JANINA ALEKSANDROWICZ, ZYGM UNT KUDELSKI
T E ST L A L (L IM U L U S A M O E B O C Y T E L Y S A T E ) W Z A S T O S O W A N IU D O O C E N Y B E Z P IE C Z E Ń S T W A B IO P R E P A R A T Ó W
THE LAL (LIMULUS AMOEBOCYTE LYSATE) TEST AS APPLIED FOR THE EVALUATION OF SAFETY OF BIOLOGICAL PREPARATIONS
Zakład Badania Surowic i Szczepionek, Państwowy Zakład Higieny 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24
Kierownik: prof. dr hab. D. Rymkiewicz
Praca ujmuje przeglądowo zastosowania testu Limulus Amoebocyte Lysate L A L do oznaczania zawartości endotoksyny w preparatach biologicznych. Omówiono rozwój badań nad endotoksyną, jej chemicznymi i biologicznymi właściwościami, oraz efekty działania. Podano charakterystykę Limulus połyphe- mus, zasady testu LAL, oraz jego zastosowanie do wykrywania endotoksyny w różnych rodzajach preparatów.
WSTĘP
Użycie testu L A L do wykrywania i kontroli obecności substancji pirogennych w p ro duktach farm aceutycznych i sprzęcie medycznym je st odkryciem ostatnich p iętn astu lat. Jed n ak że związek m iędzy reakcją a iniekq'ą dożylną płynów infuzyjnych je st znany od p onad 100 lat. W 1862 r. Billroth [4] po raz pierwszy użył słowa „pyrogen” w odniesieniu do substancji wywołujących gorączkę.
Nazwa „endotoksyną” odnosi się do specyficznego pirogenu zw iązanego ze ścianą G ram (-) bakterii, a o kreślenie „lipopolisacharyd” (LPS) związane je st ze stru k tu rą biochem iczną endotoksyny. Zazwyczaj endotoksyny uw alniają się podczas lizy kom órek bakteryjnych [2, 3].
E ndotoksyną składa się z kom pleksów lipidów i polisacharydów o różnym składzie chemicznym.
W ywiera o na liczne i bard zo różne efekty patofizjologiczne na żywe organizm y • poszczególne narządy. R eakcja organizm u na endotoksynę je st zwykle układow a 1 objawia się podwyższoną te m p era tu rą, dreszczam i, tachykardią, bólam i głowy, o b n iże niem ciśnienia, biegunką, bólam i mięśniowymi, nudnościam i, w ym iotam i i innymi objawami [8]. W najcięższych przypadkach, gdy dochodzi do uw olnienia w organizm ie dużych ilości endotoksyny, lub w wyniku p o d an ia płynów infuzyjnych czy p rep arató w zawierających duże dawki endotoksyny m oże wystąpić tzw. szok endotoksyczny, który 2 kolei m oże zakończyć się zejściem śm iertelnym [10, 30]. W związku z powyższym ■stnieje konieczność kontroli wszelkiego rodzaju płynów i p rep arató w do iniekcji, a także sprzętu m edycznego w kierunku obecności endotoksyny [1, 18].
BUDOWA CHEMICZNA ENDOTOKSYN
E ndotoksyny bakterii G ram -ujem nych są lipopolisacharydam i (LPS), ich masa cząsteczkow a w aha się od 900.000 do 1.000.000, są substancjam i odpornym i n a ciepło (tzw. ciepłostałym i). A ntygenow e właściwości lipopolisacharydów są związane z ich częścią wielocukrow ą, a większość aktywności biologicznych wiąże się z częścią lipidową.
M ożna wyróżnić zasadnicze trzy części w budow ie przestrzennej LPS [24]:
1. Polisacharyd swoisty dla antygenu O (np. A ntygen som atyczny O Salmonella) danego szczepu bakterii złożony z pow tarzających się kom binacji oligosacharydów (np. m annoza-ram noza-galaktoza) tworzących swoistą d eterm in an tę haptenow ą.
2. Polisacharyd rdzeniowy (N -acetyloglukozoam ina, glukoza, galaktoza, heptoza) jednakow y u wszystkich bakterii G ram -ujem nych.
3. L ipid A je st zbudow any z dw usacharydow ego rdzenia, pow iązanego z pewną liczbą reszt acylowych, którym i m ogą się różnić lipidy A pochodzące z różnych bakterii.
C zasam i u niektórych drobnoustrojów (np. Salmonella m innesota), lipid A występuje w kilku w ersjach jednocześnie. R dzeń polisacharydowy połączony je st z lipidem A za
pom ocą kwasu 3-dezoksy-D -m annooktulozow ego. R dzeń polisacharydow y i lipid A
m ogą być połączone 2-keto-3-dezoksytrójsacharydem [24, 29].
S tru k tu ra chem iczna lipidu A poszczególnych bakterii wykazuje swoistość gatun kową. W przypadku niektórych drobnoustrojów lipid A jest m ieszaniną kilku związków o zbliżonej stru k tu rze (Rye. 1).
Rye. 1. Chemiczna budowa lipidu A. The chemical structure of Lipid A.
Lipopolisacharydy bakteryjne są tak rozpow szechnione i m ają tak w ielostronne działanie np. im m unostym ulujące z jednej strony, a toksyczne z drugiej strony, że przy stosow aniu p rep a rató w pochodzenia biologicznego (surowice, szczepionki, płyny infu- zyjne i inne) należy określić zaw artość LPS i wykluczyć zanieczyszczenie nim tychże p reparatów .
B iologiczna reaktyw ność lipopolisacharydów bakteryjnych je st bardzo różnorodna [24]. Endotoksyny działają na układ odpornościow y, wywierają działanie na k o m ó r k i bezp o śred n io i pośrednio. W iązanie LPS do błony kom órkow ej je st p o d s t a w o w y m etap em interakcji LPS z kom órkam i. In terakcja ta wyzwala kaskadę reakcji wewnątrz kom órkow ych. W iąże się z recep to ram i na błonie kom órkow ej w form ie kom pleksu L PS-binding p ro tein (LBP), który jest glikoproteiną surowiczą m ającą powinowactwo do re cep to ra CD 18 („scarenger re c e p to r”). Innym i m echanizm am i działania LPS na m onocyty i m akrofagi są absorpcja, pinocytoza i fagocytoza.
E fekt działania endotoksyny (LPS) jest zależny od dawki. W zależności od niej różny jest udział poszczególnych reakcji bezpośrednich i pośrednich składających się na całą odpowiedź.
W Polsce od szeregu lat produkow any był p re p a ra t lipopolisacharydu z hodow li E.
coli szczep Kroegera 08 otrzymywany zm odyfikow aną m eto d ą Westphala i Leudeńtza,
noszący nazwę Pyrogen S tan d ard . Był to p re p a ra t służący do: 1) b ad an ia wrażliwości zwierząt dośw iadczalnych (królików ) n a działanie ciał gorączkotw órczych, a także 2) służący do niesw oistego pobudzenia odporności w stanach naw racających zakażeń układu oddechow ego. W ykorzystanie tego p re p a ra tu wym agało je d n a k dalszych b adań. W C entrum Szkolenia K adry W ojskowej A kadem ii M edycznej były prow adzone b a d a nia, na podstaw ie których stw ierdzono, że p re p a ra t je st nietoksyczny. N aw et cała ampułka (500 j) Pyrogenu p o d an a myszy nie pow odow ała jej śm ierci. Z kolei Pyrogen podawany człowiekowi p o dskórnie w ilości 50-450 j był przyczyną zaczerw ienienia i obrzęku utrzym ującego się w miejscu wstrzyknięcia przez 2 dni oraz m anifestow ał się wzrostem tem p eratu ry do 38°C.
W wielu krajach do tej pory praw nie obowiązującym testem na obecność ciał pirogennych je st tzw. test króliczy. W 1985 r. został przez F arm ak o p eę U S A w prow a dzony test L A L (L im u lu s amoebocyte lysate) jako oficjalnie stosow any test do określania stężenia endotoksyn bakteryjnych w w odzie [27, 28].
CHARAKTERYSTYKA LIMULUS POLYPHEMUS
Odczynnikiem stosow anym w teście L A L je st lizat am ebocytów (k o m ó rek krwi) jednego z przedstaw icieli staw onogów (Arthropoda), należącego do grom ady staroraków
(M erostomata) w podtypie szczękoczułkowców (Chelicerata) o nazw ie L im u lu s polyphe- mus. Potocznie zwany jest on „krabem ” podkowiastym , choć nie m a nic w spólnego z
krabami czy skorupiakam i. W łaściwą nazwą jest skrzypłocz. Żyje n a wybrzeżu atlantyc kim Am eryki Płn. O d M aine po Ju k atan a także w w odach Pacyfiku od Z ato k i B engal skiej po płd.-zach. Japonię, na Sum atrze, B orneo i Filipinach (Ryc. 2).
Ryc. 2. Fotografia Limulus polyphemus. Photography of Limulus polyphemus.
Z etk n ięcie się krwi skrzypłocza z endotoksyną bakteryjną (LPS) prow adzi do agre gacji am ebocytów , ich degranulacji i rozerw ania, efektem tego je st tw orzenie się skrzepu pozakom órkow ego. B akterie G ram ( - ) zostają w ten sposób unieruchom ione w skrzepie. W n atu rz e reakcja ta m a za zadanie chronić L im ulus przed inwazją bakterii G ram (-).
W łaściwości koagulacji endotoksyn bakterii G ram ( - ) przez am ebocyty Lim ulus zostały w ykorzystane in vitro do testu określającego stężenie endotoksyn w badanych p rep ara tac h .
ZASADA TESTU LAL (LIMULUS AMOEBOCYTE LYSATE)
T est L A L wykorzystuje zdolność endotoksyny do aktywacji kaskadow ej reakcji od proenzym u-koagulogenu do enzym u koagulazy przy użyciu lizatu L im u lu s amoebocyte (LA L). W diagnostyce je st szeroko stosowany do wykrywania endotoksyn przy endo- toksem ii, w surow icach pacjentów , zanieczyszczeniach endotoksyną p re p a rató w poda wanych w iniekcjach, a także w skażeniach nią sprzętu m edycznego. D o testu LAL stosuje się odpow iednie zestawy odczynników różnych firm (np. Chrom ogenix-Sw eden).
O dróżnia się trzy podstaw ow e m etody postępow ania (ryc. 3).
Ryc. 3. Modyfikacje testu LAL.
The modifications of basic LAL test.
• M eto d a żelow a (gel-clot) - o p iera się na zasadzie reakcji endotoksyny z krwią skrzypłocza pow odującej koagulację poprzez uruchom ienie łańcucha reakcji enzy matycznych w wyniku których pow staje żel. R eakcja ta je st p ó ł ilościowa. W reakcji tej wyznacza się „punkt końcowy” pow stającego żelu w obec krzywej standardow ej ustaw ionej w granicach m iędzynarodow ych je d n o stek aktywności endotoksyny (EU): od 0,03 E U /m l do 1,2 E U /m l (Ryc. 4).
• M eto d a turbidym etryczna polega na podobnym postępow aniu tylko, że oznacza się zm ętn ien ie w obec krzywej standardow ej przy dł. fali 405 nm.
• T est L A L z użyciem substratu chrom ogenicznego S-2423, KABI (tzw. zestaw Endo L A L C o atest E ndotoxin). R eakcja polega na uaktyw nianiu enzym ów obecnych w odczynniku LAL, k tó re działając na substrat S-2423 uw alniają z niego p-nitroani- linę (P N A ) wg schem atu:
rzę ta dośw iadczalne. I tak np. epinefryna, błękit metylowy am foteryna B, kontrasty są z natury rzeczy gorączkotw órcze [6, 7]. P o n ad to stw ierdzono, że roztw ory fosforanow e w olne od pirogenów m ogą wywołać gorączkę u królików, jeżeli są wstrzyknięte w dużych ilościach [27, 28], w przeciwieństwie do niektórych środków uspokajających takich jak poch o d n e fenotiazyny, kortykosteroidy, p rep araty przeciw gorączkow e (pa racetam ol, A P A P i in.), m ogące obniżyć tem p eratu rę ciała królika, m askując w ten sposób pirogenny potencjał badanych roztw orów [2, 3]. Z tego wynika, że pew ne grupy p rep arató w (chem ioterapeutyki, antybiotyki, płyny infuzyjne i dooponow e) są trudne do b ad a ń testem n a królikach na obecność substancji pirogennych ze względu na ich różne właściwości [6, 7, 11, 16, 17, 19, 32]. Szczególnie w przypadku preparatów dooponow ych obecność pirogenów je st wyjątkowo niebezpieczna ze względu n a drogę ich podaw ania i pow inna zostać wykluczona.
Jak w spom niano wcześniej w 1985 r. do bad an ia stężenia endotoksyny bakteryjnej w w odzie ja k o potencjalnego wskaźnika pirogenności F arm ak o p ea U S A w prowadziła oficjalnie test L A L [33].
W 1987 r. F arm ak o p ea E uropejska [12] zatw ierdziła LA L do oznaczania en d o to k syny w w odzie. F D A US w tym samym roku p odaje dopuszczalną zaw artość en d o to k syny w lekach, niektórych pro d u k tach biologicznych i sprzęcie medycznym [15].
Pfeiffer [26] podaje, że 12 laboratoriów w różnych krajach należących do przemysłu
farm aceutycznego już rutynow o stosuje powyższy test zam iast testu na królikach. Dotyczy to zarów no badań w trakcie procesu produkcyjnego jak też oznaczeń pirogen ności p ro d u k tó w końcowych np. płynów do wlewek pozajelitowych [23], szczepionek bakteryjnych i wirusowych [20], ekstraktów alergenowych [5], plazm y i frakcji osocza [9, 14, 25, 27, 28] oraz wielu innych prep arató w [11, 17, 32].
Jeżeli chodzi o zastosow anie testu LA L do oznaczania endotoksyny w osoczu krwi to niektórzy badacze [10, 25] tw ierdzą, że aktywacji enzymów i pow staw aniu reakcji żelowej w teście L A L przeszkadzają n atu raln e inhibitory [21].
W H O w 1990 r. zaakceptow ała ten test obok tradycyjnego testu na królikach oraz elektroforetycznego testu za pom ocą barw ienia srebrem [34-36].
W ubiegłym roku n iek tó re firmy (Sm ithK line-Beecham , M erck-Sharp-D ohm e) w pro wadziły test L A L do kontroli pirogenności szczepionek (np. Engerix, Pedvax) obok dotychczas stosow anego testu n a królikach.
F a rm ak o p ea Polska - F P V - [13] w prow adziła test LA L jak o obowiązujący do b ad a n ia pirogenów w antybiotykach i w odzie zam iast wyłącznie do tej pory stosowa nego testu biologicznego.
W Z akładzie B adania Surowic i Szczepionek P Z H w ykonano w stępne badania zaw artości endotoksyny w wybranych grupach prep arató w biologicznych stosując test L A L [1]. Z b a d an o zaw artość endotoksyny w 44 bio p rep aratach w tym 20 serii szcze pionek wirusowych i bakteryjnych, 10 serii ludzkich im m unoglobulin do stosowania dożylnego i 14 serii antybiotyków. W ykazano przydatność testu LA L do wykrywania endotoksyn w p re p a ra tac h biologicznych. P row adzone są dalsze b ad an ia zm ierzające do określenia lim itu endotoksyny w p re p aratac h dla których dotychczas nie m a wy mogów.
Autorzy dziękują dr A. Fenton za pomoc w poszukiwaniu niektórych pozycji piśmiennictwa i dr B.I. Piotrowicz za opracowanie charakterystyki Limulus polyphemus.
Applications of the Horseshoe Crab (Limulidae). Alan R. Liss, Inc., New York 1979, 353. - 18
Jastrzębski Z Wykrywanie obecności endotoksyn bakteryjnych w środkach farmaceutycznych. Biuletyn Instytutu Leków, 1995, 3, 31. - 19. Jorgensen J.H., Smith R.F.: Rapid detection of contaminated intravenous fluids using the Limulus in vitro endotoxin assay. App. Microbiol. 1973,26, 521. - 20. KreeftenbergJ.G., Loggen H.G., van RamshorstJ.D., Beuvery E.C.: The Limulus
Amoebocyte Lysate Test Micromethod and Application in the control of sera and vaccines.
RIVM, Bilthoven - International Symposium on pyrogenicity. S. Karger, Basel, 1977, 34, 15. 21. Levin J., Tomasulo P.A., Oser R.S.: Detection of endotoxin in human blood and demo nstration of an inhibitor. J. Lab. Clin. Med. 1970, 75, 903. - 22. Lynn W.A., Golenbock D.T.: Lipopolisaccharide antagonits Immunol. Today 1992, 13, 271. - 23. Mascoli C.C., Weary M.E.:
Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral infectable products
and medical devices: Advantages to manufacturers and regulatory officials. Bull. Parenter. Drug Assoc., 1979 b, 33(2), 81. - 24. Nowicki A., Szwech P.-. Regresja nowotworów pod wpływem lipopolisacharydów bakteryjnych. Pol. J. Immunol., 1994, 19, 263. - 25. Pearson F.C., Bacich J.,
Srigley W., Maglalang E., Graff E.,Abroson F., Garcia D .: Applications of the Limulus Amoebocyte Lysate Assay to testing of Human Serum Albumin. Dev. Ind. Microbiol. 1981, 29, 371. - 26. Pfeiffer М., Scheer R:. Die Ruckgewinnung von Endotoxinen aus wazrigen Limulus- Amobozyten-
Lysat-Test mittels Ultrafiltration. Pharm. Ind. 1989, 51, 9, 1034. - 27. Piotrowicz B.I., Edlin S.E.,
McCartney A.Ch.: A sensitive chromogenie Limulus Amoebocyte Lysate micro-assay for detection
of endotoxin in human plasma and in water. Zbl. Bakt. Hyg. A. 1985, 260, 108. - 28. Piotrowicz
В.I., Watt /., Edlin S., McCartney A.C.: A micromethod for endotoxin assay in human plasma
using Limulus Amoebocyte Lysate and a chromogenie substrate. Eur. J. Clin. Microbiol., 1985, 4, 1, 52. - 29. Romanowski P., Dzierzbicka K., Myśliwski A., Kołodziejczyk A.M.: Syntetyczne immunomodulatory wzorcowane na naturalnych produktach mikroorganizmów. Postępy Bioche mii 1991, 37, 159. - 30. Sturk A ., van Deventer S.J.H., Wanter ten Cate J. et al.: Bacterial Endotoxins, Wiley-Liss, 1991, 1 Progress in Clinical and Biological Research 1991, v. 367.
31. Symposium on Bacterial Endotoxin, Some aspects of Biological Activites. Abst. Ed. W.
Kaca University of Łódź, Poland, 1996, 4. - 32. Thomas L.L.M., Cate H., Sturk A . et al.:
Quantitative chromogenie endotoxin determination in cerebrospinal fluid. Clin. Chim. Acta, 1983, 127, 137. - 33. US Pharmacopea 1985 XXI, ch. 85. - 34. WHO, The collection, fractionation, quality control and uses of blood products, Geneva, 1981, 108. - 35. WHO, Expert Commitee on Biological Standardization Tech. Rep. Ser. 800 Geneva, 1990, 136. - 36. WHO, Endotoxin, Tech. Rep. Ser. Nr 858, 1995, 45.
