DIAGNOSTYKA WIRUSOLOGICZNA Z UWZGLĘDNIENIEM ZAKAŻEŃ
HBV, HCV I HIV
DIAGNOSTICS OF VIRAL INFECTIONS WITH SPECIAL REGARD TO HBV, HCV AND HIV
STRESZCZENIE: Wirus zapalenia wątroby typu B (ang. hepatitis B virus – HBV), wirus zapalenia wątroby typu C (ang. hepatitis C virus – HCV) oraz ludzki wirus nabytego upośledzenia odporno-ści (ang. human immunodeficiency virus – HIV) są ogólnoświatowymi poważnymi problemami w zakresie zdrowia publicznego. Do zakażenia HIV, podobnie jak HBV czy HCV, dochodzi wśród ludzi przez kontakt z krwią i produktami krwiopochodnymi, podczas zanieczyszczonych iniekcji, a także na drodze kontaktów seksualnych. Możliwa jest również transmisja wertykalna. W pracy przedstawiono podstawowe etapy diagnostyki zakażeń wirusowym zapaleniem wątroby typu B (wzw B), wirusowym zapaleniem wątroby typu C (wzw C) i HIV. Oparto się na licznych dokumen-tach opublikowanych przez instytucje i stowarzyszenia oraz naukowych publikacjach.
SŁOWA KLUCZOWE: HBV, HCV, HIV, podstawy rozpoznawania zakażenia
ABSTRACT: Hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency vi-rus (HIV) are three important public health problems worldwide. HIV shares common route of infection with HBV and HCV through blood and blood products, unsafe injections, sexual acti-vity; vertical infection is also possible. This report provides an overview of basic steps for HBV, HCV and HIV diagnostics. Numerous documents from different institutions and societies as well as other scientific publications were reviewed to arrive at this summary.
KEY WORDS: basic elements of diagnosis, HBV, HCV, HIV, infection
Katedra i Oddział Kliniczny Chorób Zakaźnych,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Bytomiu, al. Legionów 49, 41-902 Bytom,
Tel. (32) 281 92 41 wew. 253 e-mail: annabk@inet.com.pl Wpłynęło: 25.08.2014 Zaakceptowano: 08.09.2014 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2014047
WSTĘP
Zgodnie z danymi Światowej Organizacji Zdrowia (ang. World Health Organization – WHO) 46% wszystkich chorób oraz 59% ogółu zgonów jest spowodowanych scho-rzeniami o charakterze przewlekłym. Interpretując te dane można obliczyć, że z powodu chorób przewlekłych rocz-nie umiera 35 milionów ludzi. Niepokojący jest także fakt, że liczba ta systematycznie rośnie.
Wśród przewlekłych chorób znaczące miejsce zajmu-ją schorzenia wątroby, będące np. w Wielkiej Brytanii pią-tą przyczyną zgonów (po chorobach układu krążenia, uda-rach, chorobach układu oddechowego i nowotworach). Należy podkreślić, że liczba zgonów z powodu zejściowej
fazy choroby wątroby wykazuje wyraźną tendencję wzro-stową [1].
Lista czynników sprawczych odpowiedzialnych za roz-wój przewlekłej choroby wątroby jest długa, wśród nich naj-ważniejsze miejsce zajmują zakażenia wirusami pierwotnie hepatotropowymi, takimi jak wirus zapalenia wątroby typu B lub wirus zapalenia wątroby typu C.
Innym niezwykle ważnym problemem medycznym oraz epidemiologicznym jest zakażenie wirusem nabytego nie-doboru odporności.
W skali ogólnoświatowej liczba przewlekle zakażonych HBV wynosi ponad 370 milinów, HCV – około 130 milio-nów, natomiast infekcją HIV jest dotkniętych blisko 40 mi-lionów ludzi [2].
Rozważając kliniczne konsekwencje przewlekłych zaka-żeń HBV, HCV lub HIV nie można pominąć infekcji sko-jarzonych HBV/HCV, HIV/HCV, HIV/HBV, HIV/HBV/ HCV oraz zakażeń utajonych wirusami pierwotnie hepato-tropowymi. Właśnie infekcje utajone lub koinfekcje stwa-rzają trudności diagnostyczne oraz terapeutyczne. Nale-ży podkreślić wagę epidemiologiczną klinicznego proble-mu schorzeń skojarzonych oraz utajonych, zwłaszcza w od-niesieniu do chorych z zaburzeniami immunologicznymi, względnie leczonych immunosupresyjnie. Zaniechanie spe-cjalistycznego postępowania diagnostycznego i odstąpienie od terapii przeciwwirusowej ma istotne znaczenie progno-styczne.
Innym szczególnym zagadnieniem w dociekaniach epi-demiologiczno-klinicznych jest obserwacja znana wszyst-kim doświadczonym klinicystom, iż przewlekłe zakaże-nie każdym z omawianych wirusów przebiega bezobjawo-wo przez długi okres czasu. Okres ten jest liczony w latach, wynikające z tego faktu opóźnienie diagnostyczne i terapeu-tyczne może w każdym przypadku pogarszać prognozę sku-tecznego leczenia, a także sprzyjać dalszemu rozprzestrze-nianiu infekcji.
Drogi zakażenia HBV, HCV oraz HIV są identyczne: do infekcji dochodzi zawsze poprzez transmisję parente-ralną za pośrednictwem zakażonej krwi, drogą bezpośred-nich kontaktów seksualnych; dodatkowo matka może być źródłem zakażenia dla swojego dziecka. W odniesieniu do HBV należy pamiętać również o możliwości transmi-sji horyzontalnej w środowisku domowym poprzez kontakt z zainfekowanym członkiem rodziny.
Wymienione wirusy różni taksonomia i szereg cech bio-logicznych, ale posiadają one także cechy wspólne.
W Tabeli 1 zebrano najważniejsze cechy biologiczne wi-rusów HBV, HCV i HIV [3].
Analizując problem przewlekłych zakażeń wirusowych, w kontekście zagrożeń epidemiologicznych należy pod-kreślić, że jedyna istniejąca i wysoce skuteczna szczepion-ka chroni przed zaszczepion-każeniem wirusem zapalenia wątroby typu B. Natomiast w przypadku HCV i HIV wczesne rozpo-znanie z określeniem fazy choroby ma decydujące znacznie w osiągnięciu sukcesu terapeutycznego.
ROZPOZNAWANIE ZAKAŻENIA HBV
Wirus zapalenia wątroby typu B jest wirusem DNA na-leżącym do rodziny Hepadnaviridae. Do zakażenia docho-dzi poprzez uszkodzoną skórę lub błony śluzowe. Materia-łem zakażającym jest krew oraz inne płyny ustrojowe. Okres wylegania waha się od 40 do 160 dni (średnio 60–90 dni). HBV występujące u matki stanowi znaczące ryzyko zaka-żenia dziecka (transmisja wertykalna), innymi drogami za-infekowania są transmisja horyzontalna (mająca miejsce
w warunkach domowych) oraz przekazanie czynnika cho-robowego na drodze bezpośrednich kontaktów seksualnych. Wirus zapalenia wątroby typu B nie wywiera efektu cy-topatycznego na komórkę wątrobową, natomiast przewlekła infekcja (dominująca obecnie w klinice) jest dynamiczną interakcją pomiędzy wirusem, hepatocytami i układem im-munologicznym gospodarza. W przebiegu przewlekłego za-każenia tym wirusem kluczową rolę odgrywa tzw. cccDNA (ang. covalently closed circular DNA).
Najprostszym wykładnikiem przewlekłego wzw B jest HBs-antygenemia, utrzymująca się przez okres co najmniej sześciu miesięcy.
Naturalny przebieg zakażenia został zróżnicowany na kil-ka faz, które nie mają przebiegu sekwencyjnego.
FAZY ZAKAŻENIA HBV
FAZA TOLERANCJI IMMUNOLOGICZNEJ
Etap tolerancji immunologicznej charakteryzuje się: obecnością antygenu „e” (HBeAg) w surowicy krwi, wy-sokim stopniem replikacji wirusa (wysokie wartości HBV-DNA), prawidłową aktywnością aminotransferaz oraz brakiem lub niewielkimi zmianami martwiczo-zapalnymi w tkance wątrobowej. Spontaniczna eliminacja HBeAg jest niezwykle rzadka. Faza ta jest najczęściej obserwowana u lu-dzi zainfekowanych perinatalnie, względnie w najmłodszym okresie życia. Pacjenci ci są wysoce zakaźni z uwagi na nasi-loną odnowę biologiczną wirusa.
FAZA IMMUNOLOGICZNIE REAKTYWNA HBeAg-DODATNIA
Etap ten cechuje się obecnością antygenu „e” w suro-wicy krwi obwodowej, relatywnie niską replikacją wirusa ocenianą niższą wartością HBV-DNA, podwyższoną sta-le lub okresowo aktywnością aminotransferaz (aminotrans-feraza alaninowa – ALT), zmianami martwiczo-zapalny-mi w tkance wątrobowej oraz szybszym postępem włók-nienia. Tę fazę obserwuje się częściej u dorosłych zakażo-nych w młodym wieku. Może ujawnić się po latach trwania etapu tolerancji immunologicznej. Spontaniczna eliminacja HBeAg jest możliwa z ujawnieniem się swoistych przeciw-ciał anty-HBeAg.
NIEAKTYWNE ZAKAŻENIE HBV (STATUS NOSICIELSTWA)
Nieaktywne zakażenie może rozwinąć się po serokon-wersji w układzie „e”, tj. po eliminacji HBeAg i pojawie-niu się anty-HBeAg. Ta faza charakteryzuje się zniknię-ciem lub bardzo niską wartością HBV-DNA oraz prawidło-wą aktywnością aminotransferaz. W celu rozpoznania tego etapu zakażenia wzw B należy obserwować chorego przez
okres roku, kontrolując aktywność aminotransferaz (ALT) co najmniej co 3–4 miesiące oraz wartość HBV-DNA. Ak-tywność aminotransferazy alaninowej powinna pozostawać w normie (<40 IU/mL), a wiremia – <2000 IU/mL. U nie-których zainfekowanych wartość HBV-DNA może być wyż-sza przy prawidłowej aktywności ALT. Chorzy z niską wire-mią HBV, ale z okresowo podwyższoną aktywnością ami-notransferazy alaninowej powinni być objęci dalszymi ba-daniami, z biopsją wątroby włącznie. W tej fazie zakażenia prognoza dotycząca zdrowia jest raczej korzystna, z niewiel-kim zagrożeniem rozwoju marskości wątroby i ewentualnie raka wątrobowokomórkowego (ang. hepatocellular carci-noma – HCC). Eliminacja HBsAg z serokonwersją do anty- -HBsAg może nastąpić samoistnie u około 1–3% zakażonych rocznie, najczęściej po latach ujemnego wyniku HBV-DNA. Należy jednak pamiętać, że zawsze istnieje ryzyko postę-pu choroby wątroby, z reguły bez serorewersji (tj. HBe-Ag-ujemne) i dlatego każdy pacjent z tą fazą zakażenia po-winien być obserwowany do końca życia oraz powinno się u niego przeprowadzać badanie aktywności ALT (po upły-wie rocznego okresu wczesnej obserwacji) co 6 miesię-cy. Chorych z wartością HBV-DNA >2000 IU/mL należy okresowo oceniać pod kątem postępu zmian chorobowych w tkance wątrobowej z wykorzystaniem technik nieinwazyj-nych, względnie biopsji wątroby. U pacjentów z tą fazą za-każenia wzw B stężenie HBsAg we krwi obwodowej wynosi poniżej 1000 IU/mL.
PRZEWLEKŁE ZAPALENIE WĄTROBY HBeAg-UJEMNE
Przewlekłe zapalenie wątroby HBeAg-ujemne może roz-winąć się w okresie immunologicznej aktywności po elimi-nacji HBeAg lub po latach utrzymywania się fazy toleran-cji immunologicznej (nieaktywne zakażenie wzw B). Repre-zentuje późny okres aktywności immunologicznej w natu-ralnym przebiegu zakażenia tym wirusem. Charakteryzu-je się okresowym podwyższeniem wiremii HBV-DNA oraz nieprawidłową aktywnością ALT. U tych osób spontaniczna remisja choroby jest mało prawdopodobna. Należy podkre-ślić, że zróżnicowanie fazy nieaktywnej infekcji od przewle-kłego zapalenia wątroby HBeAg-ujemnego może niekiedy nastręczać trudności w praktyce klinicznej. Generalnie pro-gnoza co do postępu choroby u osób zakażonych od wielu lat jest korzystniejsza; natomiast u zakażonych przez krótszy okres czasu postęp włóknienia jest szybszy z równoczesnym szybszym rozwojem marskości wątroby ze wszystkimi moż-liwymi powikłaniami oraz z większym ryzykiem przemiany nowotworowej hepatocytów. Taki pacjent wymaga częstych kontroli aktywności ALT (pierwszy rok obserwacji co 3–4 miesiące) oraz pomiarów wiremii HBV.
FAZA HBsAg-UJEMNA PO ELIMINACJI HBsAg
Faza HBsAg-ujemna po eliminacji HBsAg przebiega z wykrywalnym materiałem genetycznym wirusa w tkance
Cecha HBV HCV HIV
Rodzina Hepadnaviridae Flaviviridae Retroviridae Rodzaj Orthohepadnavirus Hepacivirus Lentivirus Wielkość wirionu 42 nm 30–60 nm 80–120 nm Kształt wirionu Sferyczny Sferyczny Sferyczny
Otoczka Tak Tak Tak
Genom dsDNA ssRNA ssRNA Wielkość genomu 3,2 kbp 9,5 kbp 9–10 kbp Stabilność Wrażliwy na kwas Wrażliwy na kwas i eter Wrażliwy na eter Miejsce replikacji
ge-nomu
Jądro Cytoplazma Jądro Transmisja Parenteralna Parenteralna Parenteralna Występowanie Częste Częste Wysokie Przewlekła choroba Często Często Tak Potencjał onkogenny Tak Tak Nie Wiek w momencie
zakażenia
Każdy wiek Dorośli Każdy wiek Okres wylęgania 50–180 dni 40–120 dni Różny
Stan nosicielstwa Różne fazy zakażenia Tak Zakażenie nieuleczalne Zakaźny materiał
biologiczny
Krew, nasienie i inne wydaliny lub wydzie-liny organizmu czło-wieka
Krew, nasienie i inne wydaliny lub wydzie-liny organizmu czło-wieka
Krew, nasienie i inne wydaliny lub wydzie-liny organizmu czło-wieka
rusami HBV, HCV i HIV (opracowano na podsta-wie [3]).
wątrobowej; we krwi obwodowej HBV-DNA nie jest na ogół wykrywane. U takich pacjentów obserwuje się obecność przeciwciał anty-HBcAg nie zawsze z obecnymi przeciw-ciałami anty-HBsAg. Eliminacja HBsAg przed fazą mar-skości jest korzystnym wykładnikiem zahamowania postę-pu choroby, w przeciwnym wypadku – tj. eliminacji HBsAg po przemianie marskiej – ryzyko rozwoju HCC pozostaje. Kliniczne znaczenie tzw. utajonego wzw B omówiono w od-rębnej części pracy [4].
W Tabeli 2 przedstawiono podstawowe elementy diagno-styczne głównych faz zakażenia HBV [5].
W praktyce klinicznej diagnostyka wzw B opiera się na badaniach serologicznych oraz technice biologii moleku-larnej.
Serologiczne markery zakażenia HBV wykorzystywane w praktyce przedstawiono w Tabeli 3.
Większość zakażeń wirusowego zapalenia wątroby typu B przebiega bezobjawowo, u około 30% dorosłych w ostrej fazie infekcji obserwuje się żółtaczkę i inne kliniczne oraz biochemiczne cechy zapalenia wątroby. W tej fazie choro-by w surowicy krwi obecny jest antygen powierzchniowy (HBsAg), antygen „e” (HBeAg) oraz wysokie stężenie prze-ciwciał przeciwko antygenowi rdzeniowemu wirusa w klasie IgM (anty-HBcAg-M).
Skuteczna odpowiedź immunologiczna organizmu czło-wieka prowadzi do eliminacji HBeAg i ujawnienia się prze-ciwciał przeciwko antygenowi „e” (anty-HBeAg) oraz elimi-nacji HBsAg z ewentualną obecnością anty-HBsAg.
Utrzymywanie się HBs-antygenemii przez okres dłuższy niż 6 miesięcy przemawia za przewlekłym zakażeniem wi-rusem zapalenia wątroby typu B.
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA ZAKAŻENIA HBV
Wykazanie obecności materiału genetycznego wiru-sa (HBV-DNA) we krwi obwodowej stanowi bezpośredni wskaźnik wiremii i zakaźności chorego. HBV-DNA jest wy-krywany we krwi obwodowej od dwóch do czterech tygodni przed ujawnieniem się HBsAg.
Oznaczanie HBV-DNA jest także wykorzystywane przy ustalaniu wskazań do leczenia przeciwwirusowego oraz mo-nitorowania jego skuteczności.
Zgodnie z zasadami międzynarodowego standardu WHO wartość HBV-DNA jest obecnie określana w jednostkach międzynarodowych (IU/mL).
Obecnie w diagnostyce oraz monitorowaniu przebiegu zakażenia i ocenie skuteczności terapii są wykorzystywane następujące analizy molekularne:
Tolerancja immu-nologiczna Faza immunolo-gicznie reaktywna HBeAg-dodatnia Nieaktywne zaka-żenie HBV (status nosicielstwa) Reaktywacja zakażenia – HBeAg(-) HBeAg (+) (+) (-) (-) HBV-DNA (IU/mL) >2×107 Bardzo wysoka >2×104 Wysoka <2×103 Niska >2×103 Średnia ALT Prawidłowa Podwyższona/
zmienna
Prawidłowa Podwyższona/ zmienna Patologia wątroby Brak zmian lub
minimalne Przewlekłe zapa-lenie z włóknie-niem Brak zmian lub minimalne Przewlekłe zapa-lenie z włóknie-niem (opracowano na podstawie [5]). Marker Określenie
HBsAg Główny wykładnik zakażenia HBV Pierwszy serologiczny marker infekcji
Utrzymywanie się HBsAg w surowicy krwi obwodowej ponad 6 miesięcy prze-mawia za przewlekłym zakażeniem
Anty-HBsAg Przeciwciało neutralizujące
Wyzdrowienie lub dowód immunizacji wirusem
Jedyny marker wykrywany w surowicy krwi obwodowej po skutecznym szcze-pieniu
HBeAg Aktywna replikacja wirusa; wysokie ryzyko zakażenia osoby z kontaktu Anty-HBeAg Mniej aktywna replikacja HBV
Mniejsze ryzyko transmisji wirusa; remisja choroby Mutacja w regionie precore/core genomu HBV
IgM anty-HBcAg Obecny w wysokim indeksie w ostrym zakażeniu HBV; znika z krwi obwodowej w okresie około sześciu miesięcy
10–20% chorych z przewlekłym zapaleniem wątroby typu B oraz w okresie za-ostrzenia choroby obecny we krwi obwodowej w niskim indeksie
IgG anty-HBcAg Nie jest przeciwciałem neutralizującym; wykładnik ekspozycji na HBV Izolowana obecność może przemawiać za utajonym zakażeniem wirusem
Tabela 3. Główne serologiczne markery zaka-żenia HBV i ich znaczenia w praktyce klinicznej.
t ilościowe oznaczanie wiremii (HBV-DNA);
t genotypowanie;
t lekooporność uwarunkowana genetycznie;
t mutacje w regionie (ang.) core promoter/precore.
W praktyce najczęściej wykonywanym badaniem jest ocena wiremii we krwi obwodowej lub osoczu (HBV-DNA).
Praktyczne rekomendacje dotyczące ilościowego ba-dania HBV-DNA zostały opublikowane przez różne sto-warzyszenia naukowe. W każdym z tych zapisów pod-kreśla się konieczność wykorzystywania technik o wyso-kim stopniu czułości, umożliwiających wykazanie już nie-wielkich ilości materiału genetycznego wirusa (sugerowa-ną techniką jest polimerazowa reakcja łańcuchowa w cza-sie rzeczywistym (ang. real-time polymerase chain reaction – RT-PCR)) [4, 6].
Wskazaniem do terapii jest wiremia >2000 IU/mL. Natomiast podczas leczenia przeciwwirusowego należy wykorzystywać testy wykrywające HBV-DNA już na pozio-mie 10–15 IU/mL [4]. Tylko tak niska wartość wiremii po-twierdza korzystny efekt terapii i co najważniejsze znacząco utrudnia rozwój lekooporności [4].
U osoby z udowodnioną obecnością HBsAg w surowicy krwi należy zbadać:
t układ HBeAg/anty-HBeAg;
t anty-HBcAg;
t anty-HBsAg;
t HBV-DNA (IU/mL).
Interpretację serologii HBV przedstawiono w Tabeli 4 [7].
ROZPOZNAWANIE ZAKAŻENIA HCV
Zgodnie z najnowszymi danymi epidemiologicznymi, udokumentowana liczba zakażonych wzw C na świecie waha się od 130 do 170 milionów. Geograficznie rzecz ujmując, częstość występowania HCV jest zróżnicowana, a najwyższy odsetek infekcji dotyczy Afryki oraz środkowo-wschodnich państw azjatyckich. W krajach, takich jak: Egipt, Kamerun, Arabia Saudyjska, Irak i Syria zakażenia wzw C są rozpozna-wane u 2–15% populacji. Najniższy odsetek zainfekowanych został potwierdzony w Ameryce Północnej, Australii, Japo-nii oraz Europie Północnej i Zachodniej. W Europie epide-miologia wzw C wskazuje także na znaczące zróżnicowa-nie. W północnych i zachodnich państwach Europy odsetek chorych z HCV wynosi około 1%, natomiast w południo-wych oraz niektórych wschodnich krajach – >2,5%.
Niezależnie od kraju czy kontynentu, zakażenie jest po-wiązane głównie z procedurami medycznymi – jako przy-kład służyć mogą najnowsze dane mówiące o 50–70% zaka-żeń szpitalnych HCV w Europie [8].
Genetyczne zróżnicowanie wirusa dodatkowo kompliku-je epidemiologię oraz znacząco wpływa na skuteczność le-czenia przeciwwirusowego. Wirus zapalenia wątroby typu C charakteryzuje się bowiem dużą zmiennością genetycz-ną i jest sklasyfikowany w siedmiu genotypach oznakowa-nych cyframi rzymskimi i co najmniej w 67 subtypach. Na-leży podkreślić, że niedoskonałość polimerazy HCV odpo-wiada za wysoki stopień mutacji nukleotydów w cyklu
repli-kacyjnym wirusa, sięgający od 10-5 do 10-4 [9].
HBsAg Anty-HBcAg Anty-HBsAg Ujemny Ujemny Ujemny Wrażliwy na zakażenie HBV HBsAg Anty-HBcAg Anty-HBsAg Ujemny Dodatni Dodatni Przebyte zakażenie HBV HBsAg Anty-HBsAg Anty-HBsAg Ujemny Ujemny Dodatni Odpowiedź poszczepienna HBsAg Anty-HBcAg Anty-HBcAg IgM Anty-HBsAg Dodatni Dodatni Dodatni Ujemny
Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu B
HBsAg Anty-HBcAg Anty-HBcAg IgM Anty-HBsAg Dodatni Dodatni Ujemny Ujemny Przewlekłe zakażenie HBV HBsAg Anty-HBcAg Anty-HBsAg Ujemny Dodatni Ujemny
Interpretacja trudna – istnieją cztery możliwości: t przebyte zakażenie HBV;
t fałszywie dodatni wynik anty-HBcAg; t utajone zakażenie HBV;
t wyleczenie z ostrego wirusowego zapalenia wątroby typu B
Z uwagi na niezwykle istotne znaczenie genotypu w pla-nowaniu i przewidywaniu skutecznej terapii, jego ozna-czanie jest wykonywane u każdego zakażonego wirusem wzw C.
W praktyce rozpoznawanie zakażenia opiera się na bada-niach serologicznych i molekularnych.
Badanie przesiewowe wirusowego zapalenia wątroby typu C bazuje na określaniu obecności przeciwciał anty- -HCV w surowicy krwi obwodowej. Wykazanie anty-HCV wskazuje jedynie na kontakt z wirusem, natomiast określe-nie fazy infekcji (ostra, przewlekła, przebyta) tylko w opar-ciu o wynik badania serologicznego jest niemożliwe. Nale-ży zaznaczyć, że u kobiet w ciąNale-ży oraz u pacjentów z immu-nologicznymi lub hematologicznymi problemami zdrowot-nymi możliwe jest uzyskanie wyników fałszywie dodatnich. W przygotowanych i opublikowanych przez EASL i CDC (ang. European Association for the Study of the Liver, Cen-ters for Disease Control and Prevention) rekomendacjach dotyczących między innymi zasad rozpoznawania zaka-żenia wzw C sugeruje się wykonanie u każdej osoby anty- -HCV(+) badania zmierzającego do poszukiwania materia-łu genetycznego wirusa, tj. HCV-RNA [10, 11].
W trakcie obserwacji pacjenta, trwającej z reguły przez długi okres czasu, oznaczanie HCV-RNA powinno być po-wtarzane i w zależności od potrzeby (ocena skuteczności terapii przeciwwirusowej) wykonywane metodą ilościo-wą [10, 11].
Do diagnostyki serologicznej zakażenia wzw C wykorzy-stuje się obecnie test trzeciej generacji, w którym do fazy stałej przyłączone są antygeny części rdzeniowej oraz re-kombinowane fragmenty NS3, NS4, NS5. Test trzeciej ge-neracji charakteryzuje się najwyższą czułością i swoistością umożliwiającą wykrycie swoistych przeciwciał w 8–10 tygo-dni po zainfekowaniu.
Testy umożliwiające wykrywanie anty-HCV w klasie IgM nie zdały egzaminu praktycznego z uwagi na fakt, że swoiste przeciwciała tej klasy są obecne zarówno w ostrej, jak i prze-wlekłej fazie zakażenia. Obecnie został opracowany szybki immunochromatograficzny test do wykrywania swoistych przeciwciał anty-HCV, wykorzystujący te same antygeny jak w zestawie III generacji i umożliwiający uzyskanie wyniku w ciągu kilku godzin.
W 2013 roku zaproponowano schemat postępowania dia-gnostycznego polegający na wykorzystywaniu testu przesie-wowego metodą immunoenzymatyczną (ang. enzyme im-munoassay – EIA) lub innego szybkiego testu i potwierdze-nia zakażei potwierdze-nia HCV odmiennym sposobem [11].
Potwierdzenie zakażenia wzw C jest najczęściej przepro-wadzane z wykorzystaniem techniki immunoblot. W meto-dzie tej są stosowane identyczne antygeny HCV jak w te-ście EIA, ale ich rozdział na odpowiedniej błonie pozwa-la na ujawnienie poszczególnych prążków reagujących ze swoistymi białkami obecnymi w badanej próbce krwi.
Immunoblot umożliwia stwierdzenie zakażenia wirusem, niestety nie potwierdza aktywnej infekcji [12].
TESTY MOLEKULARNE
HCV-RNA jest wykrywany zarówno w osoczu, jak i su-rowicy krwi obwodowej w ciągu od jednego do trzech tygo-dni od zakażenia i na około miesiąc przed ujawnieniem się swoistych przeciwciał anty-HCV. Jest zawsze wskaźnikiem replikacji wirusa.
Badanie kwasu nukleinowego (ang. nucleic acid testing – NAT) w badaniu jakościowym lub ilościowym bazuje na technice polimerazowej reakcji łańcuchowej, względnie na rozgałęzionej sygnałowej amplifikacji DNA (ang. bran-ched DNA signal amplification – bDNA) lub na amplifika-cji warunkowanej transkrypcją (ang. transcription media-ted amplification).
Obecnie wszystkie techniki NAT są zgodne z zasadami międzynarodowego standardu WHO, a uzyskane wyniki są przedstawiane w IU/mL [13].
Dalsze udoskonalanie technik biologii molekular-nej pozwoliło na wprowadzenie do ilościowego oznacza-nia HCV-RNA metody polimerazowej reakcji łańcuchowej w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Zgodnie z rekomendacja-mi EASL, ilościowe oznaczanie HCV-RNA do celów diagno-stycznych oraz u leczonych przeciwwirusowo chorych po-winno być przeprowadzane techniką gwarantującą wykry-cie materiału genetycznego na poziomie <15 IU/mL [14].
Określenie genotypu HCV jest ważne z uwagi na jego przydatność prognostyczną oraz wyznaczanie ewentualne-go czasu terapii przeciwwirusowej. W badaniu tym wyko-rzystuje się metodę RT-PCR polegającą na odwrotnej
hy-brydyzacji regionu 5'NC. W ostatnim okresie czasu
genoty-powanie wirusa odbywa się techniką sekwencjonowania re-gionu NS5B [15].
U osoby z dodatnim wynikiem w kierunku zakażenia HCV (anty-HCV dodatni) należy wykonać następujące badania:
t jakościowy test HCV-RNA;
t określenie genotypu wirusa;
t patomorfologia tkanki wątrobowej (oligobiopsja
wą-troby).
DIAGNOSTYKA UTAJONEGO ZAKAŻENIA HBV/HCV
W 2008 roku Europejskie Stowarzyszenie do Badań nad Wątrobą zdefiniowało utajone zakażenie wzw B jako brak HBsAg we krwi obwodowej, ale z obecnym materiałem genetycznym wirusa (HBV-DNA) w tkance wątrobowej i ewentualnie we krwi obwodowej.
Utajone zakażenie wzw B jest określane jako seropozy-tywne, kiedy wykazuje się również obecność anty-HBcAg i ewentualnie anty-HBsAg lub jako seronegatywne po wy-kryciu tylko materiału genetycznego wirusa.
Częstość ujawniania się utajonego wirusowego zapalenia wątroby typu B (HBsAg(-) anty-HBcAg(+)) jest zróżnicowa-na geograficznie i waha się od 0,1 do 2,4% w krajach Europy Zachodniej oraz w Stanach Zjednoczonych. W regionie ende-micznym utajone zakażenie wzw B wykryto u około 70–90% eksponowanej populacji. Badając tylko anty-HBcAg, wykaza-no obecwykaza-ność HBV-DNA u około 15% osób.
Rozpoznanie utajonego zakażenia wymaga zastosowa-nia wysoce czułych technik, takich jak RT-PCR oraz ne-sted-PCR z wykorzystaniem oligonukleotydowych prime-rów swoistych dla różnych regionów genomu HBV i kom-plementarnych z fragmentami konserwatywnymi genomu. Przy podejrzeniu utajonego zakażenia przydatne jest ozna-czenie anty-HBcAg.
U chorych z zaburzeniami układu immunologicznego, względnie objętych terapią biologiczną lub chemioterapią, z przyczyn onkologicznych może dojść do reaktywacji uta-jonego zakażenia wirusowego zapalenia wątroby z rozwo-jem szybko postępujących zmian narządowych.
Przy zakażeniu skojarzonym HBV/HCV, w którym infek-cja wzw B ma charakter utajony, niekiedy może rozwinąć się choroba wątroby o szybszym postępie i większym nasileniu zmian [16].
Utajone zakażenie HCV zostało określone na począt-ku XX wiepocząt-ku jako utrzymywanie się materiału genetyczne-go wirusa w osoczu, mononuklerach krwi obwodowej i/lub tkance wątrobowej w bardzo niskim stężeniu odpowiadają-cym 100–200 ekwiwalentów genomu (vge/mL) wzw C (oso-cze), 10–100 vge/μg (tkanka wątrobowa). Identyfikacja tego typu zakażenia stała się możliwa po wprowadzeniu bardzo czułych technik molekularnych pozwalających na wykrycie ≤10 vge/mL (≤3 IU/mL) oraz w tkance ≤5vge/μg, co odpo-wiada 1,5 IU/μg.
Również w takiej sytuacji istnieje zagrożenie reaktywa-cji zakażenia wzw C u chorych immunosupresyjnych [17].
ZAKAŻENIE SKOJARZONE HBV/HCV
W poszczególnych regionach świata w praktyce klinicz-nej zakażenie skojarzone HBV/HCV nie jest często obser-wowane.
U większości chorych z obydwoma wirusami obserwu-je się cechy aktywnego zakażenia wzw C i brak aktywności wzw B. Sytuacja odwrotna – wysokie wartości wiremii HBV i brak HCV-RNA we krwi obwodowej – jest także spotykana. Udokumentowano także bardziej nasilone zmiany w tkan-ce wątrobowej u chorych z zakażeniem skojarzonym w po-równaniu z nasileniem patologii u pacjentów z monoinfek-cją. W każdym z przeprowadzonych badań obserwacyjnych wykazano korelację z zachorowaniem na raka wątrobowoko-mórkowego, wyższą niż w monoinfekcjach HBV czy HCV.
Z uwagi na postęp w terapii przewlekłych wiruso-wych zapaleń wątroby, w diagnostyce infekcji należy dążyć
do ustalenia dominującego wirusa, wykorzystując dostępne techniki diagnostyczne. „Dominantę” wirusa wyznacza wi-remia określona czułą techniką RT-PCR [18].
Ustalenie dominującego wirusa u chorego z zakażeniem utajonym ma decydujące znaczenie w podjęciu odpowied-niej opcji terapeutycznej.
ROZPOZNAWANIE ZAKAŻENIA HIV
Zakażenie HIV w swoim przebiegu klinicznym charakte-ryzuje się wieloletnim okresem poprzedzającym ujawnienie się – jako konsekwencji oddziaływania wirusa – destruk-cji układu immunologicznego osoby zakażonej. Po krótko-trwałej fazie, tj. pierwotnym zakażeniu (ostra choroba retro-wirusowa) trwającym od jednego do trzech miesięcy, wirus rozpoczyna wieloletnią walkę z układem immunologicz-nym organizmu gospodarza. Ten drugi okres latencji kli-nicznej może trwać od ośmiu do dziesięciu lat. Jeżeli oso-ba zakażona nie podejmie w tym czasie leczenia antyretro-wirusowego, prowadzi to do fazy bardzo poważnego ryzy-ka rozwoju AIDS.
Stopień zakaźności osoby zainfekowanej HIV jest naj-większy w początkowym okresie infekcji (kiedy to wykrycie przeciwciał anty-HIV w kilka dni po zakażeniu powszech-nie stosowanymi metodami jest powszech-niemożliwe) oraz w okresie rozwiniętego AIDS.
Ze względu na liczne rekomendacje opracowane przez instytucje i stowarzyszenia o zasięgu światowym oraz za-lecenia obowiązujące w poszczególnych krajach, w niniej-szym opracowaniu wykorzystano zalecenia Polskiego Towa-rzystwa Naukowego AIDS.
W diagnostyce zakażenia HIV wykorzystuje się metody serologiczne i techniki biologii molekularnej.
Badania serologiczne są przeprowadzane metodą immu-noenzymatyczną z zastosowaniem testów III lub IV genera-cji. Test III generacji umożliwia wykazanie swoistych prze-ciwciał anty-HIV w około cztery tygodnie od momentu za-każenia, natomiast test IV generacji po 2–3 tygodniach. Istotną zaletą testu IV generacji jest możliwość wykrycia nie tylko swoistych przeciwciał anty-HIV, lecz także antygenu wirusa oznakowanego jako p24.
W przypadku uzyskania wyniku dodatniego, bada-nie przesiewowe powinno być wykonane w drugiej próbce krwi. Po ponownym uzyskaniu wyniku dodatniego należy przeprowadzić tzw. test potwierdzenia metodą western-blot.
Test potwierdzenia jest wykonywany w każdym przy-padku stwierdzenia wyniku dodatniego w badaniu przesie-wowym.
W badaniu techniką western-blot poszukuje się prze-ciwciał przeciwko poszczególnym antygenom wirusa HIV. To czuła i wysoce swoista metoda, która stanowi nieodzow-ny element procesu diagnostycznego zakażenia HIV.
Tylko wynik dodatni testu przesiewowego i testu po-twierdzenia pozwala na rozpoznanie zakażenia HIV. W żad-nym inW żad-nym przypadku nie można postawić takiego rozpo-znania. Wszelkie wątpliwości należy rozstrzygnąć, powta-rzając badania serologiczne po sześciu tygodniach.
TECHNIKI MOLEKULARNE
Metody biologii molekularnej pozwalają na wykrycie materiału genetycznego wirusa (HIV-RNA). Najczęściej stosowaną techniką jest polimerazowa reakcja łańcuchowa w czasie rzeczywistym, pozwalająca na wykrycie niewielkiej liczby kopii wirusa we krwi obwodowej. W praktyce należy wykorzystywać testy, których czułość pozwala na wykrycie <20 do 75 kopii/mL [19].
Ilościowe badanie HIV-RNA pozwala na potwierdzenie zakażenia HIV, jego szczególna przydatność diagnostycz-na dotyczy stanu zdrowia noworodków urodzonych przez matki zakażone. W długiej obserwacji medycznej badanie HIV-RNA jest wykonywane regularnie (co najmniej dwa razy w roku) w celu oceny postępu zakażenia, a następnie przed rozpoczęciem leczenia antyretrowirusowego. W cza-sie terapii antyretrowirusowej wartości HIV-RNA są wy-kładnikiem skutecznego leczenia.
W każdym przypadku badanie w kierunku zakażenia HIV powinno być przeprowadzone po uzyskaniu świado-mej i dobrowolnej zgody od osoby badanej.
Przed planowanym przeszczepem narządowym krwio-dawcy oraz krwio-dawcy narządów i tkanek są badani w kierun-ku zakażenia HIV bez potrzeby uzyskania zgody na prze-prowadzenie testu.
KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.
PIŚMIENNICTWO
1. Williams R. Global challenges in liver disease. Hepatology 2006;44(3):521– 526. 2. Alter MJ. Epidemiology of viral hepatitis and HIV co-infection. J Hepatol
2006;44(Suppl. 1):S6– S9.
3. Prasad K, Karnekar VK. HBV, HCV and HIV: comparable yet contrasting. Online J Health Allied Scs 2005;4(2):1.
4. European Association for the Study of the Liver. EASL clinical practice gu-idelines: management of chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol 2012;57(1):167– 185.
5. Kao JH. Diagnosis of hepatitis B virus infection through serological and viro-logical markers. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2008;2(4):553– 562. 6. Recommendations for the diagnosis and management of patients with
chronic hepatitis B infection. Alaska Native Tribal Health Consortium (onli-ne) 2010; http://www.anthc.org/chs/crs/hep/upload/HepatitisBWebsiteGu-idelines.pdf
7. Perrillo RP, Ward JW. A silent epidemic: why chronic hepatitis B matters. Med-scape education. MedMed-scape (online) 2012; http://www.medMed-scape.org/vie- http://www.medscape.org/vie-warticle/759762_transcript
8. Lavanchy D. The global burden of hepatitis C. Liver Int 2009;29(Suppl. 1):S74– S81. 9. Duffy S, Shackelton LA, Holmes EC. Rates of evolutionary change in viruses:
patterns and determinants. Nat Rev Genet 2008;9(4):267– 276.
10. European Association for the Study of the Liver. EASL clinical practi-ce guidelines: management of hepatitis C virus infection. J Hepatol 2011;55(2):245– 264.
11. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Testing for HCV infection: an update of guidance for clinicians and laboratorians. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2013;62(18):362– 365.
12. Kamili S, Drobeniuc J, Araujo AC, Hayden TM. Laboratory diagnostics for he-patitis C virus infection. Clin Infect Dis 2012;55(Suppl. 1):S43– S48. 13. Saldanha J, Heath A, Aberham C et al. World Health Organization
collabo-rative study to establish a replacement WHO international standard for he-patitis C virus RNA nucleic acid amplification technology assays. Vox Sang 2005;88(3):202– 204.
14. European Association for the Study of the Liver. EASL clinical practice guideli-nes: management of hepatitis C virus infection. J Hepatol 2013;60(2):392– 420. 15. Gryadunov D, Nicot F, Dubois M, Mikhailovich V, Zasedatelev A, Izopet J. He-patitis C virus genotyping using an oligonucleotide microarray based on the NS5B sequence. J Clin Microbiol 2010;48(11):3910– 3917.
16. Raimondo G, Caccamo G, Filomia R, Pollicino T. Occult HBV infection. Semin Immunopathol 2013;35(1):39– 52.
17. Pham TN, Coffin CS, Michalak TI. Occult hepatitis C virus infection: what does it mean? Liver Int 2010;30(4):502– 511.
18. Chu CJ, Lee SD. Hepatitis B virus/hepatitis C virus coinfection: epidemiolo-gy, clinical features, viral interactions and treatment. J Gastroenterol Hepa-tol 2008;23(4):512– 520.
19. Panel on antiretroviral guidelines for adults and adolescents. Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. De-partment of Health and Human Services. AIDSinfo (online) 2014; http://aid-sinfo.nih.gov/contentfiles/adultandadolescentgl.pdf
