G
G
G
U
U
U
Z
Z
Z
A
A
A
K
K
K
J
J
J
A
A
A
W
W
W
A
A
A
J
J
J
S
S
S
K
K
K
I
I
I
(
(
(
M
M
M
E
E
E
L
L
L
O
O
O
I
I
I
D
D
D
O
O
O
G
G
G
Y
Y
Y
N
N
N
E
E
E
J
J
J
A
A
A
V
V
V
A
A
A
N
N
N
I
I
I
C
C
C
A
A)
A
)
)
W
W
W
D
D
D
W
W
W
U
U
U
P
P
P
R
R
R
Z
Z
Z
E
E
E
S
S
S
Y
Y
Y
Ł
Ł
Ł
K
K
K
A
A
A
C
C
C
H
H
H
Z
Z
Z
I
I
I
E
E
E
M
M
M
N
N
N
I
I
I
A
A
A
K
K
K
Ó
Ó
Ó
W
W
W
J
J
J
A
A
A
D
D
D
A
A
A
L
L
L
N
N
N
Y
Y
Y
C
C
C
H
H
H
I
I
I
M
M
M
P
P
P
O
O
O
R
R
R
T
T
T
O
O
O
W
W
W
A
A
A
N
N
N
Y
Y
Y
C
C
C
H
H
H
Z
Z
Z
E
E
E
G
G
G
I
I
I
P
P
P
T
T
T
U
U
U
D
D
D
O
O
O
P
P
P
O
O
O
L
L
L
S
S
S
K
K
K
I
I
I
dr Witold Karnkowski, mgr Marta Saldat, mgr Agata Kaczmarek*GIORiN, Centralne Laboratorium w Toruniu, ul. Żwirki i Wigury 73, 87-100 Toruń e-mail: [email protected]
*obecny adres: The James Hutton Institute, Invergowrie, Dundee, DD2 5DA, Szkocja
uzaki (Meloidogyne spp.) są osia-dłymi endopasożytami roślin wyż-szych. Osobniki młodociane (J2) przenikają do korzeni roślin najczęściej przez stożek wzrostu lub w jego
bezpośred-nim sąsiedztwie. W korzeniu osobniki mło-dociane samic stopniowo nieruchomieją i powiększają objętość ciała. Dorosła samica ma kształt kulisty lub butelkowaty i jest cał-kowicie nieruchoma.
Niektóre gatunki guzaków mogą także rozwijać się w bulwach ziemniaka. Wśród nich szczególne znaczenie mają dwa blisko spokrewnione ze sobą gatunki: guzak ame-rykański (Meloidogyne chitwoodi Golden et al.) i guzak holenderski (Meloidogyne fallax Karssen), które mają status organizmów kwarantannowych we wszystkich państwach członkowskich Unii Europejskiej, a także w innych krajach spoza UE. W Polsce nie no-towano dotąd przypadku wystąpienia M.
chitwoodi lub M. fallax, jednak ze względu na
możliwość ich pojawienia się u nas pracow-nicy Wojewódzkich Inspektoratów Ochrony Roślin i Nasiennictwa (WIORiN) prowadzą poszukiwania obu tych gatunków nicieni za-równo w ziemniakach krajowych, jak i po-chodzących z importu.
W kwietniu 2010 r. pracownicy WIORiN w Łodzi pobrali w sklepie jednej z dużych sieci handlowych próbkę ziemniaków jadalnych
pochodzących z Egiptu (próbka nr 1). W trakcie badań w Laboratorium Wojewódzkim WIORiN w Sieradzu nie stwierdzono żad-nych widoczżad-nych zewnętrzżad-nych objawów porażenia. Jednak po zdjęciu skórki stwier-dzono w miąższu brązowe nekrotyczne zmiany o średnicy ok. 0,5-1,0 mm, wskazu-jące na obecność samic guzaków (fot. 1B).
W kwietniu 2011 r. pracownicy WIORiN w Kielcach pobrali, także w sklepie jednej z sieci handlowych, próbkę ziemniaków rów-nież pochodzących z Egiptu (próbka nr 2) i stwierdzili podobne objawy porażenia we-wnętrznego przez guzaki, przy braku wyraź-nych objawów zewnętrzwyraź-nych (fot. 1A). Labo-ratorium Wojewódzkie w Kielcach potwier-dziło obecność w tej próbce samic guzaków z rodzaju Meloidogyne.
Celem badań było jednoznaczne określe-nie przynależności gatunkowej nicieni znaj-dujących się w obu próbkach.
Fot. 1. Bulwa ziemniaka pochodząca z partii importowanej z Egiptu, porażona przez guzaki. A – widoczne małe okrągławe zgrubienia na powierzchni; B – widoczne objawy porażenia
wewnętrznego – nekrotyczne plamki o średnicy 0,5-1,0 mm (fot. T. Konefał)
Materiał i metody
Szczegółowe badania dotyczące identyfikacji nicieni prowadzono w Centralnym Laborato-rium Głównego Inspektoratu Ochrony Roślin i Nasiennictwa w Toruniu. Do ekstrakcji osobników guzaków z miąższu bulw zasto-sowano metodę enzymatyczną rekomendo-waną przez Europejską i Śródziemnomorską Organizację Ochrony Roślin EPPO (OEPP/EPPO 2006, 2009). Samice guzaków wyekstrahowane z bulw poddano w pierw-szej kolejności analizom molekularnym w
celu potwierdzenia lub wykluczenia obecno-ści gatunków kwarantannowych – M.
chitwo-odi i M. fallax.
Materiał pobrany do badań w 2010 r. (próbka nr 1) analizowano w pierwszej kolej-ności z zastosowaniem testu PCR-ITS po-zwalającego na stwierdzenie, czy nicienie należą do rodzaju Meloidogyne, a następnie z zastosowaniem metody RFLP-PCR (OEPP/EPPO 2009). Badania na materiale pobranym w 2011 r. (próbka nr 2) przepro-wadzono z zastosowaniem
nych przez EPPO metod JMV, PCR-SCAR, PCR-ITS i RFLP-PCR (OEPP /EPPO 2009).
Wobec negatywnych wyników testów mo-lekularnych przeprowadzonych na materiale wyizolowanym z obu próbek (wykryto gatun-ki Meloidogyne spp. inne niż kwarantanno-we), dalszą identyfikację nicieni prowadzono na podstawie budowy morfologicznej uprzednio spreparowanych samic i osobni-ków młodocianych, na podstawie publikacji Karssena (1999) oraz materiałów odniesie-nia.
Wyniki
Testy molekularne ujawniły obecność w obu próbkach ziemniaków osobników z rodzaju
Meloidogyne (fot. 4, 7, 8) należących do
jed-nego z gatunków Meloidogyne incognita (Kofoid et White 1919) (Chitwood 1949) lub
M. javanica (Treub 1885) (Chitwood 1949).
Wykluczono przynależność do kwarantan-nowych gatunków Meloidogyne chitwoodi i
M. fallax (fot. 5, 6). W wyniku obserwacji
cech morfologicznych samic i osobników młodocianych (obecności samców nie stwierdzono) oraz ich pomiarów (tab. 1) zidentyfikowano nicienie występujące w obu próbach jako należące do gatunku M.
java-nica (fot. 2).
Tabela 1
Cechy morfologiczne oraz średnie wymiary samic i osobników młodocianych J2 stwierdzonych w obu próbkach ziemniaków
Samice Osobniki młodociane J2 Próbka kształt regionu perinealnego i punktowanie oskórka (tak/nie) L (
µ
m) długość sztyletu (µ
m), szerokość (µ
m) i kształt jego guzików dlugość ogona i przezroczystej części ogona (µ
m)oraz kształt ogona
pozycja hemi- zonidu Ziemniaki pobrane w 2010 r.
region perinealny z silnie rozwiniętymi liniami bocz-nymi, które wyraźnie od-dzielają jej część grzbie-tową i brzuszną (fot. 2); brak punktowania oskórka w okolicy odbytu 475 sztylet = 14,25 szerokość guzików = 2,0 guziki sztyletu poprzecznie wydłużone, zaokrąglone ogon = 55 przezroczysta część ogona = 17 ogon stożkowaty, zaokrąglony na końcu (fot. 3) na wyso-kości kanalika wydalni-czego Ziemniaki pobrane w 2011 r.
region perinealny z silnie rozwiniętymi liniami bocz-nymi, które wyraźnie oddzielają jej część grzbietową i brzuszną; brak punktowania oskórka w okolicy odbytu (fot. 2)
450 sztylet = 14,50 szerokość guzików = 1,63 guziki sztyletu poprzecznie wydłużone, zaokrąglone ogon = 53,75 przezroczysta część ogona = 11,75 ogon stożkowaty, zaokrąglony na końcu (fot. 3) na wyso-kości kanalika wydalni-czego
Fot. 2. Płytki perinealne Meloidogyne javanica.
Strzałkami zaznaczono wyraźnie widoczne linie boczne (fot. W. Karnkowski)
Fot. 3. Ogon osobnika Meloidogyne javanica (fot. W. Karnkowski)
Fot. 4. Rozkład produktów PCR w żelu agarozowym po analizie RFLP (próbka nr 1, 2010 r.) 1, 9, 17 – marker DNA (100 bp DNA ladder, Fermentas); 2-4 – Meloidogyne spp., traw. RsaI (~900, 760 bp), 5 –
Meloidogyne fallax, traw. RsaI (~630, 130 bp), 6 – Meloidogyne chitwoodi, traw. RsaI (~760 bp), 6 – Meloidogyne hapla, traw. RsaI (brak produktu, oczekiwany produkt dla M. hapla ~620, 140 bp); 10-12
– Meloidogyne spp., traw. DraI (~500, 400, 220, 200, 180 bp), 13 – Meloidogyne fallax, traw. DraI (~650, 110 bp), 14 – Meloidogyne chitwoodi, traw. DraI (~660, 100 bp), 15 – Meloidogyne hapla, traw.
DraI (brak produktu, oczekiwany produkt dla M. hapla ~360, 380 bp); 8, 16 – kontrola negatywna
tra-wienia (fot. A. Kaczmarek)
Fot. 5. Rozkład produktów PCR JMV w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.) 1, 28 – marker DNA (100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2, 22, 23 – Meloidogyne fallax (~670 bp); 24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~540 bp); 26 – kontrola negatywna PCR; 27 – kontrola negatywna elektroforezy (fot. M. Saldat)
Fot. 6. Rozkład produktów PCR SCAR w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.); 1, 28 – marker DNA (100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2, 22, 23 –Meloidogyne fallax (~515 bp); 24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~800 bp); 26 – kontrola negatywna PCR; 27 – kontrola negatywna elektroforezy (fot. M. Saldat)
Fot. 7. Rozkład produktów RFLP w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.) (trawienie DraI); 1, 27 – marker DNA (100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2; 22, 23 –Meloidogyne
fallax (~650, 110 bp); 24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~660, 100 bp); 26 – kontrola negatywna PCR;
27 – kontrola negatywna trawienia (fot. M. Saldat)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Fot. 8. Rozkład produktów RFLP w żelu agarozowym (próbka nr 2, 2011 r.) (trawienie RsaI); 1, 27 – marker DNA (100 bp DNA Ladder, Invitrogen); 2-21 – materiał z próbki nr 2; 22, 23 –Meloidogyne
fallax (~630, 130 bp); 24, 25 – Meloidogyne chitwoodi (~760 bp); 26 – kontrola negatywna trawienia
(fot. M. Saldat)
Dyskusja
Guzak jawajski jest gatunkiem notowanym w uprawach gruntowych wyłącznie w strefie klimatu ciepłego. W czasie badań ziemnia-ków pochodzących z porażonej uprawy na Malcie (Vovlas i in. 2005) stwierdzono bar-dzo silne objawy porażenia w postaci nie-wielkich płaskich wyrośli powodujących silną deformację bulw, pod skórką zaś – nekro-tyczne plamki o średnicy ok. 0,5-1,0 mm, które były miejscami występowania samic guzaków, podobnymi do zaobserwowanych później w próbkach badanych w Polsce.
Wnioski
Wyniki badań wskazują, że guzaki
(Melo-idogyne spp.) mogą być przenoszone wraz z
bulwami i mogą być obecne w ziemniakach jadalnych znajdujących się w handlu. Guzak jawajski jest notowany w Polsce wyłącznie w szklarniach, głównie na ogórkach i pomido-rach. Mógłby rozwijać się także na ziemnia-kach, lecz uprawianych w zasadzie też tylko w szklarniach.
Rozwój szkodnika na ziemniakach upra-wianych w gruncie jest możliwy, zwłaszcza w
przypadku wysadzenia porażonego materia-łu sadzeniakowego, jednak gatunek ten nie jest w stanie przezimować w gruncie w na-szych warunkach klimatycznych, gdyż niskie temperatury zimą doprowadziłyby do likwi-dacji powstałych ognisk szkodnika. Znacznie większy problem mogłoby spowodować po-jawienie się na ziemniakach importowanych do Polski guzaków Meloidogyne chitwoodi i
M. fallax. Są to gatunki kwarantannowe, stąd
ich obecność pociągnęłaby konieczność podjęcia urzędowych zabiegów zwalczania.
Literatura
1. Karssen G. 1999. The plant-parasitic nematode genus Meloidogyne Goldi 1892 (Tylenchida) in Europe. PH.D. Thesis, Ghent University: 160 pp; 2. OEPP/ EPPO 2006. EPPO Standards. PM 3/69 Meloidogyne
chitwoodi and M. fallax: Sampling potato tubers for
detection. – Bull. OEPP 36: 421-422; 3. OEPP/EPPO 2009. EPPO Standards. PM 7/41 (2) Meloidogyne
chitwoodi and M. fallax. – Bull. OEPP 39: 5-17; 4. Vov-las N. M., Mifsud D., Landa B. B., Castillo P. 2005. Pathogenicity of the root-knot nematode Meloidogyne
javanica on potato. – Plant Path. 54: 657-664
