Zastosowanie markerów DNA do badań odmian składników mieszańcowych rzepaku.

Katarzyna Mikołajczyk, Marcin Matuszczak, Teresa Piętka Iwona Bartkowiak-Broda, Jan Krzymański

Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Roślin Oleistych w Poznaniu

Zastosowanie markerów DNA do badań

odmian składników mieszańcowych rzepaku

Use of DNA markers in the study of components winter rapeseed

hybrid varieties

mieszańcowych rzepaku posiadających cechę cytoplazmatycznej męskiej niepłodności (CMS) typu ogura oraz gen restorer. Wyizolowano genomowy DNA z liści, siewek oraz pojedyn-czych liścieni rzepaku. Określano obecność sekwencji nukleotydowej skorelowanej z CMS

ogura w mitochondrialnym DNA za pomocą

markera typu SCAR. Rośliny posiadające gen restorer identyfikowano przy pomocy startera RAPD.

A method of characterizing winter rapeseed hybrid plants containing cytoplasmic male sterility ogura trait and restorer gene was implemented. Genomic DNA from rapeseed leaves, seedlings and single cotyledons was isolated. Mitochondrial DNA regions correlated with ogura CMS were determined with the use of specific SCAR primers. Plants with restorer gene were identified using RAPD primer.

Wstęp

Markery DNA znajdują coraz szersze zastosowanie w programach hodowlanych (Krzymański 1997). Selekcja przy użyciu markerów (ang. MAS — marker assisted selection) dokonywana jest w oparciu o sprzężenie pomiędzy markerem a locus odpowiedzialnym za dziedziczenie danej cechy (Ribaut i in. 1997). Metody oparte na analizach DNA umożliwiają bezpośrednie określenie genotypu na próbkach, które mogą być pobrane z różnych części roślin znajdują-cych się w różnych fazach rozwojowych, z pominięciem zmienności niedzie-dzicznej (Krzymański 1997). Dlatego markery DNA stanowią dogodne narzędzie selekcji i znajdują coraz szersze zastosowanie (Tanksley i in. 1989). Można wyróżnić dwie zasadnicze grupy markerów DNA; typu RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism — polimorfizm fragmentów restrykcyjnych) oraz uzyskane wskutek amplifikacji specyficznych rejonów DNA z zastosowaniem łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. PCR — polymerase chain reaction) (Wolko 1997). Do drugiej grupy należą, między innymi, markery typu RAPD (ang. random

amplified polymorphic DNA), uzyskane w wyniku amplifikacji DNA z zasto-sowaniem pojedynczego startera, oraz markery typu SCAR (ang. sequence characterized amplified regions) — uzyskane wskutek amplifikacji DNA z uży-ciem dwu specyficznych starterów (Williams i in. 1990; Kesseli i in. 1992). Obie metody są stosunkowo proste; nie wymagają skomplikowanej aparatury i są możliwe do wykonania w stacjach hodowlanych, wyposażonych w termocykler i aparaty do elektroforezy na żelach agarozowych.

Różnego rodzaju markery DNA znalazły zastosowanie do: — identyfikacji oraz określenia pochodzenia odmian hodowlanych,

— charakteryzowania i selekcji cech użytkowych w programach hodowlanych, — badania wielkości rejonów DNA wprowadzanych podczas krzyżowania

odmian,

— konstruowania map genetycznych,

— badania filogenetycznego pokrewieństwa gatunków (Haley i in. 1994; Young 1994).

W programach hodowlanych rzepaku również są stosowane markery DNA. Prowadzone są prace mające na celu znalezienie istotnych dla selekcji markerów cech użytkowych, jak również skonstruowanie map genetycznych w oparciu o różnego typu markery DNA (Bartkowiak-Broda 1997). Wykryto markery karłowatości rzepaku (Foisset i in. 1995), cytoplazmatycznej męskiej sterylności (CMS) typu ogura (Krishnasamy 1993), genu restorera dla CMS ogura (Delourme i in. 1994), genu restorera dla CMS polima (Jean i in. 1997), markery sprzężone z niską zawartością kwasu linolenowego (Jourdren i in. 1996a), z odpornością na

L. maculans (Chèvre i in. 1997) oraz z genami kontrolującymi zawartość kwasu

erukowego (Jourdren i in. 1996b) i glukozynolanów (Uzunowa i in. 1995).

Ważnym problemem badawczym jest charakterystyka za pomocą markerów DNA polskich odmian hodowlanych rzepaku i jej zastosowanie w selekcji, a także wykorzystanie do identyfikacji odmian. W ramach rozpoczęcia prac w tym zakresie opracowano metodę izolacji DNA z różnych części roślin oraz przepro-wadzono analizy odmian mieszańcowych rzepaku ozimego posiadających cechę CMS typu ogura, z zastosowaniem markera DNA typu SCAR, oraz gen restorer dla CMS ogura, z zastosowaniem markera DNA typu RAPD.

Materiały i metody

Izolacja DNA z tkanki roślinnej

Liście i młode siewki rzepaku zbierano na lodzie, zamrażano ciekłym azotem i homogenizowano w moździerzu. Izolację DNA prowadzono według metody Doyle’a (Doyle 1990). DNA ekstrahowano buforem 2 x CTAB o składzie:

2% (w/v) CTAB, 100 mM Tris-Cl pH 8,0; 20 mM EDTA pH 8,0; 1,4 M NaCl; 1% (w/v) PVP; 1% (v/v) β-merkaptoetanol. Próby inkubowano w 65°C przez 30 min. Następnie poddawano ekstrakcji mieszaniną chloroform: oktanol (24 : 1) i odwirowywano przy 12000 x g przez 10 min., w celu rozdzielenia frakcji. Fazę wodną zbierano i wytrącano kwasy nukleinowe dodając 2/3 objętości izopropa-nolu. Po odwirowaniu osad przemywano 70% roztworem etanolu a następnie rozpuszczano w buforze TE i traktowano RNAzą o stężeniu 40 µg/ml w celu usunięcia kwasów rybonukleinowych. Po inkubacji 1 godz. w 37°C, DNA wytrą-cano izopropanolem oraz przemywano 70% roztworem etanolu. Po odwirowaniu osad DNA, suszono a następnie rozpuszczano w 100 µl sterylnej wody.

Stosowano również metodę modyfikowaną (opracowaną w INRA, Le Rheu, Francja), w której homogenizację prowadzono bez zamrażania tkanki ciekłym azotem, w buforze przemywającym (sorbitol 0,5 M, Tris-zas. 0,1 M, Na2EDTA

70 mM, pH = 7,5), w temp. 0°C. Osad uzyskany po odwirowaniu resuspendowano w buforze ekstrakcyjnym 2xCTAB. Dalej izolację prowadzono wg metody Doyle’a.

Amplifikacja DNA

1. PCR z zastosowaniem starterów typu SCAR

W celu wykrycia genu CMS ogura, analizę DNA prowadzono z zastoso-waniem starterów specyficznych dla regionów mitochondrialnego DNA, skorelowanych z CMS ogura (Krishmasany 1993), o następującej sekwencji nukleotydowej: 5’ GTC AAA GCA ATT GGG TTC AC 3’ oraz 5’ GTC GTT ATC GAC CTC GCA AGG 3’. Reakcję amplifikacji prowadzono w następu-jących warunkach:

a) denaturacja wstępna w 90oC przez 3 min., a następnie 30 cykli obejmu-jących denaturację w 92oC przez 30 s, przyłączenie starterów w 46°C przez 1 min., elongację w 72°C przez 2 min. (Sigareva 1997)

b) denaturacja wstępna w 90oC przez 3 min., a następnie 33 cykle obejmujące denaturację 92oC przez 30 s, przyłączenie starterów w 65oC przez 30 s, elongację w 70oC przez 1 min. 30 s, oraz elongację końcową w 70oC przez 2 min.

2. PCR z zastosowaniem starterów RAPD

Reakcję prowadzono z zastosowaniem trzech różnych starterów RAPD firmy Operon Technologies: OPC-02, OPD-02 i OPG-02 w następujących warun-kach: denaturacja wstępna w 95oC przez 30 s, a następnie 45 cykli obejmują-cych denaturację w 95oC przez 30 s, przyłączenie starterów w 35oC przez 1 min., elongację w 72oC przez 2 min. 30 s, oraz elongację końcową w 72oC przez 5 min.

Elektroforetyczny rozdział DNA

Preparaty DNA uzyskane w wyniku izolacji analizowano na 0,8% żelach agarozowych w buforze 1xTBE. Produkty reakcji amplifikacji DNA analizowano na 1,8% żelach agarozowych w buforze 1xTBE, przy natężeniu prądu 80 mA.

Wyniki i wnioski

1. Analizowano preparaty DNA uzyskane w wyniku ekstrakcji z różnych części roślin na różnych etapach rozwoju — z młodych liści, siewek oraz pojedyn-czych liścieni wyizolowanych z nasion (co pozwala na uzyskanie rośliny z pozostałej części zarodka). We wszystkich przypadkach uzyskano DNA dobrej jakości (rys. 1). Porównywano dwie metody izolacji DNA. Stwier-dzono, że metoda druga (z zastosowaniem buforu przemywającego) jest bardziej skuteczna ze względu na jakość uzyskanego preparatu DNA.

a)

b)

c)

Rys. 1. Elektroforetyczny rozdział na 0,8% żelu agarozowym preparatów DNA rzepaku wyizolowa-nego z: a) młodych liści, b) podliścieniowej części siewek (hypokotyli), c) pojedynczych liścieni; λ — DNA faga lambda.

0.8% agarose gel electrophoresis of B. napus DNA samples isolated from: a) young leaves, b) hypocotyls, c) single cotyledons; λ — phage lambda DNA.

2. Zastosowano metodę identyfikacji genu CMS ogura w odmianach mieszań-cowych rzepaku, z użyciem starterów specyficznych, zsynetyzowanych na podstawie danych literaturowych. W wyniku próby powtórzenia warunków reakcji według innych autorów (Krishmasany 1993) uzyskano prążek właściwy, odpowiadający sekwencji DNA sprzężonej z CMS, oraz szereg prążków nie-specyficznych (rys. 2, ścieżki 2 i 3) . Dlatego opracowano warunki reakcji tak, aby uzyskać jeden prążek specyficzny dla odmian, posiadających CMS oraz brak prążków w odmianach nie posiadających CMS ogura (rys. 2, ścieżki 5 i 6).

Rys. 2. Elektroforetyczny rozdział na 1,8% żelu agarozowym produktów reakcji PCR z zasto-sowaniem starterów typu SCAR dla CMS ogura; 1 i 4 — reakcje kontrolne (bez matrycowego DNA); 2 i 5 — DNA z roślin męskosterylnych; 3 i 6 — DNA z roślin męskopłodnych; 1–3 — warunki reakcji PCR według Krishnasamy (1993); 4–6 — warunki reakcji PCR opracowane w IHAR, Poznań; M — standard wielkości: AmpliSize™ DNA Size Standard, 50-2000 bp Ladder (BioRad), (w parach zasad — pz)

1.8% agarose gel electrophoresis of PCR products obtained with the use of SCAR primers specific for CMS ogura; 1 and 4 — control reactions (without template DNA); 2 and 5 — DNA from male sterile plants; 3 and 6 — DNA from male fertile plants; 1–3 — PCR reaction conditions as described by Krishnasamy (1993); 4–6 — PCR reaction conditions designed in IHAR, Poznań; M — molecular size marker — AmpliSize™ DNA Size Standard, 50-2000bp Ladder (BioRad), (in base pairs).

3. Wdrożono metodę identyfikacji roślin zawierających gen restorer, z zastoso-waniem starterów RAPD firmy Operon: OPC-02, OPD-02 i OPG-02. Zostały one wybrane na podstawie badań przeprowadzonych w INRA, Francja (Delourme i in. 1994). Starter OPG-02 okazał się nieprzydatny dla polskich odmian hodowlanych rzepaku; nie można było rozróżnić roślin zawierających (R+) i nie posiadających genu restorera dla CMS ogura (R-) (rys. 3c, ścieżki R+ i R-). Starter OPD-02 wykazywał różnicę pomiędzy roślinami R+ i R-, z tym, że polegała ona jedynie na słabszej intensywności jednego z prążków (na rys. 3b oznaczonego strzałką) w przypadku DNA uzyskanego z rośliny nie posiadającej genu restorera. Metoda ta wydaje się być trudna do zastosowania przy rutynowej analizie roślin. Starter OPC-02 różnicował rośliny typu R+ i R- w sposób jednoznaczny (rys. 3a; prążek polimorficzny zaznaczony strzałką); stosując go można w posiadanym materiale selekcjonować rośliny ze względu na obecność genu restorującego.

a) OPC-02

b) OPD-02

c) OPG-02

Rys. 3. Elektroforetyczny rozdział na 1,8% żelu agarozowym produktów reakcji PCR-RAPD z zastosowaniem starterów: a) OPC-02, b) OPD-02, c) OPG-02; 1–10 — DNA z roślin testowanych na obecność markerów genu restorera dla CMS ogura, R+ — DNA z roślin wzorcowych, posiadających gen restorer dla CMS ogura, R- — DNA z roślin wzorcowych, nie posiadających genu restorera dla CMS ogura; strzałkami zaznaczono polimorficzne prążki DNA; M — standard wielkości: DNA faga lambda po hydrolizie enzymami restrykcyjnymi Eco RI i Hind III (w parach zasad — pz)

1.8% agarose gel electrophoresis of PCR-RAPD products obtained with the use of primers: a) OPC-02, b) OPD-02, c) OPG-02; 1–10 — plants tested for the presence of CMS ogura restorer gene markers, R+ — model plants with CMS ogura restorer gene, R- — model plants without CMS ogura restorer gene; arrows indicate polymorphic bands; M — molecular size marker — phage lambda DNA digested with endonucleases Eco RI and Hind III (in base pairs)

4. Badano odmiany mieszańcowe rzepaku na obecność CMS ogura oraz genu restorującego. Materiał do badań pobierano z roślin rosnących na polu, w szklarni oraz z pojedynczych liścieni, uzyskanych ze skiełkowanych nasion. Określano genotypy dla poszczególnych roślin z zastosowaniem PCR z użyciem starterów typu SCAR (rys. 4a) oraz RAPD/OPC-02 (rys. 4b). Metodą tą przebadano około 250 roślin. Badano korelację wyników z fenoty-pem roślin, hodowanych w szklarni. Stwierdzono całkowitą zgodność wyni-ków analiz DNA z ekspresją fenotypową cech badanych przy pomocy markerów.

a) SCAR/CMS

b) RAPD/OPC-02

Rys 4. Analiza DNA odmian mieszańcowych rzepaku ozimego. Elektroforetyczny rozdział na 1,8% żelu agarozowym produktów reakcji: a) PCR z zastosowaniem starterów typu SCAR: S+ — DNA roślin męskosterylnych (CMS ogura), b) RAPD z zastosowaniem startera OPC-02: R+ — DNA roślin posiadających gen restorer dla CMS ogura, R- — DNA roślin nie posiadających genu restorera dla CMS ogura, (strzałka wskazuje prążki polimorficzne); M — standard wielkości — DNA faga lambda po hydrolizie enzymami restrykcyjnymi Eco RI i Hind III (w parach zasad — pz)

Analyses of DNAs obtained from B. napus hybrid plants. 1.8% agarose gel electrophoresis of PCR reactions products with the use of: a) specific SCAR primers: S+ — CMS ogura male sterile plants, b) RAPD/OPC-02 primer: R+ — plants with CMS ogura restorer gene, R- — plants without CMS ogura restorer gene, (the arrow indicates polymorphic bands); M — molecular size marker — phage lambda DNA digested with endonucleases Eco RI and Hind III (in base pairs)

5. Opracowane metody identyfikacji genotypów CMS ogura oraz genu restorera w preparatach DNA uzyskanych z pojedynczych liścieni stanowią dogodne narzędzie selekcji roślin we wczesnych stadiach rozwoju. Umożliwi to wybra-nie odpowiednich roślin z następnego pokolenia do dalszej hodowli, jeszcze przed kwitnieniem, zanim ujawnią się cechy fenotypowe. Zastosowanie marke-rów molekularnych w programach hodowlanych zwiększy skuteczność selekcji oraz przyczyni się do skrócenia okresu hodowlanego.

Literatura

581-585.

Chèvre A. M., Barret P., Eber F., Dupuy P., Brun H., Tanguy X., Renard M. 1997. Selection of stable

Brassica napus-B. juncea recombinant lines resistant to blackleg (Leptosphaeria maculans).

1. Identification of molecular markers, chromosomal and genomic origin of introgression. Theor. Appl. Genet. 95: 1104-1111.

Delourme R., Bouchereau A., Hubert N., Renard M., Landry B. S. 1994. Identification of RAPD markers linked to a fertility restorer gene for the ogura radish cytoplasmic male sterility of rapeseed (Brassica napus L.). Theor. Appl. Genet. 88: 741-748.

Doyle J. J., Doyle J. L 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13-15.

Foisset N., Delourme R., Barret P., Renard M. 1995. Molecular tagging of the dwarf BREIZH (Bzh) gene in Brassica napus. Theor. Appl. Genet. 91: 756-761.

Haley S. D., Afandor L. K., Miklas P. N., Stavely J. R., Kelly J. D. 1994. Heterogeneous inbred populations are useful as sources of near-isogenic lines for RAPD marker localization. Theor. Appl. Genet. 88: 337-342.

Jean M., Brown G. G., Landry B. S. 1997. Genetic mapping of nuclear fertility restorer genes for the ”Polima” cytoplasmic male sterility in canola (Brassica napus L.) using DNA markers. Theor. Appl. Genet. 95: 321-328.

Jourdren C., Barret P., Horvais R., Delourme R., Renard M. 1996a. Identification of RAPD markers linked to linolenic acid genes in rapeseed. Euphytica 90: 351-357.

Jourdren C., Barret P., Horvais R., Foisset N., Delourme R., Renard M. 1996b. Identification of RAPD markers linked to the loci controlling erucic acid level in rapeseed. Molecular Breeding 2: 61-71.

Kesseli R. V., Paran I., Michelmore R. W. 1992. Efficient mapping of specifically targeted genomic regions and the tagging of these regions with reliable PCR-based genetic markers. W: Applications of RAPD Technology to Plant Breeding, Joint Plant Breeding Symposia Deries, 1 Nov., 1992, Minneapolis, Minnesota. Wyd. przez: Crop Science Society of America, American Society for Horticultural Science, American Genetic Association, 31-37.

Krishnasamy S., Makaroff C. 1993. Characterization of the radish mitochondrial orf B locus: possible relationship with male sterility in ogura radish. Curr. Genet. 24: 156-163.

Krzymański J. 1997. Hodowla jakościowa. Hodowla roślin, materiały z I Krajowej Konferencji, 333-339.

Ribaut J.-M., Hu X., Hoisington D., González-de-León D. 1997. Use of STSs and SSRs as rapid and reliable preselection tools in a marker-assisted selection-backross scheme. Plant Mol. Biol. Rep.

15 (2): 154-162.

Sigareva M. A., Earle E. D. 1997. Direct transfer of a cold-tolerant ogura male-sterile cytoplasm into cabbage (B. oleracea ssp. capitata) via protoplast fusion. Theor. Appl. Genet. 94: 213-220. Tanksley S. D., Young N. D., Paterson A. H., Bonierbale M. W. 1989. RFLP mapping in plant

breeding: new tools for an old science. Bio/Technology 7: 257-264.

Tingey S. V., Rafalski J. A., Williams J. G. K. 1992. Genetic analysis with RAPD markers. W: Applications of RAPD Technology to Plant Breeding, Joint Plant Breeding Symposia Deries, 1 Nov., 1992, Minneapolis, Minnesota. Wyd. przez: Crop Science Society of America, American Society for Horticultural Science, American Genetic Association, 3-9.

Uzunova M., Ecke W., Weissleder K., Röbbelen 1995. Mapping the genome of rapeseed (Brassica

napus L.). I. Construction of an RFLP linkage map and localization of QTLs for seed

glucosinolate content. Theor. Appl. Genet. 90: 194-204.

Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18 (22): 6531-6535.

Wolko B., Bartkowiak-Broda I. 1997 Metody diagnostyki molekularnej w hodowli roślin. Hodowla jakościowa. Hodowla roślin, materiały z I Krajowej Konferencji, 389-403.

Young N. D. 1994. Constructing a plant genetic linkage map with DNA markers. DNA-based markers in plants, wyd. przez: Phillips R. L., Vasil I. K., Kluwer Academic Publishers, 39-58.