MAŁGORZATA TOKARSKA-RODAK1, 2 | MARIA KOZIOŁ-MONTEWKA1, 2 | JOLANTA PALUCH-OLEŚ2 | DOROTA PLEWIK3 |
GRAŻYNA OLCHOWIK2 | JANUSZ OLCHOWIK2
ZASTOSOWANIE MIKROSKOPU SIŁ ATOMOWYCH W BADANIACH
MIKROBIOLOGICZNYCH
THE APPLICATION OF ATOMIC FORCE MICROSCOPE IN MICROBIOLOGICAL RESEARCH
STRESZCZENIE: Mikroskop sił atomowych (ang. atomic force microscope – AFM) stosuje się eksperymentalnie w biologii, mikrobiologii i medycynie do badania topografii powierzchni oraz oceny własności mechanicznych komórek. Siły działające pomiędzy sondą AFM a badaną powierzchnią są mierzone z dokładnością do pikoniutonów, co pozwala na uzyskanie precy-zyjnych informacji o kształcie struktur biologicznych i rozmiarach badanych obiektów, a także o własnościach mechanicznych badanych powierzchni.
SŁOWA KLUCZOWE: mikroskop sił atomowych, moduł Younga, własności mechaniczne ABSTRACT: Atomic force microscope (AFM) is an experimental technique which until recently has been used in biology, microbiology, and medicine to investigate the topography of surface and in the evaluation of mechanical properties of cells. The forces acting between AFM probe and examined surface are measured with the accuracy of piconewtons (pN) and as a result it is possible to obtain precise information about shape of biological structures and size of studied objects as well as mechanical properties of studied surfaces.
KEY WORDS: atomic force microscope, mechanical properties, Young’s modulus
1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 2 Państwowa Szkoła Wyższa im. Papieża
Jana Pawła II w Białej Podlaskiej 3 Centrum Badań nad Innowacjami
Państwowej Szkoły Wyższej im. Papieża Jana Pawła II w Białej Podlaskiej
} MAŁGORZATA TOKARSKA-RODAK
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, ul. Chodźki 1, 20-093 Lublin, Tel./Fax: (81) 742 37 81, e-mail: rodak.malgorzata@gmail.com Wpłynęło: 25.01.2014 Zaakceptowano: 18.02.2014
PRACA POGLĄDOWA
FORUM ZAKAŻEŃ 2014;5(1):27–30 © Evereth Publishing, 2014WSTĘP
Mikroskopia sił atomowych jest techniką wykorzysty-waną współcześnie w wielu dziedzinach nauki. Pierwotnie AFM stosowano jedynie w chemii i fizyce, m.in. do bada-nia struktury krystalicznej próbek, obserwacji formowabada-nia warstw surfaktantów czy cząstek koloidalnych lub do bez-pośredniej obserwacji ułożenia cząstek polimeru w stopie. Metoda ta jest nadal wykorzystywana w metalurgii, prze-myśle materiałów optycznych i półprzewodnikowych oraz w analizie magnetycznych nośników pamięci. Od niedawna AFM znajduje eksperymentalne zastosowanie także w bio-logii i medycynie, gdzie jest używany do badania topografii powierzchni, obserwacji różnego typu struktur powierzch-niowych i komórkowych oraz określania ich własności mechanicznych [1].
AFM należy do grupy mikroskopów wyposażonych w sondę skanującą, w których uzyskanie obrazów możliwe jest dzięki wykorzystaniu oddziaływań międzyatomowych pomiędzy sondą a powierzchnią badanej próbki. Pierwszym
mikroskopem tego typu był skaningowy mikroskop tunelo-wy (ang. scanning tunneling microscope – STM), skonstru-owany w 1981 roku przez Binniga i Rohrera. Za jego wy-nalezienie naukowcy otrzymali w 1986 roku nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki. W tym samym roku Binnig zaprezento-wał mikroskop sił atomowych – nowy mikroskop wyposa-żony w skanującą sondę SPM (ang. scanning probe micro-scope) [2, 3]. Zasada działania AFM polega na skanowaniu powierzchni próbki za pomocą cienkiego ostrza zamonto-wanego na sprężystym ramieniu i pomiarze jego ugięcia, które jest proporcjonalne do zmian topografii powierzchni próbki. Pojawienie się sił pomiędzy ostrzem a próbką (ato-mowe siły van der Waalsa) powoduje wychylenie lub skrę-cenie sprężystego ramienia ze stanu równowagi. Mikroskop jest ponadto wyposażony w szereg elementów, które umoż-liwiają pomiary wartości sił, ich rejestrację i stworzenie obrazu topograficznego [2, 4, 5]. Pomiar jest dokonywany z dokładnością do pikoniutonów, co umożliwia uzyskanie trójwymiarowej topografii powierzchni badanej próbki, podczas gdy w mikroskopii elektronowej otrzymywany
Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
28 © Evereth Publishing, 2014
FORUM ZAKAŻEŃ 2014;5(1)
obraz jest dwuwymiarową projekcją. Obrazy w AFM ce-chują się wysoką rozdzielczością, a w przypadku analizy komórek nie ma konieczności utrwalania i barwienia, dzię-ki czemu można dokonywać obserwacji w ich naturalnym środowisku [6, 7]. Istnieje również możliwość otrzymania pomiarów informujących o wysokości czy średnicy obiektu oraz o właściwościach mechanicznych badanej próbki, ta-kich jak: elastyczność, siła adhezji czy tarcie [8].
MIKROSKOP SIŁ ATOMOWYCH JAKO
NARZĘDZIE W BADANIU MORFOLOGII
MIKROORGANIZMÓW
Mikroskopia sił atomowych ma duże znaczenie w ba-daniu budowy mikroorganizmów, gdyż pozwala nie tylko na obserwację drobnoustrojów i uwidocznienie powierzch-ni komórek, lecz także na dokonapowierzch-nie ich precyzyjnego po-miaru (Ryc. 1–4). Dzięki AFM można z dużą dokładnością ocenić długość, średnicę oraz wysokość komórek. O ile parametr średnicy jest powszechnie stosowany w opisie morfologicznym bakterii, o tyle parametr wysokości jest zazwyczaj pomijany. Uwzględnienie obydwu wskaźników daje możliwość lepszej wizualizacji bakterii (Ryc. 5). Dzięki AFM możliwa jest obserwacja struktur, których dostrzeże-nie dostrzeże-nie byłoby możliwe w innych mikroskopach. Na zdję-ciach krętków Borrelia burgdorferi s.s. B31, uzyskanych w mikroskopie sił atomowych, zaobserwowano struktury o charakterze długich włókien, średnicy 0,07–0,14 μm i wy-sokości 5,26–11,08 nm (Ryc. 6). Podobne formy w mikro-skopie sił atomowych zauważyli Sapi i wsp. podczas badania biofilmu tworzonego przez krętki Borrelia burgdorferi [9]. Struktury o podobnym charakterze, o długości 20 μm i średnicy 0,05– 0,015 μm, obserwowano u środowiskowych bakterii beztlenowych szczepu SSD 17B-T osadów solanek Morza Martwego [10]. Dzięki wykorzystaniu AFM dowie-dziono istnienia cyst, form L oraz „blebs” B. burgdorferi
w komórkach nerwowych i glejowych u chorych z neuro-boreliozą, analizowano zmiany morfologiczne tych krętków, a także zmiany w ekspresji białek powierzchniowych pod wpływem czynników środowiskowych [11, 12]. Mikroskop sił atomowych stosowano również w badaniach sekwencyj-nej adaptacji latentnych prątków Mycobacterium tubercu-losis. Obserwowano zmiany w obrębie ściany komórkowej bakterii, redukcję rozmiarów komórek i modyfikacje w ich podziale [3].
POMIARY WŁASNOŚCI MECHANICZNYCH
KOMÓREK Z ZASTOSOWANIEM MIKROSKOPU
SIŁ ATOMOWYCH
Własności mechaniczne należą do najważniejszych pa-rametrów cechujących żywe komórki i pozostają w związku z przeprowadzanymi przez nie procesami [13]. Pomiar sprę-żystości i sztywności powierzchni mikrobiologicznych odby-wa się poprzez ustalenie modułu Younga (stopnia, w którym materiał może być rozciągnięty lub napięty) i jest mierzony w niutonach na metr kwadratowy [1 N/ m2=1 Pa] [14].
Ist-nieje wiele metod wyznaczania modułów elastyczności, a jedną z nich jest mikroskopia sił atomowych. Badania ela-styczności przyczyniły się do poznania właściwości mecha-nicznych komórek organizmów Eucariota i Procariota oraz odkrycia różnic w elastyczności komórek pochodzących z tkanek zdrowych w porównaniu z tkankami zmieniony-mi patologicznie. Zzmieniony-miany wielkości modułu Younga zzmieniony-mie- zmie-rzone dla żywych komórek informują o przemianach za-chodzących w strukturze cytoszkieletu komórek Eucariota
Ryc. 1. Escherichia coli – obraz w AFM. Ryc. 2. Mycobacterium tuberculosis – obraz w AFM.
Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
29
© Evereth Publishing, 2014
FORUM ZAKAŻEŃ 2014;5(1)
oraz o wpływie czynników litycznych organizmu gospo-darza na chorobotwórcze bakterie (Ryc. 7) [2]. Pozwala to na rozwój nowych, dokładniejszych metod diagnostycz-nych, a szczególnie wczesnej detekcji nowotworów [15, 16]. Dzięki możliwości pomiaru deformowalności pojedynczych komórek, AFM wykorzystano do wykrywania zmian pato-logicznych w komórkach nowotworowych. Dowiedziono, że komórki te (z linii komórkowych raka piersi, prostaty, pęcherza moczowego, jelita) są bardziej deformowalne, co przekłada się na mniejszą wartość modułu Younga, zależ-ną od rodzaju komórek i stanu progresji nowotworowej [2]. Współczynnik adhezji jest parametrem opisującym wła-sności mechaniczne badanych powierzchni, wynikającym z oddziaływań międzycząsteczkowych na powierzchni ich styku. Wykorzystuje się go również do opisu oddzia-ływań w świecie struktur biologicznych. Wzrost warto-ści współczynnika adhezji świadczy o większym (silniej-szym) oddziaływaniu pomiędzy ostrzem AFM a próbką.
W przypadku komórek bakterii, adhezja jest podstawowym parametrem umożliwiającym zdobywanie i kolonizację tka-nek przede wszystkim we wrotach zakażenia. Drobnoustro-je patogenne mogą kolonizować różnorodne tkanki: skórę, serce, tkankę nerwową oraz stawy. Skolonizowany obszar może być przyczyną przewlekłej infekcji pomimo odpowie-dzi immunologicznej skierowanej przeciwko mikroorga-nizmom. Wzajemne oddziaływanie pomiędzy patogenem i tkankami organizmu zakażonego jest decydującym etapem kolonizacji, dlatego oszacowanie zmian we współczynniku adhezji z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych daje dużo większe możliwości analizy [17, 18]. Przy użyciu AFM dokonuje się badań siły tego parametru pojedynczych ko-mórek do powierzchni oraz wielowarstwowych biofilmów bakteryjnych wykazujących wyjątkowo silną adhezję, szcze-gólnie podczas początkowego etapu tworzenia biofilmu. Mikroskopia sił atomowych pozwala na badanie siły ad-hezji bakterii do różnego typu materiałów (biomateriałów,
Ryc. 3. Borrelia burgdorferi – obraz w AFM. Ryc. 4. Staphylococcus aureus – pomiar średnicy w AFM.
Ryc. 5. Borrelia burgdorferi – obraz w AFM uwidaczniający różnice w wyso-kości komórki bakteryjnej.
Ryc. 6. Borrelia burgdorferi – obraz w AFM uwidaczniający obecność struk-tur o charakterze protruzji.
Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
30 © Evereth Publishing, 2014
FORUM ZAKAŻEŃ 2014;5(1)
powierzchni mineralnych) oraz określenie sposobu, w jaki bakterie reagują z białkami powierzchni, biocząsteczkami lub powierzchnią organiczną [19, 20].
PODSUMOWANIE
Mikroskop sił atomowych znajduje coraz szersze zasto-sowanie we współczesnej biologii i medycynie. Poprzez badanie zarówno topografii powierzchni, jak i własności mechanicznych komórek bakteryjnych istnieje możliwość zobrazowania skutków działania: antybiotyków, pepty-dów antybakteryjnych, składowych dopełniacza lub spe-cyficznych przeciwciał. Możliwa jest również obserwacja procesów podziału komórek bakteryjnych czy kolonizacji powierzchni.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Braga PC, Ricci D. Atomic force microscopy: application to investigation of
Escherichia coli morphology before and after exposure to cefodizime.
Anti-microb Agents Chemother 1998;42(1):18–22.
2. Lekka M. Skaningowy mikroskop sił atomowych (AFM) i jego zastosowa-nie w medycyzastosowa-nie. Polska Akademia Nauk (online); http://www.instytucja. pan.pl/index.php?option=com_content&view=article&id=1907:skaning owy-mikroskop-si-atomowych-afm-i-jego-zastosowanie-w-medycynie-&catid=25:wydzia-iii&Itemid=64
3. Velayati AA, Farnia P, Masjedi MR et al. Sequential adaptation in latent tuber-culosis bacilli: observation by atomic force microscopy (AFM). Int J Clin Exp Med 2011;4(3):193–199.
4. Dąbrowska A. Badanie procesu rozwijania białek za pomocą AFM. Praca doktorska. Instytut Fizyki Jądrowej im. Henryka Niewodniczańskiego Polskiej Akademii Nauk, Kraków, 2007. Instytut Fizyki Jądrowej PAN (online) 2007; http://www.ifj.edu.pl/SD/rozprawy_dr/rozpr_Dabrowska.pdf?lang=pl 5. Obermair C, Kress M, Wagner A, Schimmel T. Reversible
mechano-electro-chemical writing of metallic nanostructures with the tip of an atomic force microscope. Beilstein J Nanotechnol 2012;3:824–830.
6. Dorobantu LS, Gray MR. Application of atomic force microscopy in bacterial research. Scanning 2010;32(2):74–96.
7. Louise Meyer R, Zhou X, Tang L, Arpanaei A, Kingshott P, Besenbacher F. Im-mobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological condi-tions. Ultramicroscopy 2010;110(11):1349–1357.
8. Dufrêne YF. Atomic force microscopy, a powerful tool in microbiology. J Bac-teriol 2002;184(19):5205–5213.
9. Sapi E, Bastian SL, Mpoy CL et al. Characterization of biofilm formation by Borrelia burgdorferi in vitro. PLoS One 2012;7(10):e48277.
10. Antunes A, Rainey FA, Wanner G et al. A new lineage of halophilic, wall-less, contractile bacteria from a brine-filled deep of the Red Sea. J Bacteriol 2008;190(10):3580–3587.
11. Miklossy J, Kasas S, Zurn AD, McCall S, Yu S, McGeer PL. Persisting atypical and cystic forms of Borrelia burgdorferi and local inflammation in Lyme neu-roborreliosis. J Neuroinflammation 2008;5:40.
12. Hertadi R, Gruswitz F, Silver L et al. Unfolding mechanics of multiple OspA substructures investigated with single molecule force spectroscopy. J Mol Biol 2003;333(5):993–1002.
13. Dufrêne YF, Pelling AE. Force nanoscopy of cell mechanics and cell adhesion. Nanoscale 2013;5(10):4094–4104.
14. Yao X, Jericho M, Pink D, Beveridge T. Thickness and elasticity of gram-ne-gative murein sacculi measured by atomic force microscopy. J Bacteriol 1999;181(22):6865–6875.
15. Zdybicka-Barabas A, Mak P, Klys A et al. Synergistic action of Galleria
mellonel-la anionic peptide 2 and lysozyme against Gram-negative bacteria. Biochim
Biophys Acta 2012;1818(11):2623–2635.
16. Zdybicka-Barabas A, Stączek S, Mak P, Skrzypiec K, Mendyk E, Cytryńska M. Synergistic action of Galleria mellonella apolipophorin III and lysozyme aga-inst Gram-negative bacteria. Biochim Biophys Acta 2013;1828(6):1449–1456. 17. Fikrig E, Narasimhan S. Borrelia burgdorferi – traveling incognito? Microbes
Infect 2006;8(5):1390–1399.
18. Steere AC, Duray PH, Butcher EC. Spirochetal antigens and lymphoid cell sur-face markers in Lyme synovitis. Comparison with rheumatoid synovium and tonsillar lymphoid tissue. Arthritis Rheum 1988;31(4):487–495.
19. Liu T, Yin B, He T, Guo N, Dong L, Yin Y. Complementary effects of nanosilver and superhydrophobic coatings on the prevention of marine bacterial adhe-sion. ACS Appl Mater Interfaces 2012;4(9):4683–4690.
20. Lau PC, Dutcher JR, Beveridge TJ, Lam JS. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Bio-phys J 2009;96(7):2935–2948.
Ryc. 7. Borrelia burgdorferi – obraz w AFM uwidaczniający zniszczoną po-wierzchnię komórki wskutek działania składowych dopełniacza i specy-ficznych przeciwciał.
Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.
