Michał Starzycki, Eligia Starzycka
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Roślin Oleistych w Poznaniu
Doniesienia światowe na temat hodowli
odpornościowej rzepaku ozimego na patogena
L. maculans / P. lingam
World reports about resistance breeding
of rapeseed resistant to L. maculans / P. lingam
W Polsce i na świecie patogen L. maculans / P.
lingam powoduje znaczne obniżenie plonu
nasion rzepaku. Nieodzowne w związku z tym jest prowadzenie hodowli odpornościowej
Brassica napus L. i badań nad patogenem.
Powyższa problematyka obejmuje wiele zna-czących dla genetyki i fitopatologii pozycji i jest szeroko omawiana w literaturze krajowej i zagranicznej. W opracowaniu przedstawiono światowe kierunki badań nad odpornością rzepaku na L. maculans / P. lingam.
In Poland and in the world L. maculans
/ P. lingam causes important decrease of
rapeseed yield. Because of that it is necessary to perform studies on this pathogen and resistance breeding of Brassica napus L. These topics include studies on genetics and fitopathology that are widely described in many papers in Poland and abroad. In this work world trends in studies on rapeseed resistance to
L. maculans / P. lingam have been presented.
Na całym świecie, w tym również w Polsce, patogen L. maculans / P. lingam powoduje znaczne obniżenie plonu nasion — około 15%, a przy warunkach pogodowych sprzyjających dla rozwoju patogena straty wynoszą do 50%. Aby zmniejszyć efekt porażenia grzybem próbowano stosować fungicydy. Przepro-wadzone doświadczenia (Sansford 1995; Steinbach 1995; Klodt-Bussman, Paul 1995; Penaud 1995; Thomas, Wedgwood 1997) jednoznacznie wykazały, że działanie środków chemicznych jest mało skuteczne i powoduje znaczne pod-niesienie kosztów uprawy. Nieodzowne w związku z tym jest prowadzenie hodowli odpornościowej rzepaku i badań nad patogenem. Problematyka, o której mowa, obejmuje wiele pozycji znaczących dla fitopatologii i jest bardzo bogata zarówno w literaturze krajowej, jak i zagranicznej. Prace nad odpornością rzepaku jarego i ozimego na omawianego patogena, koncentrują się wokół następujących problemów:
• Badania patogena L. maculans / P. lingam — kierunki:
1. Cytologiczno-genetyczna analiza gatunku, zmienność populacji 2. Badania mikotoksyn
• Badania odporności roślin rzepaku jarego i ozimego — kierunki:
1. Uzyskanie odporności na patogena, wykorzystując mieszańce między-gatunkowe w rodzaju Brassica
2. Transformacja niespecyficznych genów odporności do genotypów roślin rzepaku
3. Analiza odporności roślin rzepaku metodami genetycznymi oraz przy użyciu technik z zakresu biologii molekularnej
Nowoczesną cytologiczno-genetyczną analizą gatunku L. maculans/
P. lingam jest metoda oparta na rozdziale i identyfikacji chromosomów patogena
w pulsującym polu elektrycznym (Howlett i in. 1995; Howlett 1996; Jędryczka, Kachlicki 1996; Sadowski 1997; Jędryczka 1997). Nosi ona nazwę PFGE (pulsed field gel electrophoresis). Zasada metody polega na rozdzieleniu w żelu agarozowym długich cząstek DNA (chromosomów) w przemiennie pulsującym polu elektrycznym z elektrodami ułożonymi pod określonym kątem. W polu elektrycznym długie cząstki DNA rozciągają się wzdłuż i rozpoczynają migrację. Po zastosowaniu pola elektrycznego pod innym kątem w stosunku do pierwotnego, łańcuch DNA zostaje zmuszony do zmiany konformacji i rozciągania się wzdłuż nowego pola, a czas potrzebny do zmiany ułożenia zależny jest od długości cząstek DNA, co zostało wykorzystane w metodzie. W efekcie długie cząsteczki DNA o różnej masie cząsteczkowej zaczynają się rozdzielać. Metoda w pierwotnej formie pozwoliła na rozdzielenie chromosomów grzybowych o długości około 200–2500 kpz (kilo par zasad). Modyfikując metodę według systemu CHEF (contour-clamped homogenous electric field) wykorzystano 24 elektrody w układzie heksagonalnym, co pozwoliło na zmianę pulsującego pola w zakresie od 60 do 120o, a wielkość odczytywanego DNA zwiększyła się do 5,7 Mpz (mega par zasad). Zastosowanie elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym w systemie CHEF pozwoliło na identyfikację wielu cech Leptosphaeria maculans / Phoma
lingam uprzednio nie znanych, takich jak: liczba 11–12 chromosomów oraz ich
wielkość mieszcząca się w zakresie od 0,8 do 3,5 Mpz (Jędryczka 1997). Nieco odmienne podejście prezentują Pulmmer i Howlett (1995) oraz Howlett (1996). Autorzy wykonali badania, także przy użyciu elektroforezy pulsacyjnej wielkości chromosomów Leptosphaeria maculans / Phoma lingam sprawdzając ich homolo-giczność. Do tego celu wykorzystano drugie pokolenie (F2) mieszańcowe form
rodzicielskich różniących się wielkością chromosomów. Identyfikacji tetrad doko-nano za pomocą β-tubuliny, reduktazy azotanowej, rybosomalnego DNA S18 oraz dwóch starterów. Wyniki pracy pozwoliły na stwierdzenie, że długość chromo-somów po procesie mejozy u form mieszańcowych zostaje zrekombinowana do nowych wielkości różniących się znacznie od form rodzicielskich.
Populacja Leptosphaeria maculans / Phoma lingam złożona jest z kompleksu podgatunków różniących się patogenicznością, morfologią, szybkością wzrostu,
sporulacją, pigmentacją oraz zdolnością do produkcji fitotoksycznych metabolitów (Jędryczka i in. 1997a, 1997b; Kachlicki i in. 1997; Kuswinanti i in. 1997; Balesdent i in. 1997). Po analizach DNA – PCR przy użyciu specyficznych starterów, izolaty patogena pochodzące z różnych części Europy sklasyfikowano w siedmiu grupach (Tox+, Tox0 NA1, Tox0 NA2, Tox0 NA3, Erysimum, Lepidium, Thlapsi-typ). Dla polskich izolatów Tox0 NA1 polimorfizm był wysoki. Z kolei izolaty angielskie zaliczane do grupy Tox+ miały polimorfizm niski. Francuskie izolaty kolekcjonowane w ciągu trzech lat zostały zaszeregowane jako siedem gatunków lub podgatunków o zbliżonych nazwach, symbolach i dodano równocześnie do nich trzy rasy o oznaczeniach Tox+ PG-2, Tox+ PG-3, Tox+ PG-4. Inną grupę badań w zakresie poznania patogena prezentowali badacze niemieccy (Voigth i in. 1997). W cyklu infekcyjnym Leptosphaeria maculans / Phoma lingam obserwowano różną degradację komórek roślinnych na skutek działania enzymów celulolitycznych pochodzących od grzyba. Sama degradacja szkodliwych enzymów grzyba związana jest z zawartością celulazy w roślinach rzepaku. Enzymy celulolityczne obserwowane były in vitro zarówno dla grupy agresywnej patogena (A) jak i nieagresywnej (NA). Ekspresję genu odpowiedzialnego za powstanie celulazy w roślinie badano przy użyciu metody Northen RT – PCR (odwrócona transkryptaza) izolując mRNA i amplifikując go na cDNA. Wyniki jak stwierdzają autorzy były dyskusyjne. Bardzo często w badaniach patogeniczności L. maculans /
P. lingam wykorzystuje się techniki oparte na markerach izoenzymatycznych
(Brun i in. 1997b; Szklarczyk 1996; Somda i in. 1996). Warianty alleliczne danego białka enzymatycznego, nazywane allozymami, wykorzystywane są dla uwidocz-nienia polimorfizmu na poziomie badanego materiału genetycznego. Metodę tę w systemie GPI (glucose phosphate isomerase) wykorzystano do przebadania populacji grzyba L. maculans / P. lingam i rozdziału patotypów na silnie wirulentne i słabo wirulentne. Dodatkowo można było otrzymać specyficzny allozym informujący o przynależności gatunkowej. Praca ta jest ważna z punktu widzenia identyfikacji taksonomicznej w obrębie gatunku i jego form pokrewnych. Metoda ta jest także przydatna w odróżnianiu grzybów patogenicznych
L. maculans / P. lingam i Pseudocercosporella capsellae (Ell. et Ev), których
objawy na liściach rzepaku są bardzo podobne.
W literaturze mało uwagi poświęca się fitotoksynom wytwarzanym przez grzyba L. maculans / P. lingam. Sock i in. (1995) stwierdzili, że sirodesminy, a szczególnie sirodesmina PL, nie mają większego znaczenia w poziomie porażania rzepaku ozimego. Podobnego zdania są Thurwachter i in. (1995), którzy opisali dodatkowo brak korelacji pomiędzy jesiennym a wiosennym porażeniem rzepaku w warunkach polowych Niemiec, informując równocześnie o produkcji sirodesmin przez znaczną liczbę izolatów grzyba (80–100%) wybranych z populacji. Od wielu już lat w Kanadzie problematyką fitotoksyn zajmują się Pedras i Sorensen (Pedras 1995; Pedras, Sorensen 1995). Wyizolowali oni następujące
nowe fitotoksyny: phomaligol A, phomaligol A1, phomaligadione A,
phoma-ligadione B, phomapyrone A, phomapyrone B, phomapyrone C, phomaligin A, wasabidienone B, wasabidienone E. Na podstawie analiz fitotoksyn oraz DNA i RNA grzyba, autorzy wskazują na bardzo bogatą gamę gatunków i podgatunków w obrębie rodzaju Leptosphaeria.
Oddzielną problematykę w zakresie badań patogeniczności L. maculans
/ P. lingam stanowi agresywność i wirulencja. Często w pracach używa się
również terminu patogeniczność. Przeglądając literaturę spotyka się często mylne użycie wyżej podanych pojęć. Bardzo trafnie obydwie definicje, a więc agresyw-ność i wirulencję przedstawił Arseniuk (1995). Zdolagresyw-ność patogena do inwazji, opanowywania tkanek roślinnych i namnażania (reprodukcji) w/na roślinie żywicielskiej oraz (pośrednio) na pożywkach określana jest agresywnością. Z kolei zdolność patogena do uszkadzania roślin żywicielskich w różnym stopniu i wywołania objawów o różnym nasileniu określana jest wirulencją. Kuswianti i in. w 1995 sklasyfikowali populację L. maculans / P. lingam występującą w Niem-czech na 6 patogenicznych grup i jedną niepatogeniczną. Do namnażania użyto 348 pojedynczych askospor, pochodzących z różnych regionów Niemiec. W wyniku otrzymano: dla patogenicznej grupy A1 charakterystycznej dla Niemiec i Australii 256 izolatów, dla grupy A2 charakterystycznej dla Niemiec, Australii i Anglii otrzymano 36 izolatów, dla grup A3 i A4 charakterystycznych dla Francji otrzymano 3 izolaty, dla grup A5 i A6 charakterystycznych dla Niemiec otrzymano łącznie 11 izolatów. Do grupy nieagresywnych zaliczono 39 izolatów. Z najnow-szych badań tych samych autorów (Kuswinanti i in. 1997) wynika, że agresywne (A) i nieagresywne (NA) formy patogena (PGs pathogenicity groups) występują w równym nasileniu. W grupie agresywnych patotypów wyodrębniono sześć patogenicznych subgrup (PSG, A1-A6). Monitorowanie występowania posz-czególnych PSG jest bardzo ważne z punktu widzenia doboru różnorodnych odmian rzepaku i gatunków w obrębie rodzaju Brassica, przeznaczonych do hodowli i uprawy. Brun i in. (1995) charakteryzowali populację L. maculans
/ P. lingam otrzymaną z porażonych roślin gatunku Brassica nigra L. odmiany
Junius, klasyfikując patogena w dwóch grupach: grupa A — izolaty niewirulentne i nieagresywne, grupa B — izolaty wirulentne i silnie agresywne. Bardzo interesujące badania zmiany patogeniczności kanadyjskiego wirulentnego izolatu „Leroy” przedstawili Seguin-Swartz i Gugel (1995). Po próbie mutacji grzyba przy użyciu metanosulfonianuetylowego izolat stracił zdolności wirulencyjne, zmieniając równocześnie swój kariotyp. Taylor w 1994 roku, w Kanadzie przy pomocy PCR i odpowiednio dobranych starterów opracowała diagnostyczny test pozwalający na określenie występowania zarodników workowych patogena
L. maculans na nasionach przeznaczonych do siewu, bowiem przenoszenie
Po zapoznaniu się z patogenem L. maculans / P. lingam badacze próbują wykorzystać powyższe wyniki w pracach bezpośrednio związanych z hodowlą odpornościową rzepaku i gatunków pokrewnych. Znaczna liczba opracowań poświęcona jest hodowli mieszańców międzygatunkowych (Plieske, Struss 1997; Roussel i in. 1997; Brun i in. 1997a; Winter, Sacristan 1997; Eber i in. 1997; Gugel Seguin-Swartz 1997; Wahlberg, Dixelius 1997; Chevre i in. 1995; Giamoustaris, Mithen 1995a; Gerdemann-Knorck i in. 1995; Gugel i in. 1995; Magrath, Mithen 1993; Parkin i in. 1994). Powszechnie znany jest fakt występowania odporności na omawianego patogena u form dzikich, takich jak Raphanus sativus L., Sinapis
arvensis L., Eruca sativa L., Brassica atlantica L. (Scholze, Hammer 1997; Chen,
Seguin-Swartz 1997; Mithen 1996) i podwyższonej odporności u niektórych gatunków uprawnych w rodzaju Brassica, takich jak Brassica nigra L., Brassica
carinata L., Brassica juncea L., Sinapis alba L. (Gerdeman, Sacristan 1986;
Sacristan, Gerdeman 1986; Somda i in. 1995; Thomas, Wright 1995; Kuswinanti i in; 1995; Brun i in. 1995). Ciekawy schemat badań w tej dziedzinie został przedstawiony przez zespół dr Mithen’a w 1996 roku w Instytucie John Innes Centre — Norwich. Mieszańce międzygatunkowe z rodzaju Brassica posłużyły do zsyntetyzowania nowych form rzepaku jarego i ozimego o podwyższonej odporności na choroby i szkodniki (Giamoustaris, Mithen 1995a, 1995b). W pracach tych zwrócono szczególnie uwagę na rolę glukozynolanów roślinnych i ich działanie obronne przeciw patogenom. Wcześniej stwierdzono, że u roślin z rodzaju Brassica biosynteza glukozynolanów alifatycznych związana jest z kompleksowym mechanizmem dziedziczenia. Alifatyczne glukozynolany powstają z metioniny, indolowe z tryptofanu, aryloalkilowe z fenyloalaniny.
Dokładne prześledzenie biosyntezy i szlaku powstawania glukozynolanów alifatycznych przyczyniło się do ustalenia miejsc możliwych modyfikacji przy zastosowaniu krzyżówek międzygatunkowych. Autorzy stwierdzili doświadczal-nie, że wysoka koncentracja glukozynolanów, średnio 60 µmol g-1 suchej masy w liściach wpływa korzystnie zarówno na wysoki stopień odporności rzepaku na patogeny, jak również nie sprzyja wygryzaniu liści przez gołębie i ślimaki. Niższa koncentracja omawianych związków nie powodowała podobnych reakcji. Poprzez krzyżowania międzygatunkowe, a następnie przez zastosowanie krzyżowań wstecznych i izolacji otrzymano nowe formy rzepaku, które charakteryzowały się wysoką zawartością glukozynolanów w łodygach i liściach, dochodzącą do 60 µmol g-1
suchej masy, lecz niską zawartością — około 10 µmol g-1
Metionina — Methionine
Przedłużenie łańcucha — Side chain elongation
PROPYL — PROPYLS BUTYL — BUTYLS PENTENYL — PENTENYLS
3-metylotiopropyl 4-metylotiobutyl 5-metylotiopentyl
3-methylthiopropyl 4-methylthiobutyl 5--methylthiopentyl
3- metylosulfinylpropyl 4-metylosulfinylbutyl 5-metylosulfinylopentyl
3-methylsulphinylpropyl 4-methylsulphinybutyl 5-methylsulphinypentyl
2-propenyl 3-butenyl 4-pentenyl 2-propenyl 3-butenyl 4-pentenyl
Gsl-oh-A Gsl-oh-A Gsl-oh-C Gsl-oh-C 2-hydroksy-3-butenyl 2-hydroksy-4-pentenyl 2-hydroxy-3-butenyl 2-hydroxy-4-pentenyl możliwości modyfikacji biosyntezy Side chain modification
Rys. 1. Schemat biosyntezy glukozynolanów alifatycznych w rzepaku (Margrath i in. 1994)
Model of the biosynthesis of aliphatic glucosinolates in B. napus (Margrath et al. 1994)
Autorzy jednoznacznie stwierdzili, że poziom glukozynolanów alifatycznych w nasionach: 2-hydroksy-3-butenylowego, 2-hydroksy-4-pentenylowego jest ściśle związany z genotypem matecznym i w kombinacji krzyżówkowej F1
komponentów Cobra x Syn2 uzyskano dwukrotnie niższy ich poziom, w stosunku do sytuacji odwrotnej Syn2 x Cobra. Teoria ta została wcześniej potwierdzona przez Krzymańskiego (1981). Bardziej zróżnicowany efekt matroklinalny obserwowano analizując liścienie 8-tygodniowych zarodków. Otrzymanie ustabili-zowanych pod względem wysokiej zawartości glukozynolanów w roślinach, a niskiej w nasionach u hodowlanych form rzepaku było możliwe dzięki zmapowaniu go przy użyciu techniki RFLP. Wspomniana technika pozwoliła na odszukanie dwóch loci odpowiedzialnych za hydroksylację powstających glukozynolanów w liściach i nasionach rzepaku. Loci na chromosomie znajdujące się w grupie 13(Gsl-oh-C) było odpowiedzialne za sprawny przebieg biosyntezy, a loci 3(Gsl-oh-A) za przebieg słaby.
B. atlantica x B. rapa
(CC genom) (AA genom)
B. atlantica B. rapa
(CC genome) (AA genome)
Syntetyk B. napus x B. napus COBRA
(AACC genom)
Synthetic B. napus (AACC genome)
F1 x B. napus COBRA
Linie z mikrospor Linie hodowlane — Lines Lines derived from microspores izol
izol self
self
Linie DH Linie hodowlane — Lines
DH lines izol
self
Linie hodowlane — Lines
izol
self
Linie hodowlane —Lines
Rys. 2. Otrzymywanie nowych linii rzepaku o zmodyfikowanych glukozynolanach alifatycznych (Giamoustaris A., Mithen R. 1995b; Mithen 1996) — The development of the B. napus lines with
modified aliphatic glucosinolate content (Giamoustaris A., Mithen R. 1995b; Mithen 1996)
W niemieckich badaniach (Kuswinanti i in. 1995), po sklasyfikowaniu popu-lacji L. maculans / P. lingam, wykorzystano poszczególne grupy izolatów do testowania odporności różnych odmian rzepaku i gatunków z rodzaju Brassica, celem przeniesienia tej odporności poprzez krzyżowania międzygatunkowe do rzepaku. Testowano następujące gatunki:
1. Brassica napus L. biennis, odmiana Lirabon 2. Brassica napus L. biennis, odmiana Glacier 3. Brassica napus L. biennis, odmiana Quinta 4. Brassica napus L. biennis, odmiana Jet Neuf 5. Brassica napus L. biennis, odmiana Doublol 6. Brassica napus L. annua, R83-14.DH26 7. Brassica napus L. annua, R83-14.DH47 8. Brassica napus L. annua, odmiana Karat
9. Brassica rapa L., odmiana Herbstrube Runde 10. Brassica oleracea botr., odmiana Erfurster Zwerg 11. Brassica juncea, UM3132
12. Brassica juncea, 2084
13. Brassica juncea, odmiana Aurea 14. Brassica nigra, 2558
15. Brassica carinata, 2607 16. Brassica carinata, 3220
Nieliczne testowane odmiany rzepaku ozimego (nr 3, 4, 5) w stadium siewki posiadały słabą odporność na porażenie, powodowane przez określone grupy patotypów L. maculans / P. lingam. Inne gatunki badane w tym samym stadium, począwszy od B. rapa, B. oleracea, B. juncea, B. carinata oraz B. nigra posiadały zdecydowanie wyższą odporność na patogena (nr 9–16). Niemieccy badacze Plieske i Struss (1997) przy użyciu techniki RFLP zmapowali i zidentyfikowali geny odporności na porażenie P. lingam w genomie B u gatunków: B. nigra BB, 2n = 16, B. carinata BBCC, 2n = 34, B. juncea AABB, 2n = 36. Stwierdzili oni, że u wymienionych gatunków geny odporności pochodzące z genomu B są iden-tyczne. Szwedzi (Wahlberg, Dixelius 1997) wykonali podobne badania, a uzyskane wyniki wskazały na dominujące geny odpowiedzialne za odporność na P. lingam — dwa pochodzące z B. nigra, jeden z B. juncea oraz jeden z B. carinata. Chevre i in. we Francji w 1995 roku, wykonali mapę chromosomów potomstwa krzyżówek pomiędzy B. napus x B. nigra przy użyciu 6 systemów izoenzymatycznych (ADH — dehydrogenaza w alkoholu etylowym, GOT — glukoszczawiano transaminaza, 6PGD — dehydrogenaza 6-fosfoglukonowa, PGI — fosfoglukoizomeraza, PGM — fosfoglukomutaza, TPI — 3-fosfoizomeraza), 69 markerów RAPD oraz analizy RFLP. Po przeprowadzonych badaniach wyżej wymienionymi metodami, a także po inokulacji epikotyli według metody Williams’a stwierdzono 4 geny odporności występujące u rzepaku, które zostały przeniesione z gatunku B. nigra.
Oprócz tradycyjnego systemu krzyżowania, tam gdzie system ten zawodzi (zbyt duże bariery genetyczne krzyżowania), mieszańce międzygatunkowe odporne na patogena próbuje się uzyskać na drodze somatycznej hybrydyzacji (Sacristan i in. 1989; Gerdemann-Knorck i in. 1995; Gugel, Seguin-Swartz 1997; Scholze, Hammer 1997). Do tego celu przeznaczono gatunki Raphanus sativus L., Sinapis
arvensis L., Sinapis alba L. oraz rzepak jary. Tam gdzie do somatycznych
krzyżowań użyto dwóch pierwszych gatunków, otrzymano podwyższoną odpor-ność roślin na patogeny z rodzaju Alternaria i Leptosphaeria. Po wstecznych krzyżowaniach w następnych pokoleniach wprowadzona odporność zanikała. Podobna sytuacja obserwowana była w roślinach mieszańcowych, których pier-wotnymi komponentami były gorczyca biała i rzepak jary. Po przeprowadzonych trzech krzyżowaniach wstecznych zaobserwowano rośliny bardzo odporne, których w badanej populacji znajdowało się około 15%, średnio odpornych 15–40% oraz
podatnych ponad 40%. W badaniach tych inokulację przeprowadzono opryskując rośliny zawiesiną zarodników konidialnych agresywnych patotypów.
Jedną z najbardziej obiecujących dróg w otrzymaniu odpornych roślin rzepaku na porażenie L. maculans / P. lingam jest transformacja
niespecy-ficznych genów warunkujących odporność. Francuscy badacze (Grezes-Besset
i in. 1995) przy pomocy systemu Agrobacterium rhizogenes wprowadzili do rzepaku gen warunkujący syntezę chitynazy. Transgeniczne rośliny uzyskano po ko-kultywacji i analizie ekspresji genu chitynazy poprzez kultury kalusowe. W pracach zastosowano binarny wektor pBIN 19 (Dubois i in. 1992). Sam gen chitynazy działał pod kontrolą promotora, pochodzącego z wirusa mozaiki kalafiora 35S. Stwierdzono, że odporność na patogeny związana jest z akumulacją w komórkach roślinnych aktywnych białek wstrzymujących atak grzybów. Zwrócono również uwagę, że aktywnie działająca chitynaza katalizuje proces hydrolizy chityny, a więc poli β-1,4N acetyloglukozaminy, głównego komponenta ścian komórkowych Oomycetes, co skutecznie przeciwstawia się ich rozwojowi. Po otrzymaniu trzeciego pokolenia roślin transgenicznych T3, w warunkach
polowych, kolonizacja głównych patogenów rzepaku P. lingam i S. sclerotiorum następowała bardzo słabo. Odporność na porażenie przez P. lingam badanych roślin rzepaku wzrosła według autorów dwukrotnie, a średnia plama nekrotyczna na rzepaku spowodowana przez patogena S. sclerotiorum po 54 dniach od inokulacji na roślinach transgenicznych wynosiła 6,9 cm, a na roślinach kontrol-nych, nietransformowanych 32,6 cm. Podobny kierunek obrali Anglicy z firmy Zeneca Agrochemicals (Greenland i in. 1997), wprowadzając do rzepaku gen działający niespecyficznie, dający odporność na wiele patogenów pochodzenia grzybowego. Produktem genu było białko AFP (antifungal protein), znacznie podnoszące poziom odporności roślin. Autorzy stwierdzili, że czyste AFP jest bardzo aktywne i stanowi dobry czynnik selekcyjny transformowanych gatunków z rodzaju Brassica.
Na świecie wiele uwagi poświęca się analizie odporności roślin przy użyciu
metod genetycznych, a także technik z zakresu genetyki molekularnej.
Przeprowadzenie analizy odporności roślin, możliwe jest dopiero wówczas, kiedy po wstępnych badaniach zostanie wybrana metoda atestacji (tab. 1).
Tabela 1 Stosowane techniki inokulacji rzepaku patogenicznym grzybem L. maculans / P. lingam
Techniques of oilseed rape inoculation with fungal pathogens L. maculans/P. lingam
AUTOR AUTHOR Rok Year Inokulacja — Koncentracja Inoculum — Concentration Miejsce inokulacji Place of inoculation
BRUNIN, LACOSTE 1970 Askospory — 1 perytecium/roślinę Liścienie i rozety
Ascospores — 1 perithecium/plant Cotyledons, rosettes
BARBETTI 1975 Askospory — 500 zarodników/ml Siewki roślin
Ascospores — 500 ascospores/ml Seedlings
THURLING,VENN 1977 Askospory — 400 zarodników/ml Liścienie
Ascospores — 400 ascospores/ml Cotyledons
WOOD, BARBETTI 1977 Askospory — dowolna Liścienie
Ascospores — any amount Cotyledons
WOOD, BARBETTI 1977 Zarodniki konidialne — dowolna Liścienie
Pycnidiospores — any amount Cotyledons
POUND 1947 Zarodniki konidialne Nasiona
Pycnidiospores Seeds
ALABOUVETTE 1969 Zarodniki konidialne Siewki roślin
Pycnidiospores Seedlings
ALABOUVETTE i in. 1974 Zarodniki konidialne — 106 zarodniki/ml Różne stadia
Pycnidiospores — 106 spores/ml Different stages
DELWICH,WILLIAMS 1979 Zarodniki konidialne — 107 zarodniki/ml Liścienie Pycnidiospores — 107 spores/ml Cotyledons
HELMS i in. 1979 Zarodniki konidialne — 4x106 zarodniki/ml Nasiona
Pycnidiospores — 4x106 spores/ml Seeds
BONMAN i in. 1981 Zarodniki konidialne — 107 w 10µl Liścienie
Pycnidiospores — 107 in 10µl Cotyledons
Mc GEE, PETRIE 1978 Zarodniki konidialne — 3x107 zarodniki/ml 3–4 liści
Pycnidiospores — 3x107 spores/ml 3–4 leaves
HUMPERSON 1986 Zarodniki konidialne — 3x107 zarodniki/ml Nasiona, hypokotyle
Pycnidiospores — 3x107 spores/ml Seeds, hypocotyls HAMMOND-KIM i in. 1985 Zarodniki konidialne — 106 zarodniki/ml 2 liście
Pycnidiospores — 106 spores/ml 2 leaves
CETIOM 1985 Zarodniki konidialne 106 zarodniki/ml Nasiona
Pycnidiospores — 106 spores/ml Seeds
DEMARCH i in. 1986 Filtrat — 10µl Liścienie
Filtrate — 10µl Cotyledons
ROUXEL i in. 1988 Toksyna Różne stadia
Toxin Different stages
GLIMELIUS i in. 1986 Toksyna — 1-4 µl Protoplasty
Toxin — 1-4 µl Protoplasts
STARZYCKI i in. 1987 Filtrat — 50% Haploidalne embriony
Filtrate — 50% Haploid embryos
STARZYCKI, BRUN 1990 Grzybnia Hypokotyle
Mycelium Hypocotyls
STARZYCKI i in. 1995b Grzybnia lub piknospory Łodygi
Ansan-Melayah i in. (1995 i 1997) skrzyżowali patotypy L. maculans PG-3 i PG-4 i otrzymali siedem form o zróżnicowanej patogeniczności. Patotypy te posłużyły do inokulacji odmian, podatnej Westar oraz częściowo odpornej Quinta. Patotyp PG-3 nie powodował porażenia roślin odmiany Quinta, z kolei patotyp PG-4 porażał w równym stopniu obie odmiany. Potomstwo patotypów PG-3 i PG-4 użyto następnie do inokulacji podanych wyżej odmian rzepaku. Odmiana Westar była porażana przez wszystkie patotypy L. maculans w równym stopniu. Na odmianie Quinta obserwowano porażenie połowy populacji badanych roślin. Na podstawie uzyskanych wyników autorzy sugerują, że odporność roślin podyktowana była jednym genem awirulencji (avrLm1). Ci sami autorzy na podstawie podobnych badań, analizując pierwsze (F1) i drugie (F2) pokolenie roślin
zidentyfikowali dwa następne geny awirulencji. Gugel i in. w 1995 roku krzy-żowali dihaploidalne (DH) linie rzepaku wyprowadzone z częściowo odpornej odmiany Cresor oraz podatnej Westar. Potomstwo roślin F1 inokulowano
wirulentnym izolatem L. maculans (Leroy). Zaobserwowano, że dla pokolenia F1
cecha odporności związana była w dużym stopniu z cytoplazmą mateczną. Rośliny posiadające cytoplazmę z odmiany Cresor odznaczały się znacznie wyższą odpornością na porażenie przez patogena niż rośliny z cytoplazmą odmiany Westar. Ci sami badacze stwierdzają dużą korelację pomiędzy odpornością rzepaku (DH) w stadium siewki a odpornością starszych roślin. Korelacja ta nie została potwierdzona w badaniach australijskich na odmianach jarych rzepaku (Bansal i in. 1993; Ballinger, Salsbury 1995) i polskich na odmianach ozimych, co udokumentowano w rozprawie. Landry w 1994 roku zmapował chromosomy rzepaku jarego typu Canola i zlokalizował na jednym z nich gen odporności na porażenie przez omawianego patogena. Do tego celu użył techniki RFLP oraz różnych starterów RAPD. Najnowocześniejsze badania odporności roślin (Pilet i in. 1997; Foisset i in. 1997) oparte są na mapowaniu cech ilościowych, a wspomniana analiza pozwala na zlokalizowanie genów odporności (QTL – Quantitative Trait Loci). Materiałem do tego typu badań są zazwyczaj linie dihaploidalne (DH) roślin, a najczęściej stosowane są markery typu RAPD oraz SCARs. Francuzi (Pilet i in. 1997) mapowali odporność na porażenie
L. maculans / P. lingam u 152 linii (DH) rzepaku wykorzystując do tego celu 288
markerów DNA. Po dwóch latach hodowli porównano odporność wytworzonej populacji, sprawdzając ją w tych samych warunkach klimatycznych i glebowych. W wyniku badań zidentyfikowano 13 regionów w genomie, z którymi kojarzono odporność na patogena, a cztery z nich były wspólne u analizowanych roślin. Analiza (QTL) pokolenia F2 rzepaku dla różnych warunków prowadzonej hodowli,
zarówno w szklarni, jak i na polu dała takie same wyniki (Pilet i in. 1997).
Na świecie mimo wykorzystania dużego potencjału naukowego oraz środków finansowych, brak jest doniesień o wyhodowaniu odmian rzepaku odpornego na porażenie przez patogena L. maculans / P. lingam. W perspektywie najbardziej
obiecującą drogą w otrzymaniu odpornych odmian rzepaku ozimego na porażenie grzybem L. maculans / P. lingam jest transformacja niespecyficznych genów, wa-runkujących odporność roślin na najgroźniejsze patogeny pochodzenia grzybowego.
Literatura
Alabouvette C. 1969. Contribution a l’etude des modes de conservation et de dissemination de
P. lingam (Tode) Desm. Theses de Docteur de 3eme cycle (B.V.).
Alabouvette C., Brunin B., Louvet J. 1974. Recherche sur la maladie du colza due a L. maculans (Desm.) Ces. et de Note. Pouvoir infectieux des pycnospores et sensibilite varietale. Ann. Phyt. 6 (3), 265-275.
Ansan-Melayah D., Rouxel T., Balesdent M.H. 1995. Tetrad analysis of Leptosphaeria maculans interaction with Brassica napus cultivars. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995 vol. 4: 1251-1253.
Ansan-Melayah D., Balesdent M.H., Delourme R., Pilet M.L., Renard M., Tanguy X., Rouxel T. 1997. Gene-for-gene interactions in the Leptosphaeria maculans – Brassica napus pathosystem. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 48.
Arseniuk E. 1995. Odporność roślin uprawnych na stresy biologiczne i fizyczne. Materiały 2 Krajo-wego Sympozjum: Odporność roślin na choroby, szkodniki i niesprzyjające czynniki środowiska, 12-14 września 1995, IHAR Radzików: 19-37.
Balesdent M.H., Penaud A., Ansan-Melayah D., Bertrandy J., Mendes-Pereira E., Peres A., Poisson B., Rouxel T. 1997. First mapping of populations of Leptosphaeria maculans in France. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France:191.
Ballinger D.J., Salsbury P.A. 1995. Selection techniques for blackleg resistance in canola. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1260-1262.
Bansal V.K., Kharbanda P.D., Stringam G.R., Thiagarajah M.R., Tewari J.P. 1993. A comparison of greenhouse and field screening methods for blackleg resistance in doubled haploid lines of Brassica napus. Plant Disease 78: 276-281.
Barbetti M.J. 1975. Effects of temperature on development and progression in rape of crown canker caused by Leptosphaeria maculans. Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry 15 (76): 705-708.
Bonman J.M., Delwich P.A., Gabrielson R.L., Williams P.H., 1981. Virulence of Phoma lingam to cabbage. Plant disease 65/119: 865-867.
Brun H., Chevre A.M., Somda I., Renard M. 1995. Characterization of Leptosphaeria maculans populations in relation to Brassica nigra resistance to blackleg. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1257-1259.
Brun H., Levivier S., Somda I., Chevre A.M., Renard M. 1997a. An experimental approach to evaluate the potential durability of new sources of resistance to Leptosphaeria maculans introduced into oilseed rape lines. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 187.
Brun H., Levivier S., Eber F., Renard M., Chewre A.M. 1997b. Electrophoretic analysis of natural population of Leptosphaeria maculans directly from leaf lesion. Plant Pathology 46: 147-154. Brunin B., Lacoste L. 1970. Recharche sur la maladie du colza due a L. maculans (Desm.) Ces. et de
Chen C.Y., Seguin-Swartz G. 1997. Reaction of wild Crucifers to Phoma lingam, the causal agent of blackleg of Crucifers. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 190.
Chevre A.M., Eber F., This P., Barret P., Brun H., Tanguy X., Renard M. 1995. Establishment of a chromosomic map and blackleg resistance analyses from Brassica napus-Brassica nigra addition and recombinant lines. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1217-1219.
CETIOM, 1985. Techniques for the artificial contamination of oilseed rape in trial plots. Phoma
lingam blackleg / stem canker: 21-25.
Delwiche P.A. Williams P.H., 1979. Screening for resistance to blackleg of crucifers in the seedling stage. In: Proc. Eucarpia Cruciferae 1979, Conference, Wageningen: 164-170.
Demarch G., Petrie G.A., Seguin-Swartz G. 1986. Virulence and culture filtrate phytotoxicity in
L. maculans: Perspectives for in vitro selection. Canadian J. of Plant Path. 8: 422-428.
Dubois M., Grison R., Leguay J.J., Pignard A., Topek A. 1992. Recombinant gene coding for a protein having an endochitinas activity. European Patent Application EP#WO 92/01792. Eber F., Brun H., Letanneur J.C., Tanguy X., Renard M., Chevre A.M. 1997. Efficiency of B. nigra
blackleg resistance for oilseed rape improvement. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 221.
Foisset N., Cheung W.Y., Hubert N., Tuvesson S., Happstadius I., Landry B.S. 1997. Development of PCR markers linked to a blackleg disease resistance gene. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 105. Gerdemann M., Sacristan M.D. 1986. Attempts to transfer resistance to Phoma lingam from Brassica
juncea and Brassica carinata to Brassica napus through interspecific hybridization followed by
ovule culture. In: Genetic Manipulation in Plant Breeding: 149-151.
Gerdemann-Knorck M., Stenschke C., Penkert M., Schieder O. 1995. Disease-resistant Brassica plants obtained by somatic hybridization. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1263-1265.
Giamoustaris A., Mithen R. 1995a. Modifying leaf glucosinolates in oilseed rape and its effects upon pest and pathogen interactions. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1220-1222.
Giamoustaris A., Mithen R. 1995b. The effect of modifying the glucosinolate content of leaves of oilseed rape (Brassica napus ssp. oleifera) on its interaction with specialist and generalist pests. Ann. appl. Biol., 126: 347-363.
Glimelius K., Djupsjobacka M., Fellner-Feldegg H. 1986. Selection and enrichment of plant protoplast heterokaryons of Brassicaceae by flow sorting. Plant Sc. 45: 133-141.
Greenland A.J., Attenborough S., Modhwadia D., Ray J., Stenning K., Evans I.J. 1997. Genetic modification for improved pest and disease resistance. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 40.
Grezes-Besset B., Grison R., Villeger M.J., Nicolas C., Topan A. 1995. Field testing against four fungal pathogens of transgenic Brassica napus constitutively expressing a chitinase gene. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 3: 781-783.
Gugel R.K., Seguin-Swartz G., Rakow G.F.W. 1995. Comparison of cotyledon and adult plant assays and selection of blackleg resistant lines of oilseed rape using doubled haploid progeny. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1266-1268.
Gugel R.K., Seguin-Swartz G. 1997. Introgression of blackleg resistance from Sinapis alba into
Brassica napus. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas,
23-27 September 1997, Rennes, France: 222.
Hammond-Kim E., Levis B.G., Musa M. 1985. A systemic pathway in infection of oilseed rape plants by L. maculans. Plant Path. 34: 557-565.
Helms K., Cruickshane I.A.M. 1979. Germination Inoculation Technique for screening cultivar of oilseed rape and mustard for resistance to L. maculans. Phyt. Z. 95: 76-86.
Howlett B.J., Plummer K.M., Williams R.S.B. 1995. Molecular analysis of the blackleg fungus
Leptosphaeria maculans, the causal agent of blackleg of rapeseed. Rapeseed today and
tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 2: 572-573. Howlett B.J. 1996. Application of pulsed field gel electrophoresis to the study of genomes of fungal
pathogens of plants. Australasian Plant Pathology 25: 219-225.
Humperson J.F.M. 1986. The occurrence of virulent pathotypes of L. maculans in Brassica seed crops in England. Plant Path. 35: 224-231.
Jędryczka M., Kachlicki P. 1996. Zróżnicowanie kariotypów polskich szczepów Tox0 grzyba Phoma
lingam. IHAR, Rośliny Oleiste, tom XVII, zeszyt 1: 189-193.
Jędryczka M. 1997. Zastosowanie elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym (PFGE) do badań nad chromosomami grzybów fitopatogenicznych. VII Krajowa Konferencja „Grzyby mikros-kopowe — patogeny roślin i ich toksyczne metabolity”, 20.02.1997: 4-6.
Jędryczka M., Lewartowska E., Fitt B. 1997a. Comparison between Polish and UK isolates of Leptosphaeria maculans, cause of stem canker of winter oilseed rape. I. Pathogenicity evaluation. XI Meeting of Working Group „Integrated Control in Oilseed Crops” Poznań, 10-12 April 1997, poster nieopublikowany.
Jędryczka M., Balesdent M.H., Rouxel T., Fitt B. 1997b. Comparison between Polish and UK isolates of Leptosphaeria maculans, cause of stem canker of winter oilseed rape. III. Comparison of DNA by rep-PCR. XI Meeting of Working Group „Integrated Control in Oilseed Crops” Poznań, 10-12 April 1997, poster nieopublikowany.
Kachlicki P., Jędryczka M., Fitt B. 1997. Comparison between Polish and UK isolates of Leptosphaeria
maculans, cause of stem canker of winter oilseed rape. II. Secondary metabolites production.
XI Meeting of Working Group „Integrated Control in Oilseed Crops” Poznań, 10-12 April 1997, poster nieopublikowany.
Klodt-Bussmann E., Paul V.H. 1995. Investigations on natural disease resistance of 6 oilseed rape cultivars for minimizing application of fungicide in integrated production from 1992/93. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1243-1245.
Krzymański J. 1981. Odziedziczalność i heterozja niektórych cech u rzepaku ozimego dwuzerowego. Wyniki badań nad rzepakiem ozimym za lata 1978-79. IHAR Radzików: 28-46.
Kuswinanti T., Sock J., Hoppe H.H. 1995. Variation in virulence of aggressive isolates of Leptosphaeria
maculans based on cotyledon reactions on an extended differential set. Rapeseed today and
tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1248-1250.
Kuswinanti T., Koopmann B., Hoppe H.H. 1997. Subgrouping of aggressive (TOX+) Phoma
lingam isolates based on cotyledon reactions on an extended differential set and occurrence
of pathogenicity subgroups and races in Germany. XI Meeting of Working Group „Integrated Control in Oilseed Crops” Poznań, 10-12 April 1997, poster nieopublikowany.
Landry B. 1994. Identifying genes for disease resistance in canola. PBI Bulletin, November 1994: 1-3. McGee D.C., Petrie G.A. 1978. Variability of L. maculans in relation to black-leg of oilseed rape.
Magrath R., Mithen R. 1993. Maternal effect on the expression of individual aliphatic glucosinolates in seeds and seedlings of Brassica napus. Plant Breeding 111: 249-252.
Mithen R. 1996. Informacja własna z wyjazdu służbowego do Anglii w dniach 14-17.12.1996. Parkin I., Magrath R., Keith D., Sharpe A., Mithen R., Lydiate D. 1994. Genetics of aliphatic
glucosinolates. II. Hydroxylation of alkenyl glucosinolates in B. napus. Heredity 72: 594-598. Pedras M.S.C. 1995. New Phytotoxins from the blackleg fungus. Rapeseed today and tomorrow.
9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 2: 619-621.
Pedras M.S.C., Sorensen J.L. 1995. High-performance liquid chromatographic analysis of phytotoxins from the blackleg fungus. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 2: 622-624.
Penaud A. 1995. Protection fungicide contre le Phoma du colza. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995.vol. 3: 995-997.
Pilet M.L., Delourme R., Foisset N., Renard M. 1997. Mapping of QTL contributing to blackleg and light leaf spot field resistance in winter rapeseed. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 93.
Plieske J., Struss D. 1997. Inheritance and mapping of resistance genes from B-genome of Brassica against Phoma lingam in Brassica napus. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 19.
Plummer K.M., Howlett B.J. 1995. Inheritance of chromosomal length polymorphisms in the ascomycete Leptosphaeria maculans. Mol Gen Genet. 247: 416-422.
Pound G.S. 1947. Variability in P. lingam. J. of Agr. Research Washington D.C. 75 (4): 113-132. Roussel S., Nicole M., Brun H., Renard M. 1997. Cytology of resistance to Leptosphaeria maculans
conferred to Brassica napus by a Brassica juncea gene. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 186.
Rouxel C., Fritz Y.C., Kollman A., Boudquet J.F. 1988. Biology effects of sirodesmin. Pl., a phytotoxin produced by L. maculans. Plant Sc. 57: 45-53.
Sacristan M.D., Gerdemann M. 1986. Different behaviour of Brassica juncea and Brassica carinata as sources of Phoma lingam resistance in experiments of interspecific transfer to B. napus. Plant Breeding 97: 304-314.
Sacristan M.D., Braatz C. Gerdeman-Knorck M., Schieder O. 1989. Experiments on transfer of disease resistance within the genus Brassica by asymmetric somatic hybridization. Proceedings of XII Eucarpia Congress, Poster: 11-12.
Sadowski J. 1997. Elektroforeza chromosomów w pulsującym polu elektrycznym. VII Krajowa Konferencja „Grzyby mikroskopowe — patogeny roślin i ich toksyczne metabolity”, IGR Poznań, 20.02.1997: 1-3.
Sansford C. 1995. Oilseed rape: development of canker (Leptosphaeria maculans) and its effect on yield. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 2: 577-579.
Scholze P., Hammer K. 1997. Evaluation of resistance to Plasmodiophora, Alternaria spec. and
Phoma Brassica. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas,
23-27 September 1997, Rennes, France: 54.
Seguin-Swartz G., Gugel R.K. 1995. Characterization of weakly virulent mutants from the virulent strain of Leptosphaeria maculans. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 2: 616-618.
Sock J., Mennen H., Hoppe H.H. 1995. Pathogenicity of sirodesmin-deficient mutants of
Leptosphaeria maculans. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress,
Somda I., Brun H., Chevre A-M., Renard M. 1995. Variability of Leptosphaeria maculans towards
Brassica juncea resistance introduced into Brassica napus. Rapeseed today and tomorrow.
9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1254-1256.
Somda I., Renard M., Brun H. 1996. Morphology, pathogenicity and isozyme variation amongst French isolates of Leptosphaeria maculans recovered from Brassica juncea cv. Picra. Plant Pathology 45: 1090-1098.
Starzycki M., Jędryczka M., Krzymański J., Frencel I.M., Lewartowska E. 1987. In vitro preliminary studies on susceptibility resistance response of oilseed winter rape haploid embryos to Phoma
lingam culture filtrates contained in agar media. Proceedings V Polish Tissue Culture
Conference, Skierniewice: 36.
Starzycki M., Brun H, 1990. Testowanie roślin rzepaku ozimego na Phoma lingam stosując do inokulacji grzybnię patogena. Zesz. problem. IHAR. Wyniki badań nad rzepakiem ozimym: 119-123. Starzycki M., Starzycka E., Kachlicki P. Jędryczka M., Pszczoła J. 1995b. Examination of chosen
aggressive pathotypes of Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. obtained from resistant forms of
Brassica napus L. Rapeseed today and tomorrow 9th International Rapesed Congress,
Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 2: 628-630.
Steinbach P. 1995. „Early wilting” of winter oilseed rape caused by abiotic factors and secondary pathogens in the spring of 1994 in northern Germany. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 2: 592-594.
Szklarczyk M. 1996. Markery izoenzymatyczne. Zastosowanie metod biotechnologicznych w hodowli roślin, Drukrol, Kraków: 90-98.
Taylor J. 1994. Diagnostic kits to detect fungi causing blackleg. PBI Bulletin, November 1994: 7. Thomas E., Wenzel G. 1975. Embriogenesis from microspores of B. napus. Z. Pflanzenzüchtg. 74: 77-81. Thomas J.E., Wright I.R. 1995. Evaluation of disease resistance in UK performance trials of oilseed
rape. Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 4: 1234-1236.
Thomas J., Wedgwood E.F. 1997. Potential for exploiting resistance to stem canker (Leptosphaeria
maculans) in cultivars of winter oilseed rape. XI Meeting of Working Group „Integrated Control
in Oilseed Crops” Poznań, 10-12 April 1997, poster nie opublikowany.
Thurling N., Venn L.A. 1977. Variation in the response of rapeseed (Brassica napus et Brassica
campestris) cultivars to blackleg (L. maculans) infection. Aust. J. Exp. Agr. and Animal
Husbandry Vol., 17 June: 445-452.
Thurwachter F., Garbe V., Hoppe H.H. 1995. Studies on decision models for the control of blackleg (Leptosphaeria maculans). Rapeseed today and tomorrow. 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7 July 1995, vol. 3: 992-994.
Voigt K., Kredics L., Wöstemeyer J. 1997. The expression of cellulolytic enzymes secreted by the blackleg fungus Phoma lingam (Leptosphaeria maculans) during disease development on its host plant oilseed rape (Brassica napus). (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 183.
Wahlberg S., Dixelius C. 1997. Studies of Phoma lingam resistance. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 226. Winter H., Sacristan M.D. 1997. Characterization of dihaploid lines from backcrosses of Brassica
napus L. x Brassica juncea (L.) Czern. by chromosome numbers, isozymes and resistance tests
against Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not. (poster), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes, France: 187. Wood P., Barbetti M. 1977. A study on the inoculation of rape seedlings with ascospores and
pycnidiospores of the blackleg. Disease causal agent L. maculans. J. Aust. Inst. Agr. Science March/June.
