Genetyczne determinanty inwazji szczepów Escherichia coli zolowanych od dzieci z nieswoistymi zapaleniami jelit

(1)

Praca oryginalna

Forum Zakażeń 2011;2(2):41–44 © Evereth Publishing, 2011

Anna Duda-Madej | Michał Turniak | Urszula Kasprzykowska | Beata Sobieszczańska

Genetyczne determinanty inwazji szczepów

Escherichia coli izolowanych od dzieci

z nieswoistymi zapaleniami jelit

Genetic determinants of invasiveness of Escherichia coli strains isolated from children

with inflammatory bowel disease

Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

} Anna Duda-Madej, Katedra i Zakład Mikrobiologii Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Chałubińskiego 4, 50-368 Wrocław, Tel.: (71) 784 12 78, Fax: (71) 784 01 17, e-mail: aduda@mbio.am.wroc.pl

Wpłynęło: 26.06.2010 Zaakceptowano: 15.07.2011

Streszczenie: Nieswoiste zapalenia jelit (IBD) to grupa przewle-kłych chorób przewodu pokarmowego o nieustalonej etiologii, obejmująca chorobę Leśniowskiego-Crohna (L-C), wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) oraz nieokreślone zapalenie jelit (IC). Choroba L-C jest nawracającym stanem zapalnym jelit, szcze-gólnie jelita krętego oraz okrężnicy. Może pojawiać się w każdym wieku, ale coraz częściej jest diagnozowana u dzieci i nastolatków. Z etiopatogenezą choroby L-C wiązane są szczepy Escherichia coli należące do patotypu adherentno-inwazyjnych E. coli (AIEC). Ce-lem badań było określenie częstości występowania u szczepów

E. coli izolowanych od dzieci z IBD, genów kodujących inwazyny

rozpowszechnione wśród patogennych pałeczek

Enterobacteria-ceae, tj. afaD, invE, tia, aggB oraz ipaH. Uzyskane wyniki badań

wykazały obecność genów kodujących oznaczane inwazyny wśród większości (62,2%) badanych pałeczek E. coli. W połącze-niu ze zdolnością adhezji do komórek nabłonka jelita, wykazaną w uprzednich badaniach, obecność genów inwazyn u badanych szczepów E. coli upodabnia je do szczepów AIEC izolowanych od osób dorosłych z IBD. Jednakże, zróżnicowany profil genów kodu-jących inwazyny prezentowany przez badane szczepy E. coli nie wyklucza, że są to inwazyjne patogeny przewodu pokarmowego, niezwiązane z IBD.

Słowa kluczowe: adherentno-inwazyjne szczepy E. coli (AIEC) | choroba Leśniowskiego-Crohna (L-C) | inwazyny

Abstract: Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic gastro-intestinal disorder of unknown etiology. IBD comprises three cli-nical entities i.e. Crohn’s disease (CD), ulcerative colitis (UC), and indetermediate colitis (IC). Although the etiopathogenesis of CD is still unresolved, recent evidences indicated that adherent-invasive

Escherichia coli (AIEC) strains might be implicated in the disorder.

Adherent-invasive Escherichia coli strains (AIEC) differ from other pathogenic E. coli strains in their ability to survive and multiply

Wstęp

Nieswoiste zapalenia jelit (ang. IBD – inflammatory bowel disease) to grupa przewlekłych chorób przewodu pokarmo-wego o nieznanej etiopatogenezie. Do grupy IBD zalicza się chorobę Leśniowskiego-Crohna (L-C), wrzodziejące zapale-nie jelita grubego (UC) oraz zapale-nieokreślone zapalezapale-nie jelit (IC). Choroba L-C jest przewlekłym, nieswoistym procesem zapalnym, który obejmuje wszystkie warstwy ściany prze-wodu pokarmowego. Stan zapalny może dotyczyć każdego within macrophages. The AIEC pathotype was recently recognized as the putative agent responsible for inflammatory response of gut-associated lymphoid tissue in Crohn’s diseased patients. The aim of the study was to determine the prevalence of genes en-coding common to many pathogenic gram-negative rods of

En-terobacteriaceae family invasins, among the E. coli strains isolated

from children with IBD. The study was performed on 45 strains of

E. coli from children with IBD. The genes encoding invasins (afaD, invE, tia, aggB and ipaH) were detected by PCR assay with

speci-fic primers. The majority (37%) of E. coli strains presented genes encoding the invasins AfaD and AggB. In contrast, the genes tia and ipaH were present in minority (about 10%) of E. coli examined. None of the 45 tested E. coli strains revealed the presence of the

invE gene. The result of the study showed that the genes encoding

invasins were presented among most (62.2%) E. coli isolated from children with IBD. Together with their adhesive abilities demon-strated in vitro in our previous study, these E. coli strains may re-present a category of pathogenic E. coli similar to AIEC associated with IBD. On the other hand, we can not exclude that these E. coli strains may represent common invasive pathogen of children. Key words: adherent-invasive E. coli strains (AIEC) | Crohn’s dise-ase | invasins

Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.

(2)

42 © Evereth Publishing, 2011 Forum Zakażeń 2011;2(2)

odcinka przewodu pokarmowego, od jamy ustnej do od-bytu, jednak najczęściej lokalizuje się w jelicie krętym oraz okrężnicy. Do niedawna uważano, że choroba L-C dotyczy wyłącznie osób dorosłych, jednak najnowsze doniesienia wskazują, że coraz częściej zapadają na nią dzieci <16. roku życia. Wieloletnie, szeroko zakrojone badania przyczyn roz-woju choroby L-C choć wyjaśniły wiele aspektów jej pato-mechanizmu, nie ustaliły jej etiologii. Większość tych ba-dań wskazuje ponadto, że etiopatogeneza choroby L-C jest złożona i obejmuje czynniki genetyczne (np. polimorfizmy genu NOD2/CARD15), środowiskowe (tryb życia, dieta, używki, np.: nikotynizm, substancje chemiczne, składniki pokarmowe oraz mikroorganizmy), a także elementy im-munologiczne (np. stwierdzona u chorych z L-C przewaga limfocytów i wydzielanych przez nie cytokin zapalnych, tj.: TNF-α, INF-γ oraz interleukin 1, 2, 6, 8 oraz IL-12, które stymulują rozwój zmian zapalnych w przewodzie pokarmowym) [1–3].

Powstało wiele teorii na temat przyczyn rozwoju choro-by L-C, jednak największe zainteresowanie badaczy skupia się na teorii sugerującej stymulację procesu zapalnego ścia-ny jelit przez nieznaścia-ny czynnik zakaźścia-ny, np.: bakterie, wiru-sy, bądź pasożyty. W związku z tym, przebadano wiele pa-togenów człowieka, tj. wirusy (m.in. odry, Epsteina-Barr), pasożyty (m.in. przywry wątrobowe i trzustkowe) oraz bakterie pod kątem ich zdolności indukowania zmian za-palnych, charakterystycznych dla choroby L-C. Z etiologią choroby L-C wiąże się zarówno bakterie należące do flory jelita (np.: Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., pałecz-ki Escherichia coli), jak i gatunpałecz-ki chorobotwórcze dla ludzi (np. Helicobacter pullorum, Listeria spp., Yersinia spp.,

Clo-stridium difficile i inne) [4–6]. Udział bakterii w etiologii

IBD potwierdzono w badaniach na zwierzętach laborato-ryjnych wolnych od zarazków (germ free). U zwierząt tych, po wprowadzeniu do ich jelita bakterii flory fizjologicznej,

rozwijał się stan zapalny błony śluzowej jelit i objawy kli-niczne przypominające IBD. Na tej podstawie ustalono na-stępującą zależność: brak bakterii = brak objawów IBD = brak antygenów przyczyniających się do aktywacji układu immunologicznego [7].

Choć z etiopatogenezą IBD wiązano liczne drobnoustro-je, większość badań skupiła się na dwóch gatunkach bakterii: prątkach środowiskowych Mycobacterium avuim subsp.

pa-ratuberculosis (MAP) oraz pałeczkach jelitowych E. coli [8].

U pacjentów z chorobą L-C E. coli znacząco przeważają liczebnie inne gatunki mikroaerofilnych pałeczek fizjolo-gicznej flory jelit. Dodatkowo, szczepy pałeczek E. coli izolo-wane od chorych z L-C, poza adhezją do komórek nabłonka jelita, wykazują różniące je od innych patogennych szcze-pów E. coli cechy fenotypowe, tj. zdolność do przeżywania i namnażania się w makrofagach, co dało podstawę do ich określenia jako adherentno-inwazyjne E. coli (ang. AIEC – adherent-invasive E. coli) [9].

Większość badań dotyczących roli pałeczek E. coli w IBD skupia się na szczepach izolowanych od osób dorosłych. Jed-nakże z uwagi na to, że choroba L-C coraz częściej diagno-zowana jest u dzieci <16. roku życia, a potencjał patogenny szczepów E. coli izolowanych od najmłodszych pacjentów jest nieznany, nasze badania skupiły się na genotypowej charakterystyce inwazyjnego potencjału pałeczek E. coli od dzieci prezentujących różne postacie IBD.

Materiał i metody

Badania przeprowadzono na 45 szczepach E. coli izolo-wanych od dzieci z IBD: 20 szczepów izolowano z przypad-ków L-C (średnia wieku: 3 lata), 14 szczepów od dzieci z UC (średnia wieku: 2 lata), natomiast 11 szczepów izolowano od dzieci z IC (średnia wieku: 1 rok).

Gen Sekwencje nukleotydowe komplementarne dla genów Warunki reakcji Wielkość produktu Źródło

tia (F) 5’ ACCAGCGCTTCCGTCAGG 3’ (R) 5’ GCCAGATTCATTCCAGGAGG 3’ 94ºC 1 min., 55º C 1 min., 72º C 1 min., 32 cykle 382 bp 10 ipaH (F) 5’ GCTGGAAAAACTCAGTGCCT 3’ (R) 5’ CCAGTCCGTAAATTCATTCT 3’ 94º C 1 min., 56º C 2 min., 72º C 1 min., 30 cykli 424 bp 11 afaD (F) 5’ GTCACCTGCGGGATGTTACT 3’ (R) 5’ GCTCCGCCAACCGAAAAC 3’ 94º C 1 min., 60ºC 35 s., 72ºC 45 s., 35 cykli 392 bp * invE (F) 5’ ATATCTCTATTTCCAATCGCGT 3’ (R) GATGGCGAGAAATTATATCCCG 3’ 94ºC 30 s., 51ºC 1 min., 72ºC 1 min. 30 s., 25 cykli 382 bp 12 aggB (F) 5’ GCATATTACCGATGTCCTGCG 3’ (R) 5’ CCTCTTGATATTAGACATTCACCA 3’ 95ºC 1 min., 58ºC 30 s., 62ºC 45 s., 30 cykli 421 bp *

Tabela 1. Sekwencje nukleotydowe, ich źródło, warunki reakcji oraz wielkość powstałego produktu oznaczanych genów kodujących inwazyny.

* – startery zostały zaprojektowane samodzielnie na podstawie sekwencji nukleotydowej genu kodującego inwazynę.

(3)

43 © Evereth Publishing, 2011

Forum Zakażeń 2011;2(2)

Geny kodujące inwazyny wykrywano w reakcji PCR. Startery zastosowane w badaniach podano w Tabeli 1. Do badań wybrano 5 genów kodujących inwazyny opisanych wśród patogennych pałeczek E. coli:

− gen afaD – kodujący białko błony zewnętrznej AfaD za-angażowane w inwazję do komórek nabłonka szczepów DAEC (szczepy E. coli prezentujące rozsiany typ adhezji do nabłonka jelita, odpowiedzialne za biegunki u dzieci); − gen aggB – kodujący przypuszczalną inwazynę entero-agregacyjnych szczepów E. coli (EAEC), które wywołu-ją przewlekłe i ostre biegunki u dzieci i osób dorosłych; − gen tia – kodujący białko błony zewnętrznej – inwa-zynę enterotoksynogennych szczepów E. coli (ETEC), związanych głównie z biegunkami u osób podróżują-cych do krajów nieuprzemysłowionych;

− gen ipaH – kodujący inwazynę pałeczek Shigella spp. oraz enteroinwazyjnych szczepów E. coli (EIEC); − regulatorowy gen invE – odpowiedzialny za proces

in-wazji do nabłonka jelita szczepów EIEC.

Reakcja PCR

Osad z 1 ml całonocnej hodowli szczepów E. coli w bu-lionie Luria, po zawieszeniu w 200 μl wody miliQ gotowano przez 10 min, a następnie odwirowywano. Uzyskany super-natant stanowił matrycę w reakcji PCR. Warunki reakcji PCR dla oznaczanych genów kodujących inwazyny oraz se-kwencje starterów przedstawiono w Tabeli 1. Reakcje PCR przeprowadzano w termocyklerze DNA-Engine PTC-200 (MJ Research Waltham, MA, USA).

Wyniki

Większość, bo 28 (62,2%) badanych szczepów E. coli wy-kazała obecność co najmniej jednego z oznaczanych genów kodujących inwazyny. Wśród szczepów posiadających geny inwazyn, najwięcej z nich, bo 17 (60,7%), wykazało obec-ność genów kodujących inwazyny AfaD i/lub AggB. Geny

tia i ipaH były obecne u mniejszości badanych szczepów,

tj. u odpowiednio 5 (17,9%) i 4 (14,3%) szczepów E. coli. Wśród 20 szczepów E. coli izolowanych z przypadków choroby L-C, u 7 (35%) stwierdzono obecność genu afaD, u 11 (55%) szczepów genu aggB, natomiast geny tia i ipaH były obecne tylko u 2 (10%) badanych szczepów E. coli z tej grupy (Ryc. 1). W grupie 14 szczepów E. coli izolowanych z przypadków UC najwięcej, bo 6 (43%) szczepów, posiada-ło gen afaD, 4 (29%) szczepy wykazały obecność genu aggB, Ryc. 1. Udział procentowy szczepów E. coli izolowanych z przypadków

choroby L-C, prezentujących oznaczane geny kodujące inwazyny. Na wykresie wyraźnie widoczna jest przewaga szczepów E. coli prezentu-jących gen aggB, kodujący inwazynę enteroagregacyjnych szczepów

E. coli (EAEC). U szczepów tych nie stwierdzono obecności genu invE.

Ryc. 2. Udział procentowy szczepów E. coli izolowanych z przypadków UC, u których wykryto geny kodujące inwazyny. Na wykresie widoczna jest przewaga szczepów E. coli, u których wykryto gen afaD, kodujący białko adhezyjne o charakterze inwazyny, opisane wśród szczepów

E. coli o rozsianym typie adhezji (ang. DAEC – diffusely-adhering E. coli).

U szczepów tych nie stwierdzono obecności genu invE.

Ryc. 3. Udział procentowy szczepów E. coli izolowanych z przypadków IC, które posiadały oznaczane geny kodujące inwazyny. Podobnie jak w przypadku szczepów E. coli izolowanych od dzieci z UC, wśród pa-łeczek E. coli od dzieci z nieokreślonym zapaleniem jelit (IC) przewa-żają szczepy posiadające gen afaD. U szczepów tych nie stwierdzono obecności genów invE i tia.

tia aggB ipaH afaD 10% 55% 10% 35% 21% 29% 7% 43% tia aggB ipaH afaD aggB ipaH afaD 27% 9% 36%

(4)

3 (21%) szczepy genu tia i tylko 1 (7%) szczep wykazał obec-ność genu ipaH (Ryc. 2). Spośród 11 szczepów E. coli izo-lowanych od dzieci z IC, u 4 (36%) szczepów wykryto gen

afaD, u 3 (27%) izolatów gen aggB oraz u 1 (9%) szczepu gen ipaH. W grupie tej żaden z badanych szczepów nie

wyka-zał obecności genu tia (Ryc. 3). Żaden spośród 45 badanych szczepów E. coli nie wykazał obecności genu invE.

Podsumowanie

Prowadzone w ubiegłych latach badania zdolności adhe-zyjnych szczepów E. coli izolowanych od dzieci z IBD w te-ście in vitro do ludzkich komórek nabłonka jelita cienkie-go i grubecienkie-go (linii Int407 i Caco-2) wykazały, że szczepy te cechuje różnego stopnia zdolność adhezji, określona typem adhezji, tj. rozsianą, agregacyjną lub nieokreśloną. Obecne wyniki kontynuowanych badań potencjału patogennego tych szczepów wykazały, że większość z nich posiada rów-nież genetyczne determinanty inwazyn opisanych wśród pałeczek jelitowych, m.in. Shigella spp., enteroinwazyjne szczepy E. coli (EIEC). Izolowane szczepy E. coli można na tej podstawie uznać za podobne do opisanych, izolowanych od osób dorosłych z IBD szczepów AIEC, choć to należa-łoby dodatkowo potwierdzić ich zdolnością do namnażania się w makrofagach. Być może dalsze badania potencjału patogennego izolowanych szczepów E. coli od dzieci z IBD potwierdzą ich przynależność do nowo opisanego patotypu AIEC, jednak obecne wyniki należy interpretować z ostroż-nością.

Penetracja inwazyjnych pałeczek do nabłonka jelita związana jest z indukcją odczynu zapalnego oraz rozwojem klinicznych objawów, które w połączeniu z mikro-owrzo-dzeniem błony śluzowej jelita mogą sugerować nieswoiste zapalenie jelit. Z drugiej jednak strony, nie wykluczają zaka-żenia patogenem inwazyjnym, co stanowi poważny problem diagnostyczny zarówno dla lekarzy, jak i laboratoriów bak-teriologicznych. W przypadku inwazyjnych pałeczek E. coli, diagnostyka wywoływanych przez nie zakażeń zasadniczo jest niemożliwa, gdyż do tego celu konieczne jest zastosowa-nie testu inwazji in vitro do linii komórkowych, bądź tech-nik molekularnych, tj. oznaczenia genów kodujących inwa-zyny. Wyposażenie, koszt i pracochłonność badań na liniach komórkowych wykluczają je z rutynowej diagnostyki mi-krobiologicznej. Biorąc pod uwagę różnorodność i ilość inwazyn opisanych wśród pałeczek jelitowych, rutynowo wykonywana technika PCR będzie zbyt kosztowna i czaso-chłonna. W przeciwieństwie do enteroinwazjnych szczepów

E. coli (EIEC), które pod względem biochemicznym

po-dobne są do pałeczek Shigella spp. (np. są laktozo-ujemne), i które przynajmniej można podejrzewać o przynależność do patotypu EIEC, szczepy izolowane w naszych bada-niach prezentowały cechy metaboliczne charakterystyczne dla typowych pałeczek E. coli, a więc były nieodróżnialne od szczepów flory jelita (laktozo-dodatnie, nie aglutynujące z żadną surowicą dla enteropatogennych szczepów E. coli). Co więcej, kontynuowane obecnie badania potwierdzają wykazany w reakcji PCR inwazyjny potencjał tych szczepów ich zdolnością penetracji do ludzkich komórek nabłonka je-lita in vitro.

Podsumowując, uzyskane wyniki badań wskazują, że potencjalnie inwazyjne szczepy E. coli mogą stanowić czę-sty czynnik etiologiczny zakażeń przewodu pokarmowego u dzieci oraz wskazują na niebezpieczeństwo nierozpozna-nia inwazyjnego patogenu przewodu pokarmowego w ruty-nowo wykonywanych badaniach bakteriologicznych.

Piśmiennictwo

1. Hugot JP, Chamaillard M, Zouali H et al. Association of NOD2 leuci-ne-rich repeat variants with susceptibility to Crohn’s disease. Nature 2001;41(6837):599–603.

2. Kirsner JB. Historical origins of current IBD concepts. World J Gastroenterol 2001;7(2):175–184.

3. Damen GM, Hol J, de Ruiter L et al. Chemokine production by buccal epi-thelium as a distinctive feature of pediatric Crohn disease. J Pediatr Ga-stroenterol Nutr 2006;42(2):142–149.

4. Sobieszczańska B. Rola bakterii w chorobie Leśniowskiego-Crohna. Pe-diatr Współcz Gastroenterol Hepatol Żywienie Dziecka 2010;12(1):38–40. 5. Yamamoto-Furusho JK, Barnich N, Darfeuille-Michaud A. Role of bacteria

in the etiopathogenesis of inflammatory bowel disease. World J Gastroen-terol 2007;13(42):5571–5576.

6. Burich A, Hershberg R, Waggie K et al. Helicobacter-induced inflammatory bowel disease in IL-10- and T cell-deficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2001;281(3):G764–G778.

7. Bamias G, Nyce MR, De La Rue SA, Cominelli F. New concepts in the pathophysiology of inflammatory bowel disease. Ann Intern Med 2005;143(12):895–904.

8. Sartor RB. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroen-terology 2008;134(2):577–594.

9. Sobieszczańska BM, Mokracka-Latajka G. Przypuszczalny związek adhe-rentno-inwazyjnych szczepów Escherichia coli (AIEC) z chorobą Leśniow-skiego-Crohna. Gastroenterol Pol 2010;17(2):116–120.

10. Darfeuille-Michaud A, Boudeau J, Bulois P et al. High prevalence of adhe-rent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn’s dise-ase. Gastroenterology 2004;127(2):412–421.

11. Dutta S, Chatter-jee A, Dutta P et al. Sensitivity and performance charac-teristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli in-fection in children with acute diarrhea in Calcutta, India. J Med Microbiol 2001;50(8):667–674.

12. Arikawa K, Meraz IM, Nishikawa Y, Ogasawara J, Hase A. Interleukin-8 secretion by epithelial cell infected with diffusely adherent Escheri-chia coli possessing Afa adhesin-coding genes. Microbiol Immunol

2005;49(6):493–503.