Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1261
Praca oryginalna Original paper
Parwowiroza psów jest ostr¹ zakan¹ chorob¹, prze-biegaj¹c¹ wród objawów biegunki i wymiotów wy-wo³anych ró¿nymi stanami zapalenia b³ony luzowej jelit. U szczeni¹t zaka¿enie mo¿e przebiegaæ pod po-staci¹ myocarditis acuta (15, 18, 26). Choroba wywo-³ana jest przez parwowirus psi typu 2 (Canine parvo-virus 2, CPV-2), zaliczany do rodziny Parvoviridae, w obrêbie której znajduje siê m.in. wirus panleukope-nii kotów (FPV), wirus zapalenia jelit norek (MEV), wirus choroby aleuckiej norek oraz parwowirus szo-pów (ADV) (15, 26). Wirus ten posiada dwa biotypy antygenowe, okrelane jako CPV-2a i CPV-2b, wród których znajduje siê wiele wariantów. W otoczce gli-koproteinowej parwowirusa umiejscowione s¹ dwa bia³ka strukturalne VP-1 i VP-2 determinuj¹ce powsta-wanie odpornoci swoistej (20). Zaka¿enie CPV-2 najczêciej przenosi siê drog¹ pokarmow¹ przez ka³ lub karmê zanieczyszczon¹ ka³em od chorych zwie-rz¹t. Na zaka¿enie wra¿liwe s¹ psy w ka¿dym wieku, ale choroba najczêciej wystêpuje u szczeni¹t i m³o-dych psów do 3. miesi¹ca ¿ycia (3, 4, 8, 10, 18).
Aktualna sytuacja epidemiologiczna w Polsce wska-zuje na rozprzestrzenienie siê CPV-2 w populacji psów. W zwi¹zku z tym stosowana jest immunoprofilaktyka
swoista za pomoc¹ ¿ywych atenuowanych lub inakty-wowanych szczepionek przeciwko parwowirozie (4, 9, 12, 14).
Na podstawie licznych obserwacji klinicznych i ba-dañ laboratoryjnych mo¿na stwierdziæ, ¿e pomimo prowadzonych masowych szczepieñ, pojawiaj¹ siê zachorowania i padniêcia m³odych psów z powodu tej choroby (2, 3, 11, 19, 23). Odpowied immunologicz-na po zaszczepieniu szczeni¹t jest procesem z³o¿onym i zale¿y m.in. stanu zdrowia zwierzêcia oraz rodzaju zastosowanej szczepionki. Równoczenie nale¿y mieæ na uwadze nierzadko wystêpuj¹ce pierwotne lub na-byte niedobory immunologiczne psów (11, 24). Istot-nym elementem w niepowodzeniach szczepieñ s¹ tak-¿e wystêpuj¹ce ró¿nice antygenowe miêdzy szczepa-mi CPV-2 u¿ytyszczepa-mi do produkcji szczepionek a szcze-pami terenowymi wirusa kr¹¿¹cymi w rodowisku zaka¿onych zwierz¹t (1, 5, 7, 12).
Celem badañ by³o okrelenie czêstotliwoci wystê-powania przeciwcia³ CPV-2 oraz przeledzenie dyna-miki odpornoci humoralnej u psów z terenu Trójmias-ta. Ponadto dokonano analizy zmiennoci regionu genu VP-2 u szczepów CPV-2 wystêpuj¹cych w materiale biologicznym pochodz¹cym od chorych psów.
Badania serologiczne i molekularne psów
uodpornionych przeciw parwowirozie
ANDRZEJ SALWA, ANTONI KOPCZEWSKI, KRYSTYNA WOLAÑCZYK-RUTKOWIAK
Zak³ad Higieny Weterynaryjnej, ul. Kaprów 10, 80-316 Gdañsk
Salwa A., Kopczewski A., Wolañczyk-Rutkowiak K.
Serologic and molecular examination of dogs vaccinated against parvovirosis
Summary
The aim of the study was to conduct serological examinations for the presence of humoral antibodies against CPV-2, using an ELISA test. Moreover, amplification and restriction analysis (PCR-RFLP) of the fragment at 1278 bp (VP-2 gene) strains of CPV-2 biological materials of dogs with diarrhea were performed. The studies were carried out on 377 urban dogs aged from 3 months 17 years. All animals were vaccinated with commer-cially available live or inactivated vaccines against canine parvovirosis at 8, 12, 16 weeks of age. Most of the dogs were revaccinated yearly. Serological examinations determined that most of the dogs had antibodies against CPV-2 (98%) at 2-3-years-of-age. The least seropositive dogs were below 5 months (89%) and above 10 years (85%). The highest mean titer CPV-2 virus antibody were found between 0.5 1 year. 95% animals with diarrhea were positive for canine parvovirosis by use of PCR. Moreover, the RFLP analysis of the VP-2 gene sequence enabled the distinction of 3 restriction patterns of CPV-2 circulating in the dog population.
The study indicates the vaccination of dogs provides effective protection against canine parvovirosis infection. The occasional occurrence of CPV-2 in puppies and young dogs can indicate the presence of virulent strains of CPV-2 in the dog population.
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1262
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono w latach 2002-2005 u psów ró¿nych ras w wieku od 3 miesiêcy do 17 lat, pochodz¹-cych z terenu aglomeracji Trójmiasta. Wszystkie te zwie-rzêta by³y najczêciej uodporniane trzykrotnie w 8., 12., 16. tygodniu ¿ycia ró¿nymi zagranicznymi lub krajowymi mono- lub poliwalentnymi szczepionkami ¿ywymi lub in-aktywowanymi przeciwko parwowirozie w ramach pro-filaktyki swoistej schorzeñ wirusowych, bakteryjnych uk³adu oddechowego i przewodu pokarmowego psów (Van-guard, Nobivac, Duramune, Canivac). Wiêkszoæ szczepio-nych psów doros³ych by³a doszczepiana corocznie przez kilka lat. Materia³ do badañ stanowi³o 377 próbek surowi-cy krwi oraz 74 próbki ka³u lub wymazów z odbytu, po-chodz¹ce od psów, u których wyst¹pi³a biegunka wskazu-j¹ca na parwowirozê.
Badania serologiczne psów wykonywano na obecnoæ przeciwcia³ swoistych dla wirusa CPV-2 testem ELISA Ab (firmy Ingenasa). Na podstawie uzyskanych wartoci eks-tynkcji (OD) badanej próbki obliczano miano przeciwcia³ w surowicy. Zgodnie z zaleceniami producenta testu, wy-nik uznawano za dodatni, je¿eli miano przeciwcia³ badanej próbki by³o wy¿sze od wartoci progowej 100. Izolacjê wirusowego DNA do reakcji PCR z badanych próbek ka³u lub wymazów wykonywano przy zastosowaniu miniko-lumn, zgodnie z instrukcj¹ producenta (firma A&A Bio-technology, Gdañsk). Amplifikacjê wybranego fragmentu genu VP-2 CPV-2, przeprowadzano z
wykorzys-taniem dwóch starterów komplementarnych do 5 i 3 genu VP-2 o nastêpuj¹cych sekwencjach: P1 5CTACTCAGCCACCAACTAAAG 3 i P2 5 ATTTTCTAGGTGTAGTTGAGA 3 (firma Genomed Biotechnologies, USA) (7). Reakcjê PCR przeprowadzono w termocyklerze (firmy Perkin-Elmer 2400) w objêtoci 20 µl. Przed am-plifikacj¹ optymalizowano warunki wykonania reakcji PCR pod k¹tem doboru w³aciwej tempe-ratury przy³¹czania starterów. Profil temperatu-rowo-czasowy reakcji: wstêpna denaturacja (94°C/2 min.), po czym 30 cykli obejmuj¹cych: denaturacjê (93°C/1 min.), przy³¹czanie starte-rów (58°C/1 min.), wyd³u¿anie (72°C/2 min.), koñcowe wyd³u¿anie (72°C/10 min.). Produk-ty reakcji PCR wykrywano za pomoc¹ elektrofo-rezy w 2% ¿elu agarozowym z dodatkiem brom-ku etydyny. Jako wzorca masy molebrom-kularnej DNA
u¿ywano MI (puC19/MSpl) (firmy DNA Gdañsk). Kon-trolê stanowi³o DNA izolowane ze szczepu standardowe-go CPV-2, otrzymanestandardowe-go z Zak³adu Chorób Zwierz¹t Miê-so¿ernych i Futerkowych Pañstwowego Instytutu Wete-rynaryjnego w Pu³awach. Nastêpnie po wyizolowaniu produktów PCR z ¿elu agarozowego trawiono je dwoma endonukleazami restrykcyjnymi: Alu I i Rsa I. Produkty reakcji trawienia wraz z 0,25% roztworem b³êkitu bromofe-nolowego nanoszono na 12% ¿el akrylamidowy i prowa-dzono elektroforezê przez 4 godz. w buforze TAE o pH 8,1. Wielkoæ uzyskanych fragmentów DNA porównywano do wzorca masy molekularnej. Po elektroforezie zarówno ¿el agarozowy, jak i poliakrylamidowy fotografowano w wiet-le lampy UV transiluminatora (firma Fotodyne).
Wyniki i omówienie
Wyniki badañ przedstawiono na ryc. 1-4. Badanie w kierunku obecnoci przeciwcia³ swoistych dla CPV-2 w surowicy krwi psów wykaza³o ich zró¿nicowany poziom pod wzglêdem ilociowym (ryc. 1). Najwiê-cej zwierz¹t posiadaj¹cych przeciwcia³a w surowicy by³o w wieku 2-3 lat (98%). Ten wysoki odsetek uod-pornionych zwierz¹t utrzymywa³ siê u osobników wie-ku 5-6 lat, a nastêpnie ulega³ stopniowemu obni¿eniu. Najmniej seropozytywnych zwierz¹t stwierdzono w wieku do 5. miesi¹ca ¿ycia (89%) oraz 10 lat i star-szych (85%). Najwy¿sze rednie miana przeciwcia³ (2736) zanotowano u psów w wieku od 6 miesiêcy do 1 roku, najni¿sze za w wieku 10 lat i wy¿szym (331). rednie miano przeciwcia³ u m³odych psów stopnio-wo obni¿a³o siê i ponownie wzrasta³o w wieku 8-9 lat. Analiza wartoci miana przeciwcia³ wykaza³a, ¿e najwiêcej psów posiada³o miana w zakresie od 100 do 500 (36,1%) oraz od 2000 do 3000 (21,4%) (ryc. 2). Stwierdzono 7,1% zwierz¹t z mianem poni¿ej war-toci 100, uznanej za wynik ujemny. Przedstawione wyniki badañ stanowi³y potwierdzenie spostrze¿eñ Böhma i wsp. (2), którzy badali odpornoæ humoraln¹ dla CPV-2 u psów w Anglii. redni odsetek zwierz¹t z przeciwcia³ami w surowicy krwi wynosi³ 95,0%. Autorzy ci najwy¿sze miana serologiczne obserwowali
2500 2000 1500 1000 500 0 miano ELISA 100 98 96 94 92 90 88 86 84 0,5 0,5-1 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 >10 seropozytywne (%) wiek psów (lata)
odsetek psów seropozytywnych œrednie miano przeciwcia³ Ryc. 1. Czêstotliwoæ wystêpowania przeciwcia³ dla CPV-2 w surowicy psów 0-100 100-500 500-1000 1000-2000 2000-3000 >3000 miano ELISA 40 35 30 25 20 15 10 5 0 odsetek
Ryc. 2. Odsetek psów posiadaj¹cy w surowicy krwi okrelone wartoci przeciwcia³ dla CPV-2
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1263
u psów w wieku 5-6 lat. Z kolei Olson i wsp. (16) wykaza³y, ¿e w populacji szczepionych psów w Szwe-cji tylko 86,7% zwierz¹t posiada³o odpornoæ humo-raln¹.
Jak wiadomo, zasadnicz¹ rolê w kszta³towaniu siê odpornoci przeciwko CPV-2 odgrywa rodzaj i spo-sób podania szczepionki. Wed³ug Truyena (26), obec-nie stosowane monowalentne szczepionki, uzyskane drog¹ in¿ynierii genetycznej, pozwalaj¹ na uzyskanie trwa³ej wieloletniej odpornoci. Przy stosowaniu szcze-pionek u m³odych psów nale¿y mieæ na uwadze wy-stêpowanie przeciwcia³ pochodzenia matczynego, które mog¹ hamowaæ wytworzenie siê prawid³owej odpornoci przeciwwirusowej (17). Zdaniem niektó-rych autorów, kontrowersyjna jest potrzeba rewakcy-nacji u psów doros³ych, poniewa¿ po jednokrotnym uodpornieniu monowalentn¹ atenuowan¹ szczepion-k¹, odpowied humoralna i komórkowa utrzymuje siê przez ca³e ¿ycie (3, 24). Poza tym przy wielokrotnym stosowaniu ¿ywych szczepionek nale¿y siê liczyæ z wy-st¹pieniem odczynu anafilaktycznego oraz anemii he-molitycznej (nadwra¿liwoæ typu I i II) (14, 18, 25).
Wyniki badañ nad nosówk¹ i parwowiro-z¹ u rewakcynowanych psów, jakie uzys-ka³ McCaw i wsp. (12) wskazuj¹, ¿e celo-we jest coroczne doszczepianie psów. Wiêkszoæ producentów szczepionek w swoich programach szczepieñ uznaje uodparnianie ka¿dego roku za konieczne. Du¿e znaczenie przy ocenie dynamiki kszta³towania siê odpornoci u psów, ma stymulacja uk³adu immunologicznego wystêpuj¹cymi w rodowisku zwierz¹t szczepami dzikimi CPV-2 (3, 18). Stwier-dzenie w badaniach w³asnych znamienne-go obni¿enia redniej wartoci mian prze-ciwcia³ u psów dopiero w wieku 9 i wiê-cej lat, przy rzadko obserwowanych kli-nicznych przypadkach parwowirozy mo¿e wskazywaæ na wystarczaj¹ce zabezpiecze-nie psów przed zachorowaniami.
Badania molekularne przy u¿yciu tech-niki PCR wykaza³y u 9,5% psów z obja-wami biegunki obecnoæ wirusowego DNA CPV-2. Dodatnie wyniki PCR uzys-kano od psów w wieku od 6 miesiêcy do 2. roku ¿ycia. Produkty amplifikacji DNA szczepu wzorcowego CPV-2 oraz bada-nych próbek by³y identyczne i mia³y wiel-koci 1278 pz. Po trawieniu uzyskanych produktów amplifikacji enzymem restryk-cyjnym RsaI uzyskano 6 fragmentów DNA. Analiza porównawcza szczepu wzorcowego i badanych próbek DNA wy-kaza³a 4 odmienne wzory restrykcyjne (ryc. 3 i 4). Stwierdzono, ¿e wzór restryk-cyjny szczepu wzorcowego CPV-2 nie-znacznie ró¿ni³ siê od wzoru próbki nr 5. Ró¿nica ta dotyczy³a przesuniêcia siê fragmentu F. Z kolei próbki DNA nr 2, 3 i 6 od chorych psów by³y podobne i charakteryzowa³y siê wystêpowaniem do-datkowego fragmentu B1 o wielkoci oko³o 300 pz. Natomiast wzory restrykcyjne DNA próbek 4, 7 i 8 ró¿ni³y siê od pozosta³ych próbek brakiem fragmentu D. Uzyskane wyniki analizy restrykcyjnej pozwalaj¹ s¹dziæ, ¿e amplifikowane szczepy nale¿¹ do ró¿nych biotypów antygenowych parwowirusa (19). Analogicz-ne wyniki uzyskano przy trawieniu restryktaz¹ Alu I. Ciêcie tym enzymem produktu PCR da³o 5 fragmen-tów o ³¹cznej wielkoci oko³o 1270 pz. Wzór szczepu wzorcowego ró¿ni³ siê od wzorów restrykcyjnych po-zosta³ych 6 próbek. Ustalono, ¿e próbki 2, 3 i 6 mia³y identyczny profil u³o¿enia fragmentów DNA i ró¿ni³y siê od pozosta³ych próbek wystêpowaniem fragmentu B1 oraz brakiem fragmentu C. Natomiast analiza DNA próbek 4,7 i 8 wykaza³a pojawienie siê dodatkowego fragmentu D1.
Przedstawione dane s¹ zbie¿ne z wynikami otrzy-manymi przez innych autorów (5, 7, 13, 19, 21). Zwra-ca siê w nich uwagê m.in. na du¿¹ zmiennoæ genoty-Ryc. 4. Wzory restrykcyjne produktu PCR fragmentu genu VP-2 CPV-2 po
trawieniu enzymem restrykcyjnym Alu I. cie¿ki przedstawiaj¹: M wzo-rzec molekularny, 1 DNA szczepu wzorcowego CPV-2, 2-8 DNA wiruso-we izolowane od chorych psów. Z prawiruso-wej strony zdjêcia przedstawiono wiel-koci wzorca DNA, z lewej oznaczenia fragmentów trawionego produktu PCR
Ryc. 3. Wzory restrykcyjne produktu PCR fragmentu genu VP-2 CPV-2 po trawieniu enzymem restrykcyjnym Rsa I. cie¿ki przedstawiaj¹: M wzo-rzec molekularny, 1 DNA szczepu wzorcowego CPV-2, 2-8 DNA wiruso-we izolowane od chorych psów. Z prawiruso-wej strony zdjêcia przedstawiono wiel-koci wzorca DNA, z lewej oznaczenia fragmentów trawionego produktu PCR
Medycyna Wet. 2006, 62 (11) 1264
pow¹ i fenotypow¹ CPV-2 oraz na fakt, ¿e wyst¹pie-nie klinicznej postaci choroby mo¿e mieæ cis³y zwi¹-zek z okrelonym biotypem antygenowym wirusa. Carmichel (3) stwierdzi³, ¿e np. pojawiaj¹ce siê nowe szczepy wirusa wywo³uj¹ objawy chorobowe o prze-biegu nadostrym, zwykle koñcz¹ce siê zejciem mier-telnym. Badania Greenwooda i wsp. (5) nad izolatami terenowymi CPV-2 wykaza³y, ¿e mimo wystêpowa-nia trzech wariantów wirusa, stosowane szczepionki skutecznie chroni³y przed zachorowaniami. Na podo-bieñstwo miêdzy szczepami izolowanymi od psów i wilków na terenie W³och zwraca uwagê Battiliani i wsp. (1), którzy wykazali, ¿e zwierzêta dzikie mog¹ byæ rezerwuarem tego wirusa. Z kolei w Polsce Rypu-³a i wsp. (21), stosuj¹c metodê sekwencjonowania kwa-sów nukleinowych, stwierdzili, ¿e homologia pomiê-dzy nukleotydami konserwatywnego regionu genów VP1 i VP2 szczepów CPV-2 izolowanych z terenu Wroc³awia wynosi³a 88%. Du¿e znaczenie w rozprzes-trzenianiu CPV-2 odgrywa aktualna sytuacja epidemio-logiczna w danym rodowisku. Praktycznie do zaka-¿enia najczêciej dochodzi w hodowlach psów przy równoczesnym nieprzestrzeganiu podstawowych za-sad sanitarno-higienicznych (6, 8, 11, 12). Rozprze-strzenianiu zaka¿eñ CPV-1 sprzyja tak¿e zakup i trans-port zwierz¹t o nieznanym statusie immunologicznym. Reasumuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e stosowane szcze-pienia psów przeciwko parwowirozie stwarzaj¹ szan-se skutecznego zabezpieczenia przed zachorowania-mi. Sporadyczne przypadki parwowirozy u szczeni¹t i m³odych psów mog¹ byæ zwi¹zane z brakiem odpor-noci na zaka¿enie dzikimi szczepami CPV-2 wystê-puj¹cymi w rodowisku zwierz¹t.
Pismiennictwo
1.Battiliani M.,Ciulli S., Tisato E., Prosperi S.: Genetic analysis of canine pa-rvovirus isolates (CPV-2) from dogs in Italy. Virus Res. 2002, 26, 149-157. 2.Böhm M., Thompson H., Weir A., Hasted A. M., Maxwell N. S., Herrtage M. E.: Serum antibody titres to canine parvovirus, adenovirus and distemper virus in dogs in the UK which had not been vaccinated for at least three years. Vet. Rec. 2004, 154, 457-463.
3.Carmichel L. E.: Canine viral vaccines at a turning point a personal per-spective. Adv. Vet. Med. 1999, 41, 289-307.
4.Górski J., Górska Cz., Arciuch B., Arciuch H.: Etiologia i rozpoznawanie parwowirusowej choroby psów. Medycyna Wet. 1983, 39, 710-714. 5.Greenwood N. M., Chalmers W. S. K., Baxendale W., Thomson H.:
Compari-son of isolates of canine parvovirus by restriction enzyme analysis and vacci-ne efficacy against field strains. Vet. Rec. 1995, 136, 63-67.
6.Hepper P. G.: Prevalence of disease in dogs purchased from an animal rescue shelter. Vet. Rec. 1999, 144, 35-38.
7.Hirasawa T., Yono K., Mikazuki K.: Differentiation of wild and vaccine type canine parvoviruses by PCR and restriction enzyme analysis. J. Vet. Med. B 1995, 42, 601-610.
8.Hu³as C.: Próby izolacji i identyfikacji czynnika wywo³uj¹cego enzootycz-nie wystêpuj¹ce zachorowania psów obejmuj¹ce zaburzenia przewodu po-karmowego. Praca dokt. SGGW, Warszawa 1985.
9.Hu³as C., Anusz K., Leniewski S. F., Dobrzyñski A.: Szybka diagnostyka zaka¿eñ wirusem CPV-2 u psów. Medycyna Wet. 1996, 52, 175-179. 10.Kopczewski A.: Immunoprofilaktyka chorób zakanych psów i kotów oraz
zwierz¹t futerkowych. Lek w Polsce 1995, 1, 17-28.
11.Lund E. M., Armstrong P. J., Kirk C. A., Kolar L. M., Klausner J. S.: Health status and population charactrictics of dogs and cats examined at private veterinatry practices in the United States. J. Am. Vet. Assoc. 1999, 214, 1336--1341.
12.McCaw D. L., Thompson M., Tate D., Bonderer A., Chen Y. J.: Serum distemper virus and parvovirus antibody titers among dogs brought to a vete-rinary hospital for revaccination. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998, 213, 72-75. 12.Mizak B., P³ucienniczak A.: Antigenic typing Polish isolates of caninie
parvovirus. Bull. vet. Inst. Pu³awy 1995, 39, 71-76.
13.Mizak B., Rze¿utka A.: Application of nested PCR for the detection of canine parvovirus in faces. Bull. vet. Inst. Pu³awy 1999, 43, 19-24.
14.Mouzin D. E., Lorenzen M. J., Haworth J. D., King V. L.: Duration of sero-logic response to five viral antigens in dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2004, 224, 55-60.
15.Murphy F. A., Gibbs E. P. J., Horzinek M. C., Studdert M. J.: Veterinary Virology. Academic Press, New York 1999, s. 343-356.
16.Olson P., Hedhammar A., Klingeborn B.: Canine parvovirus infection, canine distemper and infectious canine hepatitis: inclination to vaccinate and antibody response in the Swedish dog population. Acta Vet. Scand. 1996, 37, 433-443.
17.Pollock R. V. H., Carmichael L. E.: Maternally derived immunity to canine parvovirus infection: transfer decline and interference with vaccination. J. Am. Med. Assoc. 1982, 180, 37-39.
18.Pollock R. V. H., Coyone M. J.: Canine parvovirus. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 1993, 23, 555-569.
19.Pratelli A., Cavalli A., Martella V., Tempesta M., Decaro N., Carmichel L. E.: Canine parvovirus (CPV) vaccination: comparison of neutra lizing antibody responses in pups after inoculation with CPV-2 or CPV-2b modified live virus vaccine. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001, 8, 612-615.
20.Rhode S. L.: Nucleotide sequence of the coat protein gene of canine parvo-virus. J. Virol. 1985, 54, 630-633.
21.Rypu³a K., Chmielewski R., mielewska-£o E., Klimentowski S.: Phylo-genic similarity of the canine parvovorus wild-type isolates on the basis of VP1/VP2 gene fragment sequence analysis. J. Vet. Med. B 2002, B, 49, 142--145.
22.Smith C. A.: Current concepts: Are we vaccinating too much? J. Am. Vet. Med. Assoc. 1995, 207, 421-425.
23.Smith J. R., Johnson R. H.: Observations on the use of an inactivated canine parvovirus vaccine. Vet. Rec. 1986, 118, 385-387.
24.Toman M., Svoboda M., Rybnicek J., Krejci J., Svobodova V.: Secondary immunodeficiency in dogs with enteric, dermatologic, infectious or parasitic diseases. Zentbl. Vetmed. B 1998, 45, 321-334.
25.Trutwein G., Hewicker-Trautwein M.: Immuno pathogenesis of virus diseases of cats and dogs. Tierärztl. Prax. 1994, 22, 63-72.
26.Tryen U.: Canine parvovirus. [w:] Carmichael L: Recent Advances in Cani-ne Infectious CaniCani-ne Parvovirus Diseases. International Veterinary Informa-tion Service, Ithaca, New York, s. 247-257.
Adres autora: doc. dr hab. Andrzej Salwa, ul. Cha³ubiñskiego 6/32, 80-807 Gdañsk; e-mail: a.salwa@gdansk.wiw.gov.pl
