A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S F O L IA B IO C H IM IC A E T B IO P H Y S IC A 9, 1992 Aneta Koceva-Chyła W P ŁY W S U B L E T A L N Y C H D A W E K P R O M IE N IO W A N IA G A M M A N A S U P E R H E L IK A L N O Ś Ć D N A O R A Z P R Z E Ż Y W A L N O Ś Ć F IB R O B LA S TÓ W L U D Z K IC H W p ra cy b a d a n o w pływ s ub le ta lny c h d aw ek p ro m ie n io w an ia g am m a n a o rg a n iz a -cję i s tru k tu rę D N A o ra z prz eży w aln ość fib ro b la stó w lu dzkic h (linia T74).
Prz eżyw alno ść o z n a c za n o m e tod ą w z ro stu k lo nalne g o k o m ó rek w ho dow li m o no - w a rstw o w ej in vitro, zm ian y s tru k tu ra ln e D N A - n a p o ds ta w ie s to pn ia re laksacji n uk le o id u , m eto d ą w iro w a nia lizow an ych T rito n e m X-100 k o m ó re k w 15-30% o b o ję tn y m grad ienc ie gęstości sa ch aro zy . D o oz nac zenia z aw a rtośc i D N A we frakc jac h g ra d ie n tu stężeń s ac h aroz y s to s ow an o flu o ro c hro m 33258 H oec hst. Su pe rhe likalno ść D N A o k re ś lan o n a p od staw ie in te rk ala cji b ro m k u etyd yny .
S tw ie rd zo n o zn aczn e zm ian y w org an izac ji i s tru k tu rz e D N A w z akres ie da w ek p ro m ie n io w an ia stos ow a n yc h d o oz nac ze nia prz eżyw alności k om órek 30 % u tra tę ujem nej su pe rsp iralizac ji D N A p o daw ce 2 G y i dals ze 2 -3 % zm ia ny w s up e rhe lik alno - ści p o d aw k ac h w iększych (6 -1 0 G y). W y niki te w s kaz ują na z na cz ną relaksację n u kleo idu k o m órek n a pro m ien iow a n y ch d aw ka m i p ro m ie n io w an ia g am m a większym i od 4 G y. Po d a w k ac h tych za o bs e rw o w an o rów nież b a rd z o niski p ro c en t przeż yw a lno -ści (1 -3 % ). Z n a cz n a u tra ta ujem nej sup erhelikaln ośc i D N A i re lak sa cja nu kle oidu , s p o w o d ow a n a rozw inięciem s u p e rstru k tu r d om en D N A (wyciągnięciem pętli D N A ] po d aw k a ch p rom ie n io w a nia g am m a , p o k tó ryc h rów nie ż zn acz nie ob n iż ał się pro ce nt przeżyw a lności k o m ó rek w skazuje, że in d u ko w a ne prz ez p ro m ie niow an ie zm iany w trzecio- i c zw artorzęd ow ej s tru k tu rz e D N A unie m oż liw iają w łaściwe fun kc jo no w an ie i replikac ję g eno m u , co w ko nsekw e ncji p ro w a dz i d o rep rod uk c yjne j śm ierci k om ó rki.
1. W ST Ę P
Jedny m z istotny ch czyn nik ów m utag ennych, z któ rym i człow iek sp oty ka się na co dzień, jest p ro m ien iow an ie jon izujące, a w szczególności m ałe jego daw ki, ak um ulow ane w organizm ie w w yniku n atu ra ln eg o p ro m ieniow an ia środo w iska oraz stoso w ania p ro m ienio w an ia do celów diagnostyczny ch i te ra -peutycznych. N ap ro m ien io w anie k o m ó rk i po w od uje uszkodzenie jej stru k tu ry
i zakłócenie pełnionych przez n ią funkcji biologicznych. K ońcow y efekt p rom ienio w ania zależy m. in. od takich czynników , ja k d aw ka p ro m ien io w a-nia, wrażliwość ko m órki na prom ieniow anie, skuteczność m echanizm ów reperacyjnych D N A . W pływ prom ienio w ania na przeżyw alność kom órk i stanow i sum aryczny efekt w szystkich tych procesów.
D otych czasow e b ad an ia nad wpływem pro m ien iow an ia jonizująceg o na organizm y żywe w ykazały, że jednym i z najpoważniejszych uszkodzeń w geno-mie euk arioty czny m są in du ko w ane przez czynniki m u tagen ne pojedyncze i po dw ójne pęknięcia D N A [14],
Pojedyncze pęknięcia (SSB) p o w stają w w yniku ro zerw ania jedn eg o z łańcuchów heliksu D N A . Są to uszkodzenia występujące najczęściej, ind u k ow an e niewielkimi daw kam i pro m ien iow an ia i prow adzące do różnego ro d zaju m utacji w organizm ie. W większości ko m ó rek pojedyncze pęknięcia są n apraw iane za p om o cą różnych m echanizm ów reperacyjnych, przy udziale enzym ów [18].
Rzadziej w ystępującym uszkodzeniem są podw ójne pęknięcia D N A (DSB), będące wynikiem ro zerw ania o bu łańcuchów heliksu w tych sam ych lub sąsiadujących ze sobą o kilka p a r zasad m iejscach. Są one szczególnie groźne dla org anizm u, gdyż niszczą naty w ną stru k tu rę D N A , a większość z nich nie jest n ap raw ian a przez ko m ó rk ę [35],
Pojedyncze i p odw ójne pęknięcia m ogą pow staw ać również w w yniku d ziałania m u tagen ów chem icznych [34],
Z uwagi n a ciągłe narażen ie organ izm u ludzkiego na działanie niskich poziom ów czyn nikó w uszkadzających, w zrasta zainteresow anie op raco w aniem czułych i niedrogich m eto d, um ożliw iających wykrycie i analizę określonej m utacji oraz testo w anie efektów genotoksycznych m u tag en ów środ ow isko -wych [16]. Wiele z wysiłków w tej dziedzinie skierow anych jest na opraco w an ie m eto d, pozw alających na wykrycie i m o nito row an ie m utacji w pojedynczej kom órce.
P raca przedstaw ia niesk om p likow aną i szybk ą m etodę um ożliw iającą ocenę wpływ u subletaln ych daw ek prom ieniow an ia, gam m a na organizację i stru k tu rę m ateriału genetycznego kom órki ludzkiej w połączeniu z oceną zdolności k o m ó rk i d o przeżycia in du ko w any ch uszkodzeń.
2. M A T E R IA Ł
2.1. Komórki
M ateriałem do b ad a ń były fibroblasty ludzkie linii T74, d o starczo ne przez B an k K om ó rek C en tru m Z d ro w ia w W arszawie.
3. M E T O D Y
3.1. Hodowla fibroblastów
H odow lę ko m ó rek pro w ad zon o w m edium Eagla (M E M ) z d od atkiem 10% płodowej surow icy cielęcej oraz gentam ycyny (50 /¿g/ml), w atm o sferze 5% C O2, tem p. 37°C i 100% wilgotności. M edium w zrostow e zm ien iano raz tygodniow o.
3.2. Napromieniowanie fibroblastów
K o m órki n ap ro m ienio w yw an o w m onow arstw ie, w tem p. od 0° d o 4°C, daw kam i od 0 do 10 G y p rom ien iow ania gam m a (źródło 60C o, w ydajność źró dła 530 G y /god z., m ierzo na za pom o cą do zy m etru F rick e’go). P rób ę k o n tro ln ą (daw ka 0 G y) przy gotow y w an o analogicznie i na czas n apro m ien io -w ania przecho-w y-w ano -w tem p. od 0 do 4°C.
3.3. Oznaczenie przeżywalności fibroblastów na podstawie wzrostu klonalnego komórek in vitro
N a pro m ien io w ane i k o n troln e ko m ó rk i przem yw ano d w uk ro tn ie zim nym (od 0° d o 4°C) PBS, d o d aw an o m edium i h o do w an o przez okres 3 tygodni. M edium zm ieniano raz tyg odniow o. N a prom ien io w ane fibro blasty do m o -m entu pon ow nego u-m ieszczenia w in ku b ato rze przechow yw ano w lodzie, w tem p. od 0° do -4°C . Po upływie 3 tygodni b arw io no ko m ó rk i 0,05% ro ztw orem fioletu krystalicznego w 10% form aldehydzie i p o d m ikrosk opem liczono kolonie sk ład ające się z co najm niej 50 k om ó rek.
3.4. Fluorymetryczne oznaczenie DN A fluorochromem 33258 Hoechst
D o identyfikacji D N A we frakcjach g rad ientu stężeń sach arozy sto sow an o flu oroch rom 33258 H oechst w stężeniu 1 //g/ml. O znaczenia fluorescencji p rzepro w adzan o przy 2ex = 350 nm i /lem = 490 nm (szczeliny 10 nm ) na spektro flu ory m etrze Jo b in -Y v on (F rancja).
3.5. Wirowanie nukleoidu w obojętnym gradiencie gęstości sacharozy
U w o lnione z lizow anych k o m órek nukleoidy w irow ano w ob ojętnym gradiencie gęstości sacharo zy (15 -3 0 % sacharoza w 2 M N aC l, 0,01 M ED TA
i 0,01 M Tris o pH 7,5 o ra z 1 ¿ig/ml 33258 H oechst). G rad ien ty stężeń sach aro zy fo rm ow ano przy użyciu autom aty czn eg o urządzenia G rad ien t F o rm er, firm y ISC O, USA . B ezpośrednio przed w irow aniem fibro blasty lizow ano na pow ierzchni sacharo zy w ciągu 1 godz., w ciem ności, w tem -peratu rze poko jow ej, płynem lizującym o składzie 1% T rito n X-100, 0,2 M E D T A , 0,01 M Tris pH 8,0 i 2 M N aCl. P rób y w irow an o w roto rze wychylnym SW -60 w ultraw irów ce Beckm an L5-65, w tem p. 15°C i 15 000 o b r./m in , po czym fra kcjon o w an o na 30 frakcji przez podw arstw ienie 50% sacharozą, na urządzeniu G ra d ien t F rac tio n a to r, firm y IS C O , U SA. Z a w ar-tość D N A w poszczególnych frakcjach oznaczano na po dstaw ie p om iaru n atężen ia fluorescencji w w aru nk ach opisanych w p. 3.4.
3.6. Oznaczenie supcrhclikalności DNA
S uperhelikalno ść D N A oznaczan o na podstaw ie relaksacji n ukleoid u w obecności b rom k u etydyn y (EB). N u kleoidy w iro w an o w obecności różnych stężeń EB w w a ru nk ach identycznych do opisanych w p. 3.5. S toso w an o stężenia w zakresie 1-20 /ig EB /m l sacharozy. N atężen ie fluorescencji, po interkalacji EB d o D N A , m ierzon o na sp ektro flu ory m etrze Jobin -Y vo n (F ran cja) przy Aex = 360 nm i / em = 590 nm (szczeliny 10 nm).
4. W Y N I K I
4.1. Wpływ promieniowania na przeżywalność fibroblastów
Subletalne, o raz zbliżone d o nich, daw ki p ro m ien iow an ia m og ą p o w o d o -wać in terfazo w ą lub rep rod uk cyjn ą śm ierć ko m ó rk i [6]. W przy p adk u pierw -szym k o m ó rk a ginie n aty chm iast lub w krótce po n aprom ien iow an iu, w drugim zaś funkcjon uje n adal, lecz nie jest zdoln a d o reprodu kcji. K o m ó rki, k tó re przeżyły o kreślo ną d aw kę p rom ienio w ania i odzyskały w pełni zd olność repro du kcy jną, po dejm u ją n orm alny cykl życiowy i w w yniku kolejnych p odziałów m itoty cznych tw o rzą k olon ie identycznych ko m órek. K a żda z k o lo -nii pow staje z pod ziału i w zrostu klonalnego pojedynczej ko m órki.
P rzykład szalek z kolon iam i p o k az an o na fot. 1, gdzie szereg A zaw iera kolonie, utw o rzo ne przez fib ro blasty nienaprom ieniow an e, szeregi B, C, D i E - kolonie, utw o rzo ne przez fibrob lasty naprom ienio w ane daw kam i od 2 do 8 G y p rom ienio w an ia gam m a.
F o t. 1. K olon ie u tw o rz o n e prz ez n a pro m ien iow a n e i n ie na p ro m ie n io w a ne fibro blas ty ludzkie linii T74. Ilość k om ó re k /s z alk ę 60 m m prz ed na p ro m ie nio w a n ie m 5,0 x 103; A 0 G y (k o n tro la ),
B - 2 G y , C - 4 G y , D - 6 G y , E - 8 G y
4.1.1. O kreślenie m inim alnej ilości ko m órek, przy której fibrob lasty ludzkie linii T74 zdolne są d o w zrostu klo naln eg o in vitro
W w aru nk ach in vitro poszczególne ro dzaje ko m órek zdo ln e są d o w zrostu k lo nalnego przy różnej po czątkow ej ilości k om ó rek. Jest o na inn a dla ko m órek poszczególnych linii tego sam ego rodzaju, w znacznym stop niu zależy tak że o d w aru n kó w p ro w a dzenia hodowli. W zw iązku z tym konieczne jest k ażd orazo w e w yznaczenie m inim alnej ilości ko m ó rek , przy któ rej w d a
nych w aru nk ach hodow li (wielkość naczyń, rodzaj surowicy i płynów ho d ow -lanych, częstotliw ość zm iany m edium w zrostow ego itp .), k o m ó rk i danej linii
zd olne są d o w zrostu klo nalnego in vitro. M etodą kolejnych rozcieńczeń w artość tę dla nien ap rom ien io w an ych fib rob lastów linii T74 o kreślon o na
1,0x 10 3 kom órek /szalk ę o średnicy 60 mm i na 1 ,5 x 10 3 kom órek dla fib ro blastów n ap rom ieniow anych (tab. 1).
T a b e l a 1 Ilość kolonii u tw o rz on yc h przez n a p ro m ie n io w a ne fibrob la sty lu dzkie linii T74
przy ró żny ch po czą tko w ych stężeniach kom órek
D a w - Ilość k o m ó re k/s za lk ę 60 m m
k a 0,5 x 103 1 ,0 x !0-3 1,5 x 103 2 ,0 x 10 3 2.5 x l 03 5,0 x 103 1 0 ,0 x 10 3 (G y)
Iloś ć k om ó re k /s z alk ę 0 śred nicy 60 m m ( x ± s )
0 0 1 3 ,6 ± 0 ,3 36,6 ± 1 ,5 49,3 ± 4 ,0 64,3 ± 4 ,0 6 5 ,0 ± 4 ,9 122,7 ± 2 , 0
2 0 0 14,5 ± 1,7 16,3 ± 1,5 36,0 ± 2 , 6 36,3 ± 3 ,4 57,0 ± 2 ,0
4 0 0 1 0,0± 1,0 5 ,6 ± 0 ,5 22,3 ± 3 , 2 19,3 ± 3 ,2 27,7 ± 3 ,2
6 0 0 1 ,0 ±0 , 0 3 ,6 ± 0 ,5 10,3 ± 2 ,9 4,0 ± 0 ,0 8,3 ± 1 ,5
8 0 0 0 0,7 ± 1 ,1 2 , 0 ± 1.0 2,3 ± 2 ,3 3,0 ± 1 ,0
4.1.2. W pływ początkow ej ilości n ap rom ie niow an ych ko m ó rek na zdolność tw orzenia kolonii
W celu spraw dzen ia czy p o czątk ow a ilość fibro blastó w badan ej linii T74
m a wpływ na ich zdoln ość tw orzen ia kolo nii, ko m órki ro zp asażow yw an o w ilościach: 1,5 x 103, 2,0 x 103, 2,5 x 103, 5,0 x 103 i 10,0 x 103 ko m ó rek na szalkę o średnicy 60 m m. F ib ro b lasty naprom ieniow yw an o daw kam i 2, 4,
6 i 8 G y p ro m ien iow ania g am m a, po czym h o do w an o przez ok res 3 tygodni. W b adan ym zakresie stężeń nie stw ierdzono istotnego wpływu początkow ej ilości fib ro blastów n a średnią p rocen tow ą zdolność tw orzenia kolonii - w raz ze w zrostem daw ki p rom ienio w ania p rocent zdolnych d o reprod ukcji ko m órek zm niejszał się w sp osó b p o do b n y (tab. 2, rys. 1). P orów n anie testem F S nedecora, m eto dą analizy w ariancji A N A W A II [33] w spółczynników regresji dla nachylen ia pro stych przed staw iających zależność ilości u tw orzo -nych kolonii od daw ki p ro m ienio w ania, nie w ykazało statystycznie istot-nych różnic w poró w n yw aln ych p ar am e trac h przy poziom ie istotności a = 0,95. Niezależnie od stosow anego stężenia po czątk ow ego n astępo w ał znaczny spadek przeżywalności ko m ó rek po d aw kach większych od 4 G y i znikom y pro cen t przeżywalności po daw k ach 6 i 8 G y (tab. 2, rys. 1). N ależy jed n ak zaznaczyć, że w p rzy p ad ku stężeń większych (5,0 x 103 i 10,0 x 103), znaczna liczba utw orzon ych kolonii stw arzała pew ne trud ności z d ok ład n ym ich policzeniem , w zw iązku z czym za op tym alne dla tej linii kom ó rko w ej u zn ano stężenia 2,0 x l 03 - 2,5 x l 03 ko m órek/szalkę o średnicy 60 mm .
Ś red nia p ro c en to w a z do ln oś ć tw o rz enia k olo nii przez n a p ro m ie nio w a ne fib ro bla sty lud zkie linii T_ 4 przy różn ych p oc zą tk ow y ch stężenia ch k om ó rek
Ilość k om ó re k/sz alkę 60 m m D a w k a 1,5 x I03 2 , 0 x 10 3 2,5 x 103 5,0 x 103 1 0 ,0 x 10 3 Ilość ko lo n ii/sza lk ę 60 m m (w % ) 0 2 4 6 8 10 0 39.2 ± 4 ,3 27.3 ± 3 ,0 2,7 ± 0 ,0 0 1 00 33,1 ± 3 ,0 11,5 ± 1,1 7.4 ± 1 , 3 1.4 ±2,3 10 0 56.0 ± 4 ,1 34,7 ± 4 ,9 16.1 ± 3 ,8 3,1 ± 1,3 10 0 55,4 ± 5 ,1 29,8 ± 4 ,9 6,2±0 ,0 3,6 ± 3 , 5 1 00 46.5 ± 2 .0 22.5 ± 2 ,6 6,8± 1,1 2,4 ± 0 , 8
Rys. 1. Przeżyw alno ść n ap ro m ie n io w an y ch fibro blastów ludzkich linii ^ 4 (na osi y frakc ja k o m ó re k, k tó re przeżyły d a n ą d aw k ę p ro m ie niow an ia )
4.2. Fluorymetryczne oznaczenie DNA przy użyciu fluorochroniu 33258 Hoechst
Ilość D N A w poszczególnych frak cjach g rad ien tu gęstości sacharozy oznaczan o n a p odstaw ie natężenia fluorescencji po przyłączeniu flu o ro chro m u
33258 H oechst. R eaguje on z obszaram i D N A bogatym i w A -T [5], m echanizm reakcji do ty chczas nie został d ok ład n ie poznany.
Przyłączenie D N A pow od uje przesunięcie m aksim um fluorescencji czys-tego flu oroc hrom u z 350 do 358 nm w widm ie w zbudzenia i z 490 do 458 nm
w w idm ie emisji oraz znaczny w zrost natężenia fluorescencji (30 -k rotn y
mox rnax
Rys. 2. Fluoresc enc yjne w idm a w zbud zenia: a. 33258 H oe ch st (1 //g/m l), w zm ocnienie 300 x ; b. 33258 H oe ch st (1 //g/m l + D N A (0,5 /ig/m l), w zm ocnienie 30 x ; c. 33258 H oe ch st (1 //g /m l) + D N A (0,5 /ig/m l) + sa c h a ro z a (20 % ), w zm o cnienie 30 x ; d. 33258 H oe c hs t (I /ig /m l) + D N A (0,5 /ig /m l) + D N A (0,5 //g/m l) + sa c h a ro z a (2 0 % ) + płyn liz ujący (30 /d /m l), w zm o cnien ie 30 x
Rys. 3. Flu ores cen cy jne w idm a em isji: a. 33258 H oe ch st (I /<q/ml), w zm ocnienie 300 x ; b. 33258 H o ech st (1 //g/m l) + D N A (0,5 //g/m l), w zm ocnienie 30 x ; c. 33258 H oe ch st (1 /ig/m l) + D N A (0,5 /łg/'m l) + sa c h a ro z a (2 0% ), w z m ocnien ie 3 0 x ; d. 33258 H oe ch s t (I /(g/m l) + D N A (0,5
w przyp ad ku w idm a w zbudzenia i 15-krotny w p rzy p ad ku w idm a emisji (rys. 2, 3). Ilościowe oznaczenie reakcji na podstaw ie krzywych wzorcowych w ykazało liniową zależność w iązania D N A do flu oro chro m u w zakresie stężeń nanog ram o w ych i m ik ro gram o w y ch, o dużym nachyleniu prostych (rys. 4, 5).
R ys. 4. K rzy w a w zo rco w a o zna cze nia D N A m e to d ą flu orym etryc zn ą z flu o ro ch ro m e m 33258 H oech st
DNA [¿jg ]
Rys. 5. K rzyw a w z orco w a ozn acze nia D N A m etod ą flu ory m etrycz ną z flu oro ch ro m e m 33258 H o echs t
W celu ustalenia opty m aln ych w arun k ów oznaczenia D N A w y k on ano w idm a w zbudzenia i emisji fluo ro ch ro m u w obecności sk ład ników grad ientu gęstości sacharozy. S tw ierdzono, że sacharoza w stosow anych stężeniach (15 -3 0 % ) pow odu je nieznaczne wygaszenie fluorcscencji w ob u w idm ach, płyn lizujący na to m iast - nieznaczny jej w zrost (rys. 2. rys. 3). P ozostałe składniki
(E D T A , T ris-H C l, N aC l) nie m iały wpływu na wielkość fluorescencji. W irow a-nia ko n troln e, w któ ry ch w iro w an o fib rob lasty zawieszone w PBS, bez płynu lizującego lub PBS i płyn lizujący bez fib rob lastó w , wykazały, że w przypad ku nielizowanych ko m ó rek w żadnej z frakcji nie występuje przyro st natężenia fluorescencji; w p rzy pad ku drugim zaś natężenie fluorescencji było większe tylko w pierwszych 2 3 frakcjach, znajdu jących się poza frakcjam i szczytu D N A nuk leoidu lizow anych k om ó rek, w irow anych w tych sam ych w a ru nk ach (rys. 6).
FLUORESCENCJA
NUMER FRAKCJI
_ s ~ A B
Rys. 6. N a tęż enie fluorescencji (jed no s tki arb itra ln e j) w posz czególnych frak cjach 15 30% o bo ję tn e go g rad ie n tu gęstości s ac h aro zy p o o dw iro w an iu : A fib ro b las tó w nielizow any ch,
B - płyn u lizującego i PBS bez fibrob las tó w
4.3. Wpływ promieniowania na superhelikalność DNA
U szko dzenia D N A o zn aczan o na po dstaw ie sto pnia relaksacji nuk leoid u n aprom ien io w an ych fib ro blastów o raz zm ian w superhelikalności D N A .
W zastoso w any m 15-30 % ob ojętnym gradiencie gęstości sacharozy, D N A nukleoidu sedym entuje w p ostaci ostreg o szczytu, obejm ującego 2-3 frakcje w przy p adk u fib ro blastów nienaprom ien io w an ych i 3 -4 frakcje w przypad ku fibro blastów naprom ieniow anych. Szybkość m igracji D N A w gradiencie gęstości sacharozy, ulegała zm niejszeniu w raz z w zrostem dawki prom ieniow a-nia (rys. 7), co sp ow odo w ane było sto pn iow ą u tra tą ujemnej superhelikalności D N A w ew nątrz ją d ra k om ó rk i i przejściem cząsteczki ze stru k tu ry zwartej
w stru k tu rę bardziej o tw a rtą i zrelaksow aną. M ak sym alny efekt zao bser-w obser-w ano po dabser-w ce 2 G y, po której następo bser-w ała 30% u tra ta ujem nej superspiralizacji heliksu w stosun ku do kon tro li (rys. 8). Przy d aw k ach większych zm iany były m niejsze względny spadek szybkości sedym entacji nukleoidó w w przedziale daw ek 8 10 G y w ynosił ty lk o 2,4% (tab. 3).
FLUORESCENCJA
NUMER FRAKCJI
0 Gy 2 Gy 4 Gy 8 Gy -*-10 Gy
Rys. 7. Przyk łado w e profile se dym en tacji n uk le oidu fib ro b las tó w ludzkic h linii T74 w 15 -3 0% o bo jętny m g rad ien cie gęstości s ac haroz y
T a b e l a 3
P ro ce n tow a u tra ta ujem nej su pe rsp iralizac ji D N A i ilość ind uk ow a ny ch pojedync zy ch pęknięć w fu nkcji d aw ki p ro m ie n io w an ia D a w k a (G y) 0 2 4 8 10 d¡/d0 x 100 100 69,4 ± 3 ,5 63,2 ± 2 , 4 5! ,8 ± 2 , 8 49,6 ± 2 ,3 SSB /genom - 900 1700 3500 4300
D a w k a [Gy]
Rys. 8. Proc en t u tra ty ujem nej sup erspiraliza cji D N A na pro m ie niow a n yc h fib ro b la stó w ludzkic h w s to su n k u d o k o n tro li (fib ro b la sty n ien a pro m ie niow an e )
W zględną dro gę sedym entacji n u kleo idu w funkcji daw ki prom ien io w ania przedstaw ion o na rys. 9. Liniow ą część krzywej w yko rzystan o d o oszacow ania ilości in du kow anych pojedynczych pęknięć D N A , ekw iw alentnych dla danej daw ki p rom ienio w ania [17]. U zyskane w artości dla daw ek w zakresie 2 -1 0 G y wynoszą odpo w iedn io 900-43 00 pojedynczych pęknięć D N A /g en o m kom órk i (tab. 3).
Rys. 9. W zględna odległość sed ym entacji nu kleo idu w 15 -30% ob o ję tn y m gra dienc ie gęstości sac haroz y: di od ległości se dym entacji n u k le oid u fib ro b la stów n ap ro m ien io w a ny ch ; d„ o dle
g-łość sedym entac ji n u kleo idu fibro blastów n ien ap ro m ien io w any ch (k o n tro la )
4.4. Oznaczenie superhelikalności DNA
W celu stw ierdzenia czy w zastosow anych w aru nk ach lizy i w irow an ia ko m órek sedym entacja nu kleoid u uw a ru n k ow an a je st stru k tu rą D N A we-w nątrz ją d r a , a zm iany we-w szybkości sedym entacji są we-wynikiem zm ian
konform acyjn ych zachodzących w su p erstru k tu r ach D N A in vivo, przep ro w a-dzo no w irow anie nu kleo idu w obecności b ro m k u etydy/iy (EB) [10, 11].
W o i w 5 10 V __/ 20 (jg EB
Rys. 10. Sc he m a t lokalizacji p as m a n u kleo id u w iro w a nyc h w 15 -3 0% o bo ję tny m gra diencie gęstości sa c ha ro zy w ob ecnoś ci róż nych stężeń b ro m k u ety dyn y
R ys. 11. S ed ym e ntacja n u k le oidu w 15 -3 0% o b oję tn y m gra die ncie gęstości s a ch aro zy w obecn ości ró żn ych stężeń b ro m k u ety dy ny (E B): dj - odległość sed ym entacji nu kleoidu w obe cnoś ci EB; d Q
S tw ierdzon o charak terysty czny dla su perhelikalnego D N A dw ufazow y sp osób sedym entacji, zależny od stężenia EB [2, 10, II], N a rys. 10 p rzed staw ion o sch em at lokalizacji pasm nukleoid u w probów ce wirowniczej, w idocznych pod lam pą UV (filtr 254 nm ), a na rys. 11 zależność względnej szybkości sedym entacji n ukleoidu (dj/d0) od stężenia EB. Najwyżej p ołożone było pasm o nu kleoid u w irow anych w obecności 5 /ig EB /m l sacharozy, najniżej pasm o nuk leoid u w irow anych bez EB o raz nuk leoid u w irow anych w obecności 20 /.tg EB/m l. W zakresie stężeń EB od 0 -5 /¿g/ml następow ał spadek szybkości sedym entacji n ukleoid u na sk utek stopniow ego rozwinięcia ujem nych su perskrętów heliksu D N A po interkalacji b ro m ku etydyny. Stęże-nie EB, przy k tóry m nuk leo idy badan ej linii fibrob lastów osiągnęły n ajm n iej-szą szybkość sedym entacji w ynosiło 5 /ig EB/ml. Stężenie to m ożna określić ja k o „ p u n k t rów n o w agi” (equivalence point) [2]. P un k t ten określa ilość EB, w ystarczającą do całkow itej relaksacji w szystkich do stęp nych ujem nych sup erskrętów dom en D N A . Od tego p u n k tu zaczyna się ich „p rzew ijanie” w k ieru n -ku przeciw nym i fo rm o w anie supersk rętó w do d atn ich (stężenie EB od 5--20 /¿g/ml). W pro w adzenie do datn iej superspiralizacji heliksu po w odu je stopniow e u pak ow anie nu kleoid u i w zrost jego szybkości sedym entacji, k tó r a osiąga w artość zbliżoną do sedym entacji natyw nego, k o ntrolneg o D N A przy stężeniu 20 ng EB/ml (rys. 12).
FLUORESCENCJA
N U M ER FR AKC J I
EB - 07W EB - I P0 *«- EB - 3 p<} EB - 6 pa EB - 10 pg E B - 30/10
Rys. 12. Prz yk ła do w e profile sedym entacji n uk le oidu fib ro b las tó w lud zkich linii ( 7 4 w 15-30% o b ojętny m g radien cie gęstości sa ch a ro z y w obecn ości ró żny ch stężeń b ro m k u e tydy ny
5. D Y SK U S J A
H y dro dyn am iczne b ad an ia interfazow ego genom u kom órek euk ario ty cz-nych wykazały, że w łókna chro m a tyn o w e zaw ierają m o cn o up ako w ane stru k tu ry solenoidalne, zorganizow ane w duże su persoleno idalne pętle D N A , utrzym ujące sw oją stru k tu rę za p om ocą w iązan ia do białek niehistonow ych [2, 10, 11, 26, 28]. Istnienie superhelik alny ch do m en D N A , p o do b n ych do wielkich pętli, w ychodzących ze w spólnego szkieletu stw ierdzon o na zdjęciach z m ikroskop u elektronow ego p re p ara tó w jąd ro w ego D N A , o trzym an ych przez łag od ną liżę jąd e r ko m órek, p o o ddy socjow aniu histo nów i większości białek niehistonow ych [11], In tegralność pętli zostaje zapew nio na przez ich z ak o t-wiczenie w m atrik s jądro w ej [1, 27, 28], skąd m o żna je uw olnić działaniem detergentów jon ow ych lub roztw orów 2 M N aC l i 5 M m o cznika [25, 30, 40], P o w o dują one degradację stru k tu ry m atriks, co sugeruje, że isto tną rolę w zakotw iczeniu pętli D N A od gryw ają w iązania w odorow e i jono w e.
O becnie przyjm uje się, że dom en y D N A są po d staw ow ą jed n o stk ą organizacji su p crstru k tu r D N A wyższego rzędu w ko m ó rce eukario tyczn ej. Są one obecne tak w ją d rz e intcrfazow ym , jak i w ch rom osom ach m etafazow ych [11, 28, 41],
Szereg danych p rzem aw ia za tym , że m iejsca zakotw iczenia pętli D N A w m atrik s nic są p rzy padko w e i zn ajd ują się w pobliżu fragm entó w D N A bo gatych w A T [27], a długość pętli D N A m iędzy dw om a m iejscami zakotw iczenia rów na się wielkości rep liko nu [4], W ybarw ienie brom kiem etydyny um ocow any ch w m atrik s pętli D N A daje w m ikrosk opie o b raz tzw. aureol (halo) o średnicy 13-15 /¿m [28, 32, 36, 39],
Ponieważ w b akteriofagach [20] i plazm id ach [15] replikacja D N A nie m oże być zain icjow ana, d o pó ki D N A nie ulegnie superskręceniu , sugerow ano przez analogię, że w k om ó rk ach eukario ty czn ych inicjacja replikacji w ym aga rów nież u tw orzenia superskręconej konfiguracji D N A [29], a wysoce z o r-ganizow ane stru k tury wyższego rzędu chro m aty n y m ogą brać udział w m ech a-nizm ach ko n trolo w an ia procesów transkry pcji, replikacji i reperacji D N A [21]. Liza ko m ó rek eu kario tyczny ch detergentam i niejonowym i w obecności wysokich stężeń soli (2 M N aC l) uw alnia stru k tu ry p o d o b ne do jąd e r, zw ane n ukleoidam i. N uk leo idy zaw ierają superskręcony D N A , R N A i n iektóre białk a niehistonow e, są n ato m iast całkow icie po zbaw ione h istonów i lipidów . S topień superskręcen ia D N A w nu kleoidzie m ożna obserw ow ać po dczas sedym entacji przy niskim g, w 153 0% ob ojętnym gradiencie gęstości sac h aro -zy, zaw ierającej 2 M N a C l [8, 9, 10]. W prow adzen ie kilku pęknięć do cząsteczki D N A p ow o duje w yk ryw alną u tratę ujemnej superspiralizacji heliksu i jego relaksację [13, 19, 23].
R elaksacja sup erskręconego D N A (generow anie wolniej sedym entujących nukleoidó w ) jest pierwszym etapem obserw ow anym po dczas reperacji D N A
w k o m órk ach ludzkich, n a k tó re d ziałan o próm ien iow aniem U V [10, 22, 42] lub M N N G [22, 23],
W pracy b ad an o wpływ subletaln ych daw ek p ro m ien iow an ia gam m a na organizację i stru k tu rę D N A w jąd rz e fib ro b lastó w ludzkich w p ow iązan iu ze zdolnością nap ro m ienio w any ch k om ó rek d o rep ro duk cji i przeżycia in d u k o -w anych uszkodzeń.
D o nap rom ien io w an ia stoso w ano daw ki od 0 do 10 G y prom ienio w ania gam m a, obejm ujące zakres daw ek biologicznych, k tó re k o m ó rk a m oże prze-żyć. H odow le k om ó rek napro m ien iow yw an o w m o now arstw ie, w tem p. od 0° d o 4°C , w lodzie, w który m ko m ó rk i były przechow yw ane d o m om en tu rozpoczęcia hodow li porad iacyjnej lub lizy. S tosow an ie niskiej tem peratu ry w trakcie i po nap rom ie nio w an iu jest niezwykle istotne ze względu na zah am o w anie procesów reperacyjnych D N A [14],
N iezależnie od stoso w anego stężenia początk ow eg o naprom ieniow an ych fibro blastów stw ierdzono znaczny spadek przeżyw ałności ko m ó rek po d aw -kach 6 i 8 G y (tab. 2, rys. 1). W yniki te są zgodne z rezu ltatam i innych bad ań, w których stw ierdzano bard zo niski procen t przeżywalności ko m órek eu k a rio -tycznych po daw k ach większych od 4 G y [6].
U szkodzenia D N A w zakresie daw ek stosow anych do przeżywalności k om ó rek oznaczan o m etod ą sedym entacji n ukleoid u w 15- 30% obo jętny m gradiencie gęstości sacharo zy. T ec hn ika ta uw ażana jest za jed n ą z najbardziej czułych m etod oznaczenia uszkodzenia i nap raw y D N A w kom órce [8, 19, 31], D N A k om ó rek nieuszkod zony ch znajduje się w konfiguracji superskręco- nej, p o siada stru k tu rę zw artą i sedym entuje szybko, p odczas gdy D N A k om órek uszkodzonych , na skutek obecnych w cząsteczce pojedynczych pęknięć, w ystępuje w konfiguracji zrelaksow anej i sedym entuje wolniej. S topień relaksacji zależny jest od ilości in du ko w any ch przez prom ieniow anie pojedynczych pęknięć w cząsteczce D N A . W p rz yp ad k u kolistego D N A p ro k ario n tó w i wirusów w prow ad zenie chociażby jed neg o pęknięcia do jego cząsteczki po w od uje rozplecenie nici D N A i zniszczenie su p erstru k tury heliksu. Induk cja po dw ó jnego pęknięcia p ro w ad zi d o całkow itej u traty kolistej stru k tu ry D N A i przejścia w stru k tu rę liniow ą. W o dró żn ien iu, W prowadzenie jedn eg o pojedynczego pęknięcia do jąd ro w eg o D N A eu k ario ntó w nie p ow o du -je -jeg o całkow itej relaksacji. W yn ik a to ze stru k tu ry genom u eukariotycznego, w którym D N A zo rganizow an y jest w do m en y różnej wielkości, w kom pleksie z b iałk am i i R N A . Z tego w zględu in du ko w an e przez prom ieniow anie pojedyncze pęknięcia nie pro w ad zą od razu do całkow itego zniszczenia superhelikalnej stru k tu ry D N A , gdyż w zależności od wielkości daw ki uszkadzan e są stop niow o kolejne dom eny. Z najduje to odbicie w szybkości sedym entacji D N A nu kleoidu. W zależności od wielkości dom en te sam e daw ki prom ieniow ania relak sują cząsteczkę D N A w różnym stopniu i p o w o-dują odm ienne zm iany w szybkości jeg o sedym entacji. Pozwala to, przy
zastosow an iu odpo w iednich ró w nań , obliczyć ilość pojedynczych pęknięć, koniecznych do osiągnięcia sta n u całkow itej relaksacji D N A genom u badanej ko m ó rki, a stąd wielkość do m en [19].
Podczas gdy D N A w zasadow ym grad iencie gęstości sacharo zy skład a się z sedym entujących niezależnie pojedynczych nici [7], nukleoid zb udo w an y jest z dużej ilości superhelikalnych pętli D N A , k tó re zachow u ją się po do bn ie do cząsteczek kolistego D N A obecność jedn eg o pojedynczego pęknięcia w pętli po w odu je całkow itą u tratę jej superspiralizacji i rozciągnięcie. P ow stają bardziej zrelaksow ane, luźniejsze stru k tu ry , k tó re w gradiencie gęstości sac ha-rozy sedym entują wolniej. P ozw ala to śledzić obecność pojedynczych pęknięć D N A w genom ie ko m órki na podstaw ie szybkości sedym entacji nukleoidu [10,
13], O becność kilku pojedynczych pęknięć w genom ie po w odu je w ykryw alną u tr atę ujem nej superspiralizacji D N A nu kleoidu. M etodę m o żn a stosow ać do w ykryw ania bardzo niskich poziom ó w uszkodzeń D N A ok. I S S B /2 x 10loD m asy D N A [3, 19], po dczas gdy m aksym alna ilość pojedynczych pęknięć D N A w ykryw alnych m etod ą w irow ania w zasadow ym gradiencie gęstości sacharozy wynosi 0,1-1 SSB/108D m asy D N A [7, 19],
S toso w ana w pracy m eto d a sedym entacji nukleoid u stanow i własne op raco w anie po do bn y ch m eto d z piśm iennictw a [10, 24, 37], Szybkość sedym entacji nukleoidu była niezależna od stężenia k om ó rek poniżej 1 x 106. Przy wyższych stężeniach ko m ó rki, w obecności płynu lizującego, wykazywały tendencję do agregacji, co po w od ow ało niepraw idłow ą sedym entację nu kleo-idu. O p ty m alna ilość k om ó rek stosow anych d o w irow ania w ynosiła 50-100 tys. D o pełnej lizy fib ro blastów najbardziej od pow iednie ok azało się 1% stężenie T rito n u X -100. W literatu rze opisyw ane jest stosow anie m niejszych stężeń T rito nu X -10 0 (0 ,1 -0 ,5% ) [8, 9, 10, 13, 21, 23, 31]. O kazały się one niew ystarczające dla całkow itej lizy fib ro blastów - przy tych stężeniach stw ierdzano po d m ikro sko pem niek om p letną lizę kom ó rek.
Tech nikę sedym entacji nu kleo id u sto sow an o w b ada niach dotyczących identyfikacji i napraw y pojedynczych pęknięć D N A , induk ow an ych przez p ro m ien iow an ie gam m a, prom ien iow an ie UV oraz m itom ycyny C w k o m ó r-kach H eL a [10], w leukocytach i fibro blastach osó b zdrow ych o raz osó b ch orych na Xeroderma pigm entosum [7, 10], w b ad an ia ch n ad wpływem inh ibitorów syntezy A D P -ryb ozy n a przebieg reperacji D N A w m ysich k o m ó rk ach łeukem icznych L j2io [13, 24], ja k rów nież do identyfikacji p ojedyn -czych pęknięć i ich nap raw y w k om ó rk ach śledziony i grasicy szczura [37], M eto dę stosow ano rów nież do w ykryw ania uszk odzeń D N A w ątro by szczura in vivo po działaniu k ancero genó w z g rup y aflatok sy n [19], zw iązków alkilujących M N U i M N N G [12, 31], 4N O Q [31], w b ad an iach , dotyczących wpływu in hibitorów reperacji D N A w naprom ienio w any ch prom ieniow aniem UV fibrob lastach ludzkich [7, 23] oraz wpływ u in hibito ró w topo izo m erazy lub polim erazy D N A n a reperację uszk odzeń D N A w napro m ien iow an ych k o m ó
kach now otw orow ych [21]. Tech nika o kaz ała się szczególnie p rzy d atn a do identyfikacji ad d u k tó w kan ccrogen ów , których działanie wpływa na des-tabilizację trzecio- i czw artorzędow ej stru k tu ry D N A i u tratę jeg o ujem nej sup erhelikalności [12]. C zułość m etody sedym entacji nu kleoidu przewyższa 20 30 razy czułość tradycyjnej m etody oznaczenia pojedynczych pęknięć D N A w zasadow ym gradien cie gęstości sach arozy [3, 13]. Jest rów nież bardziej czuła od elucji zasadowej: m etod a sedym entacji nuk leo idu m o żn a w ykryć obecność ok. 200-300 SS B/genom ko m ó rki, po dczas gdy za p om o cą elucji zasadowej ok. 500 SSB/genom [13, 14]. Lipetz i wsp. [19] określili p ró g w ykryw alności uszkodzeń D N A na 0,3 G y p ro m ieniow ania X w p rz yp ad k u sedym entacji nuk leoidu i 10 razy więcej (3 G y) w p rzyp adk u elucji zasadow ej. Yew i Joh n so n [42] zastosow ali w łasny w a rian t techniki sedym entacji nuk leoid u d o oznaczenia ilości pojedynczych pęknięć D N A , pow stałych w w yniku działania endo nu kleaz nacinających nici D N A w procesie nap raw y D N A i udow odnili, że rów noległe zastoso w anie d o tego sam ego celu m etod y elucji zasadow ej w ym aga zastoso w ania daw ek prom ien io w a nia UV o rząd wielkości większych od stosow anych w sedym entacji nu kleoidu. D urkacz i wsp. [13] określają czułość m etody na 1-5 G y prom ien io w ania gam m a w zależności od b ad an eg o m ateriału.
W przedstawionej pracy najniższą sto so w aną daw ką były 2 G y prom ienio -w ania gam m a. Znaczny stopień u traty ujem nej superhelikalno ści D N A po tej daw ce (ok. 30% ) sugeruje, że m ożliwe jest rów nież oznaczenie uszkodzeń D N A nu kleoidu fib ro blastów po daw k ach m niejszych. Ze względu na du żą w ydajność źród ła stoso w anego do napro m ien iow an ia k om ó rek nie było w tych w a ru n kach możliwe sto sow an ie m niejszych daw ek.
D użą zaletą m etody są jej w arunki - fizjologiczne pH i łago dna liza k om ó rek bezpośrednio n a pow ierzchni gradien tu gęstości sach aro zy, które pozw alają w yelim inować d o d atk o w e u szkodzenia, ja k np. in du ko w an e w labil- nych m iejscach ap ury now ych pojedyncze pęknięcia D N A w w aru nk ach wysokich ( > 12,5) w artości pH o raz um ożliw iają zachow anie natyw nej stru k -tu ry trzecio- i czw artorzędow ej D N A w ew nątrz ją d ra .
Czułość i p rzy datność m etod y zostają znacznie po dniesion e przez w prow a-dzenie technik fluorescencyjnych do identyfikacji D N A we frakcjach gradien tu gęstości sacharo zy [5, 19], Techniki fluorescencyjne poszerzają zakres stoso w a-nia m etody o b ad an ia populacji ko m órek nie dzielących się lub słabo dzielących się, który ch w y znakow anie jest b ard zo u tru d n io n e lub wręcz niemożliwe. W ym agają rów nież niewielkich ilości m ateriału do badań. U m oż-liwia to zastosow anie m eto dy d o b ad ań n iejed noro dnej populacji ko m órek o różnej długości cyklu kom órk ow eg o, co w przy p adk u ich znako w an ia rad ioizo top am i m oże p row adzić d o m ylnej in terpretacji w yników. Połączenie ob u technik jest szczególnie p rzyd atne do oznaczenia niskich poziom ów pojedynczych pęknięć D N A , aku m u low an ych w po pulacjach starzejących się
ko m órek in vivo ja k o jeden z efektów n atu ralneg o procesu starzenia się [19], Pęknięcia te są trud n e do w ykrycia innymi m etodam i.
W pracy do identyfikacji D N A używ ano flu oro chrom u 33258 H oech st stosow anego powszechnie w cytologicznych b ad an iach ch ro m o so m ó w [5, 1 1], S tw ierdzo no dużą czułość i specyficzność reakcji flu o ro ch ro m u z D N A oraz jeg o przyd atność do identyfikacji D N A we frakcjach g rad ien tu gęstości sacharozy. M eto da jest niezwykle p ro sta i szybka, gdyż nie wym aga d o d a t-kow ego przygotow ania i inkubacji próbek przed oznaczeniem . Czyni ją to ko nk ure ncy jną nie tylko dla m etod radioizo topo w ych, ale i w stosun ku do innych m etod fluorym etrycznych, stoso w anych do oznaczenia D N A we frak cjach gradien tów gęstości sacharo zy.
S uperhelikalno ść D N A fibro blastów oznaczan o na podstaw ie w zorca sedym entacji nukleoidu w obecności w zrastających stężeń b ro m ku etydyny. N atyw ny D N A kom órki eu kariotycznej znajduje się w kon form acji super- skręconej, k tó ra pow oduje, że podczas w irow ania w obo jętnym gradiencie gęstości sacharo zy nukleoid uw olniony w wyniku łagodnej lizy kom órek sedym entuje szybko. W irow an ie nu kleoid u w obecności w zrastających stężeń EB wywołuje, na skutek interk alacji b rom k u do cząsteczki D N A , rozluźnienie superskrętów pętli dom en D N A i w olniejszą sedym entację nukleoidu. Jest o na w ynikiem stopniow ej u traty ujem nej superspiralizacji heliksu i trw a do m o m en tu osiągnięcia m inim alnej w artości stałej sedym entacji, ch arak tery sty cz-nej dla całkow icie rozwiniętego D N A . Przy tej w artości cząsteczka nie zawiera skrętów superhelikalnych i znajd uje się w postaci zrelaksow anej. Przy dalszym zw iększeniu stężenia EB szybkość sedym entacji zaczyna w zrastać jest to po czątek zm iany superspiralizacji cząsteczki z ujemnej na d o datnią. W raz z dalszym w zrostem stężenia EB postępu je d o d atn ia su perspiralizacja D N A , w w yniku czego staje się on bardziej zw arty i sedym entuje szybciej. W ten charak tery sty czn y sposób sedym entuje tylko natyw ny, superhelikalny D N A . Im bardziej stru k tu ra D N A jest gęsta, o w ysokim stopn iu superhelikalności, tym więcej ujem nych sup erskrętów obecnych jest w superheliksie i do całkow itego ich usunięcia i rozwinięcia stru k tu ry D N A w ym agane są wyższe stężenia EB [11, 41], S ed ym entacja nu kleoidu k om ó rek nap ro m ien io w an ych i nienaprom ien iow anych w obecności różnych stężeń EB pozw ala oznaczyć stopień superhelikalności D N A in vivo, uzyskać inform acje o przestrzennej organizacji D N A w kom órce, oznaczyć ilościowo ind u ko w an e przez czynniki uszkadzające zm iany w trzecio- i czw artorzędow ej stru k tu rze D N A oraz określić wielkość do m en D N A .
Stw ierdzono charak tery sty czn y dla su perhelikalnego D N A dw ufazow y sp osó b sedym entacji, zależny o d stężenia EB (rys. 10, 11). Sugeruje to, że w zastosow anych w aru nk ach m etody, brom ek etydyny zm ienia stopień superspiralizacji D N A in situ, a sp osób sedym entacji nu kleoidu odzw ierciedla różne pozio m y organizacji su p e rstru k tu r D N A w genom ie kom órki.
W p o do b ny ch b ad an iach z piśm iennictw a m ożna sp o tk ać w artości od 2 do 5 /ig EB/m l ja k o od po w iadające p unk tow i rów now agi [9, 10, 19, 21, 31], różnice te m ogą w ynikać z wielkości do m en D N A w poszczególnych ro dzajach k om ó rek b ądź z różnic w stosow anych tech nikach w irow ania i lizy kom órek.
W ykazano znaczne zm iany w superhelikalnej stru k tu rze D N A w zakresie daw ek p rom ien iow ania sto sow an ych do oznaczenia przeżyw alności. N ajw ięk-sze zm iany zao bserw o w an o w przedziale 0 2 G y (30% u tra ta ujem nej superspiralizacji D N A ). Z n ac zna u tra ta ujem nej sup erhelikaln ości D N A po d aw k ach 2 i 4 G y , kiedy to rów nież znacznie ob niżał się p rocent przeżyw alno-ści k o m ó re k wskazuje, że zm iany w trzecio- i czw artorzędow ej stru k tu rze heliksu D N A (wyciągnięcie pętli D N A po d wpływem p rom ien iow ania) unie-m ożliw iają właściwe funk cjonow anie i replikację geno unie-m u, co w konsekwencji prow adzi do reprodukcyjnej śmierci ko m órki.
D u ża w rażliwość sup erhelikaln ych str u k tu r D N A na obecność po jedyn-czych pęknięć stanow i rów nież pod staw ę do op raco w an ia czułych m etod w ykryw ania niskich poziom ów uszkodzeń D N A i testow an ia m u tagennego wpływu różnych czynników środow iskow ych (prom ieniow anie, m utageny chem iczne) na D N A ko m ó rk i eukariotycznej.
6. B IB L IO G R A F IA
[1] B a r r a c k E. R., C o f f e y D. S., (1982), R ec ent. Prog. H orm . Res.. 38. 133. [2] B e n y a j a t i C. , W o r c e l A. (1976), C ell, 9. 393.
[3] B r a s h D. E., H a r t R. W. (1978), J. E n viron . P ath ol. T ox ico l., 2. 79.
[4] B u o n g i o r n o - N a r d e l l i M. . M i c h a l i G. , C a r r i M. T. , M a r i l l e y M. (1982), „ N a tu re ” , 298, 100.
[5] C e s a r o n e C. F., B o l o g n e s i C. , S a n t i L. (1979). A n alyt. B iochem ., 100, 188. [6] C h a d w i c k K. H., L e e n h o u t s H. P. (1973), Phys. M ed Biol., 18. 78.
[7] C h a r l e s W. C. , C l e a v e r J. E. (1982), B iochim . B iophys. Res. C o m m u n ., 107. 250. [8] C o o k P. R , B r a z e l l J. A. (1975), J. Cell Sei., 19, 261.
[9] C o o k P. R „ B r a z e l l J. A. (1976), E xp. Cell' R es., 103, 341. [10] C o o k P. R „ B r a z e l l J. A. (1976), „ N a tu re ” , 263, 679.
[11] D a r n e 11 J., L o d i s h H ., B a 11 i m o r e D . (1986), M o le cu la r C ell B iology, (Sei. A m . Inc.). [12] D r i n k w a t e r N. R „ M i l l e r J. A. , M i l l e r E. C. , Y a n g N . C . (1978), C a n c e r R es., 38,
3247.
[13] D u r k a c z B., I r w i n J., S h a l l S. (1981), E ur. J. B iochem .. 121, 65.
[14] F r e i d b e r g E. A., H a n a w a l t P. E. (1983), DNA Repair: A Laboratory Mannual o f Research Procedures, M. D e ker, (red .). N ew Y ork , 60 65.
[15] G e l i e r t M ., O ’ D e a M . H „ 11 o h T „ T o m i z a w a J. (1976), P roc. N atl. A cad. Sei. U SA. 73, 4474.
[16] J e n s e n H. R „ L e a r y J. F. (1990), Flow C y to m e try an d So rtin g, (W iley-L iss, Inc) New Y o rk , 553.
[17] L e h m a n A. R., O r m e r o d M . G . (1970). B iochim . B iophys. A c ta, 204, 128. [18] L i n d a h l T . (1982), A n n. Rev. B iochem ., 51, 61.
[19] L i p e t z P. D ., B r a s h D . E ., J o s e p h L. B., J e w e 11 H. D. , L i s l e D. R. , L a n t r y L. E., H a r t R. W. , S t e p h e n s R. E. (1982), A nalyt. B iochem ., 121, 339.
[20] L o v e t t M. A. , S p a r k s R. B„ H e l i n s k i D. R. (1975), Proc. N a tl. A cad . Sei. U SA , 72, 2905.
[21] M a t t e m M. R. , P a i n t e r R. B. (1979), Biochim . Biophys. A c ta., 563, 293. [22] M a t t e m M. R. , S c u d i e r o D. A. j( 1981), B iochim . Biophys. A c ta , 653, 248. [23] M a t t e m M. R., P a o n e R. F ., D a y R. S. (1982), B iochim . B iophys. A cta, 687, 6. [24] M a t t e m M. R. , Z w e i l i n g L. A. , K e r r i g a n D. , K o h n K. W. (1983), B iochem . B iophys. Res. C o m m u n ., 112, 1077. [25] M u l l e n d e r s L. H. F., v a n K e s t e r n A. C. , B u s s m a n C. J. M. , v a n Z e e l a n d A. A. , N a t a r a j a n A. T . (1984), M u ta t. R es., 141, 75. [26] N a k a n e N . , I d e T . , A h z a i K . , O h a r a S . , A n d o h T . (1978), J. B iochem . [Tokyo], 84, 145. [27] N e l s o n W. G. , P i e n t a K . J . , B a r r a c k E. R., C o f f e y D . S. (1986), A n n. Rev. B iophys. C he m ., 15, 457.
[28] P i e n t a K. J „ C o f f e y D. S. (1984), J. C ell Sei., Sup pl., 1, 123. [29] P o v i r k L. F. , P a i n t e r . R. B. (1976), Biochim . Biophys. A c ta , 432, 267.
[30] R a z i n S. V. , C h e r n o k h v o s t o r V . V., Y a r o v a y a O. V. , G e o r g i e v G . P. (1985),
P rogress in N onhistone Protein R esearch, J. B ek hor (red .), C R C Press In c., B oca R a to n , New
Y o rk , vol. II, 92.
[31] R o m a g n a F. , K u l k a m i S. M. , A n d e r s o n M . W. (1985), Biochem . Biophys. Res. C o m m u n ., 127, 56.
[32] R o t i R o t i J. L. , W r i g h t W . D . (1987), „ C y to m e try ” , 8, 461. [33] S a w i c k i F. (1982), E le m en ty s ta ty s ty k i dla lek ar zy. W ars zaw a, 126. [34] S i n g e r B., K u s m i e r e k J. T . (1982), A nn . Rev. B iochem ., 52, 655.
[35] S z o s t a k J., O r r - W e a v e r T. L. , R o t h s t e i n R. J., S t a h l F. W. (1983), Cell, 33, 25. [36] T a y 1 o r Y. C ., D u n c a n P. G ., Z h a n g X ., W r i g h t W. D. (1991), In t. J. R a d ia t. Biol.,
59, 359.
[37] T e m p e l K. (1985), Z bl. Vet. M e d., 32, 123.
[38] V a n d e r V e l d e n H. M. W. , W a n k a F . (1981), M ol. Biol. R ep., 12, 69. [39] V o g e l s t e i n B„ P a r d o l l D. M. , C o f f e y D. S. (1980), Cell, 22, 79.
[40] W a n k a F. , P i e c k A. C. M. , B e k e r s A. G. M. , M u l l e n d e r s L. H. F. (1982), The
N uclear E nvelope a nd The N uclear M a tr ix , G . G . M au l (red.), A la n R ., L iss Inc., N ew Y o rk ,
199.
[41] W a t s o n J. D „ H o p k i n s N. H „ R o b e r t s J. W „ S t e i t z J . A., W e i n e r A. M . (1987),
M olecular B iology o f gene, J. R . G ille n (red .), B enjam in /C om m ing s Pu bl. C om p . In c., M enlo
P a rk , C a liforn ia , 254-255.
[42] Y e w E. F. H ., J o h n s o n R. T. (1979), Biochem . B iophys. A cta , 262, 240.
W p łynęło d o R edak cji K a te d ra Biofizyki
„ F o lia biochim ic a et b io ph ys ica ” U niw ers ytetu Ł ó dz kiego
24.07.1991
A n eta K oceva-C hyla
E F F E C T O F S U B L E T H A L D O SE S O F G A M M A R A D IA T IO N O N D N A S U P E R H E L IC IT Y A N D S U R V IV A L O F H U M A N F IB R O B L A S T S
E ffec t o f su ble tha l doses o f g am m a ra d ia tio n on cell surviv al a n d D N A su pe rhe licity in h u m a n fib ro bla sts w as stu died.
C ell surviv al was es tim a te d on th e ba sis o f c lona l g ro w th o f irra d iate d fib rob la s ts in m o no la y e r c u ltu re in vitro.
T he nucleoid se d im e nta tio n tec hn iq ue was used to stu dy ioniz ing ra d ia tio n-in d uc e d D N A d a m a ge in vivo as well a s to ex am ine D N A supe rhelicity.
In cre ase d c o n ce n tra tio n s o f e thidium b rom ide (E B ) w ere used to titra te th e D N A su perc oilin g re sponse in n o n -irrad ia te d cells. T his res pon se c on siste d o f a relax atio n ph ase (1 -5 fig/m l EB) a nd rew indin g pha se (5 -20 n g/rnl EB). O b serv ed biphas ic d ep en de nc e o f s e dim e n ta tio n d istan c e o f nucle oid on th e c on c e n tra tio n o f EB suggests th a t the dye alte red the a m o u n t o f D N A su percoiling
in situ.
T he degree o f D N A su pe rco ilin g an d th us the se d im e nta tio n ra te o f nuc leoid in abs ence o f EB w as very sensitive to s tra nd b re a k s in duced in D N A by th e do ses o f g am m a ra d ia tio n em ployed in th e cell survival as say. D oses o f 2 8 G y o f g am m a ra d ia tio n in duce d a d ose d e p en d e nt re d uctio n in the s e dim en tation o f nucle oid. L oss o f ne gative D N A su p erc oiling w as in itially ra pid (a b ou t 30 % a fte r th e do se o f 2 G y ) a nd the n p roc eed ed a t a slo w er rate (a b o u t 35% a nd 48 % a fte r the dos es o f 4 G y an d 8 G y respectively), in dic atin g a significa nt re lax a tio n o f nucleo id s tru c tu re a t the dos es o f g am m a ra d ia tio n g re a ter th a n 4 G y , a t w hich als o a significa nt de creas e in fib ro bla sts survival oc curred .
Significa nt loss o f negative D N A su pe rco ilin g w ithin the ra n g e o f do se s o f ga m m a ra d ia tion re sultin g in signific ant d ecre ase o f cell surviv al suggests th a t d es ta biliz in g effect o f ra d ia tio n o n D N A te rtiary- a n d q u a te rn a ry stru c tu res (extensive D N A bre ak s an d re la xa tion o f nucleoid su perh elicity) d is tu rb n o rm al fu n ctio n s a n d re p lic a tio n s o f ge nom ic D N A , in c onse qu cnc e leading to a re p rod uc tive d e ath o f cells.
C o ns id erin g the sen sitivity a nd sim plicity o f the m e tho d , th e nu cleo id s ed im e n ta tion te chn iqu e m igh t be a lso a useful tool in th e m on ito rin g o f D N A lesions indu ce d by e n v iro n m e n ta l m uta ge ns in a va riety tissues a nd cell types.