Artyku³ przegl¹dowy Review
Po raz pierwszy wirus grypy wiñ (swine influenza virus SIV) zosta³ wyizolowany od zwierz¹t choruj¹-cych z objawami zaburzeñ ze strony uk³adu oddecho-wego przez Richarda Shopea w 1918 r. (21). Na pod-stawie charakterystyki serologicznej szczepów wirusa grypy izolowanych w tym czasie od ludzi i wykazanego ich bliskiego pokrewieñstwa z pochodz¹cym od wiñ szczepem A/swine/Iowa/15/30, o wzorze antygenowym H1N1, okrelanym jako klasyczny podtyp wirusa in-fluenzy wiñ (classical swine influenza virus), Shope postawi³ hipotezê, ¿e by³ on odpowiedzialny za wybuch pandemii grypy zwanej hiszpank¹. Teoria ta zosta³a pó-niej potwierdzona przez wyniki analizy sekwencji nu-kleotydowej omawianych drobnoustrojów (10).
Analizy filogenetyczne wirusów grypy, jak równie¿ serologiczne badania diagnostyczne czy stosowane do oceny immunogennoci szczepionek opieraj¹ siê na budowie bia³ek hemaglutyniny (H) i neuraminidazy (N). W populacji cz³owieka oraz wiñ wystêpuj¹ najczêciej szczepy posiadaj¹ce H typu 1 i 3 oraz N typu 1 i 2 (2).
Pochodzenie szczepów SIV wystêpuj¹cych na wiecie
Szczep klasyczny influenzy wiñ H1N1 utrzymywa³ siê na kontynencie pó³nocnoamerykañskim przez wiele lat, po czym w 1970 r. zosta³ zawleczony do Europy (g³ównie W³och) i Azji (19). Pod koniec lat 70. stop-niowo ust¹pi³ miejsca ptasiej odmianie wirusa grypy (avian like) o tym samym podtypie, który rozpowszech-ni³ siê i utrwali³ wród europejskich wiñ (4). Równo-legle do populacji trzody chlewnej zosta³ wprowadzo-ny ludzki szczep wirusa grypy o wzorze H3N2, odpo-wiedzialny za epidemiê grypy ludzi w 1968 r. Spowo-dowa³ on masowe zachorowania wiñ w Czechos³owa-cji w 1975 r. (24), we W³oszech w 1980 r. (17), w Belgii (11) oraz Francji (1) w 1984 r., jak równie¿ w Wielkiej Brytanii w 1987 r. (27). W po³owie lat 80. wród izola-tów SIV pojawi³y siê dwa reasortanty: H3N2 oraz H1N2. Pierwszy z nich wystêpowa³ w dwóch postaciach: re-asortanta podwójnego oraz potrójnego. Podwójny reasortant powsta³ w wyniku wymieszania siê genów
Mo¿liwoci i ograniczenia
profilaktyki swoistej grypy wiñ
IWONA MARKOWSKA-DANIEL, ANDRZEJ KOWALCZYKZak³ad Chorób wiñ Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Markowska-Daniel I., Kowalczyk A.
Possibilities and limitations of swine influenza prophylaxis Summary
The aim of the paper was the presentation of the newest information regarding abilities to prevent swine influenza using conventional vaccines and technologically advanced preparations obtained by using genetic engineering.
In the 90s most swine influenza isolates were closely related to human influenza virus and therefore the vaccine based on human virus type A, subtype H3N2, was widely used. Due to its subsequently decreased efficacy, resulting from antigenic drift and shift as well as the occurrence of new reasorrtants, a new generation of preparations was elaborated. Induction of natural protection against influenza virus is correlated with non-mutation-dependant antibodies, therefore the use of genes coding conserve proteins for immunoprophylaxis was tested. The use of protein NS1 as a differentiation marker between naturally exposed and vaccinated animals, as well as protein NP as an antigen inducing effective cell-mediated and humoral immunological response were suggested. Much attention was given to the selection of gene carriers like plasmid vectors and recombinant viruses; the mechanism of cross-immunoprotection between SIV subtypes; and the adjuvant function.
Currently we have no commercially available new generation vaccine that would be able to guarantee spectacular results of immunization for pig breeders, but we have to underline that pilot studies on animals models have as a goal the development of effective tools for the protection of humans against influenza.
ludzkiego szczepu H3N2 oraz klasycznego wiñskiego szczepu H1N1, za potrójny reasortant zawiera³ dodat-kowo geny pochodz¹ce z ptasiej odmiany wirusa (4). Z kolei szczep o wzorze H1N2 by³ nowym podtypem posiadaj¹cym gen H najbardziej zbli¿ony do ludzkiego wirusa H1N1 kr¹¿¹cego w latach 80. oraz gen N wyka-zuj¹cy pokrewieñstwo z genem N szczepu wystêpuj¹-cego u ludzi (human-like) H3N2 (2). W Wielkiej Bryta-nii wykazano obecnoæ szczepu H1N2 bêd¹cego wielo-krotnym reasortantem, który powodowa³ zachorowania wiñ na du¿¹ skalê, kr¹¿¹c daleko poza pierwotnym miejscem jego izolacji. Omawiany skok antygenowy jest typem mutacji wystêpuj¹cym rzadko, ale powoduj¹cym powa¿ne utrudnienia zarówno w diagnostyce, szczegól-nie serologicznej, jak i w immunoprofilaktyce.
Najczêciej wystêpuj¹cy mechanizm zmiennoci po-legaj¹cy na pojedynczych mutacjach w genomie wirusa grypy w znacznie mniejszym stopniu wp³ywa na s³ab¹ ochronê obserwowan¹ po szczepieniu ni¿ ma to miej-sce w przypadku skoku antygenowego (2). Przyk³adem tego procesu mo¿e byæ nieznaczne zró¿nicowanie szcze-pów SIV wyizolowanych w Holandii w latach 1995--1996, maj¹ce cis³y zwi¹zek z miejscem izolacji wiru-sa (4). Nie stwierdzono natomiast rozbie¿noci miêdzy izolatami z dwóch nastêpuj¹cych po sobie epizodów choroby w obrêbie tej samej fermy. Przyjêto wiêc, ¿e nowe mikro-warianty mog¹ rezydowaæ w populacji stada przez kilka sezonów, powoduj¹c corocznie zacho-rowania zwierz¹t.
Szczepienia tradycyjne
Wród scharakteryzowanych antygenowo izolatów SIV pochodz¹cych z Europy, zgromadzonych w latach 1977-1995, wiêkszoæ wykazywa³a bliskie pokrewieñ-stwo ze szczepami ludzkimi pochodz¹cymi z lat 1972--1979. Wskazuje to na wprowadzenie wirusa grypy z populacji ludzi do populacji trzody chlewnej na po-cz¹tku lat 70. Z tego powodu ludzki szczep wirusa gry-py typu A, podtypu H3N2, stanowi³ szczepionkê stoso-wan¹ w profilaktyce grypy wiñ a¿ do koñca lat dzie-wiêædziesi¹tych (5). Okaza³o siê jednak, ¿e izolaty pochodz¹ce z przypadków grypy wiñ w Holandii po-cz¹wszy od 1993 r. nie reagowa³y krzy¿owo z surowic¹ przeciwko ludzkiej odmianie szczepu H3N2, co potwier-dza, ¿e niska efektywnoæ szczepieñ mog³a byæ spowo-dowana niedostosowaniem antygenu szczepionkowego do bie¿¹cej sytuacji epizootycznej. Porównano tak¿e szczepy H3N2 izolowane od ludzi i wiñ w tym czasie na obszarze Holandii i Belgii. Okaza³o siê, ¿e uplaso-wa³y siê one na odrêbnej ga³êzi powi¹zañ filogenetycz-nych (5). Uznano wiêc, ¿e przyczyn¹ wspomniafilogenetycz-nych za-chorowañ wiñ by³ inny wirus H3N2, który dosta³ siê do populacji trzody chlewnej, ni¿ szczep zbli¿ony do stanowi¹cego szczepionkê. Przeprowadzone badania serologiczne wykaza³y reaktywnoæ izolatów holender-skich skolekcjonowanych po 1993 r. z przeciwcia³ami dla odmiany wiñskiej H3N2. Na tej podstawie de Jong i wsp. (5) odrzucili koncepcjê wprowadzenia ludzkiego szczepu H3N2 do populacji wiñ na pocz¹tku lat 90. Wyniki te wyranie kontrastowa³y z opisanymi przez
Donatelli i wsp. (6) badaniami przeprowadzonymi w 1995 r. we W³oszech, w których wykazano reaktyw-noæ izolatów SIV z surowic¹ posiadaj¹c¹ przeciwcia³a dla ludzkiej odmiany szczepu H3N2. Przedstawione roz-bie¿noci mog³y wynikaæ z ró¿nego pochodzenia geo-graficznego szczepów SIV. Rozpatruj¹c przyczyny nie-skutecznoci szczepieñ wiñ w krajach Beneluksu szcze-pionk¹ zawieraj¹c¹ komponenty wirusa ludzkiego, po-stawiono dwie hipotezy. Wed³ug pierwszej brak reakcji krzy¿owych w tecie HI oraz oddzielny filogenetycznie podklaster izolatów wiñskich w stosunku do szczepów ludzkich by³ spowodowany niezale¿nym dryftem nowe-go typu H3N2. Druga wskazywa³a na zmianê w budo-wie podstawników w ³añcuchu aminokwasowym hema-glutyniny w pozycji 144, polegaj¹c¹ na glikozylacji. Zaznaczono jednak, ¿e tego rodzaju zmiana nie wp³y-wa na przebieg reakcji immunologicznej w sposób rów-nowa¿ny jak w przypadku substytucji aminokwasowej (5).
Znanym zjawiskiem jest indukcja wysokiego pozio-mu przeciwcia³ w nastêpstwie szczepieñ homologicz-nych i s³absza ochrona oraz odpowied po szczepieniach heterologicznych (22). W celu przeledzenia wystêpo-wania oraz mechanizmów immunoprotekcji krzy¿owej miêdzy ró¿nymi podtypami SIV, a szczególnie wobec nowego reasortanta H1N2, przeprowadzono szereg do-wiadczeñ. Miêdzy innymi Van Reeth i wsp. (20) im-munizowali zdrowe, seronegatywne winie szczepami H1N1, H1N2 oraz H3N2 w nastêpuj¹cych 5 kombina-cjach: oddzielnie ka¿dym z trzech wariantów wirusa, podaj¹c równoczenie atenuowane szczepy H1N1 i H3N2 lub aplikuj¹c konwencjonaln¹ szczepionkê zawieraj¹c¹ komponenty szczepów H1N1 oraz H3N2 z 1976 r. Po zaka¿eniu kontrolnym wszystkich osobni-ków szczepem H1N2 wyizolowanym w 1998 r. stwier-dzono wysokie miano przeciwcia³ w grupach szczepio-nych szczepami homologicznymi, s³ab¹ indukcjê prze-ciwcia³ (2 osobniki na 9) w grupie immunizowanej H1N1 oraz H3N2 w sposób skojarzony, natomiast ko-mercyjny biopreparat nie zapewnia³ ochrony. Prawdo-podobnie by³o to spowodowane ró¿nicami w sekwencji aminokwasowej bia³ka H, bowiem 39 miejsc by³o od-miennych w genie H w podtypie H1N1 i H1N2. Brak ochrony immunologicznej ze strony szczepionki komer-cyjnej wskazuje jednoznacznie, ¿e mutacje zachodz¹ce w budowie hemaglutyniny maj¹ znacz¹cy wp³yw na efektywnoæ szczepieñ, potwierdzaj¹c tym samym ko-niecznoæ okresowej aktualizacji sk³adu biopreparatów stosowanych w zapobieganiu grypie wiñ.
W badaniach na myszach stwierdzono, ¿e zaka¿enie kontrolne wirusem grypy analogicznym do zastosowa-nego w szczepionce nie wywo³uje ¿adnych objawów klinicznych, a obecnoci wirusa nie wykrywa siê w dro-gach oddechowych po up³ywie jednego dnia od zaka¿e-nia. Z kolei zaka¿enie szczepem heterologicznym wy-d³u¿a okres siewstwa z jednego dnia do piêciu, jedno-czenie zwiêkszaj¹c proliferacjê i ró¿nicowanie limfo-cytów T cytotoksycznych (28).
Naukowcy z Uniwersytetu w Ames (14) po podaniu prosiêtom wirusa heterologicznego w stosunku do
prze-ciwcia³ obecnych w siarze macior zaobserwowali wzmo-¿one objawy zapalenia p³uc, bêd¹ce prawdopodobnie konsekwencj¹ interferencji i zmiany kierunku prolife-racji limfocytów pomocniczych Th1 na Th2. Wzmo¿o-na proliferacja Th2 hamuje tworzenie subpopulacji Th1 oraz wzmaga wydzielanie interleukiny (IL) 4 i 10. W takim przypadku przeciwcia³a siarowe nie s¹ w sta-nie wzbudziæ szybkiej odpowiedzi komórkowej zwi¹za-nej z Th1 i doprowadziæ do usuniêcia wirusa z ustroju.
Szczepionki genetyczne i rekombinowane
Brak w pe³ni skutecznej ochrony przed zaka¿eniem wirusem grypy po zastosowaniu szczepionek konwen-cjonalnych zrodzi³ potrzebê podjêcia badañ zmierzaj¹-cych do opracowania nowoczesnych preparatów opar-tych m.in. na wykorzystaniu kwasów nukleinowych. Rozwój badañ w tym kierunku uzasadniony by³ tak¿e koniecznoci¹ znalezienia alternatywnej metody immu-nizacji, pozwalaj¹cej unikn¹æ ryzyka wynikaj¹cego z wprowadzania ca³ego wirusa, jego mutacji podczas pasa¿y w procesie produkcji czy objawów ubocznych bêd¹cych konsekwencj¹ alergizacji przez bia³ka jaj ku-rzych, nadal powszechnie wykorzystywanych do pro-dukcji antygenu szczepionkowego. Wiêkszoæ badañ w tym zakresie koncentruje siê na wykorzystaniu plaz-midów DNA zawieraj¹cych geny koduj¹ce antygeny po-wierzchniowe H oraz N, wprowadzanych domiênio-wo (i.m.), do¿ylnie, donosodomiênio-wo (i.n.) lub ródskórnie, najczêciej przy u¿yciu tzw. pistoletu genowego (gene gun) (9). Poniewa¿ wprowadzony materia³ jest podda-wany ekspresji de novo w komórkach, jego produkt jest eksponowany przez receptory MHC klasy I i II, czego rezultatem jest stymulowanie zarówno odpowiedzi ko-mórkowej, jak i humoralnej.
Zdania badaczy na temat skutecznoci szczepionek DNA bazuj¹cych na genie H s¹ podzielone. Dla przy-k³adu: Ulmer i wsp. (25) sugeruj¹ brak znacz¹cej ochro-ny immunologicznej u wiñ po wstrzykniêciu DNA z genem H. Z kolei Larsen i wsp. (15) odnotowali wzrost poziomu przeciwcia³ po szczepieniu szczepionk¹ gene-tyczn¹ z genem H i dodatkowej immunizacji szczepionk¹ tradycyjn¹.
Tian i wsp. z Instytutu Weterynarii w Harbin w Chi-nach (23) postanowili zwróciæ uwagê na rodzaj wekto-ra, pozostawiaj¹c wysoce zmienny gen H jako antygen szczepionkowy. W swoich badaniach wykorzystali wi-rus choroby Aujeszkyego (PRV), w którym zast¹pili nieistotne fragmenty repetytywne genem H wyciêtym z izolatu podtypu H3N2 z 2001 r., pochodz¹cego od wi-ni wykazuj¹cej objawy grypopodobne. Dziêki temu cz¹stka zakana nie straci³a funkcji replikacyjnych in vivo oraz in vitro, nabywaj¹c zredukowan¹ wirulencjê. Immunizacji poddano myszy podaj¹c jednej grupie zwie-rz¹t dowiadczalnych i.n. wirusa transgenicznego, dru-giej wyjciowy szczep PRV, a trzeciej grupie placebo. Dwadziecia osiem dni póniej zwierzêta poddano za-ka¿eniu kontrolnemu szczepem H3N2, z którego pocho-dzi³ gen H. Przeciwcia³a anty-SIV wykryto wy³¹cznie w grupie myszy szczepionych transgenicznym PRV-H, przy czym ich poziom podnosi³ siê do 6 tygodni po
za-ka¿eniu. Badania histopatologiczne wykaza³y u nich brak typowych, zwi¹zanych z zaka¿aniem SIV, zmian w obrêbie uk³adu oddechowego. U pozosta³ych zwie-rz¹t przeciwcia³a na minimalnym poziomie wykryto dopiero po 6 tygodniach. Na podstawie uzyskanych wyników Tian i wsp. uznali, ¿e rekombinat PRV-H jest w stanie zapewniæ ochronê myszy zaka¿anych SIV, in-dukuj¹c przede wszystkim odpowied typu komórko-wego.
Kompleksowe badania w tym zakresie przeprowadzili tak¿e Macklin i wsp. (16). Dokonali oni oceny immu-nogennoci oraz wartoci ochronnej szczepionki DNA zawieraj¹cej plazmid nios¹cy gen H lub gen nukleopro-teiny (NP), op³aszczone na cz¹steczkach z³ota, które aplikowali w 6 miejsc na skórze lub dojêzykowo (ce-lem penetracji do uk³adu immunologicznego b³on lu-zowych). Porównali ponadto skutecznoæ szczepionek genetycznych z biopreparatem komercyjnym, zawiera-j¹cym inaktywowane cz¹stki ca³ego wirusa oraz z po-ziomem odpornoci nabytej po przechorowaniu grypy. Immunizowane jednorazowo lub dwukrotnie w odstê-pie 4 tygodni warchlaki poddano zaka¿eniu kontrolne-mu szczepem H1N1 SIV, podanym i.n. 2 tygodnie po powtórnej immunizacji. Stwierdzono, ¿e jednorazowa immunizacja konstruktami genetycznymi nie by³a wy-starczaj¹ca do indukcji przeciwcia³ dla wirusa grypy na wykrywalnym poziomie. Wy¿sze miano przeciwcia³ za-rejestrowano po dwukrotnej aplikacji antygenu szcze-pionkowego do uk³adu immunologicznego b³on luzo-wych. Z kolei miano przeciwcia³ aglutynuj¹cych by³o wy¿sze u zwierz¹t immunizowanych ródskórnie. Naj-wy¿szy poziom odpowiedzi humoralnej stwierdzono u zwierz¹t immunizowanych szczepionk¹ komercyjn¹. Zwierzêta zaka¿one naturalnie produkowa³y przeciw-cia³a 3 tygodnie po zaka¿eniu, a poziom odpowiedzi im-munologicznej by³ zbli¿ony do grup immunizowanych preparatami zawieraj¹cymi gen H. Oceniaj¹c wartoæ ochronn¹ testowanych szczepionek brano pod uwagê miano wirusa w wydzielinie z nosa oraz czas trwania siewstwa. Szczepienie konstruktem zawieraj¹cym gen NP nie wp³ynê³o zasadniczo na ograniczenie amplifi-kacji wirusa. Zwierzêta immunizowane genem H tak¿e nie by³y w pe³ni chronione przed infekcj¹, ale siewstwo wirusa utrzymywa³o siê o 2 dni krócej ni¿ w grupie kon-trolnej, a jego miano w grupie szczepionej dojêzykowo by³o istotnie ni¿sze dzieñ po zaka¿eniu ni¿ po immuni-zacji ródskórnej. Szczepionka komercyjna, pomimo in-dukcji najwy¿szego poziomu przeciwcia³, zapewni³a naj-ni¿szy poziom ochrony na zaka¿enie kontrolne sporód wszystkich ocenianych biopreparatów. Jedynie przecho-rowanie infekcji dawa³o kompletn¹ ochronê przed powtórnym zaka¿eniem kontrolnym SIV. W zwi¹zku z uzyskaniem wysokiego poziomu genowo specyficz-nej odpowiedzi humoralspecyficz-nej i wymiernego ograniczenia amplifikacji wirusa, autorzy tej pracy pok³adaj¹ du¿e nadzieje w opracowaniu w pe³ni skutecznych szczepio-nek genetycznych przeciwko grypie ludzi.
Grupa naukowców amerykañskich (26) podjê³a ba-dania nad wykorzystaniem rekombinowanego adenowi-rusa 5 (ADV5) jako wektora cz¹steczek RNA wiadenowi-rusa
grypy. Stworzono trzy konstrukty zawieraj¹ce: gen H, NP oraz obydwa geny, pochodz¹ce ze szczepu H3N2 powoduj¹cego kliniczne przypadki grypy wiñ w Ame-ryce Pó³nocnej. Podawano je i.m. prosiêtom po odsa-dzeniu. Wesley i wsp. (26) zrejestrowali wysokie miano przeciwcia³ u osobników szczepionych ADV5 z genem H oraz z kombinacj¹ dwóch genów, pocz¹wszy od dru-giego tygodnia po immunizacji. Zwierzêta szczepione preparatem zawieraj¹cym obydwa geny by³y ca³kowi-cie chronione przed zaka¿eniem, co wyra¿a³o siê bra-kiem objawów grypy po zaka¿eniu dowiadczalnym oraz zmian patologicznych w p³ucach 1 tydzieñ po infekcji, nie wykrywano u nich równie¿ obecnoci wirusa w wymazach z nosa. U wiñ szczepionych wektorem z samym genem H miano wirusa kszta³towa³o siê na niskim poziomie. Z kolei grupa zwierz¹t immunizowa-na wy³¹cznie genem NP oraz grupa kontrolimmunizowa-na nie wy-tworzy³y odpowiedzi humoralnej do 5. tygodnia po im-munizacji. Typowe dla grypy zmiany histopatologiczne w tkance p³ucnej zarejestrowano wy³¹cznie u zwierz¹t kontrolnych. Na tej podstawie za istotny czynnik deter-minuj¹cy skuteczn¹ ochronê przeciwko wirusowi gry-py uznano kombinacjê dwóch insertów H oraz NP. Autorzy ci uwa¿aj¹, ¿e zalet¹ opracowanej przez nich szczepionki jest brak interferencji antygenu szczepion-kowego z przeciwcia³ami siarowymi, które mog¹ blo-kowaæ efekty immunizacji m³odych prosi¹t szczepion-kami tradycyjnymi. Wyniki tych badañ korespondu-j¹ z zaprezentowanymi wczeniej rezultatami prac Macklina i wsp. (16).
Liczne zachorowania powodowane w ostatnich latach przez wysoce patogenne szczepy wirusa grypy ptasiej podtypu H5N1 sk³oni³y do badañ nad mo¿liwoci¹ wy-korzystania rekombinantów ADV z konserwatywnym genem NP tego szczepu. Epstein i wsp. (7) zaobserwo-wali, ¿e immunizacja myszy ADV z genem NP wyra-nie zwiêksza³a odpowied humoraln¹ oraz wydzielawyra-nie IFN-g i TNF-a, a tak¿e limfocytów T CD4+ oraz CD8+ w stosunku do zwierz¹t szczepionych wy³¹cznie plazmi-dem z genem NP. Taka immunizacja dawa³a efektywn¹ ochronê przeciwko 200-krotnie wiêkszej dawce wirusa H1N1 u¿ytej do challengu, która dla myszy kontrolnych okaza³a siê letalna. W przypadku zaka¿enia wysoce pa-togennym szczepem H5N1 myszy immunizowane plaz-midem z genem NP utraci³y mniej masy cia³a w stosun-ku do grupy kontrolnej, a 50% z nich prze¿y³o challen-ge, podczas gdy wszystkie myszy kontrolne pad³y po zaka¿eniu. Wykazano równie¿ wyranie ni¿sze miano wirusa w p³ucach myszy z grupy dowiadczalnej. Uzna-no, ¿e wektor adenowirusowy wp³ywa korzystnie na podwy¿szenie skutecznoci szczepionki, stymuluj¹c zarówno odpowied humoraln¹, jak i komórkow¹ oraz hamuj¹c replikacjê wirusa. Badania te potwierdzi³y rów-nie¿ przydatnoæ preparatów opartych na konserwatyw-nych fragmentach genomu wirusa grypy oraz wiêksz¹ wydajnoæ i skutecznoæ rekombinantów w porówna-niu do iniekcji plazmidowego DNA (8).
Wytworzenie naturalnej ochrony przeciwko wiruso-wi grypy typu A jest skorelowane z obecnoci¹ prze-ciwcia³, które w du¿ej mierze nie by³yby zwi¹zane ze
zmiennoci¹ antygenow¹ (12). G³ównym zadaniem ta-kich szczepieñ by³aby indukcja odpowiedzi immunolo-gicznej w stosunku do bardziej konserwatywnych bia-³ek lub epitopów, st¹d podjêto badania zmierzaj¹ce do okrelenia w³aciwoci immunogennych bia³ek we-wnêtrznych SIV, w tym: niestrukturalnego (NS1 i NS2), NP oraz matrix (M1). Kim i wsp. (13) wykorzystali dwie grupy warchlaków: pierwsz¹ stanowi³y zwierzêta zaka-¿ane i.n. izolatami H1N1 i H3N2, natomiast drug¹ war-chlaki szczepione i.m. szczepionk¹ komercyjn¹ opart¹ na komponentach tych samych podtypów wirusa. Od-powied immunologiczna wobec bia³ek NP i M1 by³a w grupie pierwszej zbli¿ona w odniesieniu do obydwu podtypów wirusa. Obecnoæ IgM oraz IgG rejestrowa-no ju¿ 7. dnia po zaka¿eniu wobec bia³ek NP, a tak¿e NS1 i NS2. IgM utrzymywa³y siê u wielu wiñ, a IgG u wszystkich zwierz¹t do 28. dnia po zaka¿eniu. ¯adne ze zwierz¹t nie wytworzy³o natomiast przeciwcia³ kla-sy IgM anty M1, za przeciwcia³a klakla-sy IgG wykryto 14 dni po infekcji. Dla porównania, w grupie sk³adaj¹cej siê ze wiñ szczepionych rejestrowano s³ab¹ odpowied na bia³ka NP i M1 oraz ca³kowity brak odpowiedzi na bia³ko NS. Podobne obserwacje poczyniono wczeniej ledz¹c odpowied immunologiczn¹ przeciwko wiru-sowi grypy koni (18). Na podstawie uzyskanych wyni-ków zaproponowano aby bia³ko NS1 wykorzystaæ jako marker ró¿nicuj¹cy zwierzêta naturalnie eksponowane na dzia³anie wirusa od zwierz¹t szczepionych, natomiast ze wzglêdu na znaczny konserwatyzm w budowie ami-nokwasowej i zdolnoæ do wczesnej indukcji przeciw-cia³, za najlepszy antygen szczepionkowy uznano bia³-ko NP.
Heinen i wsp. (12) opracowali wektor bazuj¹cy na korowej czêci wirusa ¿ó³taczki typu B (HeB), na któ-rym op³aszczyli zewn¹trzotoczkowy fragment bia³ka M2 oraz gen NP (szczepionka HeB-M2-NP). Do³¹czenie genu NP by³o podyktowane dodatkow¹ indukcj¹ proli-feracji cytotoksycznych limfocytów T. Oba inserty: bia³-kowy i DNA pochodzi³y ze szczepu H3N2 A/Sw/Oeden-rode/96, wyizolowanego od chorej wini w tym samym roku. Do badañ wykorzystano 10-tygodniowe warchla-ki, które immunizowano 3-krotnie w odstêpach 3-tygod-niowych. Grupa I otrzyma³a i.m. wektor posiadaj¹cy jedynie bia³ko M2, grupa II otrzyma³a i.m. ten sam kon-strukt z dodatkiem adiuwantu, winie grupy III immu-nizowano ródskórnie szczepionk¹ zawieraj¹c¹ obydwa inserty, natomiast zwierzêta z grupy IV stanowi³y kon-trolê. Cztery tygodnie po ostatnim szczepieniu zwierzê-ta poddano zaka¿eniu kontrolnemu szczepem H1N1. Rejestrowano wysoki poziom przeciwcia³ przeciwko bia³ku M, a w grupie III dodatkowo wirusowo specy-ficzn¹ odpowied proliferacyjn¹ ze strony limfocytów T. Pomimo potencjalnie szerokiego spektrum dzia³ania skonstruowanej szczepionki nie stwierdzono jej skutecz-noci, bowiem nie zabezpieczy³a ona ¿adnej ze wiñ przed zaka¿eniem kontrolnym. Zaobserwowano nato-miast wiêksze nasilenie objawów chorobowych u wiñ szczepionych w porównaniu z grup¹ kontroln¹, a wspó³-czynnik miertelnoci w grupie III wynosi³ a¿ 50%. Tak-¿e szczepienie konstruktem z samym bia³kiem M2,
w odró¿nieniu od odpornoci, jak¹ uzyska³y immuni-zowane porównawczo myszy, nie zapewni³o winiom ochrony przed zaka¿eniem, aczkolwiek objawy klinicz-ne grypy by³y znacznie ³agodniejsze w porównaniu do wiñ kontrolnych czy zwierz¹t z grupy III. Nie wyja-niono jednoznacznie tego zjawiska, przypuszczalnie lim-focyty Th nasili³y proces zapalny. Brak protekcji móg³ równie¿ wynikaæ z niezgodnoci podtypów szczepu szczepionkowego oraz u¿ytego do zaka¿enia. Podobne zjawisko rejestrowano w przebiegu zaka¿enia wirusem gor¹czki Denga, gdzie obserwowano nasilenie objawów chorobowych przez heterotypowe przeciwcia³a nieneu-tralizuj¹ce (12).
Prowadz¹c badania nad szczepionkami przeciwko grypie, ukierunkowanymi na stymulacjê mechanizmów odpornociowych b³on luzowych, de Filette i wsp. (3) zwrócili uwagê na dobór bezpiecznego i skutecznego adjuwantu. W tym celu do rekombinowanej szczepion-ki opartej na genie M2 wklonowanym do wirusa zapa-lenia w¹troby typu B jako adiuwant zastosowali enzy-matycznie aktywn¹ podjednostkê toksyny pa³eczki cho-lery po³¹czon¹ z genem koduj¹cym fragment proteiny A Staphylococcus aureus, która wi¹¿e siê z receptorem dla IgG. Okaza³o siê, ¿e donosowa aplikacja szczepion-ki da³a stuprocentow¹ ochronê zaka¿onych kontrolnie myszy, u których rozwinê³a siê zarówno odpowied humoralna, jak i odpowied ze strony limfocytów Th1. Z kolei podanie dootrzewnowe preparatu powodowa³o wprawdzie wzrost miana przeciwcia³, ale nie reduko-wa³o wspó³czynnika miertelnoci.
Podsumowanie
Pomimo wielu wysi³ków, na razie brak jest komer-cyjnego biopreparatu nowej generacji, który móg³by zagwarantowaæ hodowcom trzody chlewnej spektaku-larne efekty immunizacji, co powoduje, ¿e szczepienia przeciwko grypie wiñ nie s¹ powszechnie stosowane. Nale¿y pamiêtaæ, ¿e badania prowadzone na modelach zwierzêcych maj¹ charakter eksperymentalny, a ich za-sadniczym celem jest opracowanie skutecznych metod ochrony ludzi przeciwko grypie. W zwi¹zku z dynamicz-nym rozwojem technik molekularnych, byæ mo¿e, w nie-dalekiej przysz³oci cel ten zostanie osi¹gniêty. Bior¹c pod uwagê postêpuj¹c¹ ewolucjê wirusa zaleca siê sta-³y monitoring aktualnie kr¹¿¹cych szczepów w celu oce-ny zgodnoci antygenów zawartych w szczepionce ze szczepami wystêpuj¹cymi na danym obszarze geogra-ficznym.
Pimiennictwo
1.Aymard M., Gourreau J. M., Kaiser C., Fontaine M., Madec F., Tillon J. P.: Immunovirologic markers of the risk of influenza A H3N2 among swine. Rev. Epidemiol. Sante Publ. 1985, 33, 283-291.
2.Brown H. I.: The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs. Vet. Microbiol. 2000, 74, 29-46.
3.de Filette M., Ramne A., Birkett A., Lycke N., Lowenadler B., Min Jou W., Saelens X., Fiers W.: The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection. Vaccine 2006, 24, 544-551.
4.de Jong J. C., Heinen P. P., Loeffen W. L., van Nieuwstadt A. P., Claas E. C., Bestebroer T. M., Bijlsma K., Verweij C., Osterhaus A. D., Rimmelzwaan G. F., Fouchier R. A., Kimman T. G.: Antigenic and molecular heterogeneity in recent swine influenza A (H1N1) virus isolates with possible implications for vaccina-tion policy. Vaccine 2001, 14, 4452-4464.
5.de Jong J. C., van Nieuwstadt A. P., Kimman T. G., Loeffen W. L., Beste-broer T. M., Bijlsma K., Verweij C., Osterhaus A. D., Class E. C.: Antigenic drift in swine influenza H3 haemagglutinins with implications for vaccination policy. Vaccine 1999, 17, 1321-1328.
6.Donatelli I., Campitelli L., Di Trani L., Puzelli S., Selli L., Fioretti A., Alexan-der D. J., Tollis M., Krauss S., Webster R. G.: Characterization of H5N2 influenza viruses from Italian poultry. J. Gen. Virol. 2001, 82, 623-630. 7.Epstein S. L., Kong W. P., Misplon J. A., Lo C. Y., Tumpey T. M., Xu L.,
Nabel G. J.: Protection against multiple influenza A subtypes by vaccination with highly conserved nucleoprotein. Vaccine 2005, 23, 5404-5410. 8.Epstein S. L., Stack A., Misplon J. A., Lo C. Y., Mostowski H., Bennink J.:
Vaccination with DNA encoding internal proteins of influenza virus does not require CD8+ CTL: either CD4+ or CD8+ T cells can promote survival and recovery after challenge. Int. Immunol. 2000, 12, 91-101.
9.Eriksson E., Yao F., Svensjo T., Winkler T., Slama J., Macklin M. D., Andree C., McGregor M., Hinshaw V., Swain W. F.: In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J. Surg. Res. 1998, 78, 85-91.
10.Fanning T. G., Slemons R. D., Reid A. H., Janczewski T. A., Dean J., Tauben-berger J. K.: 1917 avian influenza virus sequences suggest that the 1918 pan-demic virus did not acquire its hemagglutinin directly from birds. J. Virol. 2002, 76, 7860-7862.
11.Haesebrouck F., Pensaert M.: Influenza in swine in Belgium (1969-1986): epizootiologic aspects. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 1988, 11, 215--222.
12.Heinen P. P., Rijsewijk F. A., de Boer-Luijtze E. A., Bianchi A. T.: Vaccination of pigs with a DNA construct expressing an influenza virus M2-nucleoprotein fusion protein exacerbates disease after challenge with influenza A virus. J. Gen. Virol. 2002, 83, 1851-1859.
13.Kim W. I., Wu W. H., Janke B., Yoon K. J.: Characterization of the humoral immune response of experimentally infected and vaccinated pigs to swine influenza viral proteins. Arch. Virol. 2006, 151, 23-36.
14.Kitikoon P., Nilubol D., Erickson B. J., Janke B. H., Hoover T. C., Sornsen S. A., Thacker E. L.: The immune response and maternal antibody interference to a heterologous H1N1 swine influenza virus infection following vaccination. Vet. Immunol. Immunopathol. 2006, 112, 117-128.
15.Larsen D. L., Karasin A., Olsen C. W.: Immunization of pigs against influenza virus infection by DNA vaccine priming followed by killed-virus vaccine boosting. Vaccine 2001, 19, 2842-2853.
16.Macklin M. D., McCabe D., McGregor M. W., Neumann V., Meyer T., Callan R., Hinshaw V. S., Swain W. F.: Immunization of pigs with a particle-mediated DNA vaccine to influenza A virus protects against challenge with homologous virus. J. Virol. 1998, 72, 1491-1496.
17.Mancini G., Donatelli I., Rozera C., Arangio Ruiz G., Butto S.: Antigenic and biochemical analysis of influenza A H3N2 viruses isolated from pigs. Arch. Virol. 1985, 83, 157-167.
18.Ozaki H., Sugiura T., Sugita S., Imagawa H., Kida H.: Detection of antibodies to the nonstructural protein (NS1) of influenza A virus allows distinction between vaccinated and infected horses. Vet. Microbiol. 2001, 82, 111-119. 19.Reid A. H., Fanning T. G., Janczewski T. A., Taubenberger J. K.:
Characteriza-tion of the 1918 Spanish influenza virus neuraminidase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 6785-6790.
20.Van Reeth K. V., Brown I., Essen S., Pensaert M.: Genetic relationships, sero-logical cross-reaction and cross-protection between H1N2 and other influenza A virus subtypes endemic in European pigs. Virus Res. 2004, 103, 115-124. 21.Shope R. E.: The swine lungworm as a reservoir and intermediate host for swine
influenza virus. V. Provocation of swine influenza by exposure of prepared swine to adverse weather. J. Exp. Med. 1955, 102, 567-572.
22.Tamura S., Tanimoto T., Kurata T.: Mechanisms of broad cross-protection provided by influenza virus infection and their application to vaccines. Jpn J. Infect. Dis. 2005, 58, 195-207.
23.Tian Z. J., Zhou G. H., Zheng B. L., Qiu H. J., Ni J. Q., Yang H. L., Yin X. N., Hu S. P., Tong G. Z.: A recombinant pseudorabies virus encoding the HA gene from H3N2 subtype swine influenza virus protects mice from virulent chal-lenge. Vet. Immunol. Immunopathol. 2006, 111, 211-218.
24.Tumova B., Veznikova D., Mensik J., Stumpa A.: Surveillance of influenza in pig herds in Czechoslovakia in 1974-1979. 1. Introduction of influenza epidemic A (H3N2) viruses into pig herds. Zntbl. Vetmed B 1980, 27, 517-523.
25.Ulmer J. B., Donnelly J. J., Parker S. E., Rhodes G. H., Felgner P. L., Dwarki V. J., Gromkowski S. H., Deck R. R., DeWitt C. M., Friedman A.: Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 1993, 259, 1745-1749.
26.Wesley R. D., Tang M., Lager K. M.: Protection of weaned pigs by vaccination with human adenovirus 5 recombinant viruses expressing the hemagglutinin and the nucleoprotein of H3N2 swine influenza virus. Vaccine 2004, 22, 3427--3434.
27.Wibberley G., Swallow C., Roberts D. H.: Characterization of an influenza A (H3N2) virus isolated from pigs in England in 1987. Br. Vet. J. 1988, 144, 196-201.
28.Yoshikawa T., Matsuo K., Matsuo K., Suzuki Y., Nomoto A., Tamura S., Kurata T., Sata T.: Total viral genome copies and virus-Ig complexes after infection with influenza virus in the nasal secretions of immunized mice. J. Gen. Virol. 2004, 85, 2339-2346.
Adres autora: prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, ul. Sienkiewicza 35A, 24-100 Pu³awy; e-mail: iwonamd@piwet.pulawy.pl
