Medycyna Weterynaryjna - Summary Medycyna Wet. 64 (9), 1157-1160, 2008

Medycyna Wet. 2008, 64 (9) 1157

Praca oryginalna Original paper

Postêp w zakresie parametrów produkcyjnych na ogó³ prowadzi do os³abienia wrodzonej odpornoœci, stanowi¹cej pierwsz¹ barierê chroni¹c¹ organizm pta-ka przed patogenami (7, 29). Sprawnie funkcjonuj¹cy uk³ad odpornoœciowy u ptaków jest nieodzowny, by zapewniæ im zdolnoœæ do przetrwania w œrodowisku, w którym, z jednej strony, stale roœnie zagro¿enie pa-togenami wywo³uj¹cymi choroby zakaŸne, z drugiej – wprowadzane s¹ rygorystyczne ograniczenia w stoso-waniu chemioterapeutyków oraz narasta na nie opor-noœæ (17, 29, 31). Stan ten potêgowany jest bardzo czêsto oddzia³ywaniem immunosupresorów niezakaŸ-nych, trwale zwi¹zanych z warunkami chowu (8) oraz jakoœciowym i iloœciowym sk³adem skarmianej paszy (4, 9, 28). Równie¿ stosowane œrodki terapeutyczne (np. tetracykliny) mog¹ obni¿aæ si³ê oddzia³ywania bodŸca antygenowego, wp³ywaæ supresyjnie na roz-wój pamiêci immunologicznej, a tak¿e hamowaæ zdol-noœci chemotaktyczne oraz fagocytarne neutrofili (11, 12, 27). Nastêpstwem immunosupresji, zarówno

uwa-runkowanej genetycznie, jak i powstaj¹cej pod wp³y-wem ró¿nych czynników œrodowiskowych jest za-ostrzenie tocz¹cych siê procesów chorobowych, zwiêk-szona wra¿liwoœæ ptaków na infekcje, obni¿enie wskaŸników produkcyjnych oraz zmniejszenie sku-tecznoœci prowadzonej immunoprofilaktyki (5, 13, 25, 30).

Wobec powy¿szego podejmuje siê ró¿ne dzia³ania celem zminimalizowania wp³ywu czynników immu-nosupresyjnych na organizm ptaków w produkcji wiel-kotowarowej. Jednym z kierunków takiego postêpo-wania s¹ podejmowane próby modulopostêpo-wania zjawisk odpornoœciowych (10, 20-22, 24, 26). Nowatorskim kierunkiem w tym zakresie jest aplikowanie immuno-modulatorów in ovo. Wstêpne wyniki badañ (18, 26) wskazuj¹ na przydatnoœæ takiej metody immunomo-dulacji w podnoszeniu odpornoœci swoistej i nieswo-istej u indyków.

Celem badañ by³a ocena wp³ywu syntetycznego nis-kotoksycznego immunomodulatora – metisoprinolu,

Wp³yw metisoprinolu zastosowanego in ovo

na odsetek subpopulacji limfocytów T

CD3

+

_{, CD4}

+

_{i CD8}

+

_{u indyków}

TOMASZ STENZEL, BART£OMIEJ TYKA£OWSKI, MARCIN ANDRZEJEWSKI, ANDRZEJ KONCICKI

Zespó³ Chorób Ptaków Katedry Chorób ZakaŸnych i Inwazyjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UWM, ul. Oczapowskiego 13, 10-957 Olsztyn

Stenzel T., Tyka³owski B., Andrzejewski M., Koncicki A. The influence of methisoprinol applied in ovo on the percentage

of CD3+_{, CD4}+ _{and CD8}+ _{T-lymphocyte subpopulations in turkeys}

Summary

The aim of the research was to determine the influence of a synthetic immunomodulator – methisoprinol applied in ovo as a 10% solution in doses of 5 mg per egg (group I) and 20 mg of active substance per egg (group II) on the 26th _{day of incubation – on T-lymphocyte subpopulations in the blood and spleen of 5-day-old}

turkeys hatched from the treated eggs. The control group (group III) were turkeys hatched from eggs in standard hatchery conditions (without in ovo injections). The percentage of T-lymphocyte subpopulations was determined by flow cytometry using specific monoclonal anti-T CD3+_{, CD4}+ _{and CD8}+_{antibodies and an}

EPICS XL apparatus.

It was demonstrated that methisoprinol applied in ovo in doses of 5 mg per egg stimulated non-specific mechanisms of humoral immunity in 5-day-old turkey poults hatched from the treated eggs, which resulted in a higher percentage of CD3+ _{and CD4}+ _{T-lymphocytes in their blood and spleen. Methisoprinol applied in ovo}

in doses of 20 mg per egg stimulated mainly non-specific mechanisms of cellular immunity in 5-day-old turkey poults hatched from the treated eggs, as evidenced by a higher percentage of CD8+ _{T-lymphocytes in the}

spleen.

Medycyna Wet. 2008, 64 (9) 1158

aplikowanego in ovo w 26. dobie inkubacji indyczych jaj wylêgo-wych na zachowanie siê odsetka subpopulacji limfocytów T CD3+_, CD4+ _{i CD8}+ _{we krwi i w} œledzio-nie indyków wyklutych z takich jaj.

Materia³ i metody

Do badañ u¿yto 15 indycz¹t w wie-ku 5 dni typu BUT-9 obu p³ci, które podzielono na trzy grupy (po 5 pta-ków w ka¿dej). Ptaki grupy I i II wy-kluto z jaj, do których w 26. dobie in-kubacji (w trakcie przek³adania jaj wylêgowych z komory lêgowej do ko-mory klujnikowej) aplikowano meti-soprinol (Inosin-[(1-dimethyloamino--2-propanol)-4-acetamidobenzoat] w postaci 10% roztworu. Preparat stosowano w dawce 5 mg (grupa I) i 20 mg substancji czynnej (grupa II) na jajo. Kontrolê (grupa III) stano-wi³y indyczêta wyklute w standardo-wych warunkach zak³adu wylêgowe-go (bez iniekcji in ovo). Odchów pis-kl¹t prowadzono w wiwariach Zespo-³u Chorób Ptaków.

W krwi i w œledzionie 5-dniowych indycz¹t oznaczano odsetek subpo-pulacji limfocytów T CD3+_{, CD4}+

i CD8+_{. Krew pobierano w trakcie}

de-kapitacji ptaków bezpoœrednio do pro-bówek zawieraj¹cych EDTA, a œle-dziony w trakcie badania anatomopa-tologicznego. Odsetek limfocytów T

oznaczano przy u¿yciu swoistych przeciwcia³ monoklonal-nych anty-CD3+_{, CD4}+ _{i CD8}+ _{(Mouse anty-chicken FITC,}

Cell lab coulter) metod¹ cytometrii przep³ywowej z zasto-sowaniem aparatu EPICS XL (Beckman coulter). Jeden cm3

krwi nawarstwiano na 1 cm3 _{gradientu Histopaque 107}

(Sigma Aldrich), po czym mieszaninê wirowano przy prêd-koœci 400 g przez 15 minut, a uzyskiwany z interfazy ko¿u-szek komórek mononuklearnych zbierano i zawieszano w 1 cm3 _{zbuforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS).}

Zawiesinê komórek limfatycznych œledziony uzyskiwano po homogenizacji narz¹du, przes¹czeniu przez filtry ko-mórkowe i zawieszeniu w PBS. Zawiesinê komórek krwi i œledziony p³ukano dwukrotnie w PBS oraz jednokrotnie w PBS z 5% dodatkiem inaktywowanej surowicy bydlêcej i okreœlano liczbê limfocytów w ka¿dej próbie przy u¿yciu komory Thoma-Zeissa. Ponadto oceniano ¿ywotnoœæ wy-izolowanych komórek w mieszaninie przygotowanej ex tem-pore, stanowi¹cej 0,2% roztwór b³êkitu trypanu z 4,24% roztworem NaCl w stosunku 4 : 1. Nastêpnie do 3 probó-wek cytometrycznych odmierzano po 50 µl zawiesiny ko-mórek ka¿dej próby i dodawano po 5 µl przeciwcia³ mono-klonalnych anty-CD3+ _{(seria: I378-YB890, data wa¿noœci}

2008.02.28); anty-CD4+ _{(seria: J056-VG752, data}

wa¿noœ-ci 2008.07.31) lub anty-CD8+ _{(seria: D171-R649Y, data}

wa¿noœci 2008.07.31). Po inkubacji przez 30 minut,

p³uka-niu i wirowap³uka-niu przy prêdkoœci 300 g przez 5 minut w tem-peraturze pokojowej zlewano supernatant, a osad umiesz-czano w 1 ml PBS z 5% dodatkiem inaktywowanej surowi-cy bydlêcej. Tak przygotowan¹ próbê analizowano przy u¿yciu wymienionego cytometru przep³ywowego, za po-moc¹ programu CellQuest. Wyniki badañ poddano anali-zie statystycznej, stosuj¹c dwuczynnikow¹ analizê warian-cji na poziomie ufnoœci p £ 0,05 oraz p £ 0,01.

Wyniki i omówienie

Praktyczne wykorzystanie immunomodulacji coraz czêœciej postrzegane jest jako narzêdzie lekarza wete-rynarii s³u¿¹ce poprawie stanu zdrowotnego w wiel-kotowarowej produkcji drobiu (22, 24, 26). Kontrolo-wane sterowanie odczynami w obrêbie uk³adu odpor-noœciowego stwarza bowiem nadziejê na ogranicze-nie problemu, jakim w masowej produkcji drobiarskiej jest immunosupresja. Z danych piœmiennictwa wyni-ka, ¿e w koñcowym okresie embriogenzy zarodki pta-ków s¹ immunokompetentne, co umo¿liwia skutecz-ne wykonywanie zabiegów profilaktycznych ju¿ w koñ-cowej fazie inkubacji jaj wylêgowych (6, 14, 19, 23, 32). Zabiegi takie s¹ mo¿liwe na szerok¹ skalê dziêki opatentowaniu w roku 1984 metody szczepienia in ovo z wykorzystaniem systemu Inovoject® _(16).

B A

C D

FS CD3 – FITC

CD4 – FITC CD8 – FITC

Ryc. 1. Obraz cytometryczny limfocytów krwi obwodowej nawarstwianej na gra-diencie Histopaque 107 (A). Limfocyty znakowane przeciwcia³ami monoklonalnymi anty-CD3+_{FITC(B), anty-CD4}+_{FITC(C) i anty-CD8}+_FITC(D)

Medycyna Wet. 2008, 64 (9) 1159

Wobec powy¿szego, a tak¿e maj¹c na uwadze aspek-ty prakaspek-tycznego wykorzystania metisoprinolu w pro-filaktyce i terapii chorób drobiu w chowie wielkoto-warowym (18, 21, 26), podjêto próbê zastosowania tego preparatu metod¹ in ovo, zatem w okresie, gdy na rozwijaj¹cy siê zarodek nie oddzia³ywuj¹ jeszcze czyn-niki potencjalnie immunosupresyjne. Zalet¹ metody

szczepieñ in ovo jest jej du¿a wy-dajnoœæ, a ponadto daje ona mo¿-liwoœæ uzyskiwania wysokiej i wy-równanej odpornoœci przy jedno-czesnym wyeliminowaniu nieko-rzystnych czynników (stres, b³êdy w technice szczepienia), jakie to-warzysz¹ klasycznym sposobom immunizacji (1, 16, 17).

Wczeœniejsze badania (18, 26) potwierdzi³y, ¿e metisoprinol za-stosowany in ovo w dawce 5 mg na jajo, a nastêpnie w 8.-10. dniu odchowu indyków z pasz¹ w daw-ce 50 mg/kg wzmaga humoraln¹ odpornoœæ poszczepienn¹ przeciw-ko wirusowi ND. W dostêpnym piœmiennictwie brak jest jednak informacji na temat wp³ywu tego preparatu podanego do jaj w koñ-cowym okresie inkubacji na pro-centowy udzia³ subpopulacji lim-focytów T CD3+_{, CD4}+ _{i CD8}+ _we krwi obwodowej i w œledzionie indyków wyklutych z takich jaj.

Wyniki badañ w³asnych nad za-chowaniem siê subpopulacji lim-focytów T CD3+_{, CD4}+ _{i CD8}+ w krwi i w œledzionie 5-dniowych indyków wyklutych z jaj, do któ-rych in ovo aplikowano ró¿ne dawki metisopronolu, przedsta-wiono w tab. 1 oraz na ryc. 1 i 2. Z danych tych wynika, ¿e odsetek limfocytów CD3+ _{i CD4}+ _{w krwi indyków wyklutych} z jaj, do których aplikowano metisoprinol w dawce 5 mg na jajo (grupa I) by³ statystycznie wysoko istot-nie wy¿szy ni¿ w krwi indyków z grup II i III.

Nato-miast odsetek limfocytów CD8+ _{w krwi indyków}

z grupy II (aplikowano metisoprinol w dawce 20 mg na jajo) by³ ni¿szy w porównaniu z ich odsetkiem w krwi indyków z grup I i III. Najwy¿szy odsetek

lim-focytów CD8+ _{odnotowano w œledzionie indyków}

z grupy II.

Na podstawie uzyskanych wyników mo¿na stwier-dziæ, ¿e podanie metisoprinolu in ovo w dawce 5 mg na jajo powoduje istotny wzrost odsetka limfocytów T o funkcji indukcyjno-wspomagaj¹cej (komórki CD3+ i CD4+_{) we krwi obwodowej i w œledzionie} 5-dnio-wych indycz¹t. Uzyskane wyniki wskazuj¹ na immu-nomobilizuj¹cy wp³yw metisoprinolu podanego in ovo w wymienionej dawce, wyra¿aj¹cy siê nasileniem mo-bilizacji w stosunku do limfocytów B, warunkuj¹cych przede wszystkim odpornoœæ humoraln¹ (15). Wy¿sza dawka metisoprinolu zastosowanego in ovo (20 mg na jajo) powodowa³a zmniejszenie odsetka limfocy-tów T CD3+ _{i CD4}+ _{we krwi obwodowej w} porówna-niu z indykami grupy kontrolnej i grupy I.

Metisopri-e j c a l u p o p b u s e n a d a B T w ó t y c o f m il a n l a z c d a i w œ o d a p u r G I II III w e r K 3 D C + _28,36±1,94A _21,62±2,48B _22,13±1,60B 4 D C + _26,63±2,94A _18,73±3,15B _20,33±3,93B 8 D C + _21,72±0,44A _11,22±0,55B _21,98±1,29A a n o iz d e l Œ 3 D C + _56,42±9,42Aa _55,51±11,0Aa _51,21±6,19Bb 4 D C + _44,30±5,08Aa _41,40±6,08Aa _41,20±7,44Bb 8 D C + _11,10±0,61Aa _13,10±0,22Aa _18,09±0,12Bb

Objaœnienia: A, B – ró¿nice statystycznie istotne przy p £ 0,01; a, b – przy p £ 0,05

Tab. 1. Odsetek subpopulacji limfocytów T CD3+_{, CD4}+ _{i CD8}+

we krwi obwodowej i w œledzionie 5-dniowych indycz¹t wyklutych z jaj, do których aplikowano in ovo ró¿ne dawki metisoprinolu (n = 5; –x ± s)

Ryc. 2. Obraz cytometryczny limfocytów œledziony (A). Limfocyty znakowane prze-ciwcia³ami monoklonalnymi anty-CD3+_{FITC(B), anty-CD4}+_{FITC(C) i}

anty-CD8+_FITC(D) B A C D FS CD3 – FITC CD4 – FITC CD8 – FITC

Medycyna Wet. 2008, 64 (9) 1160

nol zastosowany in ovo w dawce 20 mg na jajo powo-dowa³ istotny wzrost, w porównaniu z grup¹ kontrol-n¹, odsetka subpopulacji limfocytów cytotoksyczno--supresyjnych (komórki T CD 8+_{) w œledzionie.}

Wyniki prezentowanych badañ s¹ zgodne z uzyska-nymi przez Rumiñsk¹-Groda (26), która wykaza³a wy¿szy poziom przeciwcia³ przeciwko wirusowi ND w grupie indyków otrzymuj¹cych in ovo ni¿sz¹ daw-kê metisoprinolu. Warto jednak w tym miejscu dodaæ, ¿e oznaczenia za pomoc¹ cytometru przep³ywowego u ptaków nastrêczaj¹ wiele problemów technicznych, które szczegó³owo opisali Bridle i wsp. (2), Burgess i Davison (3) oraz Gawe³ (10).

Reasumuj¹c nale¿y stwierdziæ, ¿e metisoprinol za-stosowany in ovo w dawce 5 mg na jajo pobudza u wylê¿onych z takich jaj 5-dniowych indycz¹t g³ów-nie g³ów-nieswoiste mechanizmy odpornoœci humoralnej, czego wyrazem by³ wy¿szy odsetek subpopulacji lim-focytów T CD3+ _{i CD4}+ _{we krwi obwodowej i w} œle-dzionie. Natomiast metisoprinol zastosowany in ovo w dawce 20 mg na jajo u wylê¿onych z takich jaj 5-dniowych indycz¹t pobudza g³ównie nieswoiste me-chanizmy odpornoœci komórkowej, o czym œwiadczy

wy¿szy odsetek subpopulacji limfocytów T CD8+

w œledzionie.

Piœmiennictwo

1.Ahmad J., Sharma J. M.: Protection against hemorrhagic enteritis and Newcastle disease in turkeys by embryo vaccination with monovalent and bivalent vaccines. Avian Dis. 1992, 37, 485-491.

2.Bridle B. W., Julian R., Shawen P. E., Waillancourt J. P., Kaushik A. K.: T lymphocyte subpopulations diverge in commercially raised chickens. Can. J. Vet. Res. 2006, 70, 183-190.

3.Burgess S. C., Davison T. F.: Counting absolute numbers of specific leuko-cyte subpopulations in avian whole blood using a single step flow cytometric technique: comparison of two inbred lines of chickens. J. Immunol. Meth. 1999, 227, 169-176.

4.Dietert R. D., Golemboski K. A.: Environment-immune interactions. Poult. Sci. 1994, 73, 1062-1076.

5.Dietert R. R., Lamont S. J.: Avian immunology: from fundamental immune mechanism to the integrative management of poultry. Poult. Sci. 1994, 73, 975-978.

6.Ding X., Lillehoj H. S., Dalloul R. A., Min W., Sato T., Yasuda A., Lillehoj E. P.: In ovo vaccination with Eimeria tenella EtMIC2 gene induces protective immunity against coccidiosis. Vaccine 2005, 23, 3733-3740.

7.Dohms J. E., Saif Y. M.: Criteria for evaluation immunosupression. Avian Dis. 1997, 28, 305-310.

8.Douglas J., Buddiger N.: How today’s social, political and consumer-driven environment influences the business objectives of the primary breeders: genotype, environment and nutrition interactions. 4th _{Internat. Symp. Turkey}

Dis. Berlin 2002, s. 1-12.

9.Friedman A., Bartov I., Sklan D.: Humoral immune response impairment following excess vitamin E nutrition in the chick and turkey. Poult. Sci. 1998, 77, 956-962.

10.Gawe³ A.: Farmakologiczna modulacja odpowiedzi immunologicznej kur-cz¹t uodpornianych czynnie przeciwko kokcydiozie szczepionk¹ Livacox T. Zesz. Nauk. AR Wroc³aw 2006, 535, 1-136.

11.Gr¹dzki Z.: Niektóre aspekty supresyjnego oddzia³ywania chemioterapeuty-ków na reakcje immunologiczne ustroju. Medycyna Wet. 1993, 5, 198-202. 12.Grondel J. L., Angenent G. C., Egberts E.: The influence of antibiotics on the immune system. Investigations on the cellular functions of chicken leukocytes in vitro. Vet. Immunol. Immunopathol. 1985, 10, 307-316. 13.Guiro S., Koncicki A.: Uodpornianie przeciwko NDV indyków zaka¿onych

wirusem krwotocznego zapalenia jelit. Medycyna Wet. 2004, 60, 871-873. 14.Haygreen E. A., Kaiser P., Burgess S. C., Davison T. F.: In ovo DNA

immu-nisation followed by recombinant fowl pox boost is fully protective to chal-lenge with virulent IBDV. Vaccine 2006, 24, 4951-4961.

15.Jakóbisiak M.: Immunologia. PWN, Warszawa 2000.

16.Johnston P. A., Liu H., O’Connell, Phelps P., Bland M., Tyczkowski J., Kemper A., Harding T., Avakian A., Haddad E., Whitfill C., Gildersleeve R., Ricks C. A.: Applications of in ovo technology. Poultry Sci. 1997, 76, 165--178.

17.Koncicki A.: Specific immunoprophylaxis of infectious avian diseases. Me-dycyna Wet. 2006, 62, 483-487.

18. Koncicki A., Rumiñska E., Bukowska A., Andrzejewski M., Mazur-Gonkow-ska B., KrasnodêbMazur-Gonkow-ska-Depta A.: Zastosowanie izoprynozyny in ovo w im-munomodulacji u indyków. XII Kongres PTNW, 15-17.09.2004, Warszawa, s. 341.

19.Lillehoj H. S., Ding X., Dalloul R. A., Yasuda A., Lillehoj E. P.: Embryo vaccination against Eimeria tenella and Eimeria acervulina infections using recombinant proteins and cytokine adjuvants. J. Parasit. 2005, 91, 666-673. 20.Ma³aczewska J., Rotkiewicz Z., Siwicki A. K.: Effect of methisoprinol and KLP-602 on the development of immunocompetent organs and selected bio-chemical indices of allantoic fluid of chicken embryos. Polish J. Vet. Sci. 2003, 6, 21-24.

21.Moya P., Alonso M. L., Baixeras E., Ronda E.: Immunomodulatory activity of isoprinosine on experimental viral infections in avian models. Int. J. Im-munophar. 1984, 6, 339-343.

22.Rautenschlein S., Neumann U.: Modulation of avian immune system: sup-pression versus induction of immunity. Polish J. Vet. Sci. 2004, 7, 39-46. 23.Rautenschlein S., Sharma J. M., Winslow B. J., McMillen J., Junker D.,

Cochran M.: Embryo vaccination of turkeys against Newcastle disease infection with recombinant fowl pox virus constructs containing interferons as adjuvants. Vaccine 2000, 18, 426-433.

24.Rautenschlein S., Sheikh A. M., Patnayak D. P., Miller R. L., Sharma J. M., Goyal S. M.: Effect of an immunomodulator on the efficacy of an attenuated vaccine against avian pneumovirus in turkeys. Avian Dis. 2002, 46, 555--561.

25.Rumiñska E., Koncicki A., Stenzel T.: Budowa i funkcjonowanie uk³adu od-pornoœciowego u ptaków. Medycyna Wet. 2007, w druku.

26.Rumiñska-Groda E.: Wp³yw izoprynozyny na dynamikê zjawisk immunolo-gicznych oraz przebieg zaka¿enia wirusem HE i pa³eczkami E. coli u indy-ków. Praca doktorska, Wydzia³ Medycyny Wet. UWM Olsztyn 2002. 27.Rzedzicki J., Kowalska M.: Immunosupresyjne dzia³anie niektórych leków

u zwierz¹t. Medycyna Wet. 1992, 49, 298-300.

28.Rzedzicki J., Kowalska M.: Wp³yw ¿ywienia na kszta³towanie siê zjawisk odpornoœciowych u zwierz¹t. Medycyna Wet. 1992, 48, 249-251. 29.Sharma J.: Introduction to poultry vaccines and immunity. Adv. Vet. Med.

1999, 41, 481-494.

30. Sharma J. M.: The structure and function of the avian immune system. Acta Vet. Hungar. 1997, 45, 229-238.

31.Ungemach F. R.: Current status of veterinary drug legislation in the EU with special attention to minor species. 4th _{Internat. Symp. Turkey Dis. Berlin}

2002, s. 12-20.

32.Worthington K. J., Sergeant B. A., Davelaar F. G., Jones R. C.: Immunity to avian pneumovirus infection in turkeys following in ovo vaccination with an attenuated vaccine. Vaccine 2003, 21, 1355-1362.

Adres autora: prof. dr hab. Andrzej Koncicki, ul. Baczyñskiego 1, 10-371 Olsztyn-KieŸliny; e-mail: koncicki@uwm.edu.pl