojemnikach (Med-lab, Polska). Do badania hodowlanego wyko-rzystywano sta³e pod³o¿e wybiórczo-namna-¿aj¹ce NANAT opracowane przez Woolcock i wsp. (29). Posiewy inkubowano w temp. 30°C przez 48 godz. Ekstrakcjê DNA wyko-nywano metod¹ trawienia enzymatycznego z u¿yciem CTAB w odniesieniu do pop³uczy-ny tchawiczo-oskrzelowej oraz trawienia en-zymatycznego z u¿yciem sproszkowanego szk³a w przypadku ka³u. Techniczne szczegó-³y obydwu metod podano we wczeniejszych publikacjach (30, 31).
Oligonukleotydy u¿yte jako startery reak-cji PCR wyselekcjonowano w oparciu o dane pimiennictwa (3, 22). Do reakcji amplifika-cji u¿yto 2 par starterów (Rqfor, Rqrev i Vp1, Vp2) komplementarnych, odpowiednio, do konserwatywnego fragmentu genu
koduj¹ce-go podjednostkê 16S rybosomowekoduj¹ce-go RNA R. equi oraz frag-mentu plazmidowego genu vapA, koduj¹cego bia³ko VapA warunkuj¹ce zjadliwoæ zarazka (tab. 1). Zastosowanie po-dwójnych starterów umo¿liwia³o potwierdzenie przynale¿-noci bakterii do gatunku Rhodococcus equi oraz wykaza-nie ich zjadliwoci. Reakcjê amplifikacji przeprowadzano wed³ug procedury podanej przez Bell i wsp. (3). Produkty reakcji analizowano elektroforetycznie w 1,5% ¿elu aga-rozowym (Sigma) w obecnoci wzorca masowego (100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas, Litwa).
Wyniki i omówienie
Na podstawie obserwacji klinicznych w stadninach z enzootycznie wystêpuj¹c¹ rodokokoz¹ wyodrêbnio-no 3 grupy dowiadczalne (A, B, C) licz¹ce ³¹cznie 41 rebi¹t. Grupa A obejmowa³a 20 rebi¹t nie wykazu-j¹cych w okresie pobierania próbek klinicznych obja-wów ze strony uk³adu oddechowego. Grupa B obej-mowa³a 15 rebi¹t, u których badaniem klinicznym stwierdzono zapalenie górnych dróg oddechowych, manifestuj¹ce siê podwy¿szeniem ciep³oty wewnêtrz-nej (39,0-40,5°C), osowieniem, powiêkszeniem wêz-³ów ch³onnych ¿uchwowych, zmniejszeniem apetytu, surowiczym lub luzowo-ropnym wyp³ywem z otwo-rów nosowych oraz kaszlem. Os³uchiwaniem u wszyst-kich rebi¹t z tej grupy stwierdzano zaostrzenie szme-ru pêcherzykowego, s³yszalne zw³aszcza w okolicy p³atów dog³owowych. Grupa C obejmowa³a 6 rebi¹t, u których przy¿yciowo na podstawie badania klinicz-nego postawiono podejrzenie, a w dalszym etapie badañ metod¹ PCR potwierdzono rozpoznanie zapa-lenia p³uc wywo³anego przez zjadliwe szczepy R. equi. W grupach B i C rebiêta poddawane by³y terapii an-tybiotykowej.
U rebi¹t z grupy A, nie wykazuj¹cych klinicznych objawów ze strony uk³adu oddechowego, wyniki ba-dania próbek PTO i ka³u by³y negatywne, niezale¿nie
od zastosowanej metody (tab. 2). W grupie B, obej-muj¹cej rebiêta wykazuj¹ce s³abo nasilone objawy ze strony uk³adu oddechowego w postaci kaszlu oraz luzowo-ropnego wyp³ywu z nosa z towarzysz¹c¹ go-r¹czk¹, na 15 badanych próbek PTO i ka³u pozytywny wynik reakcji PCR uzyskano w 7 próbkach PTO oraz w 2 próbkach ka³u, natomiast wynik badania hodow-lanego by³ dodatni tylko w przypadku 3 próbek PTO. W grupie C, obejmuj¹cej 6 rebi¹t z silnie wyra¿ony-mi objawawyra¿ony-mi ze strony p³uc, dodatni wynik reakcji PCR oraz badania hodowlanego uzyskano we wszystkich badanych próbkach PTO i w 3 próbkach ka³u.
W toku obserwacji klinicznych w stadninach z en-zootycznie wystêpuj¹c¹ rodokokoz¹ wyselekcjonowa-no do dalszych badañ trzy grupy dowiadczalne, ró¿-ni¹ce siê stopniem nasilenia klinicznych objawów ze strony uk³adu oddechowego. Taki schemat postêpo-wania umo¿liwi³ grupowanie uzyskiwanych wyników badañ w zale¿noci od klinicznego stadium rozwoju choroby oraz u³atwia³ ich interpretacjê. Podobny tok postêpowania przyjmowany jest w odniesieniu do wiêkszoci badañ eksperymentalnych dotycz¹cych zaka¿eñ R. equi u rebi¹t (25, 32).
Sporód aktualnie dostêpnych metod przy¿yciowe-go rozpoznawania rodokokozy rebi¹t badanie klinicz-ne ma ograniczon¹ wartoæ diagnostyczn¹ (14). Czês-tym zjawiskiem jest brak widocznych objawów we wczesnych stadiach zaka¿enia, a niekiedy nawet w za-awansowanych stadiach rozwoju choroby (7, 13). Znaczenie tego badania wi¹¿e siê natomiast z mo¿li-woci¹ selekcjonowania na jego podstawie rebi¹t do wykonania dalszych szczegó³owych badañ, a tak¿e stwierdzania objawów zlokalizowanych poza uk³adem oddechowym, np. zapalenia wielostawowego (7, 13). Podstawow¹ metod¹ diagnostyki zaka¿eñ R. equi u rebi¹t jest badanie hodowlane, polegaj¹ce na izola-cji oraz identyfikaizola-cji zarazka na pod³o¿ach selektyw-Tab. 1. Sekwencje starterów reakcji multiplex PCR
Tab. 2. Porównanie wyników badania metod¹ multiplex PCR i hodowlanego próbek pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej i ka³u rebi¹t w zale¿noci od na-silenia klinicznych objawów ze strony uk³adu oddechowego
Objanienia: A rebiêta nie wykazuj¹ce klinicznych objawów ze strony uk³adu oddechowego; B rebiêta ze s³abo nasilonymi objawami ze strony uk³adu odde-chowego (opis w tekcie); C rebiêta z silnie wyra¿onymi objawami ze strony dolnych dróg oddechowych (opis w tekcie)
a w z a N a r e tr a t s ( ® )'K5ie'run3ek Sekwencja(5® )'3 Region Produkt .r o f q R . v e r q R ¬® CTGCGACTCCCACGTAGAGAAGAGAGCGTCTCGGGTG 16SrRNA 441pz 1 p V 2 p V ¬® GTTATGGGAGAATTTCCCTGCTGTACTCATCCCGCATACACCTGCACCTAACCACATTTC vapA 875pz ) 0 2 = n ( A a p u r G GrupaB(n=15) GrupaC(n=6) O T P ka³ PTO ka³ PTO ka³ R C P a d o t e M 7 2 6 3 e n a l w o d o h e i n a d a B 3 6 3
nych (7, 9). Najlepsze efekty uzysku-je siê, pobieraj¹c do badania pop³u-czynê tchawiczo-oskrzelow¹, z uwagi na znikomy stopieñ zanieczyszczenia próbki flor¹ towarzysz¹c¹ (1). Mate-ria³ ten mo¿na wykorzystaæ dodatko-wo do bezporedniego badania mikro-skopowego, cytologicznego oraz do ekstrakcji kwasów nukleinowych, poddawanych amplifikacji metod¹ PCR (1, 3, 7). Badanie hodowlane pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej uznawane jest niekiedy za z³oty stan-dard w laboratoryjnej diagnostyce rodokokozy i czêsto stanowi uk³ad od-niesienia dla innych metod (7). Mate-ria³ powinno siê posiewaæ na pod³o¿a wybiórcze, zawieraj¹ce antybiotyki hamuj¹ce wzrost flory konkurencyj-nej (7, 9). Jednym z czêciej stosowa-nych tego typu pod³o¿y jest po¿ywka NANAT, opracowana przez Woolcock i wsp. (29), która zosta³a wykorzysta-na w badaniach w³asnych.
Analiza wyników badañ w³asnych potwierdza sku-tecznoæ badania hodowlanego z u¿yciem selektyw-nego pod³o¿a NANAT do izolacji szczepów R. equi z pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej (ryc. 1). O spe-cyficznoci izolacji bakterii nale¿¹cych do gatunku R. equi decyduje niew¹tpliwie sk³ad pod³o¿a NANAT ograniczaj¹cy namna¿anie siê flory towarzysz¹cej (9, 29). Warto podkreliæ, ¿e badanie takie nie wnosi ¿ad-nych informacji odnonie do markerów zjadliwoci izolowanych szczepów, których okrelenie jest istot-ne z punktu widzenia wyboru metody postêpowania ze rebiêtami chorymi lub podejrzanymi o chorobê (16, 18). Wprawdzie z naturalnych przypadków zaka¿eñ rebi¹t najczêciej izolowane s¹ szczepy R. equi o za-programowanej genetycznie zjadliwoci (24), w prób-kach badanego materia³u nale¿y jednak liczyæ siê tak-¿e z obecnoci¹ szczepów niezjadliwych (5, 24). Uwa-runkowane jest to ich powszechnym wystêpowaniem w rodowisku bytowania zwierz¹t oraz zanieczyszcze-niem bakteryjnym drobin kurzu i py³u w pomieszcze-niach stajennych i na wybiegach (4, 5, 7, 10). Ponadto badanie hodowlane mo¿e dawaæ wyniki fa³szywie ujemne, zw³aszcza jeli w okresie przed pobraniem materia³u stosuje siê u zwierz¹t terapiê antybiotyko-w¹ (16, 20).
W przebiegu rodokokozy zarazek, poza p³ucami, czêsto lokalizuje siê tak¿e w przewodzie pokarmowym (7). Dotyczy to zw³aszcza m³odych rebi¹t, w wieku do 3 miesi¹ca ¿ycia, u których bakterie ulegaj¹ repli-kacji w jelitach, osi¹gaj¹c liczbê 104-105 komórek w 1 g ka³u (24). Skutkiem kolonizacji przewodu pokarmo-wego jest siewstwo zjadliwych drobnoustrojów z ka-³em oraz trwa³e zanieczyszczenie rodowiska ze-wnêtrznego. Ten fakt pozwala na wykorzystywanie
izolacji R. equi z ka³u rebi¹t w wieku do 3. miesi¹ca ¿ycia jako alternatywnej metody przy¿yciowej diagno-styki rodokokozy (1, 7), któr¹ zastosowano w bada-niach w³asnych.
W wielu laboratoriach do rozpoznawania rodoko-kozy rebi¹t wykorzystuje siê aktualnie, obok klasycz-nych technik bakteriologiczklasycz-nych, metodê PCR (17, 21, 26, 27). Sta³o siê to mo¿liwe dziêki poznaniu i opubli-kowaniu sekwencji nukleotydowej genu vapA, kodu-j¹cego bia³ko antygenowe o tej samej nazwie (19). Na tej podstawie wytypowano i opublikowano sekwencje kilku par starterów reakcji, komplementarnych do konserwatywnych regionów plazmidowego DNA (2, 21-23, 26). Alternatywnie w diagnostyce rodokokozy wykorzystaæ mo¿na startery komplementarne do frag-mentu chromosomalnego DNA, koduj¹cego podjed-nostkê 16S rybosomowego RNA (rRNA) (3, 6, 11, 21). Uwzglêdniaj¹c dane pimiennictwa z zakresu mole-kularnej diagnostyki zaka¿eñ R. equi, w badaniach w³asnych wykorzystano 2 pary starterów (tab. 1), któ-rych u¿ycie umo¿liwia³o wykazanie przynale¿noci gatunkowej izolowanych drobnoustrojów, a tak¿e okrelenie specyficznego dla R. equi markera zjadli-woci (3, 21). Z danych pimiennictwa wynika, ¿e metoda PCR stosowana by³a dotychczas g³ównie do okrelania zjadliwoci szczepów R. equi izolowanych uprzednio w badaniu hodowlanym (1, 18, 21, 26). W badaniach w³asnych podjêto próbê wykorzystania tej metody do wykrywania materia³u genetycznego R. equi bezporednio w próbkach materia³u biologicz-nego oraz do ró¿nicowania szczepów zjadliwych i nie-zjadliwych, co ma istotne znaczenie z punktu widze-nia przy¿yciowej diagnostyki choroby oraz podejmo-wanej terapii.
441 pz 875 pz
M K(+) K(–) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Ryc. 1. Produkty reakcji PCR-multiplex o d³ugoci 441 i 875 pz uzyskane z u¿y-ciem starterów Rq for, Rq rev oraz Vp1, Vp2 komplementarnych, odpowiednio, do genu 16S rRNA i genu vapA na matrycy DNA izolowanego z pop³uczyny tcha-wiczo-oskrzelowej rebi¹t
Objanienia: M marker masy cz¹steczkowej (100 bp DNA ladder, MBI, Fermentas Litwa); K () kontrola negatywna; K (+) kontrola pozytywna (DNA R. equi ATCC 33701); nr 1, 5, 6, 8, 9, 10, 11 próbki pop³uczyny pobrane od rebi¹t z grupy A; nr 2, 3, 4, 7 próbki pop³uczyny pobrane od rebi¹t z grup B i C
W stadninach z enzootycznie wystêpuj¹c¹ rodoko-koz¹ rebiêta, u których dosz³o do zaka¿enia, znajdu-j¹ siê przewa¿nie w ró¿nych stadiach klinicznych roz-woju choroby, co rzutuje na koncentracjê zarazka w materiale dostêpnym do badania, a tak¿e na mo¿li-woci jego wykrywania dostêpnymi metodami (7, 13). W badaniach w³asnych posiewy na po¿ywce NANAT i reakcjê PCR wykonywano w odniesieniu do próbek pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej i ka³u pobieranych od rebi¹t, które podzielono na trzy grupy (A, B, C) w zale¿noci od nasilenia klinicznych objawów ze stro-ny uk³adu oddechowego. Wykazano, ¿e w ka¿dej z tych grup, niezale¿nie od u¿ytej metody badania, bardziej przydatn¹ diagnostycznie okaza³a siê pop³uczyna tcha-wiczo-oskrzelowa w porównaniu do ka³u (tab. 2). Ten fakt t³umaczyæ mo¿na wy¿sz¹ koncentracj¹ R. equi w pop³uczynie, w której w niepowik³anych przypad-kach rodokokozy oraz przy zachowaniu w³aciwych zasad pobierania materia³u oczekiwaæ nale¿y jedno-rodnej zawiesiny bakterii. W badaniu próbek ka³u uwzglêdniæ natomiast nale¿y udzia³ towarzysz¹cej flo-ry bakteflo-ryjnej oraz przewa¿nie ni¿sz¹ liczbê zarazka w 1 g próbki, zw³aszcza u rebi¹t w wieku powy¿ej 3. miesi¹ca ¿ycia. W badaniach wykazano tak¿e wiêk-sz¹ przydatnoæ diagnostyczn¹ metody PCR w porów-naniu do badania hodowlanego tak w odniesieniu do ka³u, jak i pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej. Wyniki te wiadcz¹ o wy¿szej czu³oci metody PCR w po-równaniu z badaniem hodowlanym. W interpretacji wyników tych badañ uwzglêdniæ nale¿y tak¿e fakt sto-sowania terapii antybiotykowej u rebi¹t w grupach B i C, która niew¹tpliwie rzutuje na mo¿liwoci wykry-wania zarazka w badaniu hodowlanym. Na ten pro-blem zwrócili tak¿e uwagê Sellon i wsp. (21), którzy wykazali, ¿e u leczonych rebi¹t badanie hodowlane mo¿e dawaæ wynik ujemny, podczas gdy metod¹ PCR stwierdza siê w badanym materiale obecnoæ materia-³u genetycznego zjadliwych szczepów R. equi. Do
przy¿yciowej diagnostyki zaka¿eñ R. equi u rebi¹t bardziej celowe wydaje siê zatem pobieranie pop³u-czyny tchawiczo-oskrzelowej ni¿ ka³u. Konieczne jest tak¿e ustalenie, czy badane rebiêta by³y lub s¹ aktu-alnie poddawane terapii antybiotykowej. W przypad-ku stosowania antybiotyków wskazane jest u¿ycie metody PCR, daj¹cej wiêksze prawdopodobieñstwo potwierdzenia zaka¿enia w porównaniu do badania hodowlanego.
Dane pimiennictwa dotycz¹ce wykorzystania ró¿-nych metod przy¿yciowego rozpoznawania zaka¿eñ R. equi u rebi¹t potwierdzaj¹ wiêksz¹ przydatnoæ metody PCR w porównaniu z metodami konwencjo-nalnej diagnostyki bakteriologicznej (20, 21, 26, 27). Sellon i wsp. (21) wykazali, ¿e przy u¿yciu metody amplifikacji DNA mo¿liwa by³a identyfikacja R. equi w pop³uczynie tchawiczo-oskrzelowej u 34% rebi¹t w wieku 2-8 miesiêcy, natomiast w badaniu hodowla-nym zarazek wyizolowano z tego samego materia³u tylko od 17% rebi¹t. Wyniki te jednoznacznie wska-zuj¹ na wiêksz¹ czu³oæ metody PCR, której dodatko-w¹ zalet¹ jest mo¿liwoæ okrelenia zjadliwoci szcze-pów. Autorzy w swoich badaniach wskazuj¹ tak¿e na niektóre s³absze strony metody PCR, do których obok problemów natury technicznej zaliczyæ mo¿na brak mo¿liwoci wykrywania u rebi¹t zaka¿eñ wspó³ist-niej¹cych lub czêste uzyskiwanie wyników fa³szywie dodatnich, spowodowane zanieczyszczeniem materia-³u biologicznego niezjadliwymi szczepami pochodz¹-cymi ze rodowiska. W badaniach w³asnych problem ten uda³o siê wyeliminowaæ poprzez zastosowanie do wykrywania R. equi reakcji PCR-multiplex z u¿yciem starterów komplementarnych do dwóch ró¿nych frag-mentów genomu zarazka (ryc. 2). Pozwoli³o to na rów-noczesne potwierdzenie przynale¿noci gatunkowej bakterii obecnych w badanym materiale oraz obecno-ci lub braku genu vapA koduj¹cego bia³ko determinu-j¹ce zjadliwoæ R. equi.
Uzyskane wyniki potwierdzaj¹ mo¿liwoæ zastoso-wania reakcji PCR i badania hodowlanego do przy¿y-ciowej diagnostyki zaka¿eñ R. equi u rebi¹t. Wynik badania uzale¿niony jest jednak od nasilenia objawów klinicznych i rodzaju badanego materia³u (tab. 2). Metoda PCR z u¿yciem podwójnych starterów jest przydatna do wykrywania w warunkach przy¿yciowych zjadliwych szczepów R. equi oraz ró¿nicowania ich ze szczepami niezjadliwymi. Metoda ta mo¿e byæ szcze-gólnie przydatna do badania pop³uczyny tchawiczo--oskrzelowej we wczesnym okresie zaka¿enia, w któ-rym zjadliwe zarazki w wiêkszoci znajduj¹ siê we-wn¹trz komórek fagocytarnych.
Na podstawie uzyskanych wyników badañ dotycz¹-cych mo¿liwoci przy¿yciowego rozpoznawania za-ka¿eñ R. equi u rebi¹t w stadninach z enzootycznie wystêpuj¹c¹ rodokokoz¹ mo¿na przyj¹æ, ¿e najbardziej wiarygodne wyniki uzyskuje siê w odniesieniu do badania pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej metod¹ PCR.
Ryc. 2. 3-dniowa hodowla R. equi izolowanego z pop³uczyny tchawiczo-oskrzelowej rebiêcia na pod³o¿u selektywnym NANAT
Pimiennictwo
1.Anzai T., Wada R., Nakanishi A., Kamada M., Takai S., Shindo Y., Tsubaki S.: Comparison of tracheal aspiration with other tests for diagnosis of Rhodo-coccus equi pneumonia in foals. Vet. Microbiol. 1997, 56, 335-345. 2.Arriaga J., Cohen N., Derr J., Chaffin M., Martens R.: Detection of
Rhodo-coccus equi by polymerase chain reaction using species-specific nonproprie-tary primers. J. Vet. Diagn. Invest. 2002, 14, 347-353.
3.Bell K. S., Philp J. C., Christofi N., Aw D. W.: Identification of Rhodococcus equi using the polymerase chain reaction. Letters Appl. Microbiol. 1996, 23, 72-74.
4.Chaffin M. K., Cohen N. D., Martens R. J., Edwards R. F., Nevill M.: Foal-related risk factors associated with development of Rhodococcus equi pneumonia on farms with endemic infection. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2003, 223, 1791-1799.
5.Cohen N. D., OConor M. S., Chaffin M. K., Martens R. J.: Farm characteri-stics and management practices associated with development of Rhodococ-cus equi pneumonia in foals. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2005, 226, 404-413. 6.Costa Krewer C., Spricigo D., Avila Botton S., Costa M., Schrank I.,
Vargas A.: Molecular characterization of Rhodococcus equi isolates of horse breeding farms from an endemic region in south of Brazil by multiplex PCR. Brazil. J. Microbiol. 2008, 39, 188-193.
7.Giguere S., Prescott J. F.: Clinical manifestations, diagnosis, treatment, and prevention of Rhodococcus equi infections in foals. Vet. Microbiol. 1997, 56, 313-334.
8.Giguere S., Prescott J. F.: Strategies for the control of Rhodococcus equi infections on enzootic farms. Pediatrics II. In: AAEP Proceedings 1997, 43, 65-70.
9.Graevenitz A., Punter-Streit V.: Development of a new selective plating medium for Rhodococcus equi. Microbiol. Immunol. 1995, 39, 283-284. 10.Gr¹dzki Z., Ziêtek A., Hetman E., Winiarczyk S.: Wystêpowanie szczepów
Rhodococcus equi w glebie w stadninach z wystêpuj¹c¹ rodokokoz¹. Medy-cyna Wet. 2006, 62, 1310-1312.
11.Halbert N., Reitzel R., Martens R., Cohen N.: Evaluation of a multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Rhodococcus equi and the vapA gene. Am. J. Vet. Res. 2005, 66, 1380-1385.
12.Hashikura S., Higuchi T., Taharaguchi S., Orota Y., Nanao Y., Takai S.: Evaluation of nasotracheal aspiration as a diagnostic tool for Rhodococcus equi pneumonia in foals. Equine Vet. J. 2000, 32, 560-564.
13.Heidmann P., Madigan J. E., Watson J. L.: Rhodococcus equi pneumonia: clinical findings, diagnosis, treatment and prevention. Clin. Tech. Equine Pract. 2006, 5, 203-210.
14.Higuchi T., Taharaguchi S., Hashikura S., Hagiwara S., Gojo Ch., Satoh S., Yoshida M., Takai S.: Physical and serologic examinations of foals at 30 and 45 days of age for early diagnosis of Rhodococcus equi infection on endemi-cally infected farms. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998, 212, 976-981. 15.Hillidge C. J.: Review of Corynebacterium (Rhodococcus) equi lung
abs-cesses in foals: pathogenesis, diagnosis and treatment. Vet. Rec. 1986, 119, 261-264.
16.Hondalus M. K.: Pathogenesis and virulence of Rhodococcus equi. Vet. Mi-crobiol. 1997, 56, 257-268.
17.Ladron N., Fernandez M., Aguero J., Zorn G., Vazquez-Boland J., Navas J.: Rapid identification of Rhodococcus equi by a PCR assay targeting the choE gene. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 3241-3245.
18.Martens R. J., Takai S., Cohen N. D., Chaffin M. K., Liu H., Sakurai K., Sugimoto H., Lingsweiler S. W.: Association of disease with isolation and virulence of Rhodococcus equi from farm soil and foals with pneumonia. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2000, 217, 220-225.
19.Sekizaki T., Ogawa Y., Ikeda T., Ito H., Tsubaki S.: Sequence of the Rhodo-coccus equi gene encoding the virulence-associated 15-17-kDa antigens. Gene 1995, 155, 135-136.
20.Sellon D., Besser T., McConnico R., Vivrette S.: Diagnosis of Rhodococcus equi Pneumonia in Foals: PCR or Culture? AAEP Proceedings 2000, 46, 268-269.
21.Sellon D. C., Besser T. E., Vivrette S. L., McConnico R. S.: Comparison of nucleic acid amplification, serology, and microbiologic culture for diagnosis of Rhodococcus equi pneumonia in foals. J. Clin. Microbiol. 2001, 39, 1289--1293.
22.Sellon D. C., Walker K., Suyemoto M., Altier C.: Nucleic acid amplification for rapid detection of Rhodococcus equi in equine blood and tracheal wash fluids. Am. J. Vet. Res. 1997, 58, 1232-1237.
23.Takai S., Ikeda T., Sasaki Y., Watanabe Y., Ozawa T., Tsubaki S., Sekizaki T.: Identification of Virulent Rhodococcus equi by Amplification of Gene Coding for 15- to 17-Kilodalton Antigens. J. Clin. Microbiol. 1995, 33, 1624-1627. 24.Takai S., Ohbushi S., Koike K., Tsubaki S., Oishi H., Kamada M.: Prevalence of virulent Rhodococcus equi in isolates from soil and feces of horses from horse-breeding farms with and without endemic infections. J. Clin. Micro-biol. 1991, 29, 2887-2889.
25.Takai S., Sasaki Y., Tsubaki S.: Rhodococcus equi infection in foals current concepts and implication for future research. J. Equine Sci. 1995, 6, 105-119. 26.Takai S., Vigo G., Ikushima H., Higuchi T., Hagiwara S., Hashikura S., Sasaki Y., Tsubaki S., Anzai T., Kamada M.: Detection of virulent Rhodococ-cus equi in tracheal aspirate samples by polymerase chain reaction for rapid diagnosis of R. equi pneumonia in foals. Vet. Microbiol. 1998, 61, 59-69. 27.Venner M., Heyers P., Strutzberg-Minder K., Lorenz N., Verspohl J., Klug E.:
Detection of Rhodococcus equi by microbiological culture and by polymerase chain reaction in samples of tracheobronchial secretions of foals. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2007, 120, 126-133.
28.Vivrette S. L., Sellon D. C., Gibbons D. S.: Clinical application of a polyme-rase chain reaction in the diagnosis of pneumonia caused by Rhodococcus equi in a horse. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2000, 217, 1348-1350.
29.Woolcock J. B., Farmer A. M., Mutimer M. D.: Selective medium for Coryne-bacterium equi isolation. J. Clin. Microbiol. 1979, 9, 640-642.
30.Ziêtek-Barszcz A., Gr¹dzki Z.: Optimisation of the DNA-extraction method from foal faeces for the diagnosis of Rhodococcus equi infections using PCR. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2009, 53, 345-349.
31.Ziêtek-Barszcz A., Gr¹dzki Z.: The suitability of selected methods of nucleic acid extraction for detecting Rhodococcus equi DNA in tracheobronchial wash fluid using PCR. Polish J. Vet. Sci. 2010, 13, 409-413.
32.Zink M. C., Yager J. A., Smart N. L.: Corynebacterium equi infections in horses, 1958-1984: A review of 131 cases. Can. Vet. J. 1986, 27, 213-217. Adres autora: prof. dr hab. Zbigniew Gr¹dzki, ul. Bursztynowa 15/109, 20-576 Lublin; e-mail: gradzki@up.lublin.pl
