Medycyna Wet. 2007, 63 (8) 990
Praca oryginalna Original paper
U ró¿nych gatunków zwierz¹t miejscem bogatym w enzymy umo¿liwiaj¹ce interakcjê gamet w czasie zap³odnienia jest akrosom plemnika. To w³anie w nim stwierdzono obecnoæ proteinaz serynowych, tiolo-wych, arylotiolo-wych, karboksylowych oraz metaloprote-inaz (3). Wiele z nich bierze równie¿ udzia³ w proce-sie regulacji ruchu plemników, jak równie¿ w degra-dacji starzej¹cych siê plemników w naj¹drzach (6, 14). Najbardziej poznanym, a zarazem najwa¿niejszym enzymem branym pod uwagê przy ocenie jakoci na-sienia nale¿¹cym do proteinaz serynowych enzymów proteolitycznych maj¹cych w swym centrum aktyw-nym serynê, jest akrosyna (12). Ten trypsynopodobny, zwi¹zany z b³on¹ wewnêtrzn¹ akrosomu plemnika enzym bierze bezporedni udzia³ w procesie zap³od-nienia ssaków, poprzez katalizowanie reakcji hydroli-tycznego rozpadu os³onki przejrzystej komórki jajo-wej (11) oraz uczestniczy w dyspersji matrix akroso-mu i przy³¹czania plemników do zona pellucidda (12). Istotn¹ rolê w regulacji aktywnoci akrosyny pe³ni¹ obecne w plazmie nasienia inhibitory tego enzymu (8), zaadsorbowane na zewnêtrznej powierzchni b³ony plazmatycznej plemników. Inhibitory te (dziêki posia-danej du¿ej zdolnoci wi¹zania siê z akrosyn¹ lub tryp-syn¹) s¹ naturalnymi antagonistami akrosyny. G³ówn¹ funkcj¹ inhibitorów akrosyny jest ochrona bia³ek na-sienia i tkanek uk³adu rozrodczego przed proteolitycz-nym i immunogenproteolitycz-nym dzia³aniem tego enzymu,
uwal-nianego z uszkodzonych lub obumar³ych plemników (11). W takich przypadkach uwalniana akrosyna jest trwale wi¹zana przez te inhibitory. Ich zawartoæ w plazmie nasienia uzale¿niona jest od gatunku, a na-wet od wieku zwierz¹t (10). Wed³ug Torskiej (12), w ejakulowanych plemnikach cz³owieka, knura czy try-ka molowa zawartoæ inhibitorów odpowiada molo-wej zawartoci akrosyny.
W nienaruszonym akrosomie, akrosyna wraz z na-turalnymi inhibitorami oraz z form¹ zymogenow¹, tzw. proakrosyn¹, stanowi system akrosynowy plemników (4). W plemnikach ejakulowanych prawie ca³a akro-syna wystêpuje w formie nieaktywnej. Dopiero po uszkodzeniu akrosomu czy to w czasie reakcji akro-somowej, czy te¿ pod wp³ywem niekorzystnych wa-runków rodowiska proakrosyna aktywowana jest do akrosyny (3). Dlatego te¿ odpowiednia zawartoæ pro-akrosyny i pro-akrosyny w plemnikach jest wskanikiem stabilnoci akrosomów i mo¿e byæ wykorzystana jako biochemiczny test w ocenie jakoci nasienia konser-wowanego (1).
W dostêpnej literaturze wiadomoci o pozosta³ych proteinazach obecnych w akrosomie plemnika s¹ przedstawiane w sposób fragmentaryczny. Do mniej poznanych proteinaz o specyficznoci trypsynowej mo¿na zaliczyæ wykryty w plemnikach cz³owieka sys-tem sperminogen-spermina czy w plemnikach buhaja inhibinê. SH-proteinazê zaliczan¹ do grupy proteinaz
Aktywnoæ inhibitora trypsyny w plazmie nasienia
lisa polarnego w sezonie rozrodczym
KAROLINA STASIAK, BOGDAN JANICKI
Katedra Biologii Ma³ych Prze¿uwaczy i Biochemii rodowiska Wydzia³u Hodowli i Biologii Zwierz¹t ATR, ul. Mazowiecka 28, 85-024 Bydgoszcz
Stasiak K., Janicki B.
Activity of the trypsin inhibitor on the semen plasma of the polar fox Alopex lagopus L. during the reproductive season
Summary
The aim of this work was to determine the activity of the akrosin inhibitor on the basis of depressing the tripsin activity of polar fox (Alopex lagopus) semen and to follow the changes that affect these properties throughout the whole reproductive season. Additionally, the molecular forms of the inhibitor were electro-phoretically separated. The research covered 126 ejaculates obtained manually seven times from 18 polar foxes (at intervals of 10-12 days). The highest inhibitor activity was observed in the seminal plasma from the ejaculates obtained in the first sample, the lowest results were characteristic of the fifth sample. The lowest activity of the akrosin inhibitor, determined on the basis of depressing the tripsin activity, indicates either the weakest protection of the semen proteins along with the whole reproductive system from the influence of the akrosin devoid of damaged acrosomes or the already initiated process of proteolysis.
Medycyna Wet. 2007, 63 (8) 991
tiolowych wyizolowano z plemników wiêkszoci ga-tunków zwierz¹t hodowlanych. Natomiast proteinazy karboksylowe zwane inaczej kwanymi poznano dziêki wyizolowanej z j¹der królika proakrozyminy (3).
Celem badañ by³o okrelenie: a) aktywnoci inhibi-tora akrosyny w plazmie nasienia lisa polarnego na podstawie hamowania aktywnoci trypsyny oraz prze-ledzenie zmian, jakim ten parametr podlega w okre-sie sezonu reprodukcyjnego, b) form molekularnych inhibitora trypsyny.
Materia³ i metody
Materia³em badawczym by³o nasienie pobrane siedmio-krotnie od osiemnastu lisów polarnych Alopex lagopus L. pochodz¹cych z fermy zwierz¹t futerkowych w £achowie k. Szubina w województwie kujawsko-pomorskim. Próbki nasienia pozyskiwano od samców metod¹ manualn¹ przez ca³y okres wzmo¿onej aktywnoci p³ciowej, tj. od po³owy lutego do po³owy kwietnia 2003 roku, w odstêpach 10-12--dniowych, uzyskuj¹c ogó³em 126 ejakulatów. Po odwiro-waniu plemników z ejakulatów (10 minut przy 8000 × g) pozyskano plazmê nasienia, w której oznaczono aktywnoæ inhibitorów akrosyny na podstawie hamowania aktyw-noci trypsyny, a tak¿e wykonano profile elektroforetycz-ne form molekularnych inhibitora. Powy¿sze badania wy-konano w Instytucie Rozrodu Zwierz¹t i Badañ ¯ywnoci PAN w Olsztynie.
Oznaczanie spektrofotometryczne inhibitora znajduj¹ce-go siê w plazmie nasienia wykonano w kuwetach polisty-renowych, za pomoc¹ spektrofotometru firmy Beckman (lampa vis, faktor 980,50). W tym celu sporz¹dzono taki roztwór trypsyny, w którym aktywnoæ tego enzymu wy-nosi³a oko³o 36-40 U/l (ok. 6 mg trypsyny wo³owej roz-puszczono w 300 cm3 buforu Tris-HCl o stê¿eniu 0,05
molowym i pH 8,2). Podczas oznaczania aktywnoci spo-rz¹dzony roztwór przechowywano w lodzie. Po kalibracji aparatu przyst¹piono do oznaczenia inhibitora w badanych próbkach. W tym celu plazmê lisów polarnych rozcieñczo-no 200 × buforem Tris-HCl. Dalszy sposób przygotowania próbek zosta³ przedstawiony w tab. 1. Po 5-minutowej in-kubacji próbek (temp. 25°C) w spektofotometrze do ka¿-dej z kuwet dodano po 0,1 cm3 roztworu BAPNA (do
0,0217 g BAPNA dodano 2,5 cm3 DMSO, a po
rozpusz-czeniu 7,5 cm3 buforu Tris-HCl), wymieszano ich
zawar-toæ i dokonano pomiaru przy d³ugoci fali 410 nm co 1 minutê przez 5 minut. Zebrane wyniki aktywnoci po pod-stawieniu do wzoru: (aktywnoæ wzorcowa aktywnoæ inhibitorowa próbki) × rozcieñczenie plazmy przedstawio-ne by³y w postaci U/l.
Elektroforetyczne wykrywanie aktywnoci inhibitorów trypsyny przeprowadzono na ¿elach poliakrylamidowych o ró¿nej gêstoci, zgodnie z metodyk¹ opracowan¹ przez Laemmliego (7), z zastosowaniem aparatu do elektrofore-zy pionowej Mighty Small II firmy Amersham Pharmacia Biotech. (Szwecja). Rozdzielenia bia³ek dokonano dwoma ró¿nymi sposobami: za pomoc¹ elektroforezy niedenatu-ruj¹cej, zwan¹ inaczej natywn¹ i denaturuj¹cej (z dodat-kiem dodecylo siarczanu sodu SDS).
Elektroforeza natywna (bez dodatku SDS) pozwala roz-dzieliæ bia³ka ze wzglêdu na gêstoæ ich ³adunku. Brak de-tergentu w postaci SDS powoduje utrzymanie bia³ka w sta-nie sta-niezdenaturowanym. Rozdzia³y elektroforetyczne prze-prowadzono na 10% ¿elach poliakrylamidowych. Przed elektroforez¹ próbki plazmy nasienia mieszano z buforem obci¹¿aj¹cym w stosunku 1 : 1. Na ¿el nanoszono po 21 µl próby. Rozdzia³y przeprowadzono w buforze Tris-glicyna o pH 8,3 przy 20 mA i 200 V przez 85 minut. Po zakoñcze-niu elektroforezy ¿ele inkubowano w roztworze trypsyny wo³owej (1,5 mg trypsyny wo³owej w 25 cm3 0,1
molowe-go buforu fosforanowemolowe-go pH 7,4/1 ¿el) przez 15 minut w temperaturze 37°C. Nastêpnie zlano roztwór trypsyny, a ¿ele zalano mieszanin¹ barwi¹c¹ (13).
Masy molekularne rozdzielonych bia³ek oznaczono me-tod¹ elektroforezy denaturuj¹cej (SDS-PAGE). Rozdzia³y przeprowadzano na 12,5% ¿elach poliakryloamidowych z dodatkiem SDS, dziêki któremu bia³ka w plazmie nasie-nia zostaj¹ rozbite na podjednostki ³añcuchy polipepty-dowe. Przed elektroforez¹ próby plazm nasienia rozcieñ-czono roztworem soli fizjologicznej w stosunku 1 : 3, a nastêpnie uzyskany roztwór zmieszano z buforem do przy-gotowania prób z dodatkiem SDS i DTT (ditiotreitol) w stosunku 1 : 1. Z przygotowanej mieszaniny pobrano 0,005 cm3 i naniesiono do odpowiednich studzienek w ¿elu.
Równolegle naniesiono mieszaninê standardów firmy Bio-Rad: fosforylaza B (110,0 kDa), albumina surowicy wo³owej (90,0 kDa), albumina jaja kurzego (51,2 kDa), an-hydraza wêglanowa (36,2 kDa), sojowy inhibitor trypsyny (29,0 kDa) i lizozym (21,4 kDa). Rozdzia³ elektroforetycz-ny bia³ek plazmy nasienia przeprowadzono przy sta³ym natê¿eniu 40 mA i napiêciu o wartoci 200 V. Po zakoñ-czeniu elektroforezy (oko³o 90 minut) ¿ele umieszczono w 100 cm3 roztworu barwi¹cego, na 18 godzin w
tempera-turze pokojowej. Nastêpnie nadmiar barwnika wyp³ukano z ¿elu rozpuszczalnikiem o sk³adzie woda : metanol : kwas octowy w proporcji 8 : 2 : 1, do uzyskania bezbarwnego t³a. Z tak przygotowanego elektroforogramu, na podstawie mas molekularnych wzorców, wyznaczono masy cz¹stecz-kowe rozdzielonych frakcji bia³kowych. Masy moleku-larne frakcji bia³kowych by³y oceniane przy u¿yciu pro-gramu Kodak 1D (Eastman Kodak company, New Haven, USA).
Uzyskane wyniki aktywnoci inhibitora nie spe³nia³y za³o¿eñ o normalnoci rozk³adu i jednorodnoci wariancji, dlatego szacowanie statystycznej istotnoci oddzia³ywania terminu pobrania nasienia na wartoci aktywnoci wyko-nano z wykorzystaniem nieparametrycznej jednoczynniko-wej analizy wariancji (test Kruskala-Wallisa). Obliczenia statystyczne uzyskanych wyników wykonano przy pomo-cy programu Statistica 5.0 oraz Microsoft Excel 2003.
k i n n y z c d O W(zcomrz3e)c próBbakdaa(ncam3) y n i m u b l a g 3 8 0 , 0 o d ( ¹ n i m u b l a z r o f u B m c 0 5 o n a d o d j e w o ³ o w 3buforuTirs-HC)l 0,30 0,25 l C a C 2(0,2Mrotzwórchlorkuwapnia )l C H -s ir T e z r o f u b w y n o z c z s u p z o r 0,05 0,05 j e w o ³ o w y n y s p y rt r ó w tz o R 0,05 0,05 ) a n o z c ñ e i c z o r o i n d e i w o p d o ( a m z a l P 0,05
Medycyna Wet. 2007, 63 (8) 992
Wyniki i omówienie
Oznaczona w plazmie nasienia lisa polarnego, red-nia aktywnoæ inhibitora trypsyny dla ca³ego sezonu rozrodczego wynosi³a 3305,71 U/l. Najwy¿sz¹ aktyw-noæ inhibitora stwierdzono w plazmie nasienia z eja-kulatów uzyskanych podczas pierwszego pobrania 4296,48 U/l, natomiast najni¿sz¹ charakteryzowa³y siê próby pozyskane w pobraniu pi¹tym 2089,83 U/l (ryc. 1). Uzyskane wartoci aktywnoci inhibitora tryp-syny ró¿ni³y siê statystycznie istotnie (przy p £ 0,001) w zale¿noci od terminu pobrania, co potwierdzi³ za-stosowany test nieparametryczny. Najbardziej nieko-rzystnym wydaje siê pobranie pi¹te, gdzie oznaczona aktywnoæ inhibitora jest najni¿sza, co z kolei wiad-czy o najs³abszej ochronie bia³ek nasienia i ca³ego uk³adu rozrodczego przed dzia³aniem uwolnionej z uszkodzonych akrosomów akrosyny lub o rozpo-czêtej ju¿ proteolizie. Uzyskane wartoci aktywnoci inhibitora trypsyny skorelowano z innymi parametra-mi biocheparametra-micznyparametra-mi. Dziêki wyznaczonym zale¿no-ciom oraz uzyskanym dodatnim i statystycznie istot-nym wspó³czynnikom korelacji z koncentracj¹ plem-ników (r = 0,65, przy p £ 0,01), z aktywnoci¹ fosfa-tazy alkalicznej (r = 0,81, przy p £ 0,01) i kwanej (r = 0,65, przy p £ 0,01) mo¿na stwierdziæ, ¿e za po-chodzenie tych inhibitorów odpowiedzialne s¹ naj¹d-rza. Z kolei wyznaczony wspó³czynnik korelacji miê-dzy aktywnoci¹ inhibitora a zawartoci¹ bia³ka ogól-nego w plazmie nasienia (r = 0,36, przy p £ 0,01) su-geruje ochronê plemników przed proteoliz¹ podczas przebywania ich w nasieniowodach (2).
Przeprowadzona elektroforeza natywna (bez rod-ków denaturuj¹cych) wykaza³a w plazmie nasienia obecnoæ trzech, ró¿ni¹cych siê tempem migracji, molekularnych form inhibitora trypsyny (5). Na ryc. 2 przedstawiono bia³ka o aktywnoci inhibitora w plaz-mie nasienia pochodz¹cej od dziewiêciu losowo wy-branych lisów podczas pierwszego pobrania. We wszystkich próbach wykryto trzy ró¿ne formy tego inhibitora, sporód których tylko druga forma, o red-nim tempie migracji, stanowi³a szerokie pasmo. Po-dobnej ocenie poddano plazmê nasienia pozyskan¹ od dziewiêciu tych samych lisów podczas ostatniego
siódmego pobrania (ryc. 3). Badane plazmy charakte-ryzowa³y siê obecnoci¹ form molekularnych inhibi-tora trypsyny o najwiêkszym i rednim tempie migra-cji. W niektórych tylko przypadkach pojawi³a siê do-datkowo trzecia forma tego inhibitora. Najbardziej intensywnym, a zarazem najszerszym pasmem okaza-³a siê, podobnie jak to by³o w pobraniu pierwszym, forma o rednim tempie migracji. Porównuj¹c plazmê
Ryc. 2. Profil elektroforetyczny bia³ek o aktywnoci inhibito-ra trypsyny uzyskany w wyniku elektroforezy natywnej (plazmy pochodz¹ce od losowo wybranych lisów pobranie pierwsze)
Ryc. 3. Profil elektroforetyczny bia³ek o aktywnoci inhibito-ra trypsyny uzyskany w wyniku elektroforezy natywnej (plazmy pochodz¹ce od losowo wybranych lisów pobranie siódme)
Ryc. 4. Profil elektroforetyczny bia³ek o aktywnoci inhibito-ra trypsyny uzyskany w wyniku elektroforezy natywnej (plazmy pochodz¹ce losowo wybranego osobnika przez wszystkie siedem pobrañ)
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 termin pobrania aktywnoϾ inhibitora trypsyny
mediana œrednia min-max
Ryc.1 Aktywnoæ inhibitora trypsyny w plazmie nasienia lisa polarnego w sezonie rozrodczym [U/l]
+ + +
Medycyna Wet. 2007, 63 (8) 993
pozyskan¹ w dwóch pobraniach pod k¹tem obecnoci ró¿nych form molekularnych inhibitora wyranie za-uwa¿a siê zanik jednej z nich. W celu stwierdzenia, od którego pobrania nastêpuje zanik tej formy, wyko-nano obrazy elektroforetyczne aktywnoci inhibitora dla jednego osobnika przez wszystkie siedem pobrañ (ryc. 4). Z uzyskanego elektroforogramu wynika, ¿e trzy formy pojawiaj¹ siê w plazmie zawsze na pocz¹t-ku sezonu rozrodczego. W póniejszych pobraniach mo¿na stwierdziæ zanik formy inhibitora o najwolniej-szym tempie migracji.
W celu oszacowania masy molekularnej inhibitora w plazmie nasienia lisów polarnych zastosowano elek-troforezê denaturuj¹c¹ (SDS-PAGE). U¿ytym marke-rem by³a mieszanina szeciu wzorców o ró¿nych ma-sach molekularnych (110,0÷21,4 kDa). Na ryc. 5 przed-stawiono rozdzielenie elektroforetyczne bia³ek w plaz-mie nasienia pochodz¹cej od jednego osobnika przez wszystkie siedem pobrañ. W wyniku rozdzia³u we wszystkich przypadkach uzyskano dwa, ró¿ni¹ce siê zabarwieniem pasma. W postaci ciemniejszych pasm widoczne jest bia³ko o aktywnoci esterazy (26,5 kDa), natomiast janiejsze pr¹¿ki wykazywa³y cechy pro-teinazy serynowej (23,6 kDa). Masa cz¹steczkowa tego pasma podobna by³a do masy trypsyny, która w orga-nizmach ssaków aktywuje i degraduje inne enzymy (9, 14).
Podsumowanie
W dostêpnym pimiennictwie niewiele uwagi po-wiêca siê aktywnoci i formom molekularnym inhi-bitora trypsyny obecnego w plazmie nasienia lisa po-larnego, dlatego tym cenniejsze wydaj¹ siê wyniki uzyskane w badaniach w³asnych. Autorzy wykazali w badaniach elektroforetycznych obecnoæ trzech form inhibitora o ró¿nym tempie migracji w polu elektrycz-nym. Pod koniec sezonu reprodukcyjnego obok wy-ranego obni¿enia aktywnoci tego bia³ka stwierdziæ mo¿na spadek, a czasami wrêcz zanik formy
inhibi-Ryc. 5. Profil elektroforetyczny inhibitora trypsyny uzyskany w wyniku elektroforezy SDS-PAGE (plazmy pochodz¹ce od jednego osobnika przez wszystkie siedem pobrañ)
kDa kDa 110,0 90,0 51,2 36,2 29,0 21,4 26,5 23,6
tora o najwolniejszym tempie migracji. Te bia³ka inhibitorowe, syntetyzowane g³ów-nie w naj¹drzach odpowiedzialne s¹ za blo-kowanie aktywnoci wolnej akrosyny, któ-ra jako enzym proteolityczny mo¿e prowa-dziæ do destrukcji plemników w mêskim uk³adzie rozrodczym.
Dziêki prowadzonej kontroli aktywnoci inhibitora akrosyny (oznaczonego na pod-stawie hamowania aktywnoci trypsyny), mo¿na w dowolnym momencie sezonu roz-rodczego oceniæ jakoæ pobranego nasienia. Uzyskane wówczas wyniki staj¹ siê bardzo przydatne w praktyce, gdy¿ ka¿dego hodow-cê interesuje nasienie o wysokiej wartoci hodowlanej, na któr¹ sk³ada siê, miêdzy in-nymi, wysoka aktywnoæ inhibitora w plaz-mie nasienia.
Pimiennictwo
1.Borkowski K., Strze¿ek J.: Wykorzystanie wskaników biochemicznych do oceny jakoci nasienia tryka. Medycyna Wet. 1994, 50, 200-202.
2.Ciereszko A., Piros B., D¹browski K., Kucharczyk D., £uczyñski M. J., Dobosz S., Glogowski J.: Serine proteinase inhibitors of seminal plasma of teleost fish: distribution of activity, electrophoretic profiles and relation to proteinase inhibitors of blood. J. Fish Biol. 1998, 53, 1292-1305. 3.Èechova D.: Enzymy proteolityczne w akrosomie plemnika. Materia³y
letniej szko³y m³odych pracowników nauki nt. Fizjologiczne, biochemiczne i immunologiczne zagadnienia mêskiego uk³adu rozrodczego oraz nasienia. Biul. Infor. ART, Olsztyn 1988, nr 25, 97-104.
4.Glogowski J., Falkowski J., Rotkiewicz T.: Aktywnoæ fosfataz w plazmie nasienia knurów w cyklu rocznym i ich zwi¹zek z podstawowymi wyznacz-nikami jakociowymi ejakulatów. Rocz. Nauk. Zoot. 1997, 24, 85-95. 5.Kot³owska M., Kowalski R., Glogowski J., Jankowski J., Ciereszko A.:
Gelatinases and serine proteinase inhibitors of seminal plasma and the repro-ductiven tract of turkey (Meleagris gallopavo). Theriogenology 2005, 63, 1667-1681.
6.Kowalski R., Wojtczak M., Glogowski J., Ciereszko A.: Gelatinolytic and anti-trypsin activities in seminal plasma of common carp: relationship to blood, skin mucus and spermatozoa. Aquat. Living Resour. 2003, 16, 438--444.
7.Laemmli U. K.: Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680-685.
8.Lee C., Keefer M., Zhao Z. W., Kroes R., Berg L., Liu X. X., Sensibar J.: Demonstration of the role of prostate-specific antigen in semen liquefaction by two-dimensional electrophoresis. J. Andrology 1989, 10, 432-438. 9.Paju A., Bjartel A., Hang W.-M., Nordling S., Borgstrom A., Hansson J.,
Stenman U.-H.: Expresion and characterization of trypsinogen produced in the human male genital tract. Amer. J. Pathol. 2000, 157, 2011-2020. 10.Strze¿ek J.: Wybrane uk³ady enzymatyczne nasienia zwierz¹t gospodarskich
w aspekcie doskonalenia jego konserwacji i p³odnoci samców. Zesz. Probl. Post. Nauk. Rol. 1987, 340, 9-40.
11.migielska J., Strze¿ek J.: Aktywnoæ inhibitorów akrosyny w plazmie nasienia buhaja jako wskanik oceny stanu b³on akrosomu. Zesz. Probl. Post. Nauk. Rol. 1986, 263, 185-197.
12.Torska J.: W³aciwoci wysokocz¹steczkowych inhibitorów proteinaz z plazmy nasienia buhaja. Zesz. Nauk. ART Olsztyn. Zootechnika 1989, 351, supl. D.
13.Uriel J., Berges J.: Characterization of natural inhibitors of trypsin and chymotrypsin by electrophoresis in acrylamide-agarose gels. Nature 1968, 218, 578-580.
14.Wojtczak M., Glogowski J., Ko³dras M., Kucharczyk D., Ciereszko A.: Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids. Aquat. Living Resour. 2003, 16, 461-465.
Adres autora: dr in¿. Karolina Stasiak, ul. Mazowiecka 28, 85-084 Byd-goszcz; e-mail: szynder@atr.bydgoszcz.pl
