Wirus cytomegalii – epidemiologia, diagnostyka, leczenie i zapobieganie

Małgorzata Polz-Dacewicz

Wirus cytomegalii – epidemiologia, diagnostyka,

leczenie i zapobieganie

Cytomegalovirus – epidemiology, diagnostics, therapy and prophylaxis

} Zakład Wirusologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, ul. Chodźki 1, 20-093 Lublin, Tel./Fax: (81) 742 37 88, e-mail: m.polz@umlub.pl Wpłynęło: 04.02.2013 Zaakceptowano: 28.02.2013

Streszczenie: Ludzki cytomegalowirus (ang. Human

Cytomegalo-virus – HCMV) – należący do rodziny Herpesviridae, podrodziny

Be-taherpesvirinae – jest szeroko rozpowszechniony. HCMV cechuje

się wysoką zapadalnością i śmiertelnością wśród pacjentów o ob-niżonej odporności, jak np. biorcy przeszczepów narządów litych i szpiku oraz zakażeni wirusem HIV. Ponadto jest częstą przyczyną zakażeń wrodzonych. Obecnie w profilaktyce i leczeniu wirusa cy-tomegalii stosowane są gancyklowir, foskarnet i cidofowir, w sto-sunku do których dochodzi do selekcji szczepów opornych. Z tego względu prowadzone są badania nad innymi lekami, np. CMX001, AIC246, leflunomidem lub imitinibem, a także badania nad zasto-sowaniem związków pochodzenia roślinnego (np.  flawonoidy). Jak dotąd brak jest skutecznej szczepionki profilaktycznej prze-ciwko cytomegalowirusowi. Na różnych etapach badań znajdują się szczepionki podjednostkowe, szczepionki DNA, peptydy oraz szczepionki z wykorzystaniem wektorów.

Słowa kluczowe: CMV | patogeneza | szczepionki | terapia |

tro-pizm wirusa

Abstract: Human cytomegalovirus (HCMV), a member of the Be-taherpesvirinae subfamily of Herpesviridae family, is widespread

pathogen. CMV is a  major cause of morbidity and mortality in immunocompromised individuals such as organ transplant re-cipients and AIDS patients. Ganciclovir, foscarnet and cidofovir are currently available drugs for CMV treatment and prevention. Drug resistance can develop with all available drugs. Several new anti-CMV compounds are development as CMX001, AIC246 and licensed drugs as leflunomid, imatinib. Some flavonoids have a specific in vitro inhibitory potential against HCMV and may pro-vide good alternative to antivirals currently used in clinical prac-tice. There is no effective vaccine. Many approaches to  vaccine development are being studied, including subunit vaccines, chi-meric live-attenuated, DNA, peptide, subviral particles.

Key words: CMV | pathogenesis | therapy | vaccines | viral tropism

Wprowadzenie

Cytomegalia została opisana po raz pierwszy przez Rib-berta w  1881 roku, natomiast w  1921 roku Goodpasture i  Talbert stwierdzili, że  jest ona wywołana przez czynnik wirusowy. Ludzki wirus cytomegalii został wyizolowany z hodowli komórkowej przez trzech niezależnych badaczy: Smith’a, Rowe’a (1956 rok) oraz Wellera (1957 rok). Nazwa „cytomegalowirus” została nadana przez Wellera w  1960 roku. Obecnie CMV jest jednym z  częściej występujących oportunistycznych patogenów zakażeń wrodzonych oraz wirusów atakujących pacjentów z  obniżoną odpornością po transplantacjach i zakażonych wirusem HIV.

Biologia wirusa

CMV został sklasyfikowany w  rodzinie Herpesviridae, podrodzinie Betaherpesvirinae. Jest największym spośród ludzkich wirusów chorobotwórczych. Jego średnica wynosi 200 nm, ma około 200 otwartych ramek odczytu (ang. Open Reading Frame – ORF) i koduje ponad 200 białek. Wirion cytomegalowirusa ma  ikosahedralny białkowy kapsyd zło-żony ze  162 kapsomerów (o  średnicy około 100 nm), we-wnątrz którego znajduje się podwójna nić DNA o  wielko-ści 235 kb. Kapsyd jest otoczony białkowym tegumentem, a na zewnątrz – lipidową osłonką. Genom wirusa składa się z dwóch kowalentnie związanych segmentów (L i S), a każdy z nich zawiera unikalny region (UL i Us), zakończony frag-mentem TRL i IRL, TRs i IRs. Konfiguracja genomu przed-stawia się następująco: TRL-UL-IRL-IRs-Us-TRs  [1–4]. Strukturę genomu CMV przedstawia Rycina 1.

Poza ludzkim cytomegalowirusem do  podrodziny

Be-taherpesvirinae zaliczono także Murine cytomegalovirus

(MCMV), Rat cytomegalovirus (RCMV) oraz Chimpanzee

cytomegalovirus (CCMV). HCMV jest rutynowo

izolowa-jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.

badaniach wirusa stosowane są laboratoryjne szczepy, takie jak: AD169, Towne, Toledo [2].

Pomimo dużego zróżnicowania sekwencji genomu wśród wirusów należących do  rodziny Herpesviridae, ist-nieją fragmenty konserwatywne (geny rdzeniowe) odpo-wiedzialne za podstawowe funkcje metaboliczne i struktu-ralne [4]. Geny specyficzne dla grupy wirusów nie są istotne z  punktu widzenia replikacji in vitro, ale odgrywają rolę w  odpowiedzi immunologicznej. Analiza sekwencji geno-mu HCMV z  izolatów klinicznych wykazała obecność 70 glikoprotein, natomiast w szczepie laboratoryjnym AD169 – 57. Strukturalne glikoproteiny podzielono na dwie klasy: wspólne dla całej rodziny (gB, gH, GL, gM, gN) oraz specy-ficzne (nie wykazujące podobieństwa do  glikoprotein wy-stępujących u innych herpeswirusów). W przeciwieństwie do glikoprotein konserwatywnych, glikoproteiny specyficz-ne nie odgrywają roli w replikacji wirusa CMV w hodowli fibroblastów in vitro, ale są odpowiedzialne za tropizm i pa-togenność wirusa.

Wirus wnika do  komórki przez przyłączenie się gliprotein lipidowej osłonki wirusa do  receptorów błony ko-mórki gospodarza. Do cytoplazmy przenika kapsyd wirionu z DNA, a następnie wędruje do jądra komórki. CMV ma po-wolny cykl replikacyjny – pełny cykl trwa około 96 godzin.

Podczas litycznej fazy zakażenia następuje ekspresja na-tychmiastowych wczesnych genów wirusa (ang. immedia-te-early – IE), w  wyniku czego powstają wczesne białka, które modulują metabolizm komórki i stymulują ekspresję wczesnych genów wirusa (ang. early – E) [4]. Na tym etapie następuje replikacja DNA, po  której wczesne geny pobu-dzają ekspresję późnych genów wirusowych. Późne białka wirusowe są strukturalnymi komponentami wirionu i biorą udział w formowaniu nowych cząstek wirusa. W niektórych typach komórek wyciszenie natychmiastowych wczesnych białek wirusa jest przyczyną przejścia zakażenia w stan la-tencji. Latencja charakteryzuje się minimalną ekspresją genów wirusowych, zahamowaniem montażu i uwalniania nowych wirionów potomnych. Reaktywacja infekcji latent-nej jest możliwa pod wpływem różnych czynników środo-wiskowych, w efekcie czego dochodzi do rozwoju choroby i rozprzestrzenienia wirusa.

Komórki zakażone HCMV produkują także niezakaźne cząstki, które są podobne do zakaźnych wirionów: zawierają osłonkę, tegument i białka kapsydu, ale nie mają DNA.

Białka tegumentu pp65, pp71, pp150 i  pp28 odgrywają rolę podczas wszystkich etapów cyklu replikacyjnego wiru-sa, dlatego stanowią cel dla nowych leków przeciwwiruso-wych  [5]. Do  wyjaśnienia ich roli wykorzystywane są  me-tody fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Pp65 jest dużym białkiem odpowiadającym za  modulację odpowie-dzi immunologicznej gospodarza zarówno komórkowej, jak i humoralnej, i jest głównym celem dla limfocytów

cytotok-ekspresji natychmiastowych wczesnych genów i  zapocząt-kowaniu litycznego cyklu wirusa. Pp150 i  pp28 są  wysoce immunogenne i  biorą udział w  tworzeniu oraz uwalnia-niu nowych cząstek wirusa, przy czym pp150 (podobnie jak pp65) jest potrzebne do  wbudowania nukleokapsydu do cząstki wirusa.

Z  około 200 genów kodowanych przez CMV, ¼ jest charakterystyczna dla wirusowej replikacji i  wspólna dla wszystkich herpeswirusów  [1]. Wirus może uruchomić różne ścieżki sygnałów w  różnych typach komórek. W  fa-zie G1/G0 cyklu komórkowego następuje ekspresja IE CMV. Gen UL111 koduje wirusową interleukinę-10 cmvIL-10, która w  27% wykazuje homologię do  ludzkiej IL-10 oraz odgrywa rolę w przetrwaniu zakażenia. UL 28 zapoczątko-wuje proliferację komórek i proces onkogenezy. Transkryp-ty anTranskryp-tysensowne UL81–UL82 kodujące latentny anTranskryp-tygen jądrowy (ang. latent undefined nuclear antygen – LUNA) są wykrywane w okresie latencji. Genom CMV koduje jede-naście microRNAs (miRNAs), z których miRNA112 koduje natychmiastowe wczesne białko IE1–72kDa, hamujące syn-tezę DNA i replikację wirusa.

Epidemiologia

Badania seroepidemiologiczne wykazały, że wirus CMV jest bardzo rozpowszechniony na świecie, a zakażenia pier-wotne zwykle przebiegają bezobjawowo  [4, 6]. Nie odno-towano sezonowości zachorowań. Częstość występowania przeciwciał anty-CMV w klasie IgG zależy od wielu czynni-ków, takich jak: wiek, warunki socjalno-bytowe, rejon geo-graficzny, aktywność seksualna (zakażenia homo- i hetero-seksualne). Badania dotyczące zależności zakażenia CMV od  wieku wykazały istnienie trzech okresów zwiększonej częstości zakażeń: wczesnego dzieciństwa, dojrzewania i rozrodczy.

W  Ameryce Południowej, subsaharyjskiej części Afry-ki, wschodniej Azji oraz Indiach przeciwciała stwierdza się u 90% dzieci w wieku przedszkolnym [6]. Natomiast w Sta-nach Zjednoczonych i Wielkiej Brytanii – u mniej niż 20%. W Chinach, Brazylii oraz na Tajwanie około 56–60% dzieci w grupie wiekowej 4–7 lat jest seropozytywnych. W Hiszpa-nii odsetek seropozytywnych dzieci w przedziale wiekowym 2–5 lat wynosi 42%; zaś dorosłych w wieku 31–40 lat – 79%.

Obecność przeciwciał u krwiodawców z Afryki i Azji od-notowuje się w  95–100% przypadków, zaś w  Niemczech – u 30% dawców (w wieku 18–20 lat) do >70% u osób po 65. roku życia [6].

Wirusem można zarazić się przez bezpośredni kontakt z  osobą zakażoną, drogą wertykalną z  matki na  płód oraz drogą parenteralną (przetoczenia produktów krwiopochod-nych, przeszczepy narządów lub szpiku). Wirus może

wy-jak: wydzielina z jamy nosowo-gardłowej, mocz, wydzielina z pochwy, nasienie, mleko, składniki krwi.

Jedną z  możliwości zakażeń jest zakażenie perinatalne, czyli zakażenie noworodka w czasie porodu lub po urodze-niu, podczas kontaktu dziecka z mlekiem matki (90% CMV DNA w  mleku matek seropozytywnych)  [6]. Do  zakażeń między dziećmi dochodzi najczęściej w  żłobkach i  przed-szkolach (zakażenia horyzontalne). U  małych dzieci wirus jest obecny w ślinie i w moczu. Możliwe jest także przenie-sienie wirusa z  dzieci na  rodziców. CMV szerzy się także drogą płciową, a częstość występowania przeciwciał jest za-leżna od  wieku inicjacji seksualnej, liczby partnerów oraz współwystępowania innych chorób przenoszonych przez kontakty seksualne.

Zakażenie wirusem CMV podczas transfuzji opisano po  raz pierwszy w  1966 roku  [6]. Najczęściej związane jest ono z  transfuzją czerwonych krwinek, koncentratów płytek krwi oraz koncentratów granulocytów. Przetoczenie świeżo mrożonej plazmy i krioprecypitatów nie stanowi ryzyka zaka-żenia. Częstość poprzetoczeniowego zakażenia potwierdzona serokonwersją i/lub izolacją wirusa wynosiła średnio 30% (10–70%), a  jego ryzyko jest ściśle związane z  liczbą prze-toczeń i  jakością leukocytów. Wprowadzenie leukoredukcji w centrach krwiodawstwa znacznie zmniejszyło to ryzyko.

HCMV może także zostać przeniesiony wraz z  prze-szczepianym narządem lub szpikiem od dawców uprzednio zakażonych do  biorców seronegatywnych. Jest to  ważny czynnik ryzyka rozwoju pierwotnego zakażenia. Ryzyko rozwoju zapalenia płuc o  etiologii cytomegalowirusowej wynosi w  tym przypadku 10–30%, a  śmiertelność – około 80%. W ciągu ostatnich kilkunastu lat liczba ta znacznie się zmniejszyła w związku z profilaktycznym i/lub leczniczym stosowaniem przeciwwirusowych leków ograniczających częstość reaktywacji.

Patogeneza zakażenia

Wirus ma powinowactwo do komórek nabłonka, po za-każeniu których dochodzi do  replikacji litycznej  [1, 4, 6,]. Zakażenia pierwotne następują drogą układu oddechowego lub drogą płciową. Wirus cytomegalii, podobnie jak inne herpeswirusy, daje trwałe zasiedlenie organizmu, a jego re-zerwuarem są głównie monocyty i leukocyty wielojądrzaste, skąd wirus jest rozsiewany nawet wiele lat po pierwotnym zakażeniu (jego obecność odnotowuje się w gardle i moczu).

W  wyniku zakażenia dochodzi do  powiększenia komó-rek oraz pojawienia się charakterystycznych wtrętów we-wnątrzkomórkowych otoczonych tzw. halo, co daje wygląd tzw. sowich oczu. Większość zakażeń pierwotnych (a także nawracających) u  osób immunokompetentnych przebiega bezobjawowo.

piersiowego, prostaty, endometrium kanalików nerkowych, a  także innych organów (szpik kostny, płuca). Dlatego też można go izolować ze śliny, łez, mleka kobiecego, nasienia, wydzieliny szyjki macicy, produktów krwi oraz moczu.

Zakażenie CMV może mieć charakter latentny (niepro-duktywny), lityczny (produktywny); bezobjawowy bądź objawowy.

Ważną regulującą rolę odgrywają komórkowe nieswo-iste mechanizmy odpornościowe, takie jak komórki NK (ang.  natural killer) i  interferon  [4]. W  wyniku aktywacji TLRs następuje nasilenie produkcji cytokin i chemokin sty-mulujących komórki NK. Najważniejszą rolę pełnią cytotok- TZD[OF
MJNGPDZUZ
5
$%
Jڀ$%
1PXPEVKʇ
POF
MJ[ʒ
[BLB˃P-nych komórek w produktywnej fazie zakażenia, biorą udział w  utrzymaniu wirusa w  stanie latencji i  zapobiegają jego reaktywacji. Dlatego osoby z  defektem odpowiedzi komór-kowej dotyczącej limfocytów T znajdują się w grupie ryzyka ciężkich postaci zakażenia. Szczególnie dotyczy to pacjentów poddawanych przeszczepom narządów lub szpiku oraz zaka-żonych wirusem HIV [7–15]. Osoby te często ulegają zakaże-niom pierwotnym lub reaktywacji zakażenia, a także reinfek-cji, czyli nadkażeniu nowym szczepem wirusa. Polimorfizm glikoproteiny B (gB) determinuje tropizm wirusa do różnych narządów i  tkanek. Analiza filogenetyczna regionu UL 144 wykazała duże zróżnicowanie sekwencji szczepów klinicz-nych, co sugeruje jego rolę w zakażaniu komórek śródbłonka i  leukocytów. Wykazano, że  geny UL128, UL130, UL131A odgrywają dużą rolę w zakażaniu komórek nabłonka i śród-błonka oraz leukocytów. Genotyp gB (jak gB1 i  gB2) jest częściej związany z  zakażeniami nabytymi w  dzieciństwie i różni się od szczepów izolowanych u pacjentów z HIV [16].

Kliniczne objawy zakażenia CMV u pacjentów z obniżo-ną odpornością:

1. Wiremia CMV bardzo często jest związana z  prze-dłużającą się gorączką powyżej 38ºC z  (lub bez) leukopenią. Może ona ustąpić samoistnie. Należy jednak wykluczyć gorączkę innego pochodzenia (bakteriemia), a  w  przypadku leukopenii – efekt działania leków immunosupresyjnych.

2. Zapalenie wątroby – 2,5-krotny wzrost aktywności transaminaz, może wystąpić hiperbilirubinemia. 3. Zapalenie trzustki.

4. Zaburzenia żołądkowo-jelitowe, (głównie występują bóle z  towarzyszącą gorączką, zapalenie przełyku, dysfagia). Zaburzeniom tym może towarzyszyć za-każenie Candida.

5. Śródmiąższowe zapalenie płuc. 6. Zapalenie mięśnia serca. 7. Zapalenie pęcherza moczowego.

8. Zapalenie siatkówki – szczególnie często obserwo-wane u pacjentów z AIDS (u pacjentów bez terapii HAART 60–71%).

szczepie komórek macierzystych.

Rozróżnienie zakażeń CMV zostało przedstawione w Ta-beli 1.

Cytomegalowirus jest bardzo często przyczyną wrodzo-nych zakażeń u  ludzi  [6]. Około 10% noworodków z  za-każeniem wrodzonym wykazuje objawy cytomegalii wro-dzonej. Najczęstszym objawem jest powiększenie wątroby i  śledziony oraz wybroczyny. Wrodzone zakażenie CMV może powodować rozlane śródmiąższowe zapalenie płuc o ciężkim przebiegu. U około 20% dzieci występują zaburze-nia narządu wzroku, tj. zapalenie siatkówki i naczyniówki, które w przypadku zajęcia plamki żółtej mogą doprowadzić do ślepoty, zeza lub zaniku nerwu wzrokowego. Mogą wy-stępować także objawy ze strony ośrodkowego układu ner-wowego (OUN).

CMV jest najczęstszą potransplantacyjną infekcją wy-stępującą w ciągu 1 do 6 miesięcy po przeszczepie zarówno organów litych, jak i szpiku kostnego oraz krwiotwórczych komórek macierzystych  [7, 8]. Przeszczepy narządów li-tych niosą ryzyko zakażenia wirusem CMV w  granicach 8–50%. Wysokim ryzykiem obarczone są zabiegi torakochi-rurgiczne, np. przeszczep płuc, serca lub płuca i serca (Ta-bela 2) [15]. Szczególnie narażeni są seronegatywni biorcy, w  przypadku gdy otrzymują organ od  seropozytywnych EBXDØX
%3
8ڀUFK
HSVQJF
QBDKFOUØX
PEOPUPXBOP
EV˃ʇ
zapadalność na CMV oraz wysoką śmiertelność.

Infekcja HCMV może być związana z takimi chorobami jak: miażdżyca naczyń wieńcowych, wrzód żołądka, zabu-rzenia reumatologiczne oraz nowotwory. Istotną rolę odgry-wa odpowiedź immunologiczna gospodarza, a także repli-kacja wirusa i ekspresja jego genów.

Wiele badań wskazuje na możliwość reaktywacji zakaże-nia CMV u  immunokompetentnych pacjentów, będących w  ciężkim stanie klinicznym z  powodu oparzeń, urazów, sepsy lub zawału mięśnia serca [8, 9]. W tych przypadkach wskutek reaktywacji zakażenia w płucach dochodzi do cyto-megalowirusowego zapalenia płuc.

HCMV charakteryzuje się szczególnym tropizmem do nabłonka gruczołów ślinowych [10, 11]. Zakażenie CMV pierwotne, nawracające i wtórne niosą za sobą następujące konsekwencje: bezobjawowa lub gorączkowa wiruria u osób immunokompetentnych, poważne wrodzone zaburzenia (głuchota, ślepota, niedorozwój umysłowy) u noworodków, niemowląt i małych dzieci, częste oportunistyczne zakaże-nia u  pacjentów o  obniżonej odporności charakteryzujące się wysoką zapadalnością i  śmiertelnością. Wzrasta liczba medycznych dowodów potwierdzających fakt, że  aktywne zakażenie HCMV jest związane z  różnymi nowotworami (mózgu, piersi, płuc, jelita grubego, prostaty). Wiele badań wskazuje, że rozregulowanie ścieżki sygnałów gospodarz – HCMV moduluje odpowiedź komórkową, a  także inicjuje onkogenezę.

Rak śluzówkowo-nabłonkowy jest najczęściej występu-jącym nowotworem dużych i małych ślinianek [10]. CMV może odgrywać główną rolę w rozwoju tego typu nowotwo-ru. Wirus wykazuje tropizm do  pluripotentnych komórek macierzystych i  niezróżnicowanych komórek pnia, w  któ-rych metodą immunohistochemiczną wykazano obecność białek IE1 i pp65, charakterystycznych dla aktywnej formy zakażenia.

Diagnostyka

Rozpoznawanie objawowej cytomegalii na  podstawie objawów klinicznych jest praktycznie niemożliwe. Zwykle diagnoza opiera się na  badaniach serologicznych, analizie materiału genetycznego, rzadko – na  badaniach wirusolo-gicznych, cytolowirusolo-gicznych, histopatologicznych [12].

Metody serologiczne

Spośród różnych metod umożliwiających wykrywanie przeciwciał najbardziej popularna jest metoda ELISA, po-zwalająca na  wykrycie swoistych przeciwciał anty-CMV IgG i  anty-CMV IgM. Jednak ustalenie zależności miedzy wynikami badań a  stanem klinicznym jest bardzo trudne, szczególnie u  chorych z  zaburzeniami immunologiczny-mi. Wykrycie swoistych przeciwciał klasy IgM i  IgG lub co  najmniej czterokrotny wzrost ich miana w  klasie IgG potwierdza rozpoznanie cytomegalii, ale na  tej podstawie nie można ustalić, czy jest to zakażenie pierwotne,

reakty-Określenie Definicja

Zakażenie CMV Obecność materiału genetycznego CMV, detekcja białek wirusa lub jego izolacja w płynach ustrojowych albo tkance chorego

Choroba CMV Objawy kliniczne w postaci zespołu CMV lub zmian narządowych

Późne zakażenie CMV

Choroba CMV pojawiająca się po zakończeniu profi-laktyki (3–12 miesięcy po transplantacji)

Leczenie wyprze-dzające (profilak-tyka wybiórcza)

Regularne monitorowanie biorcy w kierunku CMV i ewentualne włączenie leczenia przeciwwirusowego Profilaktyka Leczenie przeciwwirusowe wszystkich chorych z

ryzy-kiem zakażenia CMV

Organ Zakażenie (%) Choroba (%)

Nerki 8–32 8

Serce 9–35 25

Wątroba 22–29 29

Płuco (serce/płuco) 39–41 39

Trzustka (nerka/trzustka) 50 50

wacja zakażenia latentnego czy też reinfekcja innym seroty-pem wirusa. Wykrycie u noworodka swoistych przeciwciał w klasie IgM i IgG wskazuje na zakażenie wewnątrzmacicz-ne, a  wykrycie tylko przeciwciał IgG (nawet w  wysokim mianie) może świadczyć o biernym ich przeniknięciu przez łożysko od matki; natomiast narastanie miana – o zakażeniu wewnątrzmacicznym. Przeciwciała pojawiają się w określo-nym czasie od zakażenia i dlatego badania serologiczne nie pozwalają na wczesne rozpoznanie zakażenia CMV.

Oznaczanie antygenu pp65 CMV w  leukocytach krwi obwodowej jest szybką metodą o wysokiej czułości, służącą do  oznaczania i  monitorowania czynnego zakażenia wiru-sem CMV.

Hodowla wirusa

Badania wirusologiczne wykonuje się bardzo rzadko, po-nieważ są pracochłonne, długotrwałe i kosztowne. Wirusy można izolować z  wydzieliny jamy ustno-gardłowej, dróg rodnych, krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, osadu moczu itp. CMV dobrze namnaża się w  hodowlach ludzkich em-brionalnych fibroblastów, ale efekt cytopatyczny widoczny jest dopiero po 2–3 tygodniach i wobec tego takie badanie

cji wirusa coraz częściej wykorzystuje się technikę shell vial rapid assay, polegającą na  przyspieszeniu inkubacji wirusa w  hodowli komórkowej za  pomocą wirowania. Następnie w odczynie immunofluorescencji bada się wczesne i późne białka wirusa. Metoda ta pozwala na wykrycie CMV w cią-gu 24–48 godzin.

Metody biologii molekularnej

W  ostatnich latach w  diagnostyce CMV coraz częściej wykorzystywane są  metody biologii molekularnej, opartej na  analizie kwasów nukleinowych  [17, 18]. Główną zaletą tych badań jest możliwość wykrycia zakażenia w  bardzo wczesnej fazie (tzw. okna serologicznego), przed pojawie-niem się swoistych przeciwciał. Ponadto metody te umoż-liwiają weryfikację badań serologicznych, przede wszystkim u  noworodków i  niemowląt seropozytywnych matek oraz rozstrzygnięcie, czy istniejące zakażenie CMV jest pierwot-ne, stanowi reaktywację zakażenia latentnego lub reinfekcję innym serotypem wirusa.

Najczęściej stosowana jest metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction – PCR), a ostat-nio – metoda Real-time PCR, umożliwiająca wykrycie CMV DNA w  kopiach/ml. Pozwala to  na  wykrycie aktywnego zakażenia, co  ma  duże znaczenie podczas monitorowania terapii pacjentów po  przeszczepach. Z  uwagi na  większą czułość jest alternatywą dla oznaczania antygenemii pp65 stosowanej dotychczas. Główną jej zaletą jest wysoka czu-łość i  swoistość oraz możliwość wykonania badania z  nie-wielkiej ilości materiału klinicznego. Metody biologii mo-lekularnej umożliwiają także określenie lekowrażliwości i zjadliwości wirusa.

Terapia

Obecnie w  leczeniu i  profilaktyce zakażeń CMV stoso-wane są  gancyklowir (GCV), foskarnet (FOS) i  cidofovir

Leki dostępne Wskazania Rodzaj terapii

Ganciklowir/Walgan-cyklowir

HCT, SOT, HIV Profilaktyka, leczenie

Foskarnet HCT, HIV, SOT Profilaktyka, leczenie

Cidofovir HIV, HCT, SOT Leczenie

Fomivirsin HIV Leczenie

Leflunomid HCT, SOT Leczenie

W trakcie badań:

Maribavir HCT, SOT Profilaktyka

CMX001 HCT Profilaktyka, leczenie

AJC246 HCT Profilaktyka

HCT – haematopoetic cell transplant, SOT – solid organ transplant

Ryc. 1 Struktura genomu HCMV [wg 4].

punkty uchwytu chemioterapeutyków

mediatory wnikania

antagoniści odpowiedzi komórkowej

inhibitory NK

receptory cytokin, chemokin

klowir) jest analogiem nukleozydowym i hamuje polimera-zę DNA. Foskarnet – analog pirofosforanowy, jest również inhibitorem polimerazy DNA. Cidofowir jest analogiem nukleotydowym hamującym polimerazę DNA.

W  stosunku do  wszystkich dostępnych leków mogą wyselekcjonować się szczepy oporne  [20, 21]. Najczęściej (90%) występuje mutacja w genie kodującym kinazę wiru-sową UL97, a  rzadziej w  genie kodującym wiruwiru-sową poli-merazę DNA (UL54), co skutkuje opornością na gancyklo-wir. Oporność szczególnie często pojawia się u  pacjentów QPڀQS[FT[D[FQJF
OBS[ʇEØX
%3
8ڀ[BMF˃OPʯDJ
PEڀMPLB-lizacji mutacji w  kodonie, stężenie GCV konieczne do  za-hamowania w 50% replikacji wirusa (ang. half maximal in-hibitory concentration – IC50) może wymagać podawania ponadstandardowych dawek GCV [20].

Dzięki terapiom eksperymentalnym podczas badań kli-nicznych wykrywa się wiele nowych związków [21]. Takim sposobem wykryto CMX001 (lipidową pochodną cidofowi-ru) i AIC246, które hamują późny etap wirusowej replikacji oraz maribawir – inhibitor kinazy UL97 (cechuje się niską toksycznością). Pełen wykaz leków stosowanych w zakaże-niu CMV został przedstawiony w Tabeli 3.

Wiele licencjonowanych leków w  badaniach in vitro wy-kazuje aktywność w stosunku do CMV, np. leflunomid (do-puszczony przez FDA (ang. Food and Drug Administration – Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków) do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów), immatinib inhibitor ki-nazy tyrozyny (stosowany w przewlekłej białaczce). Lefluno-mid stosowano w szczególnych przypadkach zakażenia CMV, ale jest toksyczny zarówno w monoterapii, jak i terapii skoja-rzonej. Natomiast imatinib nie wykazał aktywności in vivo.

Z  uwagi na  znaczną toksyczność większości chemiote-rapeutyków, brak możliwości stosowania u  kobiet ciężar-nych oraz selekcję mutantów oporciężar-nych, badane są  właści-wości przeciwwirusowe związków pochodzenia roślinnego. W  badaniach in vitro wykazano hamujący wpływ flawo-noidów na  replikację CMV  [22]. Jeśli wyniki te potwier-dzą badania in vivo, związki te mogą być alternatywą dla chemioterapeutyków.

Profilaktyka swoista

Najlepszym sposobem profilaktyki czynnej są szczepienia ochronne. Próby uzyskania szczepionki anty CMV sięgają lat siedemdziesiątych XX wieku  [5]. Pierwszą szczepionką testowaną na  ludziach była szczepionka AD 169, w  której szczep wirusa wyizolowany z  ludzkiej tkanki adenoidalnej pasażowano 54 razy w hodowli ludzkich fibroblastów. Jed-nak odpowiedź immunologiczna była krótkotrwała. Prowa-dzono również badania z  zastosowaniem szczepów CMV Towne, Toledo oraz Towne/Toledo.

jednostkowe (glikoproteina B z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem lub adiuwantem MF59)  [23]. Badane są  tak-że szczepionki zawierające antygen pp65. W  podobnym kierunku zmierzają badania szczepionki DNA trójwalent-nej – gB/pp65/IE1 i  biwalenttrójwalent-nej – gB/pp65. Prowadzone są  także badania nad alternatywnymi strategiami ekspresji genów przy użyciu wektorów (rekombinowany adenowi-rus, transgeniczne rośliny)  [24]. W  badaniach przedkli-nicznych (na modelach zwierzęcych) badane są kompleksy gM/gN oraz gH/gL/G0, a  także szczepionki plazmidowe i peptydowe.

W  profilaktyce zakażeń CMV stosowana jest również specyficzna immunoglobulina (CMVIG), która wpływa na przeżycie pacjentów, redukcję zapadalności na cytome-galowirus i śmiertelności z nim związanej [19].

Konflikt interesów: nie zgłoszono.

Piśmiennictwo

1. Goodrum F, Caviness K, Zagallo P. Human cytomegalovirus persistence. Cell Microbiol 2012;14(5):644–655.

2. Davison AJ, Dolan A, Akter P et al. The human cytomegalovirus genome revisited: comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J Gen Virol 2003;84(1):17–28.

3. Shikhagaie M, Mercé-Maldonado E, Isern E et al. The human cytomegalo-virus-specific UL1 gene encodes a late-phase glycoprotein incorporated in the virion envelope. J Virol 2012;86(8):4091–4101.

4. Boeckh M, Geballe AP. Cytomegalovirus: pathogen, paradigm, and puz-zle. J Clin Invest 2011;121(5):1673–1680.

5. Tomtishen JP. Human cytomegalovirus tegument proteins (pp65, pp71, pp150, pp28). Virol J 2012;9:22–28.

6. Wald A, Corey L. Persistence in the population: epidemiology, transmis-sion. In: Arvin A, Campadelli-Fiume G, Mocarski E et al. (eds). Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Cambridge University Press, Cambridge, 2007, p. 44.

7. Durlik M. Zakażenie wirusem cytomegalii u biorców przeszczepów na-rządowych. Nefrol Dial Pol 2009;13:157–163.

8. Furmańczyk A, Durlik M. Nawrotowa choroba CMV o  ciężkim przebie-gu u  pacjenta po  przeszczepie nerki – opis przypadku. Forum Nefrol 2010;3(3):169–173.

9. Limaye AP, Boeckh M. CMV in critically ill patients: pathogen or bystan-der? Rev Med Virol 2010;20(6):372–379.

10. Cook CH, Trgovcich J. Cytomegalovirus reactivation in critically ill immu-nocompetent hosts: a  decade of progress and remaining challenges. Antiviral Res 2011;90(3):151–159.

11. Melnick M, Sedghizadeh PP, Allen CM, Jaskoll T. Human cytomegalovirus and mucoepidermoid carcinoma of salivary glands: cell-specific localiza-tion of active viral and oncogenic signaling proteins is confirmatory of a causal relationship. Exp Mol Pathol 2012;92(1):118–125.

12. Correia-Silva JF, Bruna-Romero O, Resende RG et al. Saliva as a  source of HCMV DNA in allogeneic stem cell transplantation patients. Oral Dis 2010;16(2):210–216.

13. Gerna G, Lilleri D, Chiesa A et al. Virologic and immunologic monitoring of cytomegalovirus to  guide preemptive therapy in solid-organ trans-plantation. Am J Transplant 2011;11(11):2463–2471.

14. Hammond SP, Martin ST, Roberts K et al. Cytomegalovirus disease in lung transplantation: impact of recipient seropositivity and duration of anti-viral prophylaxis. Transpl Infect Dis 2012; doi:10.1111/tid.12036  [Epub ahead of print].

state-of-the-art management of cytomegalovirus infection and di-sease following thoracic organ transplantation. Transplant Proc 2011;43(Suppl. 3):S1–S17.

16. Vogel JU, Otte J, Koch F, Gümbel H, Doerr HW, Cinatl J Jr. Role of human cytomegalovirus genotype polymorphisms in AIDS patients with cyto-megalovirus retinitis. Med Microbiol Immunol 2013;202(1):37–47. 17. Boaretti M, Sorrentino A, Zantedeschi C, Forni A, Boschiero L, Fontana R.

Quantification of cytomegalovirus DNA by a fully automated real-time PCR for early diagnosis and monitoring of active viral infection in solid organ transplant recipients. J Clin Virol 2013;56(2):124–128.

18. Haynes RJ, Kline MC, Toman B et al. Standard Reference Material SRM 2366 for Measurement of Human Cytomegalovirus DNA. J Mol Diagn 2013.

Clinical aspects of cytomegalovirus antiviral resistance in solid organ transplant recipients. Clin Infect Dis 2013;56(7):1018–1029.

20. Dęborska-Materkowska D, Durlik M. Leczenie zakażenia wirusem cyto-megalii po transplantacji nerki. Forum Nefrol 2010;3(3):162–168. 21. Lurain NS, Chou S. Antiviral drug resistance of human cytomegalovirus.

Clin Microbiol Rev 2010;23(4):689–712.

22. Cotin S, Calliste CA, Mazeron MC et al. Eight flavonoids and their poten-tial as inhibitors of human cytomegalovirus replication. Antiviral Res 2012;96(2):181–186.

23. Pass RF. Development and evidence for efficacy of CMV glycoprotein B vaccine with MF59 adjuvant. J Clin Virol 2009;46(Suppl. 4):S73–S76. 24. Loomis RJ, Lilja AE, Monroe J et al. Vectored co-delivery of human

cyto-megalovirus gH and gL proteins elicits potent complement-independent neutralizing antibodies. Vaccine 2013;31(6):919–926.