Med. Weter. 2013, 69 (2) 116
Praca oryginalna Original paper
Nosaciznê wywo³uje pa³eczka nosacizny Burkhol-deria mallei zwana dawniej Pseudomonas mallei lub Actinobacillus mallei (2, 6, 11, 12). Jest to zakana i zaraliwa choroba nieparzystokopytnych o przebiegu zazwyczaj przewlek³ym. Cechuje j¹ obecnoæ ³atwo rozpadaj¹cych siê guzków i owrzodzeñ na b³onach luzowych, skórze i w narz¹dach wewnêtrznych. Wiel-b³¹dy, niedwiedzie, wilki i psy równie¿ s¹ wra¿liwe na zaka¿enie (6, 10, 12). Byd³o i winie nie choruj¹ na nosaciznê (2, 6). Natomiast ma³e prze¿uwacze mog¹ ulec zaka¿eniu, jeli przebywaj¹ w bliskim kontakcie z chorymi koñmi (12).
Nosacizna mo¿e przebiegaæ w postaci ostrej lub prze-wlek³ej. Na ostr¹ postaæ nosacizny zapadaj¹ zwykle os³y, mu³y i zwierzêta miêso¿erne, konie za choruj¹ w 90% przypadków na postaæ przewlek³¹. Podzia³ na nosaciznê p³uc, nosa i skóry jest dokonany na pod-stawie miejsca wystêpowania zmian. Jest to podzia³ pomocniczy, gdy¿ w zasadzie zmiany we wszystkich wymienionych narz¹dach wystêpuj¹ równoczenie, ale z ró¿nym nasileniem.
Nosacizna jest przenoszona tak¿e na cz³owieka przez bezporedni kontakt z chorymi zwierzêtami lub zainfekowanym materia³em. Zagro¿enie stanowi rów-nie¿ praca z pa³eczkami nosacizny w laboratorium. Zaka¿enie nastêpuje przewa¿nie przez kontakt,
pod-czas którego zarazki nosacizny wnikaj¹ w g³¹b tkanki poprzez uszkodzon¹ skórê lub b³onê luzow¹. Mo¿e ono nast¹piæ tak¿e drog¹ aerogenn¹. U ludzi zaka¿e-nie B. mallei ma ciê¿ki przebieg kliniczny i bez odpo-wiedniego leczenia prowadzi do mierci (2, 12). Pato-gennoæ tego drobnoustroju czyni go potencjalnym czynnikiem biologicznym, który mo¿e byæ wykorzy-stywany w atakach bioterrorystycznych (2).
Nosacizna by³a dawniej szeroko rozpowszechniona i powodowa³a ogromne straty. Zosta³a wyeliminowana z wielu krajów dziêki ustawowym badaniom, likwi-dacji zaka¿onych zwierz¹t i ograniczeniom importo-wym. Nadal utrzymuje siê w niektórych krajach Azji, Afryki i Ameryki Po³udniowej. W latach 2010-2011 nosacizna wystêpowa³a w Afganistanie, Bahrajnie, Erytrei, Libanie, Mongolii, Birmie, Kuwejcie, Brazy-lii, Indiach, Iranie i Pakistanie (World Animal Health Information Database, OIE, http://www.oie.int/). Mo¿e byæ rozpatrywana jako choroba powracaj¹ca i zostaæ sprowadzona wraz ze zwierzêtami domowymi lub koñmi wycigowymi do wolnych od niej obszarów. W Polsce ostatni przypadek nosacizny u konia stwier-dzono w 1957 r. Zgodnie z krajowymi regulacjami, nosacizna nale¿y do zakanych chorób zwierz¹t pod-legaj¹cych obowi¹zkowi rejestracji (8).
Badania nad zastosowaniem metody western-blotting
do serologicznej diagnostyki nosacizny
AGNIESZKA KÊDRAK-JAB£OÑSKA, SYLWIA BUDNIAK, ANNA SZCZAWIÑSKA, MONIKA REKSA, MAREK KRUPA
Zak³ad Mikrobiologii Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Kêdrak-Jab³oñska A., Budniak S., Szczawiñska A., Reksa M., Krupa M.
Studies on the application of the western-blotting method for serological diagnostics of glanders Summary
The aim of the study was to evaluate the application of SDS-PAGE electrophoresis and western-blotting for serological diagnostics of glanders. Six commercial Burkholderia mallei antigens, eight anti-B. mallei sera and two negative sera were used in the study. In the first part of the study electrophoretic profiles of antigens in SDS-PAGE were determined at a gradient of 4% to 20% of polyacrylamide gel. Optimal conditions of western-blotting reaction were determined. In the case of all examined antigens and anti-B. mallei sera, the presence of protein fractions in the range from 42 to 33 kDa and one band of the molecular weight of 16 kDa were demonstrated by immunoblotting reaction. Additional bands of the different molecular weight were also observed. The antigens examined did not show reaction with negative sera. In the next part of the study, a sensitivity of the western-blotting method and the CFT were compared. The western-blotting method was two four times more sensitive than the CFT.
Med. Weter. 2013, 69 (2) 117 Badania serologiczne w kierunku nosacizny s¹
wy-konywane przy u¿yciu odczynu wi¹zania dope³niacza (OWD). Jest to obecnie jedyna metoda serologiczna oficjalnie uznana przez OIE (World Organisation for Animal Health). Dok³adnoæ tej metody wynosi 90--95% (6). Wed³ug OIE, w przypadku surowic niespe-cyficznych oraz daj¹cych fa³szywe wyniki w tecie OWD mo¿liwe jest zastosowanie metod alternatyw-nych, takich jak ELISA lub western-blotting (1-7, 9). Celem badañ by³a ocena zastosowania metody roz-dzia³u elektroforetycznego w SDS-PAGE oraz western--blotting do serologicznej diagnostyki nosacizny.
Materia³ i metody
Antygeny i surowice. Do badañ u¿yto szeciu komer-cyjnych antygenów Burkholderia mallei (B1, B2, B3, B4, B5 i B6) oraz siedmiu komercyjnych surowic kontrolnych dodatnich, w tym szeciu surowic komercyjnych jednej fir-my (S1, S2, S3, S4, S5 i S6) i jednej pochodz¹cej z innej firmy (S7). W badaniach wykorzystano równie¿ surowicê otrzyman¹ do badañ bieg³oci (S8), która dawa³a wynik do-datni w odczynie wi¹zania dope³niacza. Do dowiadczenia w³¹czono ujemn¹ surowicê królicz¹ (S9) oraz surowicê koñsk¹ reaguj¹c¹ ujemnie w OWD (S10).
Rozdzia³ w SDS-PAGE. Ka¿dy antygen mieszano z bu-forem do próbek DualColorTM Protein Loading Buffer
(Fer-mentas) zgodnie z instrukcj¹ producenta. Przed naniesie-niem na ¿el próbki gotowano w temperaturze 100°C przez 5 minut, a nastêpnie wirowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, przy 12 000 obrotów/min.
Rozdzia³ elektroforetyczny antygenów prowadzono w ¿e-lach poliakrylamidowych o gradiencie 4-20% i gruboci 1 mm (SERVA), w buforze do elektroforezy firmy Fermen-tas, w komorze do elektroforezy omniPAGE (Cleaver Scien-tific Ltd). Jako standard masy zastosowano PageRulerTM
Prestained Protein Ladder (Fermentas) o zakresie 10-170 kDa. Rozdzia³ przy sta³ym napiêciu 120 V prowadzono do momentu, gdy czo³o barwnika zbli¿a³o siê na 1-2 mm do koñca ¿elu. ¯ele barwiono metod¹ srebrzenia przy u¿yciu zestawu PageSilverTM Silver Staining Kit (Fermentas).
Western-blotting. Transfer na membranê nitrocelulo-zow¹ (Bio Rad) prowadzono przy sta³ym napiêciu 100 V w komorze do elektrotransferu mokrego (omniPAGE Elec-troblotter, Cleaver Scientific Ltd). Po przeniesieniu bia³ek na membranê blokowanie wolnych miejsc prowadzono przy u¿yciu 2% mleka (Fluka) w PBS z dodatkiem 0,02% Tween 20 w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mem-branê inkubowano w basenikach pojemnika zawieraj¹cych surowice rozcieñczone 1 : 20 w PBS z dodatkiem 0,02% Tween 20 (PBST) przez noc, w temperaturze pokojowej. Nastêpnie b³onê nitrocelulozow¹ p³ukano trzykrotnie przez 10 minut w kuwecie zawieraj¹cej ok. 100 ml PBST w tem-peraturze pokojowej oraz umieszczano w roztworze koniu-gatu Anti-Rabbit IgG Alkaline Phosphatase, Sigma przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w przypadku suro-wic S1 do S6 i S9 (surosuro-wice królicze) oraz Anti-Horse IgG Alkaline Phosphatase, Sigma dla surowic S7, S8 i S10 (su-rowice koñskie). Nastêpnie membranê ponownie p³ukano dwukrotnie w PBST i jednorazowo w PBS.
Jako substratu u¿yto SIGMAFASTTM BCIP/NBT
(Sig-ma). B³onê nitrocelulozow¹ inkubowano przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Reakcjê enzymatyczn¹ prze-rywano przez odp³ukanie membrany w wodzie destylo-wanej.
¯ele i obrazy immunoblottingu fotografowano oraz ana-lizowano przy u¿yciu programu Bio-1D++ firmy Vilber Lourmat.
Wyniki i omówienie
W pierwszym etapie badañ przeprowadzono rozdzia³ elektroforetyczny szeciu antygenów B. mallei w SDS--PAGE przy 4-20% gradiencie ¿elu poliakrylamido-wego. W badaniach wstêpnych ustalono, ¿e optymalna iloæ antygenu na próbkê wynosi 10 µl.
Nastêpnie wykonano transfer antygenów na b³onê nitrocelulozow¹. Bia³ka wykrywano przy u¿yciu su-rowic zawieraj¹cych przeciwcia³a anty-B. mallei. Wstêpnie okrelono optymalne warunki przeprowadza-nia reakcji western-blotting z surowicami kontrolny-mi dodatnikontrolny-mi i surowicakontrolny-mi ujemnykontrolny-mi. W badaniach przeprowadzonych z surowic¹ kontroln¹ dodatni¹ S2, dla koniugatu Anti-Rabbit IgG Alkaline Phosphatase wybrano rozcieñczenie 1 : 4000. Z koniugatem w ta-kim rozcieñczeniu surowica królicza ujemna S9 nie dawa³a widocznych pr¹¿ków. Z kolei w przypadku surowicy S7 dla koniugatu Anti-Horse IgG Alkaline Phosphatase jako optymalne ustalono rozcieñczenie 1 : 1000. Równie¿ w przypadku tego koniugatu z su-rowic¹ koñsk¹ ujemn¹ S10 nie stwierdzano reakcji w postaci pr¹¿ków.
Na ryc. 1 przestawiono przyk³adowe wyniki reakcji immunoblotting badanych antygenów z surowicami zawieraj¹cymi przeciwcia³a anty-B. mallei.
W reakcji western-blotting szeciu badanych anty-genów z komercyjnymi surowicami kontrolnymi do-datnimi (S1, S2, S3, S4, S5 i S6) wykrywano od 15 do 23 pasm bia³kowych o ró¿nych masach molekularnych. Profile elektroforetyczne immunoblottingów by³y wi-zualnie podobne. Dopiero analiza denzytometryczna pozwoli³a na wykazanie pewnych ró¿nic istniej¹cych miêdzy poszczególnymi antygenami i surowicami. Surowice wykrywa³y zazwyczaj bia³ka o masach 52-54, 49-50, 47-48, 44-45, 41-42, 39-40, 37-38, 35-36, 33-34, 29-30, 26-27 i 16 kDa. W zakresie 58-60 kDa surowice S1, S3, S5 i S6 reagowa³y z jednym bia³-kiem, a surowica S4 z dwoma bia³kami. W pasmach bia³kowych o masach molekularnych 31-32 i 21-22 kDa wystêpowa³ pr¹¿ek w wyniku reakcji z surowica-mi S1, S2, S5 i S6. W przypadku bia³ka w pasurowica-mie 25 kDa zazwyczaj stwierdzano reakcjê z surowicami S1, S2, S4, S5 i S6. Miêdzy 23 a 24 kDa surowice S1, S2, S5 i S6 dawa³y jeden pr¹¿ek, a surowica S3 dwa pr¹¿-ki. Surowica S3 reagowa³a równie¿ z bia³kami o ma-sie 56 i 28 kDa, surowica S4 42-43 kDa, surowica S5 65 i 43 kDa oraz surowica S6 20 i 21 kDa. ¯aden z badanych antygenów nie dawa³ reakcji w po-staci pr¹¿ków z ujemn¹ surowic¹ królicz¹ S9.
Med. Weter. 2013, 69 (2) 118
W immunoblotting z surowicami koñskimi S7 i S8 u badanych antygenów wykrywano od 11 do 21 pasm bia³kowych. Obie surowice wykrywa³y frakcje bia³-kowe o masach molekularnych: 41-42, 39-40, 37-38, 35-36, 33-34, 20, 18, 16, 14 i 12 kDa. Dodatkowo surowica dodatnia S8 zazwyczaj reagowa³a z bia³ka-mi o masie: 65, 49-50, 47-48, 44-45 i 31-32 kDa. W ba-danych antygenach nie wykrywano pasm bia³kowych przy pomocy ujemnej surowicy koñskiej S10.
W kolejnym etapie badañ porównywano czu³oæ metody western-blotting z metod¹ OWD. W przypad-ku komercyjnej surowicy dodatniej S1, której miano deklarowane przez producenta wynosi 1 : 320, w im-munoblotting stwierdzono wyranie widoczne pr¹¿ki w rozcieñczeniach 1 : 5 do 1 : 640. W kolejnym roz-cieñczeniu zaobserwowano mniej pasm bia³kowych, które charakteryzowa³y siê mniejsz¹ intensywnoci¹. W przypadku surowicy S2 o mianie 1 : 160 obserwo-wano wyranie widoczne pr¹¿ki do rozcieñczenia 1 : 320. Podobnie jak w surowicy S1 w dalszych roz-cieñczeniach wystêpowa³o mniej pasm bia³kowych, które wykazywa³y mniejsz¹ intensywnoæ. Ujemna
surowica królicza S9 nie dawa³a reakcji w postaci pr¹¿-ków w ¿adnym z badanych rozcieñczeñ.
Nastêpnie przeprowadzono immunoblotting z suro-wic¹ S7, której miano deklarowane przez producenta wynosi 1 : 40 (ryc. 2A). Stwierdzono wyranie wi-doczne pasma bia³kowe w rozcieñczeniach 1 : 5 do 1 : 160, po czym w dalszych rozcieñczeniach zaobser-wowano mniej pr¹¿ków, które charakteryzowa³y siê mniejsz¹ intensywnoci¹. Równie¿ w przypadku ujem-nej surowicy koñskiej S10 nie stwierdzono pasm bia³-kowych (ryc. 2B).
Odczyn wi¹zania dope³niacza jest powszechnie sto-sowanym, zatwierdzonym w skali miêdzynarodowej testem do badania serologicznego w kierunku nosa-cizny, metoda ta jednak zawodzi w przypadku suro-wic wykazuj¹cych aktywnoæ antykomplementarn¹ czy te¿ daj¹cych wyniki fa³szywie dodatnie. Takie wyniki mog¹ prowadziæ do utrudnieñ w obrocie zwierzêtami, a tak¿e powodowaæ wy³¹czenie zwierzêcia lub zwie-rz¹t z produkcji do czasu ich wyjanienia w badaniach potwierdzaj¹cych. Ze wzglêdów epidemiologicznych wyniki fa³szywie dodatnie stwarzaj¹ jednak mniejsze zagro¿enie w porównaniu z wynikami fa³szywie
ujem-Ryc. 1. Immunoblotting antygenów B1 (1), B2 (2), B3 (3), B4 (4), B5 (5) i B6 (6) z surowic¹ kontroln¹ dodatni¹: A. S6; B. S7; M stan-dard masy
Ryc. 2. Immunoblotting antygenu B1: A. z surowic¹ kontroln¹ dodatni¹ S7; B. z ujemn¹ surowic¹ koñsk¹ S10; cie¿ki 1 do 10: kolejne rozcieñcze-nia surowicy od 1 : 5 do 1 : 1280; M standard masy
Med. Weter. 2013, 69 (2) 119 nymi, które nie maj¹ szans na weryfikacjê. W
przy-padku surowic, które w OWD stwarzaj¹ trudnoci diag-nostyczne, metod¹ alternatywn¹ mo¿e byæ immuno-blotting. Metoda western-blotting by³a stosowana do diagnostyki serologicznej nosacizny, a tak¿e innych jednostek chorobowych, takich jak babeszjoza czy za-raza stadnicza (1, 3).
Wyniki naszych badañ s¹ zbie¿ne z wynikami Katz i wsp. (3). Autorzy ci wykazali, ¿e surowice zawiera-j¹ce przeciwcia³a anty-B. mallei daj¹ w reakcji western--blotting specyficzne i powtarzalne profile bia³kowe. Stosuj¹c w immunoblotting antygen identyczny z u¿y-wanym w tecie OWD, w badaniach przeprowadzo-nych z surowicami kontrolnymi dodatnimi uzyskali oni pr¹¿ki w podobnym jak w przypadku naszych badañ zakresie molekularnych mas bia³ek. Identycznie rów-nie¿ surowice pochodz¹ce od zwierz¹t, które nie by³y zaka¿one, nie reagowa³y w tym tecie.
Uzyskane wyniki wskazuj¹, ¿e opracowana metoda western-blotting charakteryzuje siê czu³oci¹ od dwóch do czterech razy wy¿sz¹ w porównaniu do metody OWD. Równie¿ Katz i wsp. (3) porównuj¹c punkty koñcowe rozcieñczeñ uzyskanych w metodzie OWD oraz immunoblotting, wykazali, ¿e immunoblotting jest od dwóch do czterech razy czulszy.
Reasumuj¹c, nale¿y stwierdziæ, ¿e uzyskane wyniki wskazuj¹ na mo¿liwoæ zastosowania metody wes-tern-blotting do diagnostyki nosacizny. W przypadku wszystkich u¿ytych antygenów w reakcji z surowica-mi zawieraj¹cysurowica-mi przeciwcia³a anty-B. mallei wyka-zano obecnoæ frakcji bia³kowych w zakresie od 42 do 33 kDa oraz pr¹¿ka o masie molekularnej 16 kDa. W immunoblotting badanych antygenów i surowic wy-krywano równie¿ dodatkowe bia³ka o ró¿nej masie molekularnej. Wykazano tak¿e wy¿sz¹ czu³oæ meto-dy western-blotting w porównaniu do OWD.
Kontynuacjê pracy bêdzie stanowi³o zastosowanie metody western-blotting do badania terenowych suro-wic koñskich, które w OWD stwarza³y trudnoci diag-nostyczne.
Pimiennictwo
1.Elschner M. C., Scholz H. C., Melzer F., Saquib M., Marten P., Rassbach A., Dietzsch M., Schmoock G., de Assis Santana V. L., de Souza M. M. A., Wernery R., Wernery U., Neubauer H.: Use of Western blot technique for the serodiagnosis of glanders. BMC Vet. Res. 2011, 7, 4.
2.Gliñski Z., Kostro K.: Nosacizna grona choroba i zagro¿enie bioterrory-styczne. ¯ycie Wet. 2012, 87, 389-393.
3.Katz J. B., Chieves L. P., Hennager S. G., Nicholson J. M., Fisher T. A., Byers P. E.: Serodiagnosis of equine piroplasmosis, dourine, and glanders using an arrayed immunoblotting method. J. Vet. Diagn. Invest. 1999, 11, 292-294. 4.Katz J., Dewald R., Nicholson J.: Procedurally similar competitive
immuno-assay systems for the serodiagnosis of Babesia equi, Babesia caballi, Trypano-soma equiperdum, and Burkholderia mallei infection in horses. J. Vet. Diagn. Invest. 2000, 12, 46-50.
5.Neubauer H., Sprague L. D., Zacharia R., Tomaso H., Al Dahouk S., Wernery R., Wernery U., Scholz H. C.: Serodiagnosis of Burkholderia mallei Infections in Horses: State-of-the-art and Perspectives. J. Vet. Med. B. 2005, 52, 201-205.
6.OIE: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Paris 2008.
7.Sprague L. D., Zachariah R., Neubauer H., Wernery R., Joseph M., Scholz H. C., Wernery U.: Prevalence-dependent use of serological tests for diagno-sing glanders in horses. BMC Vet. Res. 2009, 5, 32.
8.Ustawa z dnia 11 marca 2004 r. o ochronie zdrowia zwierz¹t oraz zwalczaniu chorób zakanych zwierz¹t (Dz. U. z 2008 r. Nr 213, poz. 1342, tekst jednolity). 9.Verma R. D., Sharma J. K., Venkateswaran K. S., Batra H. V.: Development of an avidin-biotin dot enzyme-linked immunosorbent assay and its comparison with other serological tests for diagnosis of glanders in equines. Vet. Micro-biol. 1990, 25, 77-85.
10.Wernery U., Wernery R., Joseph M., Al-Salloom F., Johnson B., Kinne J., Jose S., Jose S., Tappendorf B., Hornstra H., Scholz H. C.: Natural Burk-holderia mallei Infection in Dromedary, Bahrain. Emerg. Infect. Dis. 2011, 17, 1277-1279.
11.Whitlock G. C., Estes D. M., Torres A. G.: Glanders: off to the races with Burkholderia mallei. FEMS Microbiol. Lett. 2007, 277, 115-122.
12.Wittig M. B., Wohlsein P., Hagen R. M., Al Dahouk S., Tomaso H., Scholz H. C., Nikolaou K., Wernery R., Wernery U., Kinne J., Elschner M., Neubauer H.: Glanders a comprehensive review. Dt. Tierärztl. Wschr. 2006, 113, 323-330.
Adres autora: dr Agnieszka Kêdrak-Jab³oñska, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: akedrak@piwet.pulawy.pl
