Regulacja funkcji kanałów jonowych N a+przez receptory
opioidowe
Grzegorz W itkowski1, Paw eł S zulczyk2
'S tudium Medycyny M olekularnej, W arszaw a
2Akadem ia M edyczna w W arszaw ie, I W ydział Lekarski, K atedra i Zakład Fizjologii Klinicznej i Doświadczalnej
Streszczenie
Receptory opioidow e typu ц należą do grupy receptorów opioidowych, które m odyfikują funkcję licznych efektorów błonowych (cyklaza adenylow a, kanały jo n ow e K+, C a++ i N a+) i cytoplazm atycznych (aktyw acja fosfolipazy A2, kinazy białkowej typu C, kinazy МАРК, ham owanie kinazy białkow ej typu A). Fosforylacja potencjałozależnych kanałów jonow ych N a+ przez kinazę białkow ą typu A i С prowadzi do zmiany kinetyki prądu jonow y ch N a+. Celem pracy było zbadanie mechanizm u transdukcji sygnału od receptora opioidow ego typu ц do potencjałozależnych kanałów jonow ych. Receptory opioidow e aktywowano przez podanie D AM GO - syntetycznego, specyficznego agonisty receptora ц. Podanie DAM GO wywoływało spadek amplitudy oraz zmianę kinetyki prądu jonow ego N a+ w neuronach niepiram idowych. Efekt był ham ow any po podaniu inhibitorów kinaz białkowych A i C. Z kolei podanie aktyw atora kinazy A i С zm ieniało kinetykę i am plitudę prądu jonow ego N a+ w sposób podobny do DAMGO. W neuronach piram idowych kory przedczołowej nie wykazano wpływu aktywacji receptora opioidowego typu ц na prąd jono w y N a+. Wnioski: W neuronach niepiram idow ych kory przedczołowej aktyw acja receptorów opioidowych typu ц m oduluje funkcje potencjałozależnych kanałów jonow ych Na+ w m echanizm ie zależnym od kinazy białkowej A i C.
Wstęp
Receptory opioidow e występują w neuronach ośrodkowego
i obw odow ego układu nerwowego. Zastosowanie alkaloidow ych agonistów receptorów opioidowych (morfina i pochodne: fentanyl, buprenorfina, itp.) * Praca była finan so w ana z bud żetu K om itetu B ada ń N a ukow y ch
Proje kt No: K B N -0 57 5/P 0 5/2 0 05 /2 8
wywołuje szereg efektów klinicznych, które zwykle dzielim y na efekty ośrodkowe i obwodowe. Do działań ośrodkowych zaliczam y: działanie
przeciw bólowe, uspakajające, przeciwkaszlowe, depresję czynności
oddechowej, obniżenie progu drgawkowego, działanie pro- i przeciwwym iotne, zwężenie źrenic. Leki pobudzające receptory opioidow e działają na układ dokrewny - pow odując wzrost uw alniania horm onu antydiuretycznego, i zaham ow anie uwalniania części przysadkowych horm onów tropowych: folitropiny, lutropiny, tyreotropiny. Do działań obwodow ych należą: wzrost napięcia mięśni gładkich jelit, indukcja uwalniania histam iny z komórek tucznych (skurcz oskrzeli i skórne odczyny alergiczne). Wyżej opisane, efekty kliniczne w iążą się z ak ty w acją trzech typów receptorów opioidowych - ja, 5 i к
[3]. W obrębie każdego typu wyróżnianych jest szereg podtypów пр. ц1 i ц2.
Pod względem budow y biochem icznej podtypy te charakteryzują się około 60% homologią. W szystkie obecnie znane receptory opioidow e są receptorami m etabotropow ymi działającym i za pośrednictw em białek Gj/0.
Ligandy receptorów opioidow ych są klasyfikowane w różnoraki sposób. Możemy je podzielić np. na: endogenne (enkefaliny, endorfiny, dynorfiny) i egzogenne (m orfina), naturalne i syntetyczne (enkefaliny - DAM GO , DPDPE), wybiórcze i niew ybiórcze, o działaniu ago-, antagonistycznym lub mieszanym.
Zaburzenia funkcji kory przedczołowej leżą u podstaw procesów
związanych z ostrym i przewlekłym przyjm owaniem środków opioidowych
i ściśle zw iązane są z powstaniem uzależnienia. S ą dwa argumenty przem awiające za tym, że funkcja neuronów kory przedczołow ej je st m odyfikowana przez m orfinę. Po pierw sze w neuronach piramidow ych i niepiram idow ych kory przedczołowej występuje ekspresja receptorów opioidowych [10]. P onadto podaw anie egzogenne m orfiny m odyfikuje funkcję neuronów kory przedczołow ej [10].
M echanizm działania receptorów opioidowych
Stw ierdzono, że aktywacja receptora opioidow ego typu ц wywołuje następujące efekty kom órkowe [14]:
1. D ziałanie ograniczone do błony kom órkowej polega na aktyw acji receptora opioidowego, aktyw acji białka G i m odyfikacji przed podjednostki białka G efektorów błonowych. Do efektorów błonowych, kontrolowanych w tym m echanizmie, przez receptory typu [i należą:
cyklaza adenylow a (jest hamowana),
kanały jo n ow e potasowe prostownicze dokom órkowe (są aktywowane), potencjałozależne kanały jono w e wapniow e typu N, P, Q i R (są hamowane).
2. Ponadto aktyw acja receptorów typu |i może m odyfikow ać funkcje efektorów komórkowych za pośrednictw em wtórnych przekaźników cytoplazm atycznych do których należą:
fosfolipazy A2 (jest aktywowana),
kinazy białkowej typu С (PKC, jest aktywow ana), kinazy białkowej typu A (PKA, jest aktywow ana), kinazy typu М А Р К (jest aktywowana),
kanały jon ow e wapniow e typu L (są aktywow ane), kanałów potasowych wapniowozależne (są aktyw ow ane),
ham owanie potencjałozależne kanały wapniow e typu T (są ham owane), Dane pow yższe wskazują, że aktywacja receptorów opioidow ych typu ц m odyfikuje funkcje jonow ych K+, oraz kinazy białkowej A (PK A) i С (PKC).
M odulacja funkcji kanałów jonow ych N a+ przez kinazy
białkowe.
W strukturze białka kanału jonow ego N a+ typu IIA zlokalizow anego w neuronach mózgu szczura znajduje się pięć m iejsc które po dlegają fosforylacji przez PKA [8, 9]. Również w strukturze białka kanału jon ow ego N a+ znajdują się m iejsca fosforylow ane prze PKC [2]. W ykazano, że aktyw acja PKA i PKC powoduje zm ianę kinetyki różnych podtypów kanałów jono w ych N a+ [8, 9, 12,
13].
W pływ PKC na kanały jonow e N a+ w neuronach kory mózgu, jąder
podkorowych, komórkach m ięśnia sercowego i m ięśni poprzecznie
prążkow anych szczura polegał na redukcji am plitudy prądu, zw olnieniu kinetyki inaktywacji oraz przesunięciu krzywej inaktywacji zależnej od potencjału w kierunki bardziej ujem nych wartości potencjału błonowego [11, 12]. Z kolei wpływ aktywacji PKA polegał na redukcji am plitudy prądu jon ow eg o [8].
W pływ aktywacji receptorów opioidow ych typu ц na prądy
jonow e N a+ w neuronach kory przedczołowej
Jest stosunkowo niewiele danych doświadczalnych w skazujących na obecność kontroli potencjałozależnych kanałów jonow ych typu N a+ przez receptory opioidow e typu |J.. Wykazano np., że aktyw acja prądów jonow ych N a+ przez PGE2 m oże być ham ow ana w czasie aktywacji receptorów opioidowych typu ц [4]. Z kolei liczne dane doświadczalne w skazują, że potencjałozależne kanały jo n ow e N a+ w sercu m ogą być ham owane bezpośrednio przez agonistów receptora typu Ц z pom inięciem samego receptora opioidow ego [8]. Kontrola
prepuls (mV) Interp u lse in te rv al (m s)
R y e 1. A. W pływ D A M G O n a am p litu dę prądu jo n o w eg o N a +. Oś pio now a: zn orm a liz ow an a a m p litu da p rądu jo n o w e g o N a + re jestrow an ego w neuronach n iep ira m id ow yc h w w arunkach k ontroln ych, w c zasie p o d an ia D A M G O (1 ц т ) o raz w czasie p od an ia D A M G O (1 ц т ) razem z n alo kso nem (1 0 ц т ) . P od an ie ag onis ty i a ntagonisty rece ptora o pioid o w eg o oz nac zon o lin ią poziom ą. O ś po ziom a: czas w m inutach. Pow yżej p rze ds taw ion o ory g in aln e z apisy prądu jo n o w eg o N a+ w w a ru nk ach kon tro lnyc h i pod czas p od a w an ia D A M G O (a,c) i D A M G O z na loks onem (b). Prąd jo n o w y N a + induko w any byl pop rz ez b odz iec d ep olaryzu jąc y do -15 mV, trw ający 30 m s, p op rz ed zo ny 100 m s prep ulsem do -100 m V. P ote ncja ł bło now y utrzym yw a no na p ozio m ie - 80 m V.
B. W celu z b ad a nia inaktyw acji zależnej od po ten cja łu błono w eg o b ło n a k om ó rko w a była de po lary zo w ana prz ez im puls testow y (-15 m V, 30 m s) po prz edz on y bodźca m i depolary zującym i trw ającym i 1000 m s o w zrastając ej am plitudz ie (od -120 do -10 m V). N a osi pionow e j p rze dstaw ion o z n orm a lizo w a n ą am plitud ę m aksym alnego prą du N a + w y w ołan ą prz ez im puls testow y, na osi po ziom e j od ło ż on o a m plitud ę bodź ca po prz edz ają ceg o im pu ls testow y.
C. Po w ró t z inak tyw acji prą dó w jo n o w yc h N a + był bad any prz y z asto sow aniu proto kołu za w ie rają ce go d w a identyczn e im pulsy de pola ryzujące - w a run kow y i tes tow y (do -15 m V) trw a jące 30 m s. O ds tę p m ię dzy im pulsam i narastał od 0,05 do 3 60 0 m s. W ykres: z norm alizow an a a m plituda p rąd u jo n o w e g o N a + in dukow a nego prz ez im puls tes tow y (o ś pio now a), przeds taw ion a ja k o fu n kc ja w z ras tając eg o od stęp u czasu pom iędz y im pulsem w a runkow y m i testow ym
kanałów jono w ych N a+ przez receptory opioidow e typu ц za pośrednictwem
białek G i wtórnych przekaźników cytoplazm atycznych je st bardzo
praw dopodobna biorąc pod uwagę:
a. m odulację PKA i PKC przez receptory typu ц,
b. występow anie w kanałach jonowych N a+ miejsc fosforylacji przez PKA i PKC,
c. zm ianę kinetyki kanałów jonow ych N a+ pod w pływ em działania PKA i PKC.
Celem naszej pracy było stwierdzenie czy w neuronach piram idowych kory przedczołowej kanały jonow e N a+ są kontrolowane przez receptory opioidow e typu ц. Opisano właściw ości kinetyczne tetrodotoksyno-w rażliwych, prądów jonow ych N a+, w ystępujących w świeżo rozproszonych neuronach piram idowych i niepiram idow ych kory przedczołowej. N ie stw ierdzono wpływu aktywacji receptora opioidow ego typu |i na funkcje kanałów jonow ych N a+ w neuronach piram idow ych. N atom iast w neuronach niepiram idowych podanie DA MG O (selektyw nego agonisty receptory opioidowego typu ц) powodow ało około 20% spadek am plitudy prądu jonow ego N a+, przesunięcie krzywej inaktywacji w stronę hiperpolaryzacji, w ydłużenie czasu pow rotu z inaktywacji oraz zw olnienia szybkości narastania i stałej czasu inaktywacji prądu (ryc. 1).
Zmiany były odw racalne i blokowane przez antagonistę receptorów
opioidowych - nalokson. W ydaje się więc, że aktywacja receptora opioidowego w znaczącym stopniu przyczynia się do ham owania pobudliwości neuronów niepiram idow ych kory przedczołowej i w konsekw encji do dysinhibicji neuronów piram idowych.
Zbadano m echanizm transdukcji sygnału od receptora opioidow ego typu
M- do kanałów jonow ych N a+ w niepiram idowych kory przedczołowej.
Stwierdzono, że zablokow anie aktywacji białka G poprzez podanie
dokom órkow e niehydrolizującego analogu nukleotydu guaninow ego GDPßS znosi efekt ham owania prądu N a+ przez DAMGO. Wynik ten wskazuje, że w transdukcji sygnału bierze udział białko G.
Podanie forskoliny - aktywatora cyklazy adenylow ej (co prowadzi do aktyw acji PK A) i estru forbolow ego (PMA) - aktyw atora PKC powodowało redukcję am plitudy, zw olnienie szybkości narastania i zw olnienie stałej czasu inaktywacji prądu N a+. Zatem aktywatory PKA i PKC działały na prądy jonow e Na+ podobnie jak aktyw acja receptora opioidowego typu ц.
Całkowite zaham ow anie wpływu aktywacji receptora opioidowego typu Ц na prąd jono w y N a+ występowało po inkubacji neuronów niepiram idowych z inhibitorem PKA (H-89).
R y e 2. A. W pływ D A M G O i selektyw ne go in hibito ra PK A - H -89 (0,1 ц т ) na a m plitud ę prądu jon o w e go N a+. O ś p ionow a: z norm alizow an a am p litud a prądu jo n o w e g o N a +, o ś po ziom a: czas w m inutach. W obecn oś ci H -89 podaw aneg o do środo w is ka ze w ną trz kom órkow ego nie obs erw ow ano zm n iejs ze nia a m plitudy prądu jo n ow e go N a + w cza sie po d a w a n ia DA M G O . Pow yżej: ory ginalne zapisy prąd u jo n o w e g o N a + w w arunkac h ko ntro lny ch i po dcza s po daw ania D A M G O (a,c) o ra z w trak cie in ku bac ji z H -89 (b).
B. W pływ D A M G O i selek tyw neg o in hib itora PK C - ch lorku ch elerytryn y (3 ц т ) na am p litud ę prądu jo n o w e g o N a +. W czas ie po daw ania in hibitora PK C efek t D A M G O na am plitu dę prądu jon o w e go N a+ był znosz ony. O ś piono w a: z norm aliz ow an a a m plitu da prą du jo n o w e g o N a +, oś poziom a: czas w m inuta ch. D A M G O po daw an o przed, w trakc ie i po z akoń czeniu inkubacji kom órki z ch lorkiem chelerytry ny. Pow yżej: orygin alne z apisy prąd u jo n o w e g o N a + prz ed i w tra kc ie p o da w an ia D A M G O w w arun kach k on tro lnyc h (a, c) i w w aru nk ac h inkubacji z ch lo rk iem ch elery tryn y (b).
P odobnie podanie chlorku chelerytryny - blokera PKC rów nież hamowało wpływ aktywacji receptora opioidow ego ц na kanały jo n ow e N a+ (ryc. 2).
Wyniki powyższych badań wskazują, że białko G oraz PKA i PKC biorą udział w transdukcji sygnału od receptora opioidow ego typu ц do kanału jonow ego N a+.
Piśmiennictwo
1. A lreja, M ., A gha janian G.K. (1 993) O piates su press a restin g so dium d e pe nd e n t inw ard c urren t and a ctiv ate an o utw a rd p otass ium c urrent in locus c o eru leu s n eu ron s. J. N eu rosc i.,
1 3 ,3 5 25 -3 5 3 2.
2. C a ntrell, A .R ., C a tterall, W .A. (2001). N eurom odu lation o f N a+ chan nels: an unex pected form o f c ellular plas ticity . Nat. Rev. N eurosci. 2(6), 397 -407 .
3. C o rbe tt, A., H end ers on , G. (20 02) O p ioid R ecep tors, h ttp ://w w w .b io tr e n d .c o n i/p d f/o p r e v .p d f 4. G old, M .S., L evin e, J.D . (199 6) D A M G O inhibits pro sta gla nd in E 2-ind uc ed po ten tiation o f a
T T X -re sista nt Na+ c urre n t in rat sen sory neu rons in vitro. N eurosci. Lett., 21 2, 83-86. 5. Ingram S.L.., W illiam s J.T . (1 994) O pioid inhibition o f Ih via adenylyl cyclase. N e ur o n , 13,
179-186.
6. Ingram S .L., W illiam s J.T. (1996) M odulation o f the Ih by cyclic nu cle tide s in gu inea pig prim a ry afferen t ne urons. J. P hys., 492 , 97 -10 6
7. Joshi S. K., G e bh art G.F. (20 03) N o nop io id A ctions o f U 50 .48 8 E n antio m ers C o ntribu te to T h eir Periphera l C utan eo us A ntin ocic eptive Effects. JP E T., 305, 9 19 -9 24
8. Sm ith, R .D., G oldin, A.L. (199 7) Phos pho ryla tion at a Sin gle Site in the Rat B rain Sodiu m C h annel Is N ecessary an d Sufficie nt for C urren t R edu ction by Pro tein K in ase A. J. N eurosc i.,
1 7 , 6 0 8 6 - 6093.
9. Sm ith, R .D., G o ldin , A. L. (20 00) Potentiatio n o f rat brain so dium channe l cu rre nts by PK A in X en o pu s oo cyte s in volv es I-II linker. AM .J. Physiol., C ell P hys iol., 278 , 638 -645 . 10. Steke te e J.D. (2 00 2 ) N eurotrans m itte r system s o f the m edial prefrontal corex: potential role
in se n sitiz atio n to psyc hostim u lants . Br. Res. Rev., 41, 203-22 8.
11. Sv obo da , K., L up ica C. (1 998 ) O p ioid In hib itio n o f H ippo cam pa l In terneu ron s via M odu la tio n o f P otas sium a nd H ype rpolarizatio n-A ctivated C atio n (4 ) C u rre n ts ../. N eu rosci., 18, 70 84 -70 98.
12. Qu et al. (19 96) Pho sp ho ry lation o f the S15 05 in the ca rdiac N a+ ch anne l is req u ired for m od ula tio n by p rote in kinas e C. J. Gen. P hy siol.,108, 375-37 9.
13. V ijay aragav an, K., B outjdir, M ., C hahine , M. (200 4) M o d u la tio n o f N a v1.7 and N a v1.8 Periphera l N erve Sod iu m C ha nnels by Protein K inase A and Protein K inase C.
J. N e uro ph ys io l. 91, 1556 - 1569.
14. W illia m s, J.T. et al. (2 001 ) C e llular and synaptic adap tatio ns m ed iatin g o pioid de penden ce.
P hysiol. R e v., 8 1 ,2 9 9 -3 4 3 .
15. W im pe y, T .L ., C ha vkin , C. (1 991) O pioids activate both an in w ard re ctifie r and a novel vo lta ge -ga ted p otas siu m c ond ucta nce in the hippocam pal form atio n. N e u ro n , 6(2), 281 -289 .
A dres do k ore sp o nd e nc ji: G rz e g o rz W itk o w s k i A kadem ia M edyc zna w W arszaw ie, 1 W yd ział L ekarski K atedra i Z akład Fizjologii K linic zne j i D ośw iad czalnej K rako w sk ie Prze dm ieś cie 26/28 00 -9 27 W arszaw a tel.: (48 22) 82 6 4 2 75 e-m ail: gregor@ am w aw .edu.p l
