Praca oryginalna Original paper
Wp³yw formy konfekcjonowania
i metody mro¿enia nasienia knura
na wybrane wskaniki u¿ytkowoci rozrodczej loch
WIES£AW BIELAS, ANDRZEJ DUBIEL, ANNA RZ¥SA,JAN TWARDOÑ, WOJCIECH NI¯AÑSKI
Katedra Rozrodu Zwierz¹t z Klinik¹ Zwierz¹t Gospodarskich Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, pl. Grunwaldzki 49, 50-366 Wroc³aw
Bielas W., Dubiel A., Rz¹sa A., Twardoñ J., Ni¿añski W.
Effect of packaging form and methods of boar semen freezing on chosen reproductive indexes of sows
SummaryThe aim of this work was to estimate the influence of packaging forms and freezing methods of the semen of boars on the reproductive performance of sows. Experiments were carried out with 50 sows in a large swine farm. The females in experimental groups were inseminated with FT whilst in the control groups with liquid semen. Ejaculates from 4 boars were frozen in a polystyrene box onto static LN nitrogen vapor in 5 ml maxi and 0.5 ml medium straws according to methods A and B, modifications of the Westendorf et al (1975) and of the Pursel and Park (1987) technique, respectively. The sows were divided into five research groups, ten pigs in each group. The sows in experimental groups 1, 2, 3, and 4 were inseminated with frozen semen whilst in control group 5 with liquid semen. The females in groups 1 and 2 were inseminated with the semen frozen using method A and confectioned in a 0.5 ml medium and in 5 ml maxi straws, respectively. Whilst the sows in the group 3 and 4 were inseminated with the semen frozen according to method B and packaged in 0.5 ml and 5 ml straws, respectively, in each group. One insemination dose consisted of either 5 billion spermatozoa placed into one 5 ml maxi straw or of ten 0.5 ml medium straws with 500 million spermatozoa. The sows were inseminated twice or three times every ten hours with frozen semen. The first insemination took place 24 h after the sow had first shown a standing reflex. Females inseminated with frozen semen were inseminated post cervically, three times every 10 h during each oestrus. One insemination dose comprises 5 × 109 of sperm and
5mg of PGF2á. The occurrence of ovulation was detected by ultrasonography. Efficiency of insemination and reproductive performance of sows have been evaluated on the basis of conception and farrowing rates and total piglets born in a litter. The conception rate, the farrowing rate and the total piglets born in a litter in all five groups (1, 2, 3, 4, 5) were: 100, 90, 100, 90, 100%; 80, 70, 90, 70, 100% and 10.62 ± 1.92; 9.42 ± 1.51; 10.77 ± 2.53; 9.71 ± 1.79; 12.0 ± 1.8, respectively. A total of 40 females were inseminated with frozen (experimental) and 10 with liquid semen. There were no statistically significant differences in pregnancy and farrowing rates between all the experimental groups. Sows inseminated with liquid semen gave significantly higher percentages of litter size than females inseminated with frozen semen (12.00 vs. 10.19) (Table 1). Sows in groups 1 and 3 inseminated with semen frozen in 0.5 ml straws according to methods A and B had significantly higher litter sizes than sows in groups 2 and 4 inseminated with semen frozen in 5 ml straws according to corresponding methods A and B (10.62 and 10.77 vs. 9.42 and 9.71), respectively (Table 2). Animals inseminated with semen frozen in 0.5 ml straws had significantly higher percentages of litter size than females inseminated with semen frozen in 5 ml straws (10.7 vs. 9.57) (Table 3). There were no significant differences in litter size between females inseminated with semen frozen according to methods A and B (10.06 vs. 10.31) (Table 4). Acceptable reproductive performance of female pigs after AI with frozen semen was probably achieved because special attention was paid to the heat detection and timing of insemination related to ovulation (with the aid of rectal and abdominal ultrasonography), post-cervical insemination, addition of PGF2á to each insemination dose, improvement of the freezing-thawing methods and good freezability of the sperms donors. Both freezing methods are relatively simple, but method B is less time consuming in preparation than method A. Fertility results obtained with frozen-thawed boar semen in our experiments are quite satisfactory. These results indicate that under good conditions (insemination strategy) frozen boar semen can give results that approach those obtained with fresh semen.
Pomimo potencjalnych mo¿liwoci zastosowania krio-konserwacji nasienia knura w kierowanym rozrodzie trzo-dy chlewnej, nadal nasienie mro¿one wykorzystywane jest bardzo rzadko. Sporód najwa¿niejszych przyczyn ogra-niczonego zastosowania nasienia mro¿onego do insemi-nacji samic w warunkach fermowych zaliczyæ nale¿y ni¿-sz¹ p³odnoæ i plennoæ inseminowanych loch, wiêkni¿-sz¹ ni¿ u innych gatunków podatnoæ plemników na szok ch³odowy, spowodowan¹ unikaln¹ budow¹ b³ony komór-kowej. Plemniki ruchliwe po rozmro¿eniu niejednokrot-nie niejednokrot-nie s¹ w staniejednokrot-nie doprowadziæ do zap³odniejednokrot-nienia dziêki destabilizacji b³ony komórkowej (3). Aby temu przeciw-dzia³aæ, podawano dwukrotnie wy¿sz¹ liczb¹ gamet w in-seminacji doszyjkowej, a plemniki zamra¿ano w ró¿nych typach opakowañ, a¿eby zminimalizowaæ niekorzystny wp³yw zmian temperatury w czasie zamra¿ania i rozmra-¿ania (11, 17, 22). Próby te nie przynios³y jednak spo-dziewanego efektu (18). Pewn¹ nadziejê na prze³amanie tego impasu mo¿e przynieæ podawanie ni¿szych dawek rozmro¿onych plemników konfekcjonowanych w opako-waniach plastykowych oraz wprowadzanie nasienia jak najbli¿ej miejsca zap³odnienia (20). Niemniej wa¿ne wy-daje siê ustalenie d³ugoci rui, poniewa¿, jak wiadomo, owulacja wystêpuje po up³ywie 2/3 rui, bez wzglêdu na d³ugoæ trwania objawów. Krótki okres ¿ycia plemników rozmro¿onych w drogach rodnych wymaga inseminacji do 8 godzin przed owulacj¹ (18). Gwa³towny rozwój ultra-sonografii pozwala obecnie w miarê precyzyjnie ustaliæ moment owulacji przy u¿yciu badania przezskórnego lub rektalnego lochy (6, 12). Interesuj¹ce s¹ równie¿ infor-macje na temat pozytywnego wp³ywu PGF22 alfa na w³a-ciwoci plemników oraz u¿ytkowoæ rozrodcz¹ wiñ in-seminowanych nasieniem konserwowanym w stanie p³yn-nym (13, 16). Uwa¿a siê, ¿e porozmro¿eniowa ocena plemników powinna opieraæ siê zazwyczaj na badaniach laboratoryjnych. Kosztowne i czasoch³onne inseminacyjne dowiadczenia fermowe mog¹ byæ obarczone wp³ywem zdrowia oraz rodowiska, w jakim przebywaj¹ lochy po unasiennianiu (3, 11). Niemniej jednak wydaje siê, ¿e decyduj¹cym kryterium porozmro¿eniowej oceny jako-ci kriokonserwowanego nasienia jest fakt zap³odnienia komórki jajowej, a nastêpnie normalny rozwój zarodka i p³odu. W orodku wroc³awskim opracowano dwie no-watorskie metodyki mro¿enia nasienia knura, a skutecz-noæ i efektywskutecz-noæ tych technologii potwierdzono na lo-chach w terenowych warunkach fermowych (4).
Celem badañ by³o okrelenie wp³ywu metody mro¿e-nia oraz formy konfekcjonowamro¿e-nia plemników knura na u¿ytkowoæ rozrodcz¹ loch w warunkach fermowych z uwzglêdnieniem wskanika zap³adnialnoci, wskanika oproszeñ i ogólnej liczby prosi¹t urodzonych w miocie.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 50 lochach wieloródkach mie-szañcach F1 rasy wbp i pbz oraz 4 knurach ró¿nych ras (wbp, pbz, pi × du, ha × pi) w wieku 2 do 5 lat w fermie trzody chlewnej w ¯ernikach Wielkich w okresie od 2007 do 2009 r. Zwierzêta przez okres badañ od¿ywiano zgodnie z normami przewidzianymi dla tego gatunku. Do dowiadczeñ insemina-cyjnych w danym tygodniu losowo wybierano 5 loch z puli oko³o 30 samic, które wchodzi³y w cykl produkcyjny po odsa-dzeniu prosi¹t. Dziêki temu nie dezorganizowano pracy na
fer-mie w sektorze rozrodu opartego na zasadzie ca³e pofer-miesz- pomiesz-czenie zajête ca³e pomieszpomiesz-czenie wolne (all in all out). Czêæ inseminacyjna dowiadczenia dobieg³a koñca, gdy liczba mic osi¹gnê³a 50 sztuk. Lochy rozdzielano losowo po 10 sa-mic do czterech grup dowiadczalnych nr: 1, 2, 3, 4 i jednej grupy kontrolnej nr: 5. Lochy w grupie 1, 2, 3 i 4 inseminowa-no nasieniem mro¿onym/rozmro¿onym, za w grupie kontrol-nej nr 5 nasieniem konserwowanym w stanie p³ynnym w roz-rzedzalniku BTS. Nasienie od 4 knurów pobierano metod¹ manualn¹ na fantomie jeden raz w tygodniu. Zakwalifikowany pe³ny ejakulat o objêtoci powy¿ej 200 ml, w którym co naj-mniej 80% plemników porusza³o siê ruchem prawid³owym, bez-porednio po ocenie rozdzielano na dwie równe czêci. Ka¿d¹ czêæ ejakulatu zamra¿ano równolegle wg innej metody, pierw-sz¹ konserwowano wg metody A, za drug¹ wg metody B. Dok³adny opis obydwu metod zosta³ uprzednio przez nas opi-sany (3, 5). Metoda A jest modyfikacj¹ technologii Westen-dorfa i wsp. (22), za metoda B powsta³a w oparciu o oryginal-n¹ procedurê Pursela i Parka (17). Modyfikacja w³asna meto-dologii Westendorfa i wsp. (22) polega³a na zastosowaniu rozrzedzalnika BTS (Beltsville Thawing Solution) (w miejsce rozrzedzalnika Mercka) do rozrzedzenia nasienia wkrótce po ocenie i pobraniu. W zmodyfikowanej do badañ w³asnych metody Pursela i Parka (17) zwiêkszono wspó³czynnik g w czasie odwirowywania plazmy nasienia z 300 do 800 g. Ekwi-librowane nasienie w obydwu metodach konfekcjonowano w s³omkach plastykowych firmy Minitüb o objêtoci 5 i 0,5 ml, i zamra¿ano w statycznych parach ciek³ego azotu 120°C w pojemnikach ze styropianu. Po zamro¿eniu s³omki sk³ado-wano w kontenerach z ciek³ym azotem. S³omki 5 ml rozmra-¿ano w ³ani wodnej w temperaturze 42°C przez okres 40 s, za s³omki 0,5 ml w temperaturze 60°C przez 8 sekund. Do inseminacji wykorzystywano s³omki, w których co najmniej 30% plemników porusza³o siê ruchem postêpowym. Przed in-seminacj¹ przygotowywano dawki inseminacyjne, rozrzedza-j¹c rozmro¿one nasienie rozrzedzalnikiem BTS do objêtoci 40-50 ml. Schemat uk³adu dowiadczenia podano w tab. 1. Samice w grupie 1 i 2 unasienniano nasieniem mro¿onym wg metody A, natomiast w grupie 3 i 4 mro¿onym wg metody B. Lochy w grupie 1 i 3 inseminowano nasieniem konfekcjono-wanym w s³omkach 0,5 ml, za w grupie 2 i 4 konfekcjonowa-nym w s³omkach o objêtoci 5 ml. Dawkê inseminacyjn¹ dla loch w grupach dowiadczalnych sporz¹dzano albo z 1 s³omki o objêtoci 5 ml o koncentracji 5 × 109 plemników, albo z 10 s³omek o objêtoci 0,5 ml o koncentracji 5 × 109 plemników w s³omce. Lochy w grupie kontrolnej inseminowano w sposób rutynowo stosowany na fermie nasieniem konserwowanym w stanie p³ynnym w rozrzedzalniku BTS, przy liczbie plemni-ków w dawce inseminacyjnej od 3 do 4 × 109. Tu¿ przed inse-minacj¹ do ka¿dej porcji nasienia mro¿onego dodawano 5 mg prostaglandyny PGF2 alfa w formie 1 ml preparatu Dinolytic (Pharmacia Animal Health). Objêtoæ dawki inseminacyjnej
ij c a w r e s n o k a d o t e M a i n e i s a n A B Konserpw³aycnjnaymwstanie a n l a z c d a i w o d a p u r G 1 2 3 4 5 l m w i k m o ³ s æ o t ê j b O 0,5 5 0,5 5 Insemsicnha³ocjdazonnaysmieniem c i m a s æ o n b e z c i L h c a p u r g w 10 10 10 10 10
Tab. 1. Uk³ad dowiadczenia
Objanienia: A zmodyfikowana technologia zamra¿ania nasie-nia knura Westendorfa i wsp. (22); B zmodyfikowana technolo-gia zamra¿ania nasienia knura Pursela i Parka (17)
dla loch inseminowanych nasieniem mro¿onym wynosi³a 50 ml, za dla loch inseminowanych nasieniem sch³odzonym 100 ml. Samice inseminowane nasieniem mro¿onym inseminowano w obecnoci knura (14) kateterem jednorazowym do insemi-nacji pozaszyjkowej (IMV, Francja). Lochy unasienniano w na-turalnej rui po odsadzeniu miotu po up³ywie co najmniej 24 godzin od pocz¹tku wyst¹pienia odruchu tolerancji. Samice una-sienniane nasieniem mro¿onym reinseminowano dwukrotnie, co 10 godzin, za lochy w grupie kontrolnej po 24 godzinach od pierwszego zabiegu. Lochy w grupie kontrolnej insemino-wano kateterem do inseminacji doszyjkowej. Prosiêta od loch odsadzano na fermie w czwartek, póniej samice umieszczano w pojedynczych okratowanych stanowiskach, jedno obok drugiego. W poniedzia³ek i wtorek przeprowadzano badania ul-trasonograficzne jajników u loch wykazuj¹cych odruch tole-rancji. Badania USG wykonywano ultrasonografem Animal Skaner Dramiñski Polska przy pomocy g³owicy sektorowej ab-dominalnej o czêstotliwoci 5 MHz. U loch wiêkszych i spo-kojniejszych badania jajników prowadzono g³owic¹ sektoro-w¹, rektaln¹, równie¿ o czêstotliwoci 5 MHz. Badanie jajni-ków oraz pêcherzyjajni-ków przedowulacyjnych wykonywano wg procedury opisanej przez Kaufolda i Althouse (12). Skutecz-noæ unasienniania i u¿ytkowoæ rozp³odow¹ loch oceniano na podstawie wskanika zap³adnialnoci, wskanika oproszeñ i ogólnej liczby prosi¹t urodzonych w miocie. Badania w kie-runku ci¹¿y wykonywano 28-35 dni od zabiegu inseminacji. 3 lochy inseminowane nasieniem mro¿onym zosta³y wybrako-wane po poronieniu pod koniec ci¹¿y. Zebrany materia³ licz-bowy opracowano statystycznie za pomoc¹ programu Statisti-ca 6.0 metod¹ jednoczynnikowej analizy wariancji w uk³adzie ortogonalnym. Istotnoæ ró¿nic miêdzy rednimi oszacowano testem Duncana. Badania zosta³y przeprowadzone po zaapro-bowaniu procedur przez II Lokaln¹ Komisjê Etyczn¹ we Wro-c³awiu.
Wyniki i omówienie
W tab. 2 podano wyniki analizy u¿ytkowoci rozrod-czej loch inseminowanych nasieniem mro¿onym i sch³o-dzonym. W porównaniu z nasieniem
mro¿onym lochy inseminowane nasie-niem sch³odzonym uzyskiwa³y istotnie wiêcej prosi¹t w miocie (o 1,81 prosiê-cia), odpowiednio: 10,19 ± 2,00 i 12,00 ± 1,8 prosiêcia (p £ 0,05). Lochy inse-minowane nasieniem mro¿onym rodzi-³y o 1,2 dnia póniej ni¿ samice insemi-nowane nasieniem sch³odzonym, odpo-wiednio: 115,7 ± 1,55 w stosunku do 114,5 ± 0,88 dni ci¹¿y, (p £ 0,05).
Tab. 3 przedstawia u¿ytkowoæ roz-rodcz¹ uzyskan¹ w 5 grupach loch.
Istot-ne ró¿nice stwierdzono pomiêdzy wartociami wskani-ka prosi¹t ¿ywo urodzonych. Najmniej prosi¹t urodzi³o siê w grupach 2A i 4B, gdzie lochy inseminowano nasie-niem konfekcjonowanym w s³omkach 5 ml metody A i B (9,42 i 9,71 prosiêcia), istotnie wiêcej w grupach 1A i 3B, gdzie nasienie konfekcjonowano w s³omkach 0,5 ml me-tody A i B (10,62 i 10,77 prosiêcia), za najwiêcej w gru-pie 5, gdzie lochy inseminowano nasieniem sch³odzonym: 12,00 ± 1,8 prosiêcia (p £ 0,05).
W tab. 4 zamieszczono wyniki dotycz¹ce wp³ywu opa-kowania, w którym zamra¿ano plemniki knura, na u¿yt-kowoæ rozrodcz¹ loch. W porównaniu do s³omek 5 ml konfekcjonowanie plemników w s³omkach 0,5 ml pod-nosi wysoko istotnie (o 1,13 prosiêcia) redni¹ wartoæ wskanika prosi¹t ¿ywo urodzonych, odpowiednio: z 9,57 ± 1,6 do 10,7 ± 2,2 prosiêcia (p £ 0,01).
Tab. 5 przedstawia wp³yw metody kriokonserwacji na u¿ytkowoæ rozrodcz¹ loch inseminowanych nasieniem mro¿onym. W porównaniu z technologi¹ A kriokonser-wacja plemników knura wg metody B podnosi istotnie (o 0,3 prosiêcia) redni¹ wartoæ wskanika prosi¹t ¿ywo urodzonych, odpowiednio: z 10,06 ± 1,79 do 10,31 ± 2,24 prosiêcia (p £ 0,05).
Wielu autorów twierdzi, ¿e porozmro¿eniowa ocena plemników knura powinna opieraæ siê przede wszystkim na badaniach laboratoryjnych in vitro, poniewa¿ kosztow-ne i czasoch³onkosztow-ne dowiadczenia inseminacyjkosztow-ne obarczo-ne s¹ dodatkowym, trudnym niekiedy do uchwycenia, wp³ywem zdrowia samic oraz rodowiska, w jakim prze-bywaj¹ zwierzêta po unasiennianiu. Niestety, ¿adna z me-tod laboratoryjnej oceny jakoci nasienia nie jest w sta-nie samodzielsta-nie wyselekcjonowaæ ani osobnika o dob-rej zamra¿alnoci nasienia, ani prognozowaæ o jego p³od-noci in vivo (1, 3, 8, 11). Dlatego wydaje siê, ¿e wska-niki u¿ytkowoci rozrodczej oproszeñ oraz liczebnoci miotu s¹ miarodajnym kryterium oceny p³odnoci oraz
h c o l a b z c i L zWaps³koad knniieñ ) % ( a k s W kni ñ e z s o r p o ) % ( t ¹ i s o r p a b z c i L h c y n o z d o r u ) n ( t ¹ i s o r p a b z c i L h c y w tr a m ) n ( y ¿ ¹ i c æ o g u ³ D )i n d ( e n o ¿ o r m e i n e i s a N 0 4 = n 95±22 79±40 10,19±2,00a 0,62±0,82 115,7±1,55b e n n y ³ p e i n e i s a N 0 1 = n 90±31 90±31 12,00±1,80b 0,67±0,87 114,55±0,88a
Tab. 2. Wp³yw inseminacji loch nasieniem mro¿onym i sch³odzonym na wybrane wskaniki rozrodu wiñ (x ± s; n = 50)
Objanienie: a, b rednie wartoci w kolumnie z ró¿nymi indeksami ró¿ni¹ siê istot-nie przy p £ 0,05 a p u r G Metoda Rs³oodmzkaij Wskanikzap³odnieñ(%) Wskanikoproszeñ(%) Ogpórolnsia¹tilc(nzb)a Pruorsoidêztaonmea(ntrw)o D³ug(odnæ)ici¹¿y n % n % ) 0 1 = n ( 1 A 0,5ml 10 100 8 80 10,62±1,92 0,78±0,83 115,70±1,66 ) 0 1 = n ( 2 A 5ml 19 190 7 70 9,42 ±1,51a 0,44±0,73 115,33±2,60 ) 0 1 = n ( 3 B 0,5ml 10 100 9 90 10,77±2,53 0,60±0,71 115,88±1,26 ) 0 1 = n ( 4 B 5ml 19 190 7 70 9,71 ±1,79a 0,57±1,13 115,71±1,60 ) 0 1 = n ( 5 Nasieniep³ynne 19 190 9 90 12,00±1,8b 0,67±0,87 114,55±1,05 Tab. 3. Wp³yw metody kriokonserwacji nasienia na wybrane wskaniki u¿ytkowoci rozrodczej wiñ (x ± s; n = 50)
plennoci wiñ po inseminacji loch nasieniem mro¿onym, poniewa¿ decyduj¹cym kryterium porozmro¿eniowej oceny jakoci kriokonserwowanego nasienia knura jest zap³odnienie komórki jajowej, a nastêpnie normalny roz-wój zarodka i p³odu (11).
Porównanie rednich wartoci wybranych wskaników u¿ytkowoci rozrodczej loch inseminowanych nasieniem mro¿onym i sch³odzonym w niniejszych badaniach ujaw-ni³o istnienie ró¿nic istotnych statystycznie odnonie do wskanika liczby prosi¹t urodzonych w miocie. W ka¿-dym z rozpatrywanych aspektów lochy inseminowane na-sieniem sch³odzonym rodzi³y wiêcej prosi¹t, a pozosta³e wskaniki zwykle nie ró¿ni³y siê istotnie w porównaniu z lochami inseminowanymi nasieniem mro¿onym. Wyni-ki u¿ytkowoci rozrodczej loch uzyskane w pilota¿owych badaniach w³asnych nad wp³ywem inseminacji loch na-sieniem mro¿onym w aspekcie wskanika oproszeñ oraz liczebnoci miotu wynios³y, odpowiednio: 66% i 7,2 (4). W niniejszym dowiadczeniu wymienione wskaniki osi¹gnê³y wartoæ, odpowiednio: 79% i 10,19. Wyniki te potwierdzaj¹ hipotezê Almlida i Homo mówi¹c¹, ¿e mo¿-na uzyskaæ wiêcej ni¿ 10 prosi¹t w miocie oraz wysoki wskanik oproszeñ po inseminacji loch nasieniem mro-¿onym. Podobnie wysok¹ liczbê prosi¹t w miocie (10,5) uzyska³ Badura (2) w 1988 r. po inseminacji 112 loch nasieniem mro¿onym w kulkach (2). Jednak pocz¹tki nie by³y tak obiecuj¹ce, co wynika z badañ £yczyñskiego (15), w których na 30 loch inseminowanych nasieniem mro-¿onym w kulkach zaledwie 2 samice urodzi³y w sumie 16 prosi¹t. Od tego czasu poczyniono ogromny postêp i wskanik loch zap³odnionych oraz wielkoæ miotu u loch inseminowanych nasieniem mro¿onym w kulkach wyno-si³, odpowiednio: od 30,8 do 81,1% oraz od 5,2 do 10,6.
W s³omkach zamra¿anych w statycz-nych parach ciek³ego azotu te same wskaniki waha³y siê w granicach, od-powiednio: od 60 do 69,2% oraz od 8,4 do 9,0 (10, 18). Jedn¹ z innowacji by³o wprowadzenie zamra¿ania nasienia metod¹ komputerow¹ (10). Wzrost ja-koci nasienia po rozmro¿eniu przek³a-da³ siê na polepszenie wskaników roz-rodu trzody chlewnej. Jednak wzrost ten nie by³ prze³omowy, poniewa¿ wska-nik oproszeñ i liczebnoæ miotu wyno-si³y, odpowiednio: od 40 do 72,2% oraz od 6,4 do 10,7 (18, 23). Abstrahuj¹c od wyników niniejszych badañ, ni¿szy po-ziom p³odnoci uzyskiwany dotychczas w dowiadczeniach inseminacyjnych z nasieniem mro¿onym w porównaniu z nasieniem sch³odzonym móg³ byæ spo-wodowany tradycyjnym deponowaniem nasienia do szyjki macicy. Stwierdzo-no, ¿e w tym przypadku do miejsca za-p³odnienia w jajowodzie dociera 10 razy mniej plemników, pomimo podwojenia koncentracji plemników w dawce nasie-nia mro¿onego (18, 20). Dlatego wyda-wa³o siê, ¿e kolejn¹ innowacj¹ mo¿e byæ stosowanie inseminacji g³êbokiej nasie-nia mro¿onego o koncentracji zwycza-jowo stosowanej w inseminacji nasieniem sch³odzonym (20). W wietle wyników uzyskanych przez innych auto-rów rezultaty badañ w³asnych nie odbiegaj¹ negatywnie od redniej wiatowej. Mog³o to byæ miêdzy innymi spo-wodowane deponowaniem nasienia mro¿onego katetera-mi do insekatetera-minacji pozaszyjkowej (20).
Uzyskanie wysokich wskaników u¿ytkowoci rozrod-czej loch inseminowanych nasieniem mro¿onym uwarun-kowane jest synchronizacj¹ pomiêdzy owulacj¹ a inse-minacj¹. Zró¿nicowanie d³ugoci interwa³u od pocz¹tku rui do momentu owulacji u loch w zale¿noci od wp³ywu rodowiska czy zmiennoci osobniczej doprowadzi³o do rozwoju ultrasonograficznej kontroli gonad, kontrolowa-nia d³ugoci trwakontrolowa-nia odruchu tolerancji oraz wykonywa-nia zabiegu inseminacji w obecnoci knura szukarka (6, 12, 14). Poniewa¿ w du¿ej fermie trudno dok³adnie usta-liæ pocz¹tek odruchu tolerancji, bezporednim impulsem do przeprowadzania inseminacji nasieniem mro¿onym by³a niemo¿noæ ponownego znalezienia na jajnikach pê-cherzyków jajnikowych, których rednica przekracza³a 7 mm.
Badania Peny i wsp. (16) oraz Kosa i Bilkei (13) wy-kaza³y, ¿e mo¿na istotnie podnieæ wskanik oproszeñ oraz liczebnoæi miotu u loch po podaniu pod luzówkê przed-sionka pochwy 5 mg PGF2á w czasie wykonywania za-biegu inseminacji. Mechanizm dzia³ania PGF2á polega na usprawnieniu wêdrówki plemników przez wzmo¿enie czynnoci skurczowej miêniówki narz¹du p³ciowego oraz przypieszeniu owulacji. W niniejszych badaniach w celu zweryfikowania uzyskanych informacji do ka¿dej dawki nasienia mro¿onego bezporednio przed inseminacj¹ do-dawano 5 mg preparatu Dinolytic (prostaglandyny nie po-dawano przy inseminacji loch w grupie kontrolnej). Jak
Objanienia: a, b jak w tab. 2; A, B jak w tab. 1
Tab. 4. Wp³yw formy konfekcjonowania mro¿onego nasienia knura na wskaniki rozrodu loch (x ± s; n = 50)
Objanienia: a, b jak w tab. 2; A, B rednie wartoci w kolumnie z ró¿nymi indek-sami ró¿ni¹ siê istotnie przy p £ 0,01
Tab. 5. Wp³yw metody konserwacji nasienia knura na skutecznoæ i efektywnoæ unasienniania loch nasieniem mro¿onym i sch³odzonym (x ± s; n = 50)
e i n a w o k a p O zaWps³koad knniieñ ) % ( a k s W kni ñ e z s o r p o ) % ( a b z c il a n l ó g O t ¹ i s o r p ) n ( e i c o i m w a b z c i L t ¹ i s o r p ) n ( h c y w tr a m y ¿ ¹ i c æ o g u ³ D )i n d ( l m 5 , 0 i k m o ³ S 0 2 = n 100±0,00 85±36 10,70±2,20a 0,72±0,75 115,82±1,42b l m 5 i k m o ³ S 0 2 = n 90±30 73±45 19,57±1,60A 0,57±0,94 115,53±1,76a e n o z d o ³ h c s e i n e i s a N 0 1 = n 90±31 90±31 12,00±1,80B 0,67±0,87 114,55±0,88a ij c a w r e s n o k a d o t e M a i n e i s a n a k s W kni ñ e i n d o ³ p a z ) % ( a k s W kni ñ e z s o r p o ) % ( a b z c il a n l ó g O t ¹ i s o r p h c y n o z d o r u . a b z c i L t ¹ i s o r p h c y w tr a m y ¿ ¹ i c æ o g u ³ D )i n d ( A a d o t e M 0 2 = n 95±22 75±44 10,06±1,79a 0,69±0,79 115,57±1,78a B a d o t e M 0 2 = n 95±22 84±37 10,31±2,24a 0,63±0,91 115,81±1,37b e n o z d o ³ h c s e i n e i s a N 0 1 = n 90±31 90±31 12,00±1,80b 0,67±0,87 114,55±0,88a
ju¿ nadmieniono, u¿ytkowoæ rozrodcza loch insemino-wanych nasieniem mro¿onym/rozmro¿onym w obecnym dowiadczeniu nie odbiega od wyników prac przedsta-wionych przez innych autorów. Mog³o to zostaæ spowo-dowane zarówno przez w³¹czenie PGF2 alfa do procedu-ry inseminacji nasienia mro¿onego, przez podawanie na-sienia mro¿onego specjalnym kateterem do wnêtrza jamy macicy, jak równie¿ ultrasonograficzn¹ ocen¹ rozwoju pêcherzyków jajnikowych na gonadach loch.
Metoda A zosta³a opracowana na podstawie oryginal-nej technologii Westendorfa i wsp. (22), za metoda B wed³ug techniki mro¿enia nasienia knura opracowanej przez Pursela i Parka (17). Powy¿sze technologie ró¿ni¹ siê sposobem inkubowania nasienia po pobraniu ejakula-tu oraz temperaejakula-tur¹, w której oddziela siê plemniki od plazmy nasienia przez wirowanie. W niniejszym dowiad-czeniu zauwa¿alnie wy¿sza, choæ nie potwierdzona sta-tystycznie, liczba prosi¹t urodzonych przez lochy insemi-nowane nasieniem mro¿onym wed³ug metody B (o 0,25) koresponduje z wynikami wczeniejszych badañ w³as-nych, w których stwierdzono wy¿sz¹ jakoæ plemników zamra¿anych wg metody B w porównaniu z metod¹ A w aspekcie odsetka plemników o ruchu prawid³owym i z nieuszkodzonym akrosomem (3, 5).
W trakcie rozwoju technologii kriokonserwacji nasie-nia knura skoncentrowan¹ zawiesinê plemników zamra-¿ano w formie kulek na suchym lodzie lub w opakowa-niach plastykowych i tubach aluminiowych w parach ciek-³ego azotu. Obecnie mro¿one nasienie knura konfekcjo-nuje siê w du¿ych tubach plastykowych o objêtoci 5 ml, minitubach o objêtoci 0,5-1 ml, torebkach plastykowych o objêtoci 6-12 ml, tubach p³askich o objêtoci 1,7-2 ml lub w tubach aluminiowych (3, 7-9, 17, 19, 22). Z przy-czyn praktycznych preferuje siê opakowania o wiêkszej objêtoci, które zawieraj¹ od 2 do 5 × 109 plemników.
Nasienie knura w opakowaniach o du¿ym przekroju nara-¿one jest na niekorzystne warunki kriobiologiczne w cza-sie kriokonserwacji w porównaniu do naw cza-sienia konfek-cjonowanego w pojemnikach p³askich i o mniejszej ob-jêtoci. Plemniki zamra¿ane w statycznych parach ciek-³ego azotu w s³omkach o du¿ym przekroju podlegaj¹ nie-korzystnemu procesowi przech³odzenia (supercooling), a nastêpnie przed³u¿onemu okresowi krystalizacji (fre-ezing point plateau) (7). Ponadto w czasie rozmra¿ania du¿ej s³omki plemniki le¿¹ce w rodku rozmra¿aj¹ siê prawie 4 razy wolniej ni¿ komórki le¿¹ce peryferyjnie. Suboptymalne tempo zamra¿ania i rozmra¿ania plemni-ków le¿¹cych w rodku du¿ej s³omki zwi¹zane jest z nie-korzystnym stosunkiem powierzchni do objêtoci tego opakowania (du¿a objêtoæ, a ma³a powierzchnia) (22). Istotnie wy¿sz¹ jakoæ nasienia po rozmro¿eniu osi¹ga siê, gdy nasienie konfekcjonowane jest w opakowaniach o przekroju p³askim lub/i okr¹g³ym, o mniejszej objêto-ci. Spowodowane jest to stosunkiem du¿ej powierzchni do ma³ej objêtoci opakowania, co sprzyja szybkiej wy-mianie ciep³a pomiêdzy zawartoci¹ opakowania a oto-czeniem. Proces zamra¿ania i rozmra¿ania jest dziêki temu bardziej jednorodny w centrum i na obwodzie opakowa-nia, co manifestuje siê wysok¹ jakoci¹ nasienia po roz-mro¿eniu próbek (7, 8, 17, 21, 22). Zapewne wobec po-wy¿szego lochy inseminowane nasieniem konfekcjono-wanym w s³omkach 5 ml rodzi³y istotnie mniej prosi¹t
ni¿ lochy inseminowane s³omkami o objêtoci 0,5 ml mro¿onym wg metody A (o 1,2) i B (o 1,06). W zestawie-niu bior¹cym pod uwagê wy³¹cznie typy s³omek (5 i 0,5 ml) ró¿nica by³a ju¿ wysoko istotna i wynosi³a 1,13 pro-si¹t wiêcej urodzonych po inseminacji loch nasieniem kon-fekcjonowanym w s³omkach 0,5 ml.
Na podstawie uzyskanych wyników badañ nad porów-nawcz¹ ocen¹ jakoci wybranych wskaników u¿ytkowo-ci rozrodczej loch inseminowanych nasieniem wg metody A i metody B w s³omkach 0,5 i 5 ml mo¿na stwierdziæ, i¿ metody te oraz opakowania spe³niaj¹ kryteria przeprowa-dzonych analiz i mog¹ byæ wykorzystywane do insemi-nacji loch w warunkach fermowych.
Pimiennictwo
1.Almlid T., Homo P. O.: A brief review of frozen semen application under Norvegian AI service conditions. Repr. Dom. Anim. 1996, 31, 169-173. 2.Badura J.: Zamra¿anie nasienia knurów przy u¿yciu ró¿nych metod. Rocz. Nauk.
Zoot. 1988, 15, 25-34.
3.Bielas W.: Wp³yw ró¿nych metod konserwacji nasienia knura w niskich tempe-raturach na wybrane w³aciwoci plemników. Praca doktorska, Wroc³aw 1999. 4.Bielas W., Dubiel A.: Wp³yw inseminacji nasieniem mro¿onym na p³odnoæ loch, [w:] Malinowski E., K³ossowska A., Twardoñ J. (red.): Zaburzenia w rozrodzie zwierz¹t wysokoprodukcyjnych. PIWet, Pu³awy 2003, 17-20.
5.Bielas W., Dubiel A., Ni¿añski W.: Wp³yw metod konserwacji oraz form konfek-cjonowania na jakoæ plemników knura po rozmro¿eniu. Medycyna Wet. 2003, 59, 172-175.
6.Bolarín A., Roca J., Rodríguez-Martínez H., Hernández M.: Dissimilarities in sows ovarian status at the insemination time could explain differences in fertility between farms when frozen-thawed semen is used. Theriogenology 2006, 65, 669-680.
7.Bwanga C. O., Hofmo P. O., Grevle I. S., Einarsson S., Rodriguez-Martinez H.: In vivo fertilizing capacity of deep frozen boar semen packaged in plastic bags and maxi-straws. J. Vet. Med. A 1991, 38, 281-286.
8.Ericsson B. M., Petersson H., Rodriguez-Martinez H.: Field fertility with exported boar semen frozen in the new PlatPack container. Theriogenology 2002, 1065--1079.
9.Fraser L., Strze¿ek J.: Effect of different procedures of ejaculate collection, extenders and packages on DNA integrity of boar spermatozoa following freezing-thawing. Anim. Reprod. Sci. 2007, 99, 317-329.
10.Hammit D. G., Martin P. A.: Fertility of frozen-thawed porcine semen following controled-rate freezing in straws. Theriogenolgy 1989, 32, 359-367. 11.Johnson L. A., Aalbers J. G., Willems C. M. T., Sybesma W.: Use of boar
sperma-tozoa for artificial insemination. I. Fertilizing capacity of fresh and frozen sper-matozoa in sows no 36 farms. J. Anim. Sci. 1981, 52, 1130-1136.
12.Kaufold J., Althouse G. C.: An update on the use of B-mode ultrasonography in female pig reproduction. Theriogenology 2007, 67, 901-911.
13.Kos M., Bilkei G.: Prostaglandin F2á supplemented semen improves reproductive
performance in artificially inseminated sows. Anim. Repr. Sci. 2004, 80, 113--120.
14.Langendijk P., Soede N. M., Kemp B.: Uterine activity, sperm transport, and the role of boar stimuli around insemination in sows. Theriogenology 2005, 63, 500-513.
15.£yczyñski A.: Zdolnoæ zap³adniaj¹ca mro¿onego nasienia knurów. Medycyna Wet. 1977, 33, 296-298.
16.Pena F., Dominiguez J. C., Alegre B., Pelaez J.: Effect of vulvomucosal of PGF2á
at insemination on subsequent fertility and litter size in pigs field conditions. Anim. Repr. Sci. 1998, 52, 63-69.
17.Pursel V. G., Park C. S.: Duration of thawing on post acrosome morphology and motility of boar spermatozoa frozen in 5 ml maxi-straws. Theriogenology 1987, 28, 683-690.
18.Roca J., Vázquez J. M., Gil M. A., Cuello C., Parilla I., Martinez E. A.: Challanges in Pig Artificial Insemination. Reprod. Dom. Anim. 2006, 41 (Suppl. 2), 43-53. 19.Strze¿ek J., Glogowski J., Hopfer E., Wojtkiewicz K.: Kortowska metoda
zamra-¿ania nasienia knura. Medycyna Wet. 1986, 41, 349-353.
20.Watson P. F., Behan J. R.: Intrauterine insemination of sows with reduced sperm numbers: results of a commercially based field trial. Theriogenology 2002, 57, 1683-1693.
21.Weitze K. F., Rath D., Baron.: Neue Aspekte der Tiefgefrierkonservierung von Ebersperma in Plastikrohren. Dtsch. Tierärztl. Wschr. 1987, 94, 485-488. 22.Westendorf P., Richter L., Treu H.: Zur Tiefgefrierung von Ebersperma. Labor
und Besamungsergebnisse mit dem Hulsenberger Pailletten-Verfahren. Dtsch. Tierärztl. Wschr. 1975, 82, 261-300.
23.Woelders H., Matthhijas C. A., Zuidberg C. A., Chaveiro A. E. N.: Cryopreser-vation of boar semen: equilibrium freezing in the cryomicroscope and in straws. Theriogenology 2005, 63, 383-395.
Adres autora: dr Wies³aw Bielas, pl. Grunwaldzki 49, 50-366 Wroc³aw; e-mail: wieslaw.bielas@up.wroc.pl
