A C T A U N I V E R S I T A T I S L O D Z I E N S I S
FOLIA BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA 10, 1994
Andrzej Zaborowski, Magdalena Klink, Błażej Rózga
CYTOMETRYCZNA METODA
OZNACZANIA ŻYWOTNOŚCI KOMÓREK LIMFOIDALNYCH W WARUNKACH STRESU TEMPERATUROWEGO
Żywotność świeżo izolowanych lub ogrzewanych limfocytów była oceniana klasycz ną metodą mikroskopową z wykorzystaniem błękitu trypanu oraz za pomocą cytometru przepływowego po potraktowaniu komórek barwnikami fluorescencyjnymi. Cytometria przepływowa pozwala szybko i precyzyjnie określić żywotność komórek w zawiesinach.
WSTĘP
Pośród różnych m etod określania liczby żywych kom órek w zawiesinach, najczęściej spotykaną jest m etoda wykorzystująca błękit trypanu. Jest ona prosta w wykonaniu, jednakże niezbyt dokładna, a stosow ana w niej ocena liczby kom órek za pom ocą m ikroskopu świetlnego, raczej subiektywna. Bardziej precyzyjna jest m etoda spektrofotom etryczna opisana przez S a i j o [12], wymaga ona jednak użycia dużej liczby kom órek.
Innymi m etodam i służącymi do odróżniania kom órek żywych od m a rt wych, są procedury wykorzystujące barwniki fluorescencyjne. D o najczęściej stosowanych barwników należą: bromek etydyny, jodek propydyny i oranż akrydyny. Użycie wymienionych barwników wymaga zastosowania m ik ro skopu fluorescencyjnego w celu określenia liczby fluoryzujących kom órek. Barwienie barwnikam i fluorescencyjnymi, m imo że dokładniejsze, to nie eliminuje jednak subiektywnej oceny liczby fluoryzujących kom órek.
D o oceny liczby kom órek fluoryzujących zamiast m ikroskopu fluorescen cyjnego wykorzystuje się cytom etry przepływowe. Są to urządzenia, w których kom órki niesione przez nośnik przechodzą pojedynczo przez układ sensorowy, w obrębie którego odbywa się pom iar widma i intensywności fluorescencji. Ze
względu na szybkość pom iaru (do 10 000 kom órek/m in) i dużą liczbę zliczeń, m etoda ta pozwala na obiektywne określenie liczby kom órek fluoryzujących. P o nad to jest bardziej czuła i pozwala na identyfikację małej liczby kom órek m artw ych wśród dużej populacji kom órek żywych.
W niniejszym artykule postanow iono porów nać dwie m etody określania żywotności kom órek: m etodę wykorzystującą błękit trypanu oraz m etodę, w której do rozróżnienia kom órek żywych i m artw ych użyto barw ników fluorescencyjnych, a pom iaru fluorescencji dokonano za pom ocą cytom etru przepływowego.
MATERIAŁY I METODY
Komórki. D o badań używano limfocyty izolowane z węzłów chłonnych pachwinowych myszy. Wyizolowane węzły chłonne myszy po oczyszczeniu z tkanki tłuszczowej hom ogenizowano w podłożu Iscove’s z 10% zinak- tywowanej (30 m in 56°C) surowicy płodów cieląt (Fetal C alf Serum - FCS), używając hom ogenizatorów szklanych. Uzyskane kom órki płukano takim samym podłożem i odwirowywano w ciągu 10 m in przy 1200 obrotach/m in. K om órki zawieszano w PBS, przygotowując zawiesiny kom órek o gęstości 106 kom órek w mililitrze.
Limfocyty, analizowane w próbkach kontrolnych, były bardzo jednorodne, wolne od zanieczyszczeń i rum oszu komórkowego. W badaniach używano limfocyty nie ogrzewane i kom órki ogrzewane w łaźni wodnej o tem peraturze 42°C.
Określanie żywotności komórek za pomocą błękitu trypanu. W odny roztw ór błękitu trypanu (1% ) rozcieńczano 8-krotnie 0,85% NaCl i dodaw ano w stosunku 1:1 do zawiesin kom órek. Po 2-3 min od m om entu dodania błękitu trypanu, w m ikroskopie świetlnym (400x) zliczano kom órki m artw e (wybar- wiające się na niebiesko) oraz kom órki żywe (wolne od barw nika) przypadają ce na 100 zliczonych kom órek. N astępnie wyliczano procentow ą zawartość kom órek żywych w badanych zawiesinach komórkowych.
Barwienie barwnikami fluorescencyjnymi. W celu identyfikacji kom órek żywych, wybarwiających się oranżem akrydyny na kolor zielony, stosow ano trzy m etody postępowania.
1. Barwienie oranżem akrydyny (OA) o stężeniu 0,2 m g /100 ml - p ró ba P 1. D o 0,4 ml zawiesiny kom órek dodaw ano 0,1 ml OA o stężeniu 1 mg/ml. K ońcow e stężenie OA w próbie wynosiło 0,2 m g /l00 ml. O ranż akrydyny w ybarwia kom órki żywe na kolor zielony.
2. Barwienie OA o stężeniu 0,1 m g /100 ml oraz bromkiem etydyny (BE) w stężeniu 0,1 m g /100 ml - próba P2.
D o 0,4 ml zawiesiny kom órek dodaw ano 0,05 ml OA o stężeniu 1 m g /l00 ml oraz 0,05 ml BE o stężeniu 1 mg/100 ml. Końcow e stężenie barw ników wynosiło 0,1 mg/100 ml. Użycie brom ku etydyny pozwoliło iden tyfikować kom órki martwe. Barwnik wnikający do kom órek m artwych tłumi fluorescencję zieloną, pochodzącą od oranżu akrydyny.
3. Barwienie OA w stężeniu 0,2 mg/100 ml oraz BE o stężeniu 0,1 mg/100 ml - próba P3.
D o 0,35 ml zawiesiny kom órek dodaw ano 0,1 ml OA o stężeniu 1 mg/100 ml oraz 0,05 ml BE o stężeniu 1 mg/100 ml. Końcow e stę żenie barwników w próbie wynosiło odpowiednio: 0,2 mg/100 ml oraz 0,1 mg/100 ml.
Cytometria przepływowa. Próby o objętości 0,5 ml i gęstości ok. 106 kom órek/m l były analizowane za pom ocą cytom etru przepływowego A R G U S firmy Skatron. D ane analizowano za pom ocą kom putera IBM wyposażonego w podstawowe oprogram owanie firmowe dla cytom etru A R G U S.
Pom iar obejmował:
a) rozpraszanie światła w zakresie małych kątów czołowych (forward
scatter)-,
b) rozpraszanie światła pod kątem 90° (side scatter)',
c) natężenie fluorescencji poszczególnych kom órek przy użyciu bloku filtrowego FIT C , l ex = 470-490 nm i = 520-560 nm.
Analiza danych przebiegała w układzie dwóch histogramów:
- histogram 1 przedstawiał zależność forw ard scatter [LS-1] i side scatter [LSI—2];
- histogram 2 przedstawiał zależność forw ard scatter [LS-1] i natężenia fluorescencji [FL-1],
Z histogram ów odczytywano procent kom órek żywych, jak również poddaw ano analizie profile histogramów.
Obliczenia statystyczne. Wyniki przedstawiono jako średnie arytmetyczne pom iarów + odchylenie standardowe.
WYNIKI
Tabela 1 przedstawia wyniki, na podstawie których dokonano wyboru optym alnego stężenia barwników fluorescencyjnych. K om órki węzłów chłon nych ogrzewano w łaźni wodnej o tem peraturze 42°C przez 5 lub 10 min.
Liczbę kom órek żywych w próbach kontrolnych (czas 0) i w próbach ogrzewanych oceniano dwiema m e todami: za pom ocą cytom etru prze pływowego po uprzednim zastoso waniu trzech różnych stężeń OA i BE oraz za pom ocą m ikroskopu świetlnego po wcześniejszym p o tra ktowaniu kom órek błękitem trypa- nu. Wyniki zamieszczone w tab.
1 jak również na odpowiadającym im histogram ach (rys. 1) wskazują, że zastosowanie OA o stężeniu 0,1 m g /100 ml i BE o stężeniu 0,1 m g /100 ml zapewnia optym alny sposób barwienia kom órek. W dal szych doświadczeniach stosowano ww. stężenie barwników.
W następnym etapie pracy w se rii doświadczeń określano żywo tność zawiesin kom órkow ych, stosu jąc jednocześnie fluorescencyjną m e todę cytom etryczną i m etodę m ik ro skopową z użyciem błękitu trypanu. K om órki węzłów chłonnych ogrze wano w łaźni wodnej o tem peraturze 42°C przez 5 min.
Procent kom órek żywych w nie ogrzewanych (kontrolnych) lub ogrzewanych zawiesinach kom órk o wych oceniano bezpośrednio po p o traktow aniu kom órek barwnikam i.
Rys. 1. Histogramy przedstawiają trzy meto dy barwienia komórek barwnikami fluores cencyjnymi: (1) - barwienie OA o stężeniu 0,2 m g/100 ml-Pl; (2) - barwienie O A o stężeniu 0,1 m g/100 ml i BE o stężeniu 0,1 mg/100 ml-P2; (3) - barwienie OA o stę żeniu 0,2 mg/100 ml i BE o stężeniu
T a b e l a 1 Wybór optymalnego stężenia barwników fluorescencyjnych
Lp
Komórki żywe (%)
błękit trypanu
barwniki fluorescencyjne próba PI próba P2 próba P3
1 70 76 61 62
2 45 70 48 45
3 44 72* 46“ 30"
* - Histogramy pomiarów załączono w pracy.
O b j a ś n i e n i a : PI - OA o stężeniu 0,2 mg/100 ml; P2 - OA o stężeniu 0,1 mg/100 ml oraz BE o stężeniu 0,1 mg/100 ml; P3 - OA o stężeniu 0,2 mg/100 ml oraz BE o stężeniu 0,1 mg/100 ml.
Żywotność każdej zawiesiny komórkowej oceniano 3-krotnie. D ane zamiesz czono w tab. 2.
Wyniki zebrane w tab. 2 potwierdzają do brą pow tarzalność pom iarów dokonyw anych przy użyciu obu stosowanych w pracy m etod. Różnica w procentach kom órek żywych w badanych zawiesinach kom órkow ych, wyznaczanych m etodą cytometryczną, zawiera się w granicy 5-10% , a wy znaczanych m etodą m ikroskopow ą z użyciem błękitu trypanu wynosi 8% . Ogrzewanie kom órek w tem peraturze 42°C powodowało wyraźny wzrost procentu kom órek m artwych. Procenty kom órek żywych w badanych zawiesi nach, wyznaczanych porównywanymi m etodam i, są zbliżone.
T a b e l a 2
Procentowa zawartość komórek żywych
w zawiesinach komórkowych ogrzewanych w temperaturze 42°C
Czas ogrzewania
[min]
Komórki żywe (%)
błękit trypanu barwniki fluorescencyjne
numer próby x ± SD numer próby x ± SD 1 2 3 1 2 3 0 80 73 72 75 ± 4,3 76,0 70,2 71,3 72,5 ± 3,0 5 60 51 58 56 ± 4,7 63,0 55,3 65,5 61,2 ± 5,3 10 49 45 40 45 ± 4,5 49,6 48,0 45,6 47,7 ± 2,0
T a b e l a 3
Procentowa zawartość komórek żywych
w zawiesinach komórkowych ogrzewanych w temperaturze 42°C
Czas ogrzewania
[min]
Komórki żywe (%)
błękit trypanu barwniki fluorescencyjne
numer próby n x ± SD numer próby n x ± SD 1 2 3 1 2 3 0(1) 69 50 58 3 59 ± 9,5 49,5 58,5 57,0 3 55,1 ± 4,9 0(2) 64 70 69 3 68 ± 3,2 63,8 62,3 63,8 3 63,3 ± 0,9 0(3) 69 59 66 3 65 ± 5,1 60,2 64,0 61,0 3 61,7 ± 2,0 0(4) 63 59 58 3 60 ± 2,6 59,9 56,7 63,8 3 60,2 ± 5,0 5(1) 51 60 58 3 56 ± 4,7 58,0 60,5 60,2 3 59,5 ± 1,3 5(2) 43 60 59 3 54 ± 9,5 48,0 43,4 43,0 3 44,8 ± 2,7 5(3) 49 49 60 3 53 ± 6,3 57,2 52,4 53,6 3 54,4 ± 2,4 5(4) 60 56 63 3 60 ± 3,5 64,4 64,7 64,9 3 64,6 ± 0,3 10(1) 50 47 46 3 48 ± 2,0 41,0 35,0 37,4 3 37,8 ± 3,0 10(2) 46 42 48 3 45 ± 3,0 41,6 40,2 42,9 3 41,5 ± 1,3 10(3) 46 38 50 3 43 ± 6,4 32,2 36,2 36,4 3 34,9 ± 2,3 10(4) 40 39 37 3 39 ± 1,2 42,3 40,8 42,6 3 49,9 ± 0,9
U w a g a : Liczby w nawiasach oznaczają numer próby.
Podobny wniosek pozwalają wyciągnąć wyniki przedstaw ione w tab. 3. W tym przypadku procentow ą zawartość kom órek żywych w zawiesinach nie ogrzewanych (kontrolnych) lub ogrzewanych w tem peraturze 42°C określano po 1 godz. przetrzym ywania kom órek w PBS, w tem peraturze pokojowej. Spowodowało to spadek procentu kom órek żywych w badanych zawiesinach kom órkow ych, stwierdzony obiem a m etodami.
DYSKUSJA
Przy określaniu zawartości żywych kom órek w zawiesinach wykorzystuje się różnicę w przenikaniu różnorodnych barwników przez błony kom órek m artw ych lub żywych. N iektóre barw niki nie m ogą przechodzić przez błonę kom órek żywych. Zalicza się do nich: błękit trypanu, eozyna Y, nigrozyna oraz
barwniki fluorescencyjne, takie jak: jodek propydyny czy brom ek etydyny [3, 6], N atom iast inne barwniki, np: dw uoctan fluoresceiny, penetrują tylko nienaruszoną błonę kom órkow ą [3, 1], W związku z tym w przypadku barwienia bromkiem etydyny lub jodkiem propydyny ocenia się fluorescencję m artw ych kom órek, natom iast w przypadku barwienia oranżem akrydyny określa się fluorescencję kom órek żywych [2, 3, 6],
W ewnątrz kom órki barwniki m ogą wiązać się z różnymi organellami kom órkow ym i lub związkami chemicznymi. Barwniki fluorescencyjne, takie jak: jodek propydyny, brom ek etydyny, oranż akrydyny, najczęściej wiążą się z kwasami nukleinowymi [1, 2, 3, 5, 7, 8, 14]. Inne barwniki, np. nigrozyna 540, rodam ina, m ają zdolność wiązania się z błoną kom órkow ą, natom iast Nikle
R ed wykazuje powinowactwo do lipidów [10]. Niefluorescencyjne barw niki,
takie jak: błękit trypanu, eozyna Y, nigrozyna, m ogą wnikać tylko do m artwych kom órek [6].
Tradycyjnie liczbę żywych lub m artw ych kom órek ocenia się m ik ro skopowo w m ikroskopie świetlnym lub fluorescencyjnym. W przypadku użycia barw ników fluorescencyjnych, zamiast czasochłonnej m etody m ikroskopowej m ożna zastosować cytom etr przepływowy. Użycie cytom etru przepływowego pozwala na policzenie dużej liczby kom órek, co zwiększa wiarygodność otrzymywanych wyników i pozwala również uniknąć subiektywności m etody mikroskopowej [11, 4], M etoda cytometrii przepływowej jest szczególnie użyteczna w ocenie żywotności zawiesin kom órkow ych zawierających niewielki procent kom órek m artwych [4, 9, 13, 15].
Zastosowanie oranżu akrydyny, jak o jedynego barw nika różnicującego kom órki żywe i m artwe, nie zawsze pozwala na uzyskanie dokładnego wyniku. A nalizując wyniki zamieszczone w tab. 1 m ożna stwierdzić, że procent kom órek żywych w zawiesinach barwionych samym oranżem akrydyny jest wyższy niż procent kom órek żywych oznaczany za pom ocą błękitu trypanu. Zastosow anie dodatkow ego barw nika brom ku etydyny (barwiącego kom órki m artwe) pozwoliło precyzyjnie ocenić zawartość żywych kom órek w badanych zawiesinach kom órkowych. W tym przypadku nie obserwowano istotnych różnic między wartościam i procentu kom órek żywych oznaczanych m etodą cytom etryczną lub m ikroskopow ą w różnorodnych zawiesinach k o m ó rk o wych. Świadczy to o pełnej przydatności m etody cytometrycznej do szybkiej oceny żywotności kom órek w zawiesinach kom órek świeżo izolowanych lub poddaw anych różnym stresom.
M etoda cytom etryczna wydaje się być nie tylko mniej czasochłonna niż m etoda m ikroskopow a, ale również bardziej dokładna. Świadczy o tym lepsza pow tarzalność wyników uzyskiwanych tą m etodą w doświadczeniach, w k tó rych oceniano żywotność kom órek w wielu próbach przygotowywanych z tej
samej zawiesiny komórkowej. Stwierdzenie to pozostaje w zgodzie z opiniami autorów stosujących odmienne m etody odróżniania kom órek żywych od m artw ych [8, 15].
LITERATURA
[1] A n d r e e f f M. (1990), Flow Cytometry and Sorting, Chap.: Flow cytometry o f leukemia, Willey-Liss, 697-724.
[2] C a r t e r N. P. (1990), Flow Cytometry A Practical Approach. Chap.: Measurement o f
Cellular Subsets Using Antibodies, ed. M. G. Ormerod, 45-67.
[3] H u n t S . V. (1987), Lymphocytes A Practical Approach, Chap.: Preparation o f Lymphocytes
and Accessory Cells, ed. C. C. B. Klaus, 1-32.
[4] J e n s e n R. H., L e a r y J. F. (1990), Flow Cytometry and Sorting, Chap.: Mutagenesis as
Measured by Flow Cytometry and Cell Sorting, Willey-Liss, 553—562.
[5] J a n s s e n O., W e s s e l b o r g S., H e c k l - O s t r e i c h e r B„ P e c h h o l d K . , B e n d e r A., S c h o l d e n m a i e r S., M o l d e n h a u e r G., K a b e l i t z D. (1991), J. Immu nol., 146, 35-39.
[6] M i s h e l l B. B„ S h u g i S. M., H e n r y C., C h a n E. L„ N o r t h J., G a l l i l y R., S l o m i c h M„ M i l l e r K., M a r b r o o k J., P a r k s D., G o o d A. H. (1980), Selected
Method in Cellular Immunology, Chap.: Preparation o f Mouse Cell Suspensions, ed. B. B.
Mishell, S. M. Shiigj, 1-27.
[7] M y c A., K i m m e l . , D a r z y n k i e w i c z Z., Estimation Dexamethasone ( DEX), Action
on Cell Cycle Kinetics and G-exit in Lymphocytes (w druku).
[8] N i c o l e t t i L, M i g l i o r a t i G., P a g l i a c c i M. C„ G r i g n a n i F„ R i c c a r d i C. (1991), J. Immunol. Meth., 193, 271-279.
[9] N i r R„ Y i s r a e l i Y., L a m e d R., S a h a r E. (1990), Appl. Envion. Microbiol., 56, 3861-3866.
[10] O r m e r o d M. G. (1990), Flow Cytometry A Practical Approach, Chap.: An Introduction to
Fluorescence Technology, ed. M. G. Ormerod, 29-44.
[11] O r m e r o d M. G. (1990), Flow Cytometry A Practical Approach, Chap.: Further Ap plications to Cell Biology, ed. M. G. Ormerod, 265-272.
[12] S a i j o N. (1973), Immunology, 24, 83-690. [13] S t e e n H. B. (1983), Histochem. J. 15, 147-160.
[14] S t e e n H. B„ B o y e E., S k a r s t a d K., B l o o m B. (1982), Cytometry, 2, 249-257. [15] S z e k e l y J . G . , L o b r e a u A. U., E i n s p e n n e r M . , R a a p h o r s t G. P. (1989), Int. J.
Radiat. Biol., 47, 681-688.
Wpłynęło do Redakcji Folii Katedra Biofizyki Molekularnej
15 07 1992 r. K atedra Termobiologu
Uniwersytet Łódzki Centrum Mikrobiologii i Wirusologii PAN
Andrzej Zaborowski. Magdalena Klink, Błażej Rózga
THE CYTOMETRIC METHOD FOR MEASUREMENT OF THE VIABILITY OF LYMPHOID CELLS UNDER HEAT SHOCK
The viability of freshly isolated or heat-treated lymphocytes was estimated by the classical microscopic method based on trypan blue inclusion and it was measured by flow cytometry of the cells stained with acridine orange and ethydium bromide or with acridine orange alone. It has been showed that (low cytometry of fluorescence stained cells allowed to determine the viability of the cell suspensions containing even a small percentage of dead cells rapidly and accurately.
