Artyku³ przegl¹dowy Review
Rozrostowe zapalenie jelit wiñ (porcine proliferati-ve enteritis PPE) (9) jest stosunkowo now¹ chorob¹, jednak coraz czêciej wystêpuj¹c¹ u wiñ w Polsce. Czynnikiem etiologicznym jest odkryta na pocz¹tku lat 90. XX wieku bakteria Lawsonia intracellularis (16). Choroba ta w wielu stadach wiñ na wiecie i w Polsce powoduje znacz¹ce obni¿enie efektywnoci chowu (25). Zachorowania szczególnie czêsto dotycz¹ zwierz¹t w du¿ych fermach, o wysokich standardach higienicz-nych, w których w ró¿nych programach profilaktycz-nych zwykle stosuje siê du¿e iloci chemioterapeuty-ków, przyczyniaj¹cych siê do selekcji mikroflory jeli-towej, w tym równie¿ L. intracellularis. Rozpoznanie PPE jest bardzo trudne, poniewa¿ objawy kliniczne (bie-gunka) oraz zmiany sekcyjne czêsto nie s¹ charaktery-styczne dla tej choroby. W postaci przewlek³ej bardzo czêsto obserwowany jest przebieg atypowy i wówczas nie obserwuje siê objawów biegunki, a jedynie obni¿o-ne przyrosty masy cia³a, mog¹ce sugerowaæ jej wystê-powanie (4).
Wystêpowanie PPE na wiecie
Schwartz i Beister w 1931 r. jako pierwsi opisali przy-padki rozrostowego zapalenia jelit u wiñ w USA (19). Udokumentowane wystêpowanie choroby u wiñ na kontynencie pó³nocnoamerykañskim, po³udniowoame-rykañskim, europejskim, azjatyckim, afrykañskim i aus-tralijskim potwierdzaj¹ jej rozprzestrzenienie na ca³ym wiecie.
Etiologia PPE
Pocz¹tkowo za czynnik etiologiczny PPE uznawano drobnoustroje z rodzaju Campylobacter spp. (Campy-lobacter hyointestinalis, C. mucosalis, C. coli) (9). Ana-liza sekwencji 16S rDNA wyizolowanych z czystych szczepów bakterii uzyskanych z przypadków PPE wy-kaza³a bardzo du¿e ich podobieñstwo do analogicznych sekwencji Desulfovibrio desulfuricans. Potwierdzono tym samym filogenetyczne pokrewieñstwo tych drob-noustrojów z przedstawicielami rodziny Desulfovibrio-naceae. Na tej podstawie zaliczono je do klasy Delta, typu Proteobacteria (8), rzêdu Desulfovibrionales, rodziny Desulfovibrionacea. Bakterie te pocz¹tkowo okrelono jako organizmy podobne do Campylobacter (Campylobacter-like organisms CLOs) lub jako or-ganizmy wewn¹trzkomórkowe (intracellular organisms IO). Póniej ze wzglêdu na miejsce paso¿ytowania g³ównie w jelicie biodrowym okrelano je jako ileobac-ter intracellularis lub ileal symbiont intracellularis (IS intracellularis) (8). Obecnie mikroorganizmy te nosz¹ nazwê Lawsonia intracellularis, nadan¹ przez McOrista i wsp. na czeæ Lawsona, który wraz ze wspó³-pracownikami jako pierwszy namno¿y³ je na pod³o¿u komórkowym in vitro (16).
Morfologia i hodowla Lawsonia intracellularis
Lawsonia intracellularis jest Gram-ujemn¹ zakrzy-wion¹ lub sigmoidaln¹ pa³eczk¹ ze zwê¿aj¹cymi siê bie-gunami (18). D³ugoæ komórki wynosi 1,25-1,75 µm,
Lawsonia intracellularis
czynnik rozrostowego zapalenia jelit wiñ
JOANNA P£AWIÑSKA, MARIAN BINEK*Katedra Higieny ¯ywnoci i Ochrony Zdrowia Publicznego Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Nowoursynowska 159, 02-786 Warszawa
*Zak³ad Bakteriologii i Biologii Molekularnej Katedry Nauk Przedklinicznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej SGGW, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa
P³awiñska J., Binek M.
Lawsonia intracellularis the causative agent of porcine proliferative enteritis Summary
Lawsonia intracellularis, a Gram-negative, curved rod was identified as the causative agent of porcine proliferative enteritis (PPE) in the 1990s. The bacterium is an obligate intracellular parasite, and thus cannot be multiplied in-vitro on standard media. Nowadays, two types of the disease have been distinguished: acute and chronic. Pigs with PPE usually demonstrate clinical signs two weeks after a period of stress caused by transportation, heat, overcrowding or weaning piglets from sows. The infected animals suffer from diarrhea and indicate reduced growth rate and weight gain. In some cases the disease leads to death. PPE is difficult to diagnose as both its clinical signs and the pathological changes it causes are unspecific. The pathogen is identified in laboratory conditions by the use of PCR, and IFAT is applied to track specific antibodies. Tiamulin and tylozyne are the most popular drugs used to prevent PPE.
a szerokoæ 0,25-0,43 µm (8). Nie stwierdzono u niej obecnoci rzêsek, fimbrii i nie ma ona zdolnoci wy-twarzania przetrwalników. Przy barwieniu zmodyfiko-wan¹ metod¹ Ziehl-Neelsena bakteria wykazuje kwa-soopornoæ. Drobnoustroje naturalnie wystêpuj¹ w cy-toplazmie enterocytów i namna¿aj¹ siê tylko w dziel¹-cych siê komórkach nab³onka b³ony luzowej krypt je-litowych, g³ównie w jelicie biodrowym i okrê¿nicy (8, 14). Lawsonia intracellularis nie namna¿a siê in vitro na standardowych pod³o¿ach bakteriologicznych ani na zarodkach kurzych (8). Mo¿na je namna¿aæ w hodowli komórek enterocytów szczura linii komórkowej IEC--18, w atmosferze mikroaerofilnej (19).
Chorobotwórczoæ dla zwierz¹t
Na rozrostowe zapalenie jelit nara¿one s¹ g³ównie dwa gatunki zwierz¹t: chomiki (5) i winie (4). U in-nych zwierz¹t, jak np.: lisów niebieskich (14), jeleni, psów (11), koni (5), owiec, winek morskich, ma³p ma-kaków, królików, fretek, myszy i szczurów (14) choro-bê opisano, ale zdarza siê ona sporadycznie i wystêpuje w pojedynczych przypadkach. Rozrostowe zapalenie jelit zosta³o opisane równie¿ u ptaków w stadzie emu (14) i strusi (5).
Patogeneza PPE
Wed³ug Lawsona i wsp. (15), proces kolonizacji ko-mórek nab³onka jelitowego in vitro przez L. intracellu-laris jest podobny do tego, jaki zachodzi in vivo. Stwier-dzono, ¿e do enterocytów szczura bakterie wnikaj¹ w ci¹gu pierwszej godziny po zaka¿eniu i namna¿aj¹ siê w znacznych ilociach ju¿ po 18 godzinach od wnik-niêcia (18). Proces wnikania bakterii jest zale¿ny od wieku i aktywnoci komórki ¿ywiciela, natomiast mniej jest zale¿ny od samych zarazków. Lawson i wsp. (15) przeprowadzili badania, z których wynika³o, ¿e os³abio-ne i uszkodzoos³abio-ne komórki L. intracellularis równie¿ prze-dostawa³y siê do komórek linii IEC-18. Zahamowanie wnikania bakterii do enterocytów przez cytochalazynê D wskazuje na zale¿noæ tego procesu od aktyny. Bak-terie kolonizuj¹ komórki, a nastêpnie wnikaj¹ do ente-rocytów na drodze makropinocytozy. Uwolnienie bak-terii z endocytu nastêpuje ju¿ po 3 godzinach od zaka-¿enia (15), po czym nastêpuj¹ szybkie ich podzia³y w cy-toplazmie enterocytów. Namna¿anie siê bakterii ma miejsce wy³¹cznie w m³odych, dziel¹cych siê komór-kach nab³onka jelitowego. Nie stwierdzono przenosze-nia siê zaka¿eprzenosze-nia do dojrza³ych enterocytów (21). W wa-runkach naturalnych komórki nab³onka krypt jelitowych zaka¿ane s¹ tylko w okresie ich intensywnego podzia³u, dlatego leki, które hamuj¹ wzrost komórek, równie¿ za-pobiegaj¹ namna¿aniu siê bakterii. Komórki linii ko-mórkowej IEC-18 kontynuuj¹ podzia³y nawet wówczas, kiedy s¹ bardzo silnie zaka¿one. W konsekwencji ich liczba proporcjonalnie wzrasta, a¿ do momentu, kiedy zaka¿enie obejmuje 90%, a czasami nawet wy¿szy od-setek komórek. McOrist i wsp. (21) dowiedli, ¿e po-wstawanie zmian rozrostowych w jelitach ma miejsce wtedy, kiedy s¹ w nich obecne L. intracellularis, nato-miast powrót b³ony luzowej do stanu prawid³owego
nastêpuje po eliminacji bakterii. Zdarza siê, ¿e po sa-moistnej eliminacji L. intracellularis z komórek luzów-ki jelit i organizmu gospodarza bez stosowania chemio-terapeutyków, zwierzêta wracaj¹ do zdrowia, a w jeli-tach ponownie odtwarzaj¹ siê prawid³owe uk³ady ko-mórek nab³onka jelitowego (14).
W dowiadczeniu, w którym winiom podano zeskro-binê b³ony luzowej jelita cienkiego zwierz¹t pad³ych na krwotoczn¹ postaæ PPE (21) lub czyst¹ kulturê L. intracellularis (10) wykazano, ¿e typowe zmiany dla PPE uwidaczniaj¹ siê w ci¹gu 12-14 dni, a siewstwo bakterii z ka³em mo¿e utrzymywaæ siê nawet przez 13 tygodni po zaka¿eniu. Zmiany chorobowe ograniczaj¹ siê do jelita biodrowego i okrê¿nicy, rzadziej jelita czcze-go i jelita lepeczcze-go (17). Badania Geudes i wsp. (10) z 2003 r. wykaza³y, ¿e stosuj¹c ¿yw¹ hodowlê L.
intra-cellularis jako atenuowan¹ szczepionkê (Enterisol©
Ileitis, Boehringer Ingelheim USA) mo¿na ograniczyæ siewstwo tych bakterii do 9 tygodni. Jensen i wsp. (12) prowadz¹cy badania na winiach wykazuj¹cych ostre zapalenie otrzewnej wykazali, ¿e L. intracellularis obec-ne by³y nie tylko w komórkach nab³onka jelitowego lecz tak¿e w makrofagach, granulocytach obojêtnoch³onnych i w wietle naczyñ ¿ylnych w¹troby.
Z badañ McOrist i wsp. (19) nad etiologi¹ i patoge-nez¹ PPE wiadomo, ¿e zwierzêta gnotobiotyczne nie ulegaj¹ zaka¿eniu L. intracellularis, natomiast na zaka-¿enie podatne s¹ winie konwencjonalne i SPF (specy-fic patogen free). Zachorowaniom zwierz¹t sprzyja brak higieny, rzadko sprz¹tane pod³o¿e w kojcach, chów na g³êbokiej ció³ce i nieprzestrzeganie w chowie wiñ zasady ca³e pomieszczenie pe³ne ca³e pomieszcze-nie puste (cpp-cpp). Na szerzepomieszcze-nie siê choroby wp³ywa równie¿ brak bie¿¹cej dezynfekcji, nieuprz¹tanie odcho-dów zwierz¹t i niestosowanie ogólnego odka¿ania przed wprowadzeniem kolejnej grupy produkcyjnej (27).
Postacie kliniczne
W przesz³oci rozró¿niano piêæ klinicznych form PPE, do których zaliczano (14): postaæ przewlek³¹ choroby (PIA porcine intestinal adenomatosis), martwicowe zapalenie jelit (NE necrotic enteritis), miejscowe za-palenie jelita biodrowego (RE regional ileitis), prze-rostow¹ krwotoczn¹ enteropatiê (PHE proliferative haemorrhagic enteropathy), przerostowe zapalenie jeli-ta lepego i okrê¿nicy (PE proliferative enteropathy). Obecnie wyró¿nia siê dwie postacie kliniczne PPE: ostr¹ i przewlek³¹. Kliniczne objawy choroby u wiñ czêsto pojawiaj¹ siê po dwóch tygodniach w nastêpstwie stre-su zwi¹zanego z transportem, upa³em, nadmiernym za-gêszczeniem zwierz¹t lub po odsadzeniu od maciory (14).
Postaæ ostr¹ obserwuje siê g³ównie u tuczników o masie cia³a 50-100 kg oraz niekiedy u zwierz¹t stada podstawowego. Charakterystycznym objawem jest bie-gunka. Ka³ jest ciemnoczerwony i rozluniony. winie s¹ os³abione i nie chc¹ jeæ, s¹ apatyczne, wykazuj¹ ane-miê (10). Temperatura wewnêtrzna cia³a jest obni¿ona. W stadzie obserwuje siê nag³e padniêcia zwierz¹t bez wyranych klinicznych objawów. mieræ w nastêpstwie
ostrej i podostrej postaci choroby mo¿e nastêpowaæ w przeci¹gu 2-7 dni po pojawieniu siê pierwszych obja-wach klinicznych. miertelnoæ w stadzie jest du¿a i wynosi 50-90% pog³owia (14, 22). U zwierz¹t pad³ych, w czasie sekcji stwierdza siê przekrwienie jelita cien-kiego. Z opisu tej postaci choroby wynika, ¿e czêæ zwierz¹t mo¿e przechorowaæ. U pronych macior mo¿e dochodziæ do poronienia na skutek wycieñczenia orga-nizmu matki w wyniku krwawej biegunki (14).
Przewlek³a postaæ PE by³a obserwowana u wiñ w ró¿nym wieku. U zwierz¹t z t¹ postaci¹ choroby ob-serwuje siê ³agodn¹ biegunkê prowadz¹c¹ do utraty masy cia³a lub ma³ych przyrostów (4). Dotyczy ona zwykle wiñ w wieku miêdzy 6. a 20. tygodniem ¿ycia. Tempe-ratura wewnêtrzna cia³a jest normalna lub subnormal-na. Ka³ mo¿e byæ uformowany lub rozluniony z odcie-niem czarnym. U niektórych zwierz¹t czasami mo¿na zaobserwowaæ biegunkê utrzymuj¹c¹ siê od kilku dni do kilku tygodni, podczas której ka³ jest barwy szaro--br¹zowej lub br¹zowej o konsystencji zaprawy cemen-towej. Przewlek³a postaæ PPE ujawnia siê niejednokrot-nie po 2-3 tygodniach po przemieszczeniu wiñ, zmia-nie ¿ywienia lub zmiazmia-nie chemioterapeutyku stosowa-nego w paszy leczniczej (21, 29). W stadzie obserwuje siê zwiêkszon¹ liczbê wiñ char³aczych, ró¿ni¹cych siê mas¹ cia³a od innych zwierz¹t w grupie (29). Mimo ¿e miertelnoæ jest niska i w stadach wiñ z przewlek³¹ postaci¹ PE siêga zaledwie 5%, to jednak bardzo istot-ny jest niekorzystistot-ny efekt ekonomiczistot-ny tuczu i straty zwi¹zane ze spadkiem przyrostów masy cia³a (22) (ryc. 1).
Zmiany anatomopatologiczne
W ostrej postaci choroby zmiany anatomopatologicz-ne zlokalizowaanatomopatologicz-ne s¹ g³ównie w jelicie biodrowym, rza-dziej w czczym, lepym i okrê¿nicy. ciana zmienio-nych odcinków jelit jest zgrubia³a. Stwierdza siê obrzêk b³ony podluzowej, czasami wystêpuj¹ w niej wybro-czyny. W wietle jelit mo¿e wystêpowaæ wie¿a krew lub skrzepy w³óknika (21).
W postaci przewlek³ej PPE charakterystyczne jest ró¿nego stopnia zgrubienie jelita cienkiego (ryc. 2B)
i/lub jelita grubego, g³ównie górnego odcinka okrê¿ni-cy. Zgrubia³a ciana jelita jest konsystencji têgiej, b³ona luzowa z wyranymi poprzecznymi, g³êbokimi fa³da-mi (21) przypofa³da-minaj¹cyfa³da-mi pofa³dowaniem korê mózgu. Niekiedy dochodzi do jej uszkodzenia, wówczas wia-t³o danego fragmentu jelit mo¿e byæ wype³nione strzêp-kami obumar³ej b³ony luzowej.
Zmiany histopatologiczne
Dla wszystkich postaci rozrostowego zapalenia jelit charakterystyczn¹ zmian¹ jest rozrost nab³onka b³ony luzowej w kryptach jelitowych. Krypty s¹ zwykle po-wiêkszone, wyd³u¿one i wy³o¿one licznymi st³oczony-mi, dziel¹cymi siê oraz niedojrza³ymi komórkami na-b³onka. Brak jest komórek kubkowych, nab³onek za jest s³abo zró¿nicowany. Dziel¹ce siê komórki mog¹ zawieraæ w cytoplazmie L. intracellularis (4, 16, 29). Zwykle po trzech tygodniach od zaka¿enia w zaatako-wanych komórkach nab³onka jelitowego obserwuje siê liczne Gram-ujemne zakrzywione bakterie.
Po 7-9 tyg. od zaka¿enia uwidaczniaj¹ siê zmiany ultrastrukturalne o charakterze zwyrodnieniowym w ko-mórkach nab³onka. Obserwuje siê utratê mikrokosm-ków, obrzêk komórek nab³onka a nastêpnie obkurcza-nie siê komórek i tworzeobkurcza-nie uwypukleñ do wiat³a jelita (21). Jedne z nich s¹ wyranie zaokr¹glone i wysuniête do wiat³a krypty, inne zawieraj¹ pozornie normalne j¹dro i mitochondria (15). W niektórych przypadkach w wietle krypt jelita obserwowano zarówno komórki bak-terii, jak i uwypuklone balonowato enterocyty. W nie-których komórkach nab³onka jelitowego by³y uszkodzo-ne orgauszkodzo-nella komórkowe lub b³ona komórkowa (21).
Rozpoznanie laboratoryjne
Laboratoryjne rozpoznanie PPE polega na wykryciu Lawsonia intracellularis w próbkach ka³u i jelit lub swoistych przeciwcia³ w surowicy krwi. Poniewa¿ za-razka nie mo¿na wyhodowaæ in vitro na pod³o¿ach bak-Ryc. 1. Zró¿nicowanie masy cia³a u wiñ z jednego miotu
cho-rych na PPE (badania w³asne)
Ryc. 2. A. Prawid³owa b³ona luzowa jelita biodrowego dal-szego wini; B. Zgrubienie i pofa³dowanie poprzeczne b³ony luzowej jelita biodrowego dalszego wini w przebiegu prze-wlek³ej postaci PPE (badania w³asne)
teriologicznych, wobec tego jedn¹ z metod wykrywania L. intracellularis jest stwierdzenie obecnoci w prepa-racie mikroskopowym zakrzywionych pa³eczek wybar-wionych np. zmodyfikowan¹ metod¹ Ziehl-Neelsena, a tak¿e hodowla zarazka in vitro w pod³o¿u komórko-wym lub wykrycie fragmentów jego genomu metod¹ PCR.
Metoda Warthin-Starrya. Powszechnie wykorzy-stywan¹ technik¹ histopatologiczn¹, s³u¿¹c¹ do wykry-wania L. intracellularis, jest metoda barwienia Warthin--Starrya, w której po standardowej procedurze przygo-towania preparatów, wykorzystuje siê sole srebra do uwidocznienia bakterii (10, 27). Otrzymane preparaty mo¿na ogl¹daæ w mikroskopie wietlnym.
Wykrywanie Lawsonia intracellularis przy pomo-cy metody PCR. Do tego celu mo¿na u¿yæ dwuetapo-wej metody PCR (PCR i nested PCR) lub jednoprobów-kowej metody nested PCR. Metod¹ PCR mo¿na wy-kryæ bakterie w liczbie 103/1 g materia³u, natomiast
ne-sted PCR jest 100-krotnie czulsz¹. Tymi metodami mo¿-na badaæ próbki ka³u wie¿e i mro¿one oraz wie¿e, mro-¿one lub utrwalane w formalinie wycinki jelit (5, 9, 24). Ewentualne niepowodzenia w uzyskaniu wyników me-tod¹ PCR wynikaj¹ z trudnoci izolowania DNA Law-sonia intracellularis z ka³u chorych zwierz¹t, ze wzglê-du na wzglê-du¿¹ zawartoæ w nim ró¿nego typu inhibitorów lub powszechne stosowanie chemioterapeutyków.
Real-time PCR. Do wykrywania Lawsonia intracel-lularis coraz czêciej stosowana jest metoda real-time PCR. S³u¿y ona do ilociowego okrelenia amplifiko-wanego DNA w czasie rzeczywistym. W metodzie tej swoista sonda oligonukleotydowa np. sondy TaqmanTM,
wykorzystywane do wykrywania L. intracellularis, s¹ podwójnie znakowane fluorescencyjnie; na koñcu 5 reporter, a na koñcu 3 wygaszacz. Hybrydyzuj¹c pod-czas reakcji PCR z sekwencj¹ DNA w obszarze miêdzy starterami powoduj¹, ¿e aktywnoæ 5-3 Taq polimera-zy likwiduje wp³yw wygaszacza, co wywo³uje emisjê fluorescencji. Iloæ uwolnionego reportera jest propor-cjonalna do iloci zamplifikowanego DNA i ronie z ka¿dym cyklem. Do przeprowadzenia ca³ego cyklu re-akcji s³u¿y specjalna aparatura, jak np. LightCykler, w której podczas badania zachodz¹ ww. procesy, a wy-nik uwidoczniony zostaje np. w formie wykresu na ekra-nie monitora (26).
FISH (rRNA hybrydyzacja in situ fluorescen-cyjna hybrydyzacja rRNA in situ). FISH jest now¹ metod¹ wykrywania zarazków, w tym tak¿e tych, któ-rych nie mo¿na wyhodowaæ in vitro (2). Wykorzysty-wana sonda oligonukleotydwa wykrywa wysoce kon-serwatywne geny rRNA, dziêki czemu jest bardzo swo-ista i przydatna do analizy filogenetycznej wielu mikro-organizmów. Sonda oligonukleotydowa dla L. intracel-lularis zosta³a stworzona na bazie sekwencji 16S RNA: Law: 5-AAC CGG AGC AGT CTC TCT AG-3 (2) i wyznakowana pochodn¹ izotiocjaniny CY-3. Proce-dura badania polega na tym, ¿e wycinki jelit wiñ utrwala siê w formalinie, nastêpnie wykonuje siê preparaty jak do badania histopatologicznego. Hybrydyzacjê przepro-wadza siê przez 16 godzin w wilgotnej komorze, w temp. 45°C z 20 µl buforu hybrydyzacyjnego i 50 ng sondy.
Wycinki s¹ nastêpnie p³ukane przez 15 minut w wodzie i w 100 ml podgrzanego do 45°C buforu hybrydyzacyj-nego nie zawieraj¹cego sondy (2). Obraz bakterii po³¹-czonych z sond¹ oligonukleotydow¹ ogl¹dany jest w mikroskopie epifluorescencyjnym, wyposa¿onym w 75 W lampê ksenonow¹ i zestaw filtrów.
Stosuj¹c kilka sond, mo¿na wykryæ t¹ metod¹ wielo-czynnikowe zaka¿enia bakteryjne np. zaka¿enie Brachy-spira pilosicoli i Lawsonia intracellularis (17).
Hodowla w linii komórkowej IEC-18. W 1993 r. Lawson i wsp. jako pierwsi in vitro namno¿yli Lawso-nia intracellularis w hodowli komórkowej IEC-18 (en-terocyty jelita biodrowego szczura). Liniê komórkow¹
IEC-18 utrzymywali w 37°C, w atmosferze 5% CO2,
w DMEM z 10% dodatkiem p³odowej surowicy cielê-cej (FCS), co tydzieñ uzupe³niaj¹c trypsyn¹. Pod³o¿e nie zawiera³o antybiotyku, ale by³o wzbogacone L-glu-tamin¹ i uzupe³nione amfoterycyn¹ B. Po zaka¿eniu tak przygotowanej linii komórkowej IEC-18 L. intracellu-laris, do pod³o¿a dodawano neomycynê lub gentamy-cynê i wankomygentamy-cynê. W trakcie inkubacji co 2-3 dni wymieniano pod³o¿e DMEM 5% FCS z antybiotyka-mi (15, 16).
Aktualnie, jedynie nieliczne laboratoria dysponuj¹ metodyk¹ i sprzêtem niezbêdnym do izolacji oraz ho-dowli in vitro L. intracellularis.
Wykrywanie przeciwcia³
Do wykrywania przeciwcia³ IgG w surowicy wiñ s³u-¿y test immunofluorescencji poredniej (IFAT) (6). Prze-ciwcia³a IgG przeciwko Lawsonia intracellularis poja-wiaj¹ siê w surowicy po 2 tygodniach od kontaktu zwie-rzêcia z zarazkiem i utrzymuj¹ siê przez kolejne 2-4 ty-godnie (13, 16). W tecie IFAT na p³ytkê op³aszczon¹ komórkami L. intracellularis (IleiTest, Elanco) nale¿y nakropliæ odpowiednio rozcieñczon¹ surowicê badan¹ i kontroln¹ oraz inkubowaæ w wilgotnej komorze przez 12 godzin w temp. 4°C, nastêpnie przep³ukaæ PBS, do-daæ koniugatu oraz ponownie inkubowaæ w temp. 37°C przez 30 min. Po op³ukaniu p³ytkê mo¿na ogl¹daæ w mikroskopie fluorescencyjnym. Obecnoæ charakte-rystycznych zakrzywionych pa³eczek wiec¹cych na ko-lor jasnozielony wiadczy o obecnoci swoistych dla L. intracellularis przeciwcia³ (26). Test ten charaktery-zuje siê du¿¹ czu³oci¹; w dowiadczeniu Knittel i wsp. (13) po 5 tygodniach od zaka¿enia wiñ L. intracellula-ris stwierdzali obecnoæ przeciwcia³ u 90% badanych zwierz¹t. Dünser i wsp. (6) w badaniu wiñ w Austrii otrzymali 47% wyników pozytywnych.
Skutecznoæ chemioterapeutyków w zapobieganiu i leczeniu PPE
W badaniach in vitro McOrist i wsp. (23) okrelili MIC (µg/ml) ró¿nych antybiotyków w stosunku do Law-sonia intracellularis. Wynosz¹ one: bacytracyna > 32, awoparcyna > 64, wankomycyna > 128, penicylina G 1, ampicylina 1, tiamulina 4, erytromycyna 0,1, tylozyna 64, linkomycyna 32, apramycyna > 128, spektynomy-cyna 32, neomyspektynomy-cyna > 128, gentamyspektynomy-cyna > 128, enro-floksacyna 8 i chlorotetracyklina £ 4.
W badaniach klinicznych w leczeniu PE u wiñ sku-teczne okaza³y siê: erytomycyna (70 g/tonê paszy) i tia-mulina (zapobiegawczo 50 ppm i leczniczo 150 ppm w paszy lub 180 ppm w wodzie do picia), tylozyna (za-pobiegawczo 20-40 ppm, a leczniczo 100 ppm w pa-szy), chlorotetracyklina (300-600 ppm w paszy) (22, 27, 29). Dawka lecznicza walnemuliny to 1,45 do 4 mg/kg masy cia³a podawana wraz z pasz¹ przez 21 dni (20).
Uwagi koñcowe
Wspó³czenie PPE rozpoznawane jest na podstawie: wywiadu, objawów klinicznych, badañ anatomopatolo-gicznych i laboratoryjnych. Najpewniejsz¹ metod¹ roz-poznania choroby jest wykrycie L. intracellularis w badanym materiale (ka³, wycinek jelita). Dziêki roz-wojowi metod biologii molekularnej jest to mo¿liwe przy zastosowaniu techniki PCR i nested-PCR. W klinicznej diagnostyce ró¿nicowej biegunek wiñ trzeba jednak uwzglêdniæ fakt, ¿e postaæ ostra przypomina dyzenteriê spowodowan¹ zaka¿eniem Brachyspira hyodysenteriae. Postaæ przewlek³a i nietypowa jest podobna w swoim przebiegu do enzootycznych zaka¿eñ wiñ wywo³ywa-nych przez B. intermedia lub B. pilosicoli (26). Zatem w diagnostyce ró¿nicowej chorób wiñ przebiegaj¹cych z objawami biegunki konieczne jest wykonanie badañ laboratoryjnych umo¿liwiaj¹cych wykrycie ich czynni-ków etiologicznych.
Na podstawie wielu epidemiologicznych danych na temat zachorowañ wiñ na rozrostowe zapalenie jelit okazuje siê, ¿e L. intracellularis rozprzestrzenia siê z doæ du¿¹ dynamik¹ w populacji tych zwierz¹t na ca³ym wiecie. Chang i wsp. (3) podali, ¿e na Tajwanie w 33,8% stad wiñ zarazek ten by³ obecny. Podobnie w Brazylii, gdzie na podstawie przeprowadzonych tam w 1998 r. badañ epidemiologicznych, L. intracellularis wykrywano w 35,3% stad trzody chlewnej, a wed³ug badañ powtórzonych w 2000 r. ju¿ w 40,5% (24). W Europie, w Norwegii w 2000 r. 37,6% stad by³o za-ka¿onych (7), a w Niemczech ponad 80%, w tym w Dol-nej Saksonii ponad 25% (26). Wysoki odsetek stad wiñ zaka¿onych L. intracellularis stwierdza siê równie¿ w Danii (w 75% stad na podstawie badañ przeprowa-dzonych w roku 1998 i a¿ w 93,7% w 2001 r.) (28). Dane dotycz¹ce Polski pochodz¹ z publikacji Pejsaka i wsp., którzy w 2001 r. na podstawie przebadania 54 stad wiñ zarazek ten wykryli ju¿ w 74,1% stad. Nato-miast P³awiñska w 2003 r. (26), metod¹ nested PCR, bakteriê tê wykrywa³a w próbkach od wiñ zdrowych z 67,6% stad, a przeciwcia³a przeciwko niej w ponad 92% badanych stad wiñ. Wynika z tego, ¿e jest to wa¿-na choroba wiñ istotnie wp³ywaj¹ca wa¿-na efekty ekono-miczne chowu tego gatunku zwierz¹t, tym bardziej, ¿e podejmowane próby opracowania skutecznej szczepion-ki nie przynosz¹ spodziewanego skutku.
Pimiennictwo
1.Biksi I., Kacskovics I., Mandoki M., Ivan J., Horvath-Papp I., Makay G., Vetesi F.: Detection of Lawsonia intracellularis in Hungarian swine herds by polimerase chain reaction. Acta Vet. Hung. 1998, 46, 415-420.
2.Boye M., Jensen T. K., Møller K., Leser T. D., Jorsal S. E.: Specific detection of Lawsonia intracellularis in porcine proliferative enteropathy inferred from fluorescent rRNA in situ hybridization. Vet. Pathol. 1998, 35, 153-156.
3.Chang W. L., Wu C. F., Wu Y., Kao Y. M., Pan M. J.: Prevalence of Lawsonia intracellulris in swine herds in Taiwan. Vet. Rec. 1997, 141, 103-104. 4.Cooper D. M., Gebhard C. J.: Comperative aspects of proliferative enteritis.
J. Am. Vet. Med. Ass. 1998, 212, 1446-1451.
5.Cooper D. M., Swanson D. L., Gebhard C. J.: Diagnosis of prolifertive enteritis in frozen and formalin fixed, paraffin-embedded tissues from a hamster, horse, deer and ostrich using a Lawsonia intracellularis specific multiplex PCR as-say. Vet. Microbiol. 1997, 54, 47-62.
6.Dünser M., Untersperger M., Schweighart H., Schuh M.: Comarative studis by PCR and indirect immunofluorescent antibody test on the occurrence of Lawso-nia intracellularis in upper Austrian swine herds. Proc. Internat. Pig Veterinary
Society, 16th Congress, Melbourne, Australia 2000, s. 59.
7.Flø H., Bergsjø B., Grove S.: The prevalence of Lawsonia intracellularis in
Nor-wegian swine herds. Proc. Internat. Pig Veterinary Society, 16th Congress,
Mel-bourne, Australia, 2000, s. 67.
8.Gebhard C. J., Barans S. M., McOrist S., Lin G., Lawson G. H. K.: Ileal sym-biont intracellularis, an obligate bacterium of porcine intestine showing a rela-tionship to Desulfovibrio species. Int. J. Sist. Bact. 1993, 43, 533-538. 9.Gebhard C. J., Lin G., McOrist S., Lawson G. H. K., Murtaugh M. P.: Cloned
DNA probes specific for the intracellular Campylobacter-like organism of por-cine proliferative enteritis. J. Clin. Microbiol. 1991, 29, 1011-1015.
10.Geudes R. M. C., Gebhard C. J.: Comparison of intestinal mucosa homogenate and pure culture of the homologous Lawsonia intracellularis isolate in reprodu-cing proliferative enteropathy in swine. Vet. Microbiol. 2003, 93, 159-166. 11.Husnik H., Klimes J., Tomanowa K., Smola J., Halouzka R., Tichy F., Brazdil J.:
Lawsonia intracellularis in a dog with inflammatory bowel disease. Vet. Med. Czech 2003, 48, 141-145.
12.Jensen T. K., Svensensmark B.: Unusual detection sites of Lawsonia intracellu-laris in cases of peritonitis and in the liver of pig. Proc. Internat. Pig Veterinary
Society, 16th Congress, Melbourne, Australia 2000, s. 64.
13.Knittel J. P., Jordan D. M., Schwartz K. J., Janke B. H., Roof M. B., McOrist S., Harris D. L.: Evaluation of antemortem polymerase chain reaction and serolo-gic methods for detection of Lawsonia intracellularis-exposed pigs. Am. J. Vet. Res. 1998, 59, 722-726.
14.Lawson G. H. K., Gebhart C. J.: Proliferative enteropathy. J. Comp. Path. 2000, 122, 77-100.
15.Lawson G. H. K., Macki R. A., Smith D. G. E., McOrist S.: Infection of cultured rat enterocytes by Ileal symbiont intracellularis depends on host cell function and actin polymerisation. Vet. Microbiol. 1995, 45, 339-350.
16.Lawson G. H. K., McOrist S., Jasni S., Mackie R. A.: Intracellular bacteria of porcine proliferative enteropathy: cultivation and maintenance in vitro. J. Clin. Microbiol. 1993, 31, 1136-1142.
17.McOrist S.: Ileitis illuminated by newer diagnostic tools. Enteric Diseases Pig Progress 1999, 9-11.
18.McOrist S., Jasni S., Macki R. A., Berschneider H. M., Rowlands A. C., Law-son G. H. K.: Entry of the bacterium ileal symbiont intracellularis into cultured enterocytes and its subsequent release. Res. Vet. Sci. 1995, 59, 255-260. 19.McOrist S., Jasni S., Macki R. A., MacIntyre N., Neef N., Lawson G. H. K.:
Reproduction of porcine proliferative enteropathy with pure cultures of ileal symbiont intracellularis. Infect. Immun. 1993, 61, 4286-4292.
20.McOrist S., Morgan J. H., Ripley P., Burch D. G. S.: In vitro and in-live studies of efficacy of valnemulin for proliferative enteropathy (ileitis). Proc. Internat.
Pig Veterinary Society, 15th Congress, Birmingham, England 1998, s. 114.
21.McOrist S., Roberts L., Jasni S., Rowland C. A., Lawson G. H. K., Gebhard C. J., Bosworth B Developed and resolving lesions in porcine proliferative entero-pathy: possible pathogenetic mechanisms. J. Comp. Path. 1996, 115, 35-45. 22.McOrist S., Shearn M. F. H., Morgan J.: Control of porcine proliferative
entero-pathy by oral administration of chlortetracycline. Vet. Rec. 1999, 144, 48-48. 23.McOrist S., Smith S. H., Shearn M. F. H., Carr M. M., Miller D. J. S.: Treatment
and prevention of porcine proliferative enteropathy with oral tiamulin. Vet. Rec. 1996, 139, 615-618.
24.Moreno A. M., Baccaro M. R., Coutinho L. L.: Porcine proliferative enteritis:
anatomopathological aspects. Proc. Internat. Pig Veterinary Society, 16th
Con-gress, Melbourne, Australia 2000, s. 63.
25.Pejsak Z., ¯mudzki J., Stankevicius A.: Rozprzestrzenienie zaka¿eñ Lawsonia intracellularis w populacji wiñ w Polsce. Medycyna Wet. 2001, 57, 887-889. 26.P³awiñska J.: Zaka¿enia Lawsonia intracellularis u wiñ w Polsce. Praca dokt.,
Wydz. Med. Wet. SGGW Warszawa 2003.
27.Smith S. H., McOrist S., Green L. E.: Questionnaire survey of proliferative ente-ropathy on British pig farms. Vet. Rec. 1998, 142, 690-693.
28.Stege H., Jensen T. K., Møller K., Baekbo P., Jorsal S. E.: Prevalence of intesti-nal pathogens in Danish finishing pig herds. Prev. Vet. Med. 2000, 46, 279-292. 29.Tsinas A. C., Kyriakis S. C., Lekkas S., Saris K., Bourtzi-Hatzopoulouand E., Saulidis K.: Control of proliferative enteropathy in growing/fattening pigs using growth promoters. J. Vet. Med. B 1998, 45, 115-127.
Adres autora: dr Joanna P³awiñska, Hotel Asystencki IKAR 816, ul. No-woursynowska 161, 02-787 Warszawa; e-mail: plawinska@alpha.sggw.waw.pl
