K
osm os
Strony 529-536PROBLEMY N A U K ^ IO I^ G IC Z N Y C H
Polskie Towarzystwo Przyrodników im. KopernikaB a r b a r a G r z e l a k o w s k a - S z t a b e r t
Zakład. Biochemii Komórki
Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN Pasteura 3, 02-093 Warszawa
E-mail: bgs@nencki.gov.pl.
REGULACJA CYKLU KOMÓRKOWEGO — UDZIAŁ JONÓW WAPNIA, FAKTY I HIPOTEZY
Udział jonów wapnia w stymulacji ko mórek do podziałów oraz w przebiegu określo nych etapów cyklu komórkowego jest nie podważalny. Świadczą o tym wyniki publiko wane od wczesnych lat osiemdziesiątych i uzy skane na ogół przy badaniu podziałów zarod ków zwierząt bezkręgowych, komórek hodowa nych in vitro, czy też komórek grzybów. Doku mentują one:
— gwałtowny wzrost stężenia Ca po zapło
dnieniu komórki jajowej i rozpoczęciu przez nią podziałów;
— wzrost poziomu Ca po zadziałaniu na ko mórki spoczynkowe hormonów lub czynników wzrostowych;
— podejmowanie przez komórki spoczynkowe
podziałów po mikroiniekcjach Ca lub IP3,
uwalniającego wapń z wewnątrzkomórkowych magazynów;
— opóźnienie lub zahamowanie podziałów ko mórek po mikroiniekcjach buforów chelatują- cych wapń lub przeciwciał skierowanych prze ciwko określonym białkom wiążącym wapń lub białkom będącym składnikami pomp wap niowych;
— występowanie różnic w wewnątrzkomórko wym stężeniu Ca w określonych etapach cy klu podziałowego;
— ścisłe powiązania siateczki śródplazmatycz- nej z mikrotubulami wrzeciona mitotycznego i błoną jądrową;
— obecność w różnych częściach aparatu mi totycznego (przede wszystkim w mikrotubu- lach i biegunach wrzeciona kariokinetycznego) białek wiążących wapń — zwłaszcza kalmodu- liny i kaldesmonu oraz licznych enzymów re
gulowanych przez wapń, na przykład kinazy Ca/kalmodulina II, kalpainy II, kinazy łańcu cha lekkiego miozyny i innych;
— modulowanie przez Ca powstawania i de gradacji mikrotubul, głównego składnika wrzeciona mitotycznego;
— wpływ Ca na układ aktomiozynowy;
— wpływ Ca na kondensację i dekondensa-
cję chromatyny;
— wpływ Ca na stan błon komórkowych i
związane z tym procesy transportu różnych składników.
Powyższa lista procesów modulowanych
przez Ca i istotnych dla przebiegu cyklu z
pewnością nie jest wyczerpująca. Szczegółow- sze dane na ten temat znaleźć można w opu
blikowanych artykułach przeglądowych (RA-
t a n i Sh e l d a n s k i 1986, Wh it a k e r i Pa t e l
1990, HEPLER 1992 i 1994, Lu i MEANS 1993,
Me a n s 1994, Sh o r t i współaut. 1993, Bar- BIERO i współaut. 1995, WHITFIELD i współaut.
1995, Wil d in g 1996, Ba r a ń s k a 1997). Podło
że molekularne tych procesów jednak nie jest dotąd w pełni zrozumiane.
W artykule zamierzam przede wszystkim
skoncentrować się na omówieniu najnowszych danych o wpływie Ca na układy enzymatycz ne decydujące o przebiegu cyklu komórkowe go, takie jak układ seiynowo-treoninowych ki naz cyklino-zależnych oraz układ proteolitycz ny ubikwityna/proteasom. Znaczenie tych układów dla przebiegu cyklu staje się coraz bardziej zrozumiałe i doceniane. Przypomnę też krótko podstawowe wiadomości o
fluktua-2+
cjach wewnątrzkomórkowego poziomu Ca i
odpowiedzialnych za nie mechanizmach.
2 +
IP3 — trifosforan inozytolu, CAM — kalmodulina, CAMKII — kinaza białkowa aktywowana przez Ca i kalmodulinę,
kinazy cdk — kinazy cyklino-zależne, kinaza cdc2 — kinaza cd k l, APC — cyklosom, kompleks białkowy promujący rozpoczęcie anafazy.
CYKL KOMÓRKOWY I FLUKTUACJE POZIOMU Ca2+ OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA CYKLU
Komórki eukariotyczne wkraczają w cykl komórkowy po zadziałaniu na ich powierzch nię różnorodnych sygnałów zewnętrznych, jak hormony, mitogeny, czynniki troficzne, a tak że w wyniku kontaktu ze składnikami matriks międzykomórkowej. Ulega wówczas urucho mieniu kaskada procesów biochemicznych przenoszących sygnał mitogenny do jądra ko mórkowego, w którym następuje skoordyno wana transkrypcja genów tak zwanej wczesnej i późnej odpowiedzi. Jest to część programu genetycznego odpowiedzialnego za wyjście ko mórek ze stanu spoczynkowego, wywołanie w nich syntezy DNA, podwojenie chromosomów i doprowadzenie do podziału. Istotnym elemen tem tego programu jest obecność wewnętrz nych „punktów kontrolnych” w różnych eta pach cyklu, przede wszystkim na granicy faz G l/ S i G2/M, a także podczas określonych etapów mitozy i przy tworzeniu wrzeciona ka- riokinetycznego. Funkcja „punktów kontrol nych” polega na uniemożliwieniu komórkom wejścia w kolejną fazę cyklu przed zakończe niem syntezy wszystkich niezbędnych makro
cząsteczek i uformowaniu struktur (ElLLEDGE
1996, NlGG 1995, RUDNER i MURRAY 1996).
2+
Czy obserwuje się zmiany poziomu Ca w tych krytycznych dla przebiegu cyklu momentach?
FLUKTUACJE POZIOMU Ca2+
2+
Wysoki poziom Ca w środowisku zewnę trznym jest niezbędny, aby komórki weszły w cykl podziałowy, czyli aby rozpoczęły się w nich procesy metaboliczne, charakterystyczne dla fazy G1 cyklu. Komórki różnego pochodze
nia wymagają innego stężenia Ca by mogły
wejść w cykl podziałowy: komórki nabłonkowe jelita i komórki skóry — rzędu 0,05-0,10 mM, hepatocyty, fibroblasty czy lim focyty — 1,0-1,5 mM. Natomiast komórki nowotworowe wymagają do rozpoczęcia proliferacji jedynie śladowych ilości jonów wapnia w środowisku (Wh it f ie l d i współaut. 1995, Lu i Me ans
1993). Wapń po przedostaniu się do komórek może ulec związaniu przez bardzo liczne biał ka receptorowe, przede wszystkim jednak przez kalmodulinę (CAM). Kompleks Ca - CAM jest zdolny do aktywacji ponad 20 enzy mów, w tym także kinaz fosforylujących okre ślone czynniki transkrypcyjne, na przykład CREB. Stymuluje to ekspresję wielu genów wczesnej odpowiedzi, których produkty z kolei
u r u c h a m ia ją i k o o r d y n u ją e k s p r e s ję g e n ó w k o d u ją c y c h , m ię d z y in n y m i e n z y m y z w ią z a n e z r e p lik a c ją DNA o r a z in a k t y w a c ją g e n ó w s u - p r e s o r o w y c h . N a le ż y s o b ie j e d n a k z d a w a ć s p r a w ę , ż e n ie t y lk o k in a z y a k t y w o w a n e p r z e z C a b io r ą u d z ia ł w t y c h r e g u la c ja c h (W H IT FIELD i w s p ó ła u t. 1995, Me a n s 1994).
W komórkach ju ż dzielących się aż cztero krotnie dochodzi do przejściowego wzrostu po ziomu Ca . Następuje on w późnej fazie G1 przed rozpoczęciem fazy S, w której zachodzi synteza DNA, w późnej fazie G2 przez rozpo częciem mitozy — pomiędzy stadium metafazy i anafazy, a także w czasie cytokinezy, w której następuje podział cytoplazmy.
Powyższe fluktuacje poziomu Ca wykry wane w całych komórkach są stosunkowo nie wielkie i sięgają 50-70 nM ponad poziom pod stawowy, ale z pewnością lokalne zmiany stę
żenia Ca2+ są większe (HEPLER 1994, WHIT
FIELD i współaut. 1995). Wykrywanie tych
oscylacji wapniowych stało się możliwe po wprowadzeniu do badań bardzo czułych elek trod wapniowych, chelatorów i jonoforów wap niowych, różnego typu barwników fluorescen cyjnych, a także dzięki rozwojowi technik mi kroskopowych. Zastosowanie ich umożliwia, na przykład wykrycie podwyższonego poziomu
Ca w okolicach jądra komórkowego bezpo
średnio przed rozpoczęciem mitozy (WILDING i
współaut. 1996).
Fluktuacje poziomu Ca są rezultatem je go napływu ze środowiska zewnętrznego i uwalniania w ściśle regulowanych procesach z wewnątrzkomórkowych magazynów, przede wszystkim siateczki śródplazmatycznej. Klu czową rolę w mobilizacji Ca pełni trifosforan
inozytolu, IP3, sam Ca oraz prawdopodobnie
cykliczna ADP-ryboza. Omówienie tych zaga dnień przekracza łamy tego opracowania, są one wyczerpująco potraktowane w artykułach
przeglądowych (MAKOW SKA i DUSZYŃSKI 1996,
THOMAS i współaut. 1996, BARAŃSKA 1997,
Za b ł o c k i 1997).
UKŁAD KINAZ CYKLINO-ZALEŻNYCH I WPŁYW Ca2+ NA JEGO AKTYWNOŚĆ
Przejście komórek przez krytyczne punkty kontrolne cyklu jest związane z fosforylacją bardzo różnych białek dokonywaną przez licz ne kinazy serynowo-treoninowe, znane jako kinazy cyklino-zależne (kinazy cdk) (ryc.l). Stopniowa aktywacja poszczególnych kinaz
cyklina A
cdk i wynikająca z tego fosforylacja właści wych białek (białek strukturalnych, enzyma tycznych, regulatorowych), pośrednio lub bez pośrednio zapoczątkowuje takie kluczowe wy darzenia cyklu komórkowego, jak rozpad oto czki jądrowej, kondensacja chromosomów czy też przekształcenia cytoszkieletu.
Aktywność kinaz cdk jest regulowana wie lostopniowo poprzez:
— dołączanie cyklin stanowiących podjednost ki regulatorowe kinaz,
— tworzenie labilnych kompleksów z we wnątrzkomórkowymi białkowymi inhibitorami, — fosforylację, tak zwaną aktywującą, treoni- ny obecnej w pozycji 161 łańcucha,
— fosforylację, tak zwaną hamującą, tyrozyny w pozycji 15 i treoniny w pozycji 14, które znajdują się w miejscu wiązania ATP,
— zmiany aktywności wielu kinaz i fosfataz przeprowadzających fosforylację i defosforyla- cję kinaz cyklino-zależnych,
— zmiany aktywności enzymów uczestniczą cych w syntezie i degradacji poszczególnych elementów tego układu.
Na rycinie 2 przedstawiono schematycznie powyższe możliwości regulacji aktywności ki naz cdk. Wskazano na niej także miejsce dzia łania tyrozynowo-treoninowej fosfatazy cdc25, która aktywuje kinary cdk poprzez odszczepie- nie reszty fosforanowej od tyrozyny 15 i treoni ny 14. Regulacja aktywności kinaz białkowych zaangażowanych w fosforylację kinaz cdk i fo sfatazy cdc25 jest również bardzo złożona. Uczestniczy w niej kaskada różnych kinaz i fo sfataz oraz różne nieenzymatyczne białka ko mórkowe. Zagadnienia regulacji cyklu komór kowego przez układ kinaz cyklino-zależnych są
omówione szczegółowo w bardzo licznych arty
kułach przeglądowych (LEW i KORNBLUTH
1996, Ma r t in-Ca s t e l l a n o s i Mo r e n o 1997,
Fis h e r 1997, Gr z e l a k o w s k a-Sz t a b e r t 1992,
1993, 1995a). Nadrzędnym elementem regula cyjnym cyklu stają się też wykryte niedawno kinazy typu POLO, których aktywność wydaje się koordynować działanie kinaz cdk z procesa mi replikacji DNA i tworzeniem wrzeciona mi- totycznego (LANE i NlGG 1997).
Nasuwa się pytanie, czy i w jakim stopniu aktywność układu kinaz cdk może zależeć od wewnątrzkomórkowego poziomu Ca + i jakie elementy kaskady sygnałowej, uwalnianej
przez Ca mogą w tym uczestniczyć. Pytanie
to wydaje się być zasadne. Podwyższony po ziom Ca , jak ju ż wspomniano (w rozdziale
Ogólna charakterystyka cyklu), stwierdza się w
krytycznych punktach cyklu przed rozpoczę ciem syntezy DNA oraz przed rozpoczęciem i w trakcie trwania mitozy.
2+ 2+
Czy zatem Ca i wiążąca Ca
kalmoduli-na uczestniczą w regulacji aktywności kikalmoduli-naz cdk? Badania tego problemu w dzielących się komórkach grzyba Aspergillus nidulans wyka zują, że określony poziom Ca2+-CAM decyduje o aktywności dwóch kinaz — cdc2 i NIMA (ta ostatnia nie występuje w komórkach wyższych eukariota). Przy zbyt niskim poziomie Ca2+- CAM nie następuje bowiem uaktywnienie ki naz w wyniku defosforylacji aminokwasów (Thrl4 i Tyrl5 ) znajdujących się w miejscu
wiązania przez enzym ATP (Lu i MEANS 1993).
Wynik ten wskazuje zatem, że procesem regu lowanym przez Ca +-CAM jest aktywacja spe cyficznej fosfatazy cdc25 w komórkach krę
gowców (MILLAR i RUSSEL 1992,
GRZELAKOW-cyklina B + Cdc2
+ Cdc2 (Cdk 1)
cyklina D + Cdk4/6
cyklina E + Cdk2
Gwiazdkami oznaczono punkty kontrolne cyklu. cyklina A + Cdk2
Rye. 1. Schemat cyklu komórkowego z zazna czeniem udziału różnych kinaz cdk i cyklin w poszczególnych fazach cyklu komórkowego.
2. Regulacje aktywności kinaz cdk (wg. Elledge 1996 zmodyf.)
Strzałki —> oznaczają działania aktywujące, H hamujące. Kursywą oznaczono geny ko dujące białka uczestniczące w regulacjach, linią pogrubioną szlaki (procesy) i białka, o któiych będzie mowa w tekście.
SKA-SZTABERT 1993) i NIMT w Aspergillus. Ak
tywność fosfatazy cdc25 podlega bardzo pre cyzyjnej kontroli, przede wszystkim przez do łączanie cyklin B oraz stopień ufosforylowania samego enzymu. Jest więc wielce
prawdopo-2+
dobne, że zależne od Ca -CAM kinazy, na przykład CAMKII lub inne białka wiążące Ca + uczestniczą w fosforylacji, a tym samym w ak
tywacji fosfatazy cdc25 (Lu i MEANS 1993),
brak jest jeszcze jednak eksperymentalnego
udokumentowania tej sugestii (ryc. 3). Poziom cykliny B, której proteoliza również pozostaje
pod kontrolą Ca +-CAM (patrz rozdział
Degradacja cyklin mitotycznych i udział jonów Ca ), ma też niewątpliwy wpływ na aktywność
fosfatazy cdc25.
Należy sądzić, że Ca -CAM wpływa rów nież w podobny sposób na kinazy cdk aktyw ne w fazie G l. Jak dotąd nie doniesiono o ba daniach prowadzonych w tym kierunku.
2+
Ryc. 3. Schemat udziału jonów Ca w regulacji rozpoczęcia mitozy.
W komórkach wyższych eukariota do rozpoczęcia mitozy wystarczy aktywacja tylko kinazy cdc2, u grzybów (Aspergil lus) aktywacji musi ulec także kinaza NIMA.
UKŁAD UBIKWITYNA/ PROTEASOM, JEGO REGULACJA I UDZIAŁ W DEGRADACJI REGULATORÓW CYKLU KOMÓRKOWEGO
CHARAKTERYSTYKA u k ł a d u
Ubikwityna/proteasom stanowią pozalizo- somalny układ proteolityczny przeprowadzają cy degradację białek o krótkim okresie pół- trwania, których obecność jest niezbędna tylko w określonych momentach życia komórki. Są
to p r z e d e w s z y s t k im lic z n e c z y n n ik i tr a n s k r y p - c y jn e , n ie k tó r e b ło n o w e u k ła d y tra n s p o r tu ją c e , b ło n o w e r e c e p to r y r ó ż n y c h c z y n n ik ó w w z r o s t o w y c h o ra z w ie le k in a z i fo s fa ta z , a ta k ż e b ia łk a z m u to w a n e o n ie p r a w id ło w e j s tr u k t u r z e (ClE- ch a n o v e r i Sc h w a r t z 1994, Ki n g i w s p ó ła u t.
Proteasom stanowi multikatalityczny kom pleks białkowy, charakteryzujący się zdolno ścią do degradacji biedek uprzednio wyznako wanych dołączeniem jednej lub wielu cząste czek małego białka (76 AA; 8,5 kDa) — ubikwi- tyny, chociaż znane są ju ż dziś wyjątki od tej
reguły (CIECHANOVER i SCHWARTZ 1994, MAN-
TEUFFEL-Cy m b o r o w s k a 1996). Proces ubikwi- tynacji białkowych substratów jest bardzo zło żony i wymaga uaktywnienia samej cząsteczki ubikwityny w procesie zachodzącym na koszt energii pochodzącej z hydrolizy ATP (enzym E l) oraz udziału odrębnych enzymów w przenosze niu (enzym E2) i dołączaniu (enzym E3) zakty- wowanej ubikwityny na białkowy substrat.
Informacje o poziomie aktywności protea- somu w poszczególnych fazach cyklu komór kowego są nieliczne i niejednoznaczne. Różni ce w poziomie aktywności proteasomu (wyso ka w profazie i metafazie) znaleziono w dzielą cych się synchronicznie komórkach embrio
nów żachwy Halocynthia rosetzi (KAWAHARA i
współaut. 1992). Nie obserwowano natomiast różnic w aktywności proteasomu badając eks trakty dzielących się jaj żaby szponiastej Xeno-
pus (Ma h a f f e y i współaut. 1993). Ostatnio doniesiono jednak o wzroście aktywności pro teasomu w zaktywowanych, działaniem jono- foru wapniowego A23187, jajach Xenopus. Wysunięto zatem hipotezę o możliwości regu lacji (w nieznany jeszcze sposób) aktywności proteasomu przez Ca uwalniany z wewnątrz
komórkowych magazynów (AlZAWA i współaut.
1996). Czy podobne zależności zostaną wykry te w innych układach pokażą dalsze badania.
Niemniej jednak, hipoteza o udziale Ca w
modulacji aktywności proteasomu jest bardzo pociągająca. Proteasom bowiem przeprowadza degradację tak istotnych regulatorów cyklu komórkowego jak cykliny (podjednostki regu latorowe kinaz edk), białkowe inhibitory kinaz edk oraz białka PDS1 i CUT2, spajające
chro-matydy aż do momentu rozpoczęcia anafazy. DEGRADACJA CYKLIN MITOTYCZNYCH
I UDZIAł JONÓW Ca2+
Już w 1991 roku udowodniono, że spekta kularny spadek aktywności kinazy cdc2 pod czas przejścia komórek ze stadium metafazy w anafazę jest wywołany degradacją cyklin mito- tycznych A i B w układzie ubikwityna/protea-
som (GLOTZER i współaut. 1991, GRZELAKOW-
SKA-SZTABERT 1993, KING i współaut. 1996).
Zbieżność wysokiego poziomu Ca w tym wła
śnie momencie cyklu i inaktywacji kinazy cdc2
pozwala przypuszczać, że Ca może wpływać
decydująco na zakończenie przez komórki po
działu mitotycznego (BARAN 1994, 1996). Pozo
staje do wykazania, czy ma to związek z pozio mem aktywności proteasomu.
Początkowo sądzono, że tylko cykliny mi- totyczne są degradowane w układzie ubikwity- na/proteasom. Wiązano to z obecnością w ich cząsteczkach specjalnej (określonej) sekwencji aminokwasowej (9 A A), tak zwanego boksu de strukcyjnego, i sądzono, że obecność tej se kwencji predestynuje cykliny A i B do dawania połączeń z ubikwityną. Obecnie wiadomo, że również cykliny, regulujące aktywność kinaz
edk w fazie G1 i nie zawierające boksu de
strukcją nego lecz sekwencję PEST, są degra dowane przy udziale proteasomu, a o ich po datności na ubikwitynację i proteolizę wydaje się decydować stopień ich ufosforylowania (fo sforylacja przez kinazę cdc2, King i współaut. 1996). Cykliny mito tyczne są ubikwitynowane przy udziale enzymów obecnych w tak zwanym cyklosomie, wielobiałkowym komple ksie promującym przejście dzielących się ko mórek ze stadium metafazy w anafazę (APC,
anaphase promoting complex) .
Proteoliza cyklin mitotycznych jest nie zbędnym, ale nie wystarczającym czynnikiem umożliwiającym rozpoczęcie anafazy (ryć. 4). Ca -CAM kinaza II APC/Ub/PROTEASOM cykliny mitotyczne A,B białka PDS1, CUT2 lub “ homologi ( i n h i b i t o r y a n a f a z y ) degradacja cyklin degradacja białek kinaza cdc2 początek anafazy 2+
Konieczny jest jeszcze rozpad dwóch białek ściśle powiązanych z chromatydami. U droż dży są to białka PDS1 i CUT2, postuluje się występowanie podobnych białek w komórkach wyższych eukariota. Sposób ich działania jest jeszcze w sferze hipotez; wiadomo natomiast, że ich degradacja zachodzi w proteasomie (KING i współaut. 1996).
Zbieżność czasowa degradacji cyklin mito- tycznych i inaktywacja kinazy cdc2 z podwyż szonym w tym stadium mitozy poziomem Ca i kalmoduliny od lat intrygowała badaczy cy klu komórkowego. Przez długi czas sądzono,
że niezbędność wysokiego poziomu Ca nie
zbędna jest do aktywacji proteazy — kalpainy. Proteaza ta miałaby degradować białko p39 s, czynnik cytostatyczny (CSF) ochrania jący cykliny mitotyczne przed degradacją (Lu i
Me a n s 1993). Pogląd o udziale aktywowanej
przez Ca kalpainy w proteolizie cyklin mito-
tycznych podważyły jednak wyniki doświad czeń wykazujące, że stymulowana przez Ca - CAM ich proteoliza może zachodzić w obecno ści nieaktywnej kalpainy i niezdegradowanego czynnika cytostatycznego. Obecnie udowo dniono, że nie kalpaina lecz kinaza białkowa II
2+
aktywowana przez Ca i kalmodulinę (CAMKII) stymuluje proteolizę cyklin mitotycznych i
białka p39 n°s (LORCA i współaut. 1993, 1994,
WHITAKER 1993, Ba r a n 1994). Nadal jednak
nie są znane białka fosfoiylowane przez tę ki- nazę. Pozostaje do wyjaśnienia, czy są nimi białka (enzymy) wchodzące w skład cyklosomu i uczestniczące w ubikwitynacji cyklin, czy też ma miejsce aktywacja samego proteasomu. Są pewne sugestie, że białka wchodzące w skład cyklosomu są fosforylowane przez kinazę cdc2
i kinazę białkową A (Lu i MEANS 1993, NAGAI i
współaut. 1995). Być może również kinaza CAMKII ma swój udział w fosfoiylowaniu pod- jednostek cyklosomu.
Szybka i precyzyjna degradacja cyklin mitotycznych jest problemem na tyle fascy nującym, iż opracowywane są modele mate matyczne, starające się wyjaśnić czasowe za leżności zmian wewnątrzkomórkowego pozio
mu Ca , zachodzące pod wpływem IP3 z ak
tywacją kinazy CAMKII i inaktywacją kinazy cdc2. Uwzględnia się w nich również m ożli wość wpływu samej kinazy cdc2 na poziom IP3(Ba r a n 1994, 1996, Sw a n s o n i współaut.
1997).
DEGRADACJA CYKLIN FAZY G l, BIAŁKOWYCH INHIBITORÓW KINAZ CDK I BIAŁEK SUPRESOROWYCH
— HIPOTETYCZNY UDZIAŁ JONÓW Ca2+
Brak jest, jak dotąd, danych na temat
wpływu Ca na degradację cyklin skomple-
ksowanych z kinazami cdk, działającymi w fa zie G l cyklu. Można sądzić, że wpływ taki ma miejsce, gdyż zarówno cykliny fazy G l, jak i specyficzne białkowe inhibitory kinaz cdk, działających w fazie G l (białko p40sicl drożdży i p27kip wyższych eukariota) muszą być ufo- sforylowane przed wyznakowaniem cząstecz kami ubikwityny i późniejszą degradacją w
proteasomie (KING i współaut. 1996, PAGANO i
współaut. 1995). Uczestniczy w tym kompleks kilku białek (innych niż w cyklosomie) kodo wanych w komórkach drożdży przez geny
cdc34 (enzym E2) oraz geny cdc4, cdc53 i skipi, których skoordynowane działanie do
prowadza do ubikwitynacji, a następnie do proteolizy cykliny obecnej w fazie G l i inhibi
tora p40 . Należy podkreślić, że dopiero de
gradacja tego inhibitora umożliwia komórkom
rozpoczęcie fazy S (JACKSON 1996).
Jest wielce prawdopodobne, że inne je szcze białka, pełniące funkcje regulacyjne w cyklu, są degradowane w proteasomie. I tak pokazano, że proteasom przeprowadza proteo
lizę białka p2 1, inhibitora kinaz cdk, działają
cych we wszystkich fazach cyklu komórkowe go (Bl a g o s k l o n n y i współaut. 1996, Gr z e l a
k o w s k a-Sz t a b e r t 1995a). Wysunięto nawet
sugestie, że zahamowanie proteasomalnej de gradacji tego białka mogłoby wywoływać efek ty cytostatyczne. Fosfataza cdc25, aktywująca
kinazy cdk, jest także ubikwitynowana (NE-
FSKY i BEACH 1996), co pośrednio wskazuje na możliwość jej degradacji w proteasomie. Rów nież białko kodowane przez gen supresorowy p53, tak zwany strażnik integralności genomu
(Gr z e l a k o w s k a- Sz t a b e r t 1995b, Le v i n e
1997), jest degradowane przez proteasom, a
ponadto przez zależną od Ca kalpainę (KUB-
BUTAT i VOUSDEN 1997). Przypuszcza się tak że, że białko kodowane przez gen supresorowy
Rb (Gr z e l a k o w s k a-Sz t a b e r t 1995b) i decy
dujące o intensywności przebiegu wielu proce sów metabolicznych w fazie G l cyklu, może być degradowane w układzie ubikwityna/pro
teasom (BOYER i współaut. 1996). Tak więc
udział Ca w monitorowaniu poziomu białek regulujących cykl jest nie do przecenienia.
UWAGI KOŃCOWE W artykule przedstawiono fakty i hipotezy
o udziale jonów wapnia w regulacji cyklu ko mórkowego. Faktem jest wpływ tego jonu na aktywność układu kinaz cyklino-zależnych i degradację cyklin mitotycznych. Hipotetyczne
są natomiast tłumaczenia udziału Ca w re
gulacji aktywności proteasomu i/lub aktyw ności enzymów uczestniczących w ubikwity- nacji substratów mających ulec degradacji w proteasomie. Faktem jest, że wielofunkcyjna kinaza CAMKII, o aktywności zależnej od Ca +
i kalmoduliny oraz proteaza — kalpaina są elementami uruchamianej przez Ca kaskady fosforylacji i defosforylacji. Hipotetyczne są
natomiast enzymy (z wyjątkiem fosfatazy
cdc25), których stan ufosforylowania jest istotny dla prawidłowego przebiegu cyklu. Za bardzo ważny fakt należy też traktować rosną ce zainteresowanie badaczy różnych komórko wych dróg przekazywania sygnałów problema mi regulacji przebiegu cyklu komórkowego.
CELL CYCLE REGULATION - PARTICIPATION OF CALCIUM IONS, FACTS AND HYPOTHESES S u m m a r y
The involvement of calcium in cell cycle progression has been known for many years. However, there is little information about precise molecular mechanisms by which it functions. In the article facts and hypotheses
about the role o f calcium in functioning of cyclin-depen- dent kinases and ubiquitin/proteasom system, two grou ps of regulatory proteins driving the cell cycle, are descri bed.
LITERATURA
Aiz a w a h., Ka w a h a r a H., Ta n a k a K., Yo k o s a w a H., 1996. Activation o f the proteasome during Xenopus egg acti vation implies a link between proteasome activation and intracellular calcium release. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 218, 224-228.
Ba r a n I., 1994. Exit fro m mitosis induced by a calcium
transient: the relation to the M PF and InsP3 dynamics. BioSystems 33, 203-214.
Ba r a n I., 1996. Calcium and cell cycle progression: possi
ble effects o f external perturbations on cell prolfera- tion. Biophys. J. 70, 1198-1213.
Ba r a ń s k aJ., 1 997. Wapń ja k o pierwotny i wtórny
przeka-2+
źnik inform acji Udział Ca w cyklu komórkowym, sekrecji i adhezji. Kosmos 46, 33-44.
Ba r b ie r o G ., Mu n a r o n L., An t o n io t t i S., Ba c c in o F. M ., Bo n e l l i G ., Lo v is o l o D., 1995. Role o f mitogen-indu-
cecl calcium influx in the control o f the cell cycle in B alb-c 3T3 fibroblasts. Cell Calcium 18, 542-556. Bl a g o s k l o n n yM. V., Wu G. S., Om u r aS., El- De ir yW. S.,
1996. Proteasome-dependent regulation o f p21WAF1 ,cu 1 expression. Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 564-569.
Bo y e rS. N., Wa z e rD. E., Ba n dV., 1996. E7 protein o f hu man papilloma virus-16 induces degradation o f retino blastoma protein through the ubiquitin-proteasome pa thway. Cancer Res. 56, 4620-4624.
Cie c h a n o v e r A., Sc h w a r t z A. L., 1994. The ubiquitin-me-
diated proteolytic pathway: mechanisms o f recognition o f the proteolytic substrate and involvement in the de gradation o f native cellular proteins. FASEB J. 8,
182-191.
El l e d g e S. J., 1996. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science 274, 1664-1672.
Fis h e r R. P., 1997. CDKs and cyclins in transition(s).
Curr. Op. Gen. Develop. 7, 32-38.
Gl o t z e rM., Mu r r a yA. W., Kir s c h n e r M. W., 1991. Cyc- lin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature 349,
132-138.
Gr z e l a k o w s k a-Sz t a b e r t B., 1992. Regulacja cyklu ko mórkowego — historii i komplikacji ciąg dalszy. Post. Biochem. 38, 98-107.
Gr z e l a k o w s k a-Sz t a b e r tB., 1993. Degradacja cyklin ja k o niezbędny element regulacyjny cyklu komórkowego. Post. Biochem. 39, 16-25.
Gr z e l a k o w s k a-Sz t a b e r t B., I995a. Regulacja cyklu ko mórkowego — udział inhibitorów kinaz cyklino-zależ nych. Post. Biochem. 41, 80-93.
Gr z e l a k o w s k a-Sz t a b e r tB., I995b. Geny supresorowe —
molekularne mechanizmy działania i ich znaczenie w kontroli proliferacji komórek. Kosmos 44, 323-352. He p l e r P. K., 1992. Calcium and mitosis. Int. Rev. Cytol.
138, 239-268.
HEPLER p. K., 1994. The role o f calcium in cell division. Cell Calcium 16, 322-330.
Ja c k s o n P. K., 1996. Cell cycle: cull and destroy. Curr. Biol. 6, 1209-1212.
Ka w a h a r a H., Sa w a d a H., Yo k o s a w a H., 1992. The 26S
proteasome is activated at two points in the ascidian cell cycle. Febs Lett. 310, 119-122.
Kin g R. W., De s h a ie s R. J., Pe t e r sJ. -M., Kir s c h n e r M.
W., 1996. Horn proteolysis drives the cell cycle. Scien ce 274, 1652-1659.
Ku b b u t a tM. H. G., Vo u s d e n K. H., 1997. Proteolytic clea
vage o f human p53 by calpain: a potential regulator o f protein stability. Mol. Cell. Biol. 17, 460-468.
La n e H. A., Nig g E. A., 1997. Cell-cycle control: POLO-like kinases jo in the outer circle. Trends in Cell Biol. 7, 63-68.
Le v in e A. J., 1997. p53, the cellular gatekeeper f o r growth
Le w D. J., Ko r n b l u t h S., 1996. Regulatory roles o f cyclin
dependent kinase phosphorylation in cell cycle control. Curr. Opin. Cell Biol. 8, 795-804.
Lo r c a T ., Cr u z a l e g u l F .H ., Fe s q u e t d., Ca v a d o r e J . - C .,
MERY j . , m e a n s a., Do r e e M., 1993. Calmodulin-de
pendent protein kinase II mediates inactivation of MPF and CSF upon fertilization of Xenopus eggs. Na ture 366, 270-273.
Lo r c a T ., Ab r ie u A., Me a n s A., Do r e e M., 1994. Ca 2+ is
involved through type II calmodulin-dependent protein kinase in cyclin degradation and exit fro m metaphase. Biochim. Biophys. Acta 1223, 325-332.
Lu K. P., Me a n sA. R., 1993. Regulation o f the cell cycle by
calcium and calmodulin. Endocrin. Rev. 14, 40-58. Ma h a f f e yD., Yo o Y ., Re c h s t e in e rM., 1993. Ubiquitin me
tabolism in cycling Xenopus egg extracts. J. Biol. Chem. 268, 21205-21212.
Ma k o w s k aA., Du s z y ń s k iJ., 1996. Oscylacje ifa le wapnio
we w komórce. Post. Biochem. 42, 146-158.
Ma n t e u f f e l- Cy m b o r o w s k a M ., 1996. Dekarboksylaza ornitynowa jedynym nieubikwitynowanym białkiem degradowanym przez 26S proteasomy? Post. Bio chem. 42, 113-120.
Ma r t in- Ca s t e l l a n o sC., Mo r e n o S., 1997. Recent advan
ces on cyclins, CDKs and CDK inhibitors. Trends in Cell Biol. 7, 95-98.
Means A. R., 1994. Calcium, calmodulin and cell cycle re gulation. FEBS Lett. 347, 1-4.
Mil l a r J . B. A . , RUSSEL P., 1992. The cdc25 M-phase indu cer: an unconventional protein phosphatase. Cell 68, 4 0 7 -4 1 0 .
Na g a i Y., Ka n e d aS., No m u r a K., Ya s u d a H ., Se n o T ., Ya-
m a o F., 1995. Ubiquitin-activating enzyme, E l, is pho- sphorylated in mammalian cells by the protein kinase Cdc2. J. Cell Sci. 108, 2145-2152.
Ne f s k y B., Be a c h D., 1996. P u b l acts as an E6-AP-like
protein ubiquitin ligase in the degradation o f cdc-25. E M B O J. 15, 1301-1312.
Nigg E. A., 1995. Cyclin-dependent protein kinases: key
regulators of the eukaryotic cell cycle. BioEssays 7, 471-480.
Pa g a n om., Ta m s. w., Th e o d o r a sa. m., Be e r-Ro m e r oP.,
De l Sa lG., Ch a uV., Ye wP. R ., Dr a e t t aG. F., Ro l f e
M., 1995. Role o f the ubiquitin-proteasome pathway in regulating abundance o f the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Science 2 6 9 , 6 8 2 -6 8 5 .
Ra t a nR. R., Sh e l a n s k iM. L., 1986. Calcium and the regu lation o f mitotic events. TIBS 11, 456-459.
Ru d n e rA. D., Mu r r a yA. W., 1996. The spindle assembly check-point. Curr. Op. Cell Biol. 8, 773-780.
Sh o r tA. D., Bia nJ., Gh o s h T. K., Wa l d r o n R. T., Ry b a k
S. L., Gil l D. L., 1993. Intracellular Ca * pool content
is linked to control o f cell growth. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 9 0, 4 9 8 6 -4 9 9 0 .
Sw a n s o n C.A., Ar k in A.P., Ross J., 1997. A n endogenous
calcium oscillator may control early embryonic divi sion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1194-1199. Th o m a sa. p., Bir d G. S., Ha j n o c z k y G., Ro b b-Ga s p e r sL.
D., Pu t n e y J. W., Jr., 1996,. Spatial and temporal aspects o f cellular calcium signaling. FASEB J. 10, 1505-1517.
We is s m a n A . M., 1997. Regulating protein degradation by ubiquitination. Immunol. Today 18, 189-198.
Wh it a k e rM., Pa t e lR „ 1990. Calcium and cell cycle con
trol. Development 108, 525-542.
Wh it a k e r M „ 1993. Sharper than a needle. Nature 366,
2 1 1-2 1 2.
Wh it f ie l dJ. F., Bir d R. P., Ch a k r a v a r t h yB. R., Is a a c sR.
J., Mo r l e y P., 1995. Calcium — cell cycle regulator, differentiator, killer, chemopreventor, and maybe, t6,u- mor promoter. J. Cell. Biochem. supl. 22, 74-91. Wil d in g M., 1996. Calcium and cell cycle control in early
embryos. Zygote 4, 1-6.
Wil d in gM., Wr ig h t E. M., Pa t e l R ., El l is-Da v ie s G ., Wh i
t a k e r M., 1996. Local perinuclear calcium signals as sociated with mitosis-entry in early sea urchin embryos. J. Cell Biol. 135, 1 9 1 -1 9 9 .
ZABŁOCKI K ., 1997. Cykliczna ADP-ryboza — nowa czą steczka sygnałowa w metabolizmie wapnia. K o s m o s 4 6, 1 4 7 -1 5 4 .