Praca oryginalna Original paper
U ryb, podobnie jak u ssaków, grasica odgrywa istotną rolę w homeostazie ustrojowej jako element sieci neuro-endokrynno-limfatycznej, w której pełni główną rolę w kształtowaniu odporności i rozwoju tolerancji immunologicznej (3, 5, 6, 11, 14). Narząd ten realizuje swoje zadania zarówno przez udział w recyr-kulacji limfocytów, jak i poprzez produkcję hormonów. Hormony wydzielane przez nabłonek grasicy warun-kują różnicowanie się tymocytów z protymocytów, a następnie indukują ich dojrzewanie i selektywne różnicowanie komórek T. Ekstrakty grasicze stanowią grupę związków immunomodulujących, które zdolne są przywrócić odporność komórkową zwierzętom i ludziom w okresie inwolucji grasicy, z defektami lub niedoborami immunologicznymi spowodowanymi czynnikami patogennymi czy chemioterapią (3, 9), a także zwierzętom tymektomowanym (28).
W ostatnich latach w medycynie ludzkiej i wetery-naryjnej znalazł zastosowanie preparat TFX (P.F. Jelfa S. A.) pozyskiwany z grasicy 5-7-tygodniowych cieląt, wykazujący działanie zbliżone do tymozyny frakcji 5 (10). Wskutek odbudowującego wpływu na układy: limfatyczny i krwiotwórczy, wskazania do jego
sto-sowania są wielokierunkowe. W medycynie ludzkiej szczególnie korzystne efekty działania stwierdzono przy wirusowym zapaleniu wątroby, encefalopatiach, w terapii ostrych i chronicznych infekcji, alergiach, chorobach autoimmunologicznych i nowotworowych, a także po chemio- i radioterapii (5, 7, 9, 13, 24, 30). W medycynie weterynaryjnej preparat TFX znajdu-je niewielkie zastosowanie, sporadycznie w terapii chorób o przebiegu przewlekłym i długotrwałej ob-niżonej odporności. Wynika to być może z niedosta-tecznej informacji dotyczącej dawkowania preparatu u poszczególnych gatunków zwierząt i skuteczności leczenia. W związku z tym nadal przewagę mają ba-dania eksperymentalne przeprowadzane na myszach, szczurach, królikach i świniach (15, 16, 19, 20, 21). We wstępnych badaniach nad zastosowaniem TFX u ryb uzyskano pozytywne efekty pobudzenia leu-kocytozy przy działaniu czynników stresogennych (23). Wiadomo, że karpie hodowlane wykazują okre-sy obniżonej odporności spowodowanej działaniem niekorzystnych czynników środowiskowych czy zabiegów manipulacyjnych związanych z częstymi odłowami ryb i transportem ich do nowych stawów.
Wpływ preparatu TFX na aktywność proliferacyjną
limfocytów karpi w badaniach in vivo i in vitro
ANTONINA SOPIŃSKA, ANNA GROCHOŁA
Zakład Chorób Ryb i Biologii, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
Otrzymano 08.10.2015 Zaakceptowano 12.12.2015
Sopińska A., Grochoła A.
Influence of TFX on proliferative activity of carp lymphocytes in vivo and in vitro Summary
The purpose of this experiment was to estimate the most effective doses of TFX, used in injection and in bath, for the stimulation of the activity of lymphocytes in common carp The study was performed on 9-month-old carps obtained after spring catches (in March). The fish were divided into 10 groups. Fish in groups I-IV were given TFX by intramuscular injection at doses of 20, 10, 0.5, and 0.2 mg/fish. Fish in groups VI-IX were bathed for 24, 48, and 96 hours in TFX at concentrations of 200, 100, 50, and 20 mg/l of water. Groups V and X were control. Blood samples were taken immediately after the administration of TFX in bath and after 2, 7, 14, and 28 days in groups I-IV and VIII-IX. The following parameters were determined: the number of leukocytes and lymphocytes in 1 μl of blood, the percentage of ANAE+ and E-rosette-forming cells, and the proliferative activity of lymphocyte cell cultures stimulated with Con A. Results: TFX at doses of 100, 200 mg/l of water and 10, 20 mg/fish administered by injection showed a suppressive effect on the parameters investigated. TFX at doses of 50, 20 mg/l of water and 0.5, 0.2 mg/fish caused an increase in the number of leukocytes and lymphocytes, a higher percentage of ANAE+ cells and rosette-forming cells, as well as a multiple increase in the proliferative activity of lymphocytes stimulated with Con A. The highest values were obtained after the administration of TFX in a 96-hour bath at a concentration of 50 mg/l of water.
Ponadto u karpi od 9. miesiąca życia rozpoczyna się okres inwolucji grasicy (25), a więc okres obniżonej odporności, który w połączeniu ze stresem towarzy-szącym hodowli przyczynia się do wystąpienia u ryb zwiększonej podatności na choroby.
W związku z powyższym, celem badań było okre-ślenie dawki preparatu TFX w najwyższym stopniu stymulującej aktywność proliferacyjną limfocytów karpi 9-miesięcznych, w sezonie wiosennym, do sto-sowania w iniekcji lub w kąpieli.
Materiał i metody
Badania wykonano na 720 karpiach, o masie ciała 90- -100 g, które pochodziły z gospodarstwa rybackiego woj. lubelskiego, pozyskanych w marcu z odłowów wiosennych. Doświadczenie przeprowadzono w dwóch kolejnych latach, w tej samej porze roku. Na podstawie badań klinicznych, parazytologicznych i anatomopatologicznych ryby uznano za zdrowe. Podczas 2-tygodniowego okresu adaptacyjnego ryby przebywały w akwariach 100 l, w zagęszczeniu 1 kg m.c. ryb/100 l wody, z przepływem i sztucznym napowie-trzaniem, w temperaturze wody 11 ± 1°C. Następnie ryby podzielono na 10 grup, w tym 2 grupy kontrolne. Grupy doświadczalne obejmowały po 40 sztuk ryb, grupy kontrol- ne po 20 sztuk. Rybom grup I, II, III i IV podano preparat TFX w iniekcji domięśniowej, odpowiednio, w dawkach: 20, 10, 0,5 i 0,2 mg/sztukę, rybom grupy V (kontrolnej) podano w iniekcji domięśniowej PBS. Rybom grup VI, VII, VIII i IX podano preparat TFX w kąpieli, odpowiednio, w stężeniach: 200, 100, 50 i 20 mg/l wody, trwającej 24, 48 i 96 godzin. Ryby grupy X (kontrolnej) przetrzymywano w wodzie, do której nie dodano preparatu TFX.
Krew do badań pobierano z żyły ogonowej, każdorazo-wo od 6 ryb. W grupach: I, II, III i IV materiał do badań pobierano po 2, 7, 14 i 28 dniach od podania preparatu TFX w iniekcji domięśniowej, natomiast w grupach: VI, VII, VIII i IX krew do badań pobierano bezpośrednio po zakończeniu kąpieli oraz w grupach: VIII i IX po 2, 7, 14 i 28 dniach od zakończenia kąpieli trwającej 96 godzin. Materiał od ryb grup kontrolnych (V i X) pobierano po 7 i 14 dniach od rozpoczęcia doświadczenia. U wszyst-kich ryb, zarówno po zastosowaniu TFX w iniekcji, jak i w kąpieli oraz u ryb grup kontrolnych badano liczbę leukocytów (WBC) i limfocytów w 1 µl krwi obwodowej, procentową zawartość limfocytów ANAE+ i tworzących rozetki E. Ponadto, u ryb przynależnych do grup III i X badano aktywność proliferacyjną limfocytów na mitogen Con A w hodowli komórkowej. Oznaczanie bezwzględnej liczby leukocytów i limfocytów w 1 µl krwi wykonano metodami ogólnie przyjętymi w hematologii ryb (12). Ocenę procentowej zawartości limfocytów ANAE+ wśród limfocytów izolowanych z krwi wykonywano przy użyciu metody Muellera (18), która pozwala barwieniem cyto-chemicznym wykryć w błonie komórkowej limfocytów T obecność α-naftyloesterazy (ANAE+). Ocenę zdolności limfocytów T do wiązania erytrocytów barana i tworzenia figur określanych jako rozety wykonano testem rozeto-wym E (22). Wyniki obu testów podano jako średnią z 4 równoległych prób. W badaniach in vivo aktywność prolife-racyjną limfocytów krwi karpi oceniano metodą nieswoistej
transformacji blastycznej opartej na pomiarze inkorporacji radioaktywnie znakowanego prekursora kwasów nukleino-wych H3-tymidyny. Do badań użyto limfocytów w stężeniu
2 × 106 w 1 ml podłoża. Mikrohodowle o objętości 0,2 ml
prowadzono w plastikowych mikropłytkach o okrągłym dnie (Sterilin, England) w podłożu Eagle’a z dodatkiem 10% surowicy cielęcej i antybiotyków, w obecności mito-genu konkanawaliny (Con A, 50 µg/ml; Sigma Aldrich). Próbę kontrolną stanowiła hodowla limfocytów bez obec-ności mitogenu. Po 48-godzinnej inkubacji dodano 20 µl H3-tymidyny (UVVVR Czechy) o aktywności 0,5 µCi. Po
24 godzinach komórki były izolowane, a następnie doko-nano pomiaru stopnia wbudowania znakowanej tymidyny w DNA transformujących limfocytów przy użyciu licznika scyntylacyjnego Beckmana (LS 5000 TD, Beckman). Bada-nia wykonano trzykrotnie. Wyniki przedstawiono w postaci indeksu stymulacji (SI), który obliczono z proporcji:
cpm w hodowli stymulowanej mitogenem SI = cpm w hodowli niestymulowanej mitogenem Uzyskane wyniki liczbowe badań immunologicznych poddano analizie statystycznej w zakresie średniej arytme-tycznej, odchylenia standardowego oraz istotności różnic na poziomie p ≤ 0,05 przy pomocy testu t-Studenta.
Wyniki i omówienie
Wyniki badań nad wpływem TFX na limfocyty kar-pi przedstawiono w tabelach 1-3. Uzyskane wartości dotyczące leukocytów i limfocytów krwi obwodowej karpi wskazują na wyraźny wpływ badanego preparatu na ich liczbę. Wykazana zmienność tych parametrów jest zależna od wielkości dawki preparatu i sposobu po-dania karpiom. U ryb grupy I po podaniu najwyższego stężenia leku – 20 mg/sztukę, stwierdzono statystycz-nie niższe wartości wszystkich badanych wskaźników immunologicznych w porównaniu z grupą kontrolną (tab. 1). Leukopenia i limfopenia utrzymywały się do końca doświadczenia. U ryb grupy II stwierdzono również działanie supresyjne leku w stosunku do leukocytów i limfocytów karpi. Statystycznie istotnie niższe wartości utrzymywały się na ogół podczas ca-łego doświadczenia, jedynie uzyskane wartości liczby leukocytów w 14. i 28. dniu badania były nieco niższe od grupy kontrolnej, ale bez statystycznie istotnych różnic (tab. 1). U ryb grupy III, którym podano niższą dawkę preparatu TFX – 0,5 mg/sztukę, obserwowano wyraźną leukocytozę i limfocytozę w 7. i 14. dniu badania, uzyskane wartości były statystycznie istotnie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną. W pozosta-łych terminach badania nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w obu badanych parametrach. U ryb grupy IV (0,2 mg/sztukę) przez cały okres doświad-czenia obserwowano statystycznie istotne wyższe wartości liczby leukocytów i limfocytów w 1 µl krwi obwodowej. Spośród badanych dawek najsilniejszy wpływ na limfopoezę wykazała dawka 0,2 mg/sztukę w iniekcji domięśniowej (tab. 1). Używając techniki barwienia enzymatycznego i techniki rozetowej wyka-zano, że preparat TFX w dawkach 0,5 i 0,2 mg/sztukę
wykazał istotny wzrost odsetka komórek ANAE+ i tworzących rozetki E w porównaniu z grupą kontrol- ną. Najwyższe wartości wystąpiły w grupie IV w 2. i 7. dniu doświadczenia (tab. 1). Aktywność proliferacyj-ną limfocytów T, wyrażoproliferacyj-ną wzrostem reaktywności na mitogen Con A wykazano w teście transformacji blastycznej. Wartości indeksu stymulacyjnego w obu grupach (III i IV) były statystycznie istotnie wyższe po 2, 7 i 14 dniach w porównaniu z grupą kontrolną, natomiast po 28 dniach były zbliżone do grupy kon-trolnej. Najwyższe wartości wystąpiły w grupie IV po 2 i 7 dniach od podania preparatu TFX w iniekcji domięśniowej (tab. 1).
Wyniki badań immunologicznych nad wpływem preparatu TFX podanego karpiom w kąpieli przed-stawiano w tab. 2 i 3. U ryb grupy VI, bezpośrednio po zakończeniu kąpieli trwającej: 24, 48 i 96 godzin, stwierdzono statystycznie istotnie niższe wartości liczby leukocytów i limfocytów w krwi obwodowej w porównaniu z grupą kontrolną (tab. 2). U ryb grupy
VII statystycznie istotnie niższe wartości tych para-metrów wystąpiły dopiero po 96-godzinnej kąpieli (tab. 2). U ryb grupy VIII i IX wykazano statystycznie istotnie wyższe wartości obu parametrów we wszyst-kich czasach badania, które wzrastały wraz z wydłu-żającym się czasem kąpieli, najwyższe stwierdzono po 96 godzinach działania leku w stężeniu 50 mg/l wody (tab. 2). Podobnie kształtowały się wyniki dotyczące odsetka limfocytów ANAE+ i tworzących rozetki E (tab. 2). Nasilone zjawisko pozytywnego wybarwia-nia się komórek α-naftyloesterazą i tworzewybarwia-nia rozet E wystąpiło po 96-godzinnej kąpieli (tab. 2).
Wyniki testu transformacji blastycznej w postaci indeksu stymulacji (SI) wskazują na brak odpowiedzi limfocytów T na działanie mitogenu Con A po kąpieli ryb w stężeniach 100 i 200 mg/l wody i podwyższoną reaktywność na mitogen Con A po kąpieli ryb w stęże-niach 50 i 20 mg/l wody. Szczególnie wysokie wartości indeksu stymulacyjnego uzyskano po 96-godzinnej kąpieli w stężeniu 50 mg/l wody (tab. 2).
Tab. 1. Efekt immunomodulacyjny preparatu TFX podanego karpiom w iniekcji domięśniowej (x ± SD)
Grupy ryb mg/100 g m.c.TFX Termin badania (dni) × 10WBC 3 µl–1 Limfocyty × 103 µl–1 ANAE+ (%) Rozetki E (%) Indeks stymulacji (SI)
I 20 2 7 14 28 20,4* ± 1,2 22,8* ± 1,4 22,5* ± 1,6 28,6* ± 1,1 16,7* ± 1,3 18,2* ± 1,5 18,4* ± 0,9 20,6* ± 1,2 24,5* ± 2,4 24,4* ± 3,5 26,2* ± 1,7 28,4* ± 1,2 1,8* ± 0,1 2,1* ± 0,2 2,2* ± 0,1 2,3* ± 0,3 – – – – II 10 2 7 14 28 28,7* ± 1,6 30,4* ± 1,8 34,6 ± 2,3 36,5 ± 1,4 25,5* ± 1,1 22,4* ± 1,2 21,5* ± 2,6 20,7* ± 1,7 33,2* ± 2,4 32,5* ± 2,1 33,2* ± 1,6 38,4* ± 1,7 2,3* ± 0,1 2,5* ± 0,5 2,7* ± 0,2 2,2* ± 0,2 – – – – III 0,5 2 7 14 28 40,7 ± 4,3 47,8* ± 2,6 52,4* ± 2,8 42,5 ± 2,4 36,7 ± 1,4 45,2* ± 2,3 48,8* ± 2,6 37,6 ± 0,8 67,5* ± 3,6 68,4* ± 2,7 59,3* ± 1,1 53,3* ± 1,4 9,3* ± 1,2 8,6* ± 0,8 6,5* ± 0,7 5,4* ± 0,5 9,5* ± 0,6 8,6* ± 0,4 6,8* ± 0,7 4,2 ± 0,6 IV 0,2 2 7 14 28 54,5* ± 3,1 60,5* ± 2,4 59,7* ± 1,8 45,0* ± 1,7 39,5* ± 2,8 56,8* ± 2,2 52,7* ± 2,4 40,8* ± 2,6 74,1* ± 3,2 75,3* ± 2,6 67,8* ± 4,8 60,2* ± 3,3 22,8* ± 1,2 24,6* ± 1,8 12,5* ± 1,5 14,2* ± 2,4 14,6* ± 1,4 12,4* ± 1,6 5,7* ± 1,2 4,6 ± 0,8 V kontrola – 38,5 ± 2,6 33,5 ± 2,4 42,6 ± 3,2 3,5 ± 0,8 3,8 ± 0,4
Objaśnienie: * – różnice statystycznie istotne (p ≤ 0,05)
Tab. 2. Efekt immunomodulacyjny preparatu TFX podanego karpiom w kąpieli trwającej 24, 48 i 96 godzin (bezpośrednio po zakończeniu kąpieli) (x ± SD)
Grupy ryb mg/1 lTFX kąpieli (godz.)Czas trwania × 10WBC 3 µl–1 Limfocyty × 103 µl–1 ANAE+ (%) Rozetki E (%) Indeks stymulacjiCon A
VI 200 24 48 96 30,2* ± 2,3 28,2* ± 2,1 22,8* ± 1,8 28,9* ± 1,1 17,7* ± 2,6 16,6* ± 2,2 26,8* ± 3,1 22,7* ± 3,6 22,3* ± 3,2 2,2* ± 0,1 1,8* ± 0,1 1,5* ± 0,1 3,3 ± 0,4 1,2* ± 0,1 1,4* ± 0,2 VII 100 24 48 96 38,6 ± 2,1 38,2 ± 2,4 26,8* ± 2,6 33,6 ± 2,6 32,4 ± 4,4 20,5* ± 2,3 48,7* ± 1,2 42,7* ± 3,2 42,2* ± 3,6 3,8 ± 1,4 3,3 ± 1,6 2,4* ± 1,5 4,20 ± 0,4 3,80 ± 0,2 3,40 ± 0,3 VIII 50 24 48 96 58,5* ± 2,4 64,7* ± 2,2 66,5* ± 2,6 50,4* ± 2,6 61,0* ± 2,8 63,5* ± 2,8 75,2* ± 3,4 77,3* ± 2,4 78,4* ± 3,8 16,3* ± 4,1 38,7* ± 2,2 45,2* ± 3,1 9,90* ± 0,2 15,45* ± 0,2 18,20* ± 0,4 IX 20 24 48 96 52,4* ± 2,3 59,7* ± 1,7 60,2* ± 3,1 40,2* ± 2,6 44,8* ± 1,7 52,5* ± 2,2 50,2* ± 3,1 65,7* ± 4,3 70,8* ± 2,8 18,4* ± 0,6 35,2* ± 2,1 40,2* ± 3,1 7,50* ± 0,4 8,20* ± 0,2 10,60* ± 0,3 X kontrola – 40,5 ± 2,6 36,5 ± 2,6 42,6 ± 3,2 3,5 ± 0,6 3,80 ± 0,4
Wyniki badań nad czasem utrzymywania się wzmo-żonej reaktywności limfocytów po 96-godzinnej ką-pieli w stężeniach 50 i 20 mg/l wody przedstawiono w tab. 3. Po zastosowaniu kąpieli w stężeniu 50 mg TFX/l wody wykazano statystycznie istotny wzrost wartości wszystkich badanych parametrów w okresie całego doświadczenia. U ryb grupy IX po zastosowaniu kąpieli w roztworze zawierającym 20 mg TFX na litr wody obserwowano po 14 dniach od jej zakończenia powrót do normy liczby leukocytów i limfocytów, zaś pozostałe parametry dotyczące limfocytów T (rozetki E, limfocyty ANAE+ i indeks stymulacji) utrzymywały się na statystycznie istotnie wyższym poziomie w po-równaniu z grupą kontrolną do końca doświadczenia (tab. 3).
Badania nad wpływem ekstraktów grasiczych na-turalnych i sztucznych, w tym preparatu TFX (P.F. Jelfa S. A.) na organizmy ludzi i zwierząt, od wielu lat są przedmiotem badań i przynoszą coraz więcej danych z zakresu ich immunomodulującego działania. Wykazano, że zarówno peptydy, jak i składniki lipi-dowe ekstraktów, zwłaszcza gangliozydy pobudzają elementy składowe nieswoistych mechanizmów od-pornościowych. W ostatnich latach stwierdzono, że preparaty grasicze mają wpływ nie tylko na zwiększoną proliferację limfocytów, ale także na wzrost produkcji cytokin, tj.: IL-2, IFN-γ i TNF-α (2, 3, 17). Autorzy wielu badań zwracają uwagę na zależność aktywności biologicznej wyciągów grasiczych od ich składu che-micznego. Wyniki Beplera (1) i Frasca (8) wskazują, że tymozyna 1 przywraca prawidłowe funkcje limfocytom T przez zwiększoną produkcję IL-2 i ekspresję recepto-rów IL-2R na komórkach stymulowanych mitogenem zarówno u ludzi, jak i myszy. Cillari i inni (2) wskazują, że tymopoetyna zwiększa wytwarzanie cytokin przez komórki Th-1 (IL-2, TNF-α i IFN-γ) i hamuje Th-2 (IL-3, IL-4, IL-10), co ma korzystne działanie u pa-cjentów w przebiegu sepsy i przewlekłego zapalenia wątroby. Zatz i Goldstein (29) stwierdzili, że tymo-zyna 5 (frakcja 5) powodowała dwu- lub trzykrotne wzmocnienie odpowiedzi proliferacyjnej i wzrost pro-dukcji cytokin IL-2 mysich tymocytów. Obserwowano również siedmiokrotny wzrost czynnika stymulującego hodowlę limfocytów CSF. Niektórzy autorzy zwracają uwagę na lepsze efekty aktywacji limfocytów
wystę-pujących w badaniach in vivo niż in vitro, w których to zachowany jest pełny ciąg sygnalizacji międzykomór-kowej w układzie immunologicznym, w którym odpo-wiedź proliferacyjna limfocytów T zależy od komórek APC, a rozprzestrzenianie się klonów komórek T jest konsekwencją wytwarzania IL-2 i ekspresji recep-torów IL-2R (26, 27). W związku z tym wydaje się, że wyniki badań własnych wykonane in vivo w pełni przedstawiają efekt reakcji zachodzących w organi-zmie karpi. Obserwowany wpływ preparatu TFX na odporność komórkową był zróżnicowany w zależności od podawanych dawek preparatu TFX: stymulował aktywność biologiczną w niższych stężeniach, nato-miast hamował przy wyższych. Oba zjawiska były stosunkowo stabilne w niezależnych doświadczeniach wykonanych w dwu kolejnych latach. Mechanizmy immunosupresyjne preparatu nie są dokładnie poznane, pomimo że w piśmiennictwie znajdują się na ten temat informacje. W badaniach in vitro i in vivo stwierdzono hamujący wpływ tymozyny 5 w wysokich dawkach na poziom IL-2 oraz proliferację limfocytów T w ho-dowli stymulowanej mitogenem Con A (11). Čolić E. i wsp. (4) wykazali działanie supresyjne na proliferację limfocytów T wysokich stężeń ekstraktów czosnku, działanie to korelowało z niższym poziomem cytoki-ny IL-2. W badaniach włascytoki-nych po podaniu karpiom preparatu TFX w iniekcji domięśniowej, w dawkach 20 i 10 mg, a także w kąpieli w stężeniach 100 i 200 mg/l wody również uzyskano efekt immunosupresyjny. Przedstawione w badaniach własnych dane sugerują, że TFX podany rybom w odpowiednio dobranych daw-kach, zarówno domięśniowo, jak i w kąpieli wzmaga siły obronne ustroju szczególnie w okresach obniżonej odporności związanej z inwolucją grasicy i znacznym obniżeniem metabolizmu, wczesną wiosną po zimo-waniu. Preparat TFX podany karpiom w dawkach: 0,2 i 0,5 mg w iniekcji domięśniowej oraz 50 i 20 mg/l wody w kąpieli wykazał działanie stymulujące, przywrócił obniżoną aktywność immunologiczną, a nawet w zależności od dawki spotęgował wartości badanych parametrów ponad normę. W badaniach in vivo stwierdzono wpływ leku na znaczny wzrost pro-liferacyjny tkanki limfatycznej, nasilenie tworzenia rozet E i wzrost procentowego udziału limfocytów ANAE+ w ogólnej populacji limfocytów, w badaniach
Tab. 3. Efekt immunomodulacyjny preparatu TFX podanego karpiom w 96-godzinnej kąpieli (x ± SD)
Grupy ryb mg/1 lTFX Dni po zakończeniu kąpieli × 10WBC 3 µl–1 Limfocyty × 103 µl–1 ANAE+ (%) Rozetki E (%) Indeks stymulacji (SI)
VIII 50 2 7 14 28 68,5* ± 2,6 78,3* ± 2,1 68,7* ± 2,5 58,2* ± 3,1 65,5* ± 2,8 71,3* ± 1,8 65,2* ± 2,1 54,6* ± 1,9 70,8* ± 2,8 69,2* ± 3,1 65,2* ± 2,8 62,2* ± 4,3 45,2* ± 4,1 24,7* ± 1,1 18,2* ± 2,9 16,6* ± 2,6 15,6* ± 0,1 8,4* ± 0,2 9,6* ± 0,5 8,2* ± 0,6 IX 20 2 7 14 28 50,2* ± 2,7 49,7* ± 2,2 42,7 ± 2,5 41,5 ± 3,1 46,5* ± 2,2 42,5* ± 2,1 35,2 ± 2,5 38,5 ± 2,6 78,4* ± 3,5 62,4* ± 3,4 55,4* ± 2,7 52,2* ± 3,2 42,2* ± 3,1 32,3* ± 3,2 16,3* ± 3,1 12,2* ± 2,6 12,6* ± 0,3 10,3* ± 0,2 8,7* ± 0,1 5,7* ± 0,2 X kontrola – 40,5 ± 2,6 36,5 ± 2,6 42,6 ± 3,2 3,5 ± 0,6 3,8 ± 0,4
in vitro obserwowano kilkakrotny wzrost aktywności proliferacyjnej limfocytów T stymulowanych Con A.
Uzyskane dane ilościowe i jakościowe dotyczące limfocytów karpi wskazują, że najsilniejszy efekt proliferacyjny komórek wystąpił po zastosowaniu TFX w kąpieli w stężeniu 50 mg/l trwającej 96 godzin. Wynik ten ma duże znaczenie aplikacyjne, gdyż w przypadku ryb jest znacznie wygodniejszy w wy-konaniu niż podanie preparatu w iniekcji, której kilkakrotne wykonanie w warunkach hodowlanych nie jest możliwe. Ponadto, w porównaniu do immu-nostymulacji dokonanej przez iniekcję domięśniową, stymulację poprzez kąpiel można wydłużać, a tym samym spowodować nie tylko uzyskanie wyższych wartości badanych parametrów w dłuższym czasie po wykonaniu zabiegu.
Powyższe wyniki zachęcają do kontynuowania ba-dań i określenia efektu działania preparatu TFX poda-nego rybom w karmie. Forma ta ma największe zasto-sowanie w hodowli ryb, pomija niekorzystne działanie stresu manipulacyjnego, sprawdza się w praktyce przy stosowaniu chemioterapeutyków, a także eksperymen-talnie w immunoprofilaktyce.
Piśmiennictwo
1. Bepler G.: Thymosin alpha-1 as adjunct for conventional therapy of malignant tumors: a review. Cancer Invest. 1994, 12, 491-496.
2. Cillari E., Milano S., Perego R., Gromo G., D’Agostino R., Arcoleo F., Dieli M.: Modulation of IL-2, IFN-gamma, TNF-alpha and IL-4 production in mice of different ages by thymopentin. Int. J. Immunopharmacol. 1992, 14, 1029-1035. 3. Čolić M., Popović R., Mrdaković D., Radeta M., Novaković J., Pavlović B.,
Vučević D.: Evaluation of the Immunomodulatory Properties of a Calf Lipid Thymus Extract and Standardization of a Method for Quantification of its Biological Activity. Am. J. Immunol. 2008, 3, 35-44.
4. Čolić M., Vučević D., Kilibarda V., Radičević N., Savić M.: Modulatory effects of garlic extracts on proliferation of T-lymphocytes in vitro stimulated with concanavalin A. Phytomed. 2002, 9, 117-124.
5. Cordero O. J., Pineiro A., Nogueira M.: Thymic peptides and preparations: an update. Arch. Immunol. Ther. Exp. 1999, 47, 77-82.
6. Dardenne M., Savino W.: Control of thymus physiology by peptidic hormones and neuropeptides. Immunol. Today 1994, 15, 518-523.
7. Dąbrowski M. P., Dąbrowska-Bernstein B. K., Brzosko W. J.: Teoretyczne i praktyczne przesłanki substytujące funkcje grasicy. Pol. Tyg. Lek. 1983, 13, 385-387.
8. Frasca D., Adorini L., Mancini C., Doria G.: Reconstitution of T cell functions in aging mice by thymosin alpha 1. Immunopharmacol. 1986, 11, 155-163. 9. Garaci E., Pica F., Rasi G., Favalli C.: Thymosin alpha 1 in the treatment of
cancer: from basic research to clinical application. Int. J. Immunopharmacol. 2000, 22, 1067-1076.
10. Giełdanowski J.: Immunostymulacja farmakologiczna i jej znaczenie w bada-niach podstawowych i lecznictwie, [w:] Immunoterapia. Wszechnica Polskiej Akademii Nauk, Wrocław 1984.
11. Grinblat J., Schauenstein K., Saltz E., Trainin N., Globerson A.: Regulatory effects of thymus humoral factor on T cell growth factor in aging mice. Mech. Ageing. Dev. 1983, 22, 209-218.
12. Hesser E. F.: Methods for Routine Fish Hematology. The Prog. Fish. Cult. 1960, 22, 164-171.
13. Jabłonowska E., Tchórzewski H., Banasik M., Kuydowicz J.: The effect of Roferon A and TFX on the selected subpopulations of the peripheral blood lymphocytes in patients with chronic hepatitis C. Centr. Eur. J. Immunol. 2007, 32, 119-123.
14. Kouttab N. M., Goldstein A. L., Lu M., Lu L., Campbell B., Maizel A. L.: Production of human B and T cell growth factors is enhanced by thymic hormones. Immunopharmacol. 1988, 16, 97-105.
15. Krakowski L., Krzyżanowski J., Wrona Z., Kostro K., Siwicki A. K.: The influ-ence of nonspecific immunostimulation of pregnant sows on the immunological value of colostrum. Vet. Immunol. Immunopathol. 2002, 87, 89-95.
16. Marciniak A., Szpringer E., Lutnicki K., Bełtowski J.: Influence of thymus extract (TFX) on lipid peroxidation in the plasma of rats following thermal injury. Bull. Vet. Instit. Pulawy 2003, 47, 231-238.
17. Meroni P. L., Barcellini W., Frasca D., Sguotti C., Borghi M. O., De Bartolo G., Doria G., Zanussi C.: In vivo immunopotentiating activity of thymopentin in aging humans: increase of IL-2 production. Clin. Immunol. Immunopathol. 1987, 42, 151-159.
18. Mueller J., Brun del Re G., Buerki H., Keller H. U., Hess M. W., Cottier H.: Nonspecific acid esterase activity: a criterion for differentiation of T and B lymphocytes in mouse lymph nodes. Eur. J. Immunol. 1975, 5, 270-274. 19. Obmińska-Domoradzka B., Szczypka M., Debowy J.: Effects of thymomimetic
drugs and zinc supplementation on the cellular immune response in hydrocor-tisone-suppressed mice. J. Vet. Med. 2002, 49, 469-475.
20. Ossowicka-Stępińska J., Engel-Pietrzak K., Ronin-Walknowska E.: Therapeutic application of TFX and Ubiquitin complex in pregnant rabbits with antiphos-pholipid syndrome. Int. J. Thymol. 1999, 7, 596-600.
21. Piekarska J.: Influence of selected immunotrophic compounds on T (CD4+, CD8+) and B-lymphocytes during the course of experimental trichinellosis in mice. Med. Weter. 2003, 59, 339-343.
22. Sopińska A.: Odpowiedź immunologiczna limfocytów karpi na podstawie antygenu glikopeptydowego erytrocytów owcy. Med. Weter. 1986, 42, 230- -232.
23. Sopińska A., Guz L.: Immunostymulujące działanie lewamizolu i preparatu TFX-Polfa u karpi w warunkach eksperymentalnych. Med. Weter. 1993, 49, 547-550.
24. Stasiak-Barmuta A., Puchnarewicz A., Piotrowska T., Hofman J.: Nonatopic bronchial asthma with pleuropneumonia treated with antiiflammatory and antiallergenic drugs concomitantly with immunoreconstructive therapy of TFX. Pediatria Polska 1998, 73, 961-964.
25. Stosik M., Deptuła W.: Immunologia ryb. Wydawnictwo Naukowe Uniwersy- tetu Szczecińskiego, Szczecin 2001.
26. Tarang S., Sodhi A.: Expression of Toll-like Receptors (TLRs) and Nucleotide-binding Oligomerization Domain (NODs) in murine peritoneal macrophages on in vitro treatment with Thymosin α 1. Am. J. Immunol. 2007, 3, 15-24. 27. Tzehoval E., Sztein M. B., Goldstein A. L.: Thymosins alpha 1 and beta 4
po-tentiate the antigen-presenting capacity of macrophages. Immunopharmacol. 1989, 18, 107-113.
28. Umiel T., Pecht M., Trainin N.: THF, a thymic hormone, promotes interleukin-2 production in intact and thymus-deprived mice. J. Biol. Response Mod. 1984, 3, 423-434.
29. Zatz M. M., Goldstein A. L.: Mechanism of action of thymosin.I. Thymosin fraction 5 increases lymphokine production by mature murine T cells respond-ing in a mixed lymphocyte reaction. J. Immunol. 1985, 134, 1032-1038. 30. Zimecki M., Artym J., Kocięba M., Kuryszko J., Kaleta-Kuratewicz K., Marycz K.:
Calf thymus extract attenuates severity of experimental encephalomyelitis in Lewis rats. Folia Neuropathol. 2010, 48, 246-257.
Adres autora: prof. dr hab. Antonina Sopińska, Akademicka 12, 20-033 Lublin, Poland; e-mail: antonina.sopinska@up.lublin.pl
