Zastosowanie badań molekularnych w rozpoznawaniu i różnicowaniu chorób zakaźnych

(1)

Praca poglądowa

Forum Zakażeń 2013;4(6):347–350 © Evereth Publishing, 2013

Ewa Balcerczak

Zastosowanie badań molekularnych

w rozpoznawaniu i różnicowaniu chorób

zakaźnych

Application of molecular analysis in the diagnosis and differentiation of infectious

diseases

} Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakład Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi, ul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódź, Tel./Fax: (42) 677 91 30, e-mail: ewa.balcerczak@umed.lodz.pl

Wpłynęło: 27.09.2013 Zaakceptowano: 24.10.2013

Streszczenie: Techniki biologii molekularnej znalazły szerokie

zastosowanie w diagnostyce (w tym diagnostyce chorób zakaź-nych), tworząc nowy obszar badań na poziomie molekularnym. Diagnostyka molekularna jest oparta na analizie kwasów nukle-inowych, która pozwala na: wiarygodną identyfikację patogenów, diagnostykę różnicową, epidemiologię na poziomie molekular-nym, a także szybkie określenie lekowrażliwości oraz monitoro-wanie skuteczności terapii. Takie badania stanowią najczęściej na-rzędzie uzupełniające i nie mają na celu zastąpienia klasycznych metod, wykorzystywanych powszechnie w rozpoznawaniu i róż-nicowaniu chorób zakaźnych. Należy jednak podkreślić, że w wie-lu przypadkach jedynie oznaczenia prowadzone tymi technikami – charakteryzujące się wysoką czułością i swoistością diagnostycz-ną – dostarczają w krótkim czasie wiarygodnych wyników będą-cych podstawą rozpoznania choroby oraz dalszego postępowania klinicznego.

Słowa kluczowe: choroby zakaźne | diagnostyka molekularna | PCR Abstract: Molecular biology techniques are widely used in the

diagnosis of this infectious disease by creating a new field of analysis at the molecular level. Molecular diagnostics is based on the analysis of nucleic acids which allows for reliable identifica-tion of pathogens, differential diagnosis, epidemiology at the mo-lecular level as well as the rapid determination of drug sensitivity and monitoring the effectiveness of therapy. Such tests are often complementary tool, and are not intended to replace traditional methods commonly used in the diagnosis and differentiation of infectious diseases. It should be noted that in many cases only analysis carried these techniques, which are characterized by high diagnostic sensitivity and specificity could supply reliable results as a basis for further diagnosis and clinical management.

Key words: infectious diseases | molecular diagnostics | PCR

Wstęp

W codziennej diagnostyce chorób zakaźnych, opar-tej na badaniach molekularnych, wykorzystuje się przede wszystkim: łańcuchową reakcję polimerazy (ang. polyme-rase chain reaction – PCR), kilka modyfikacji tej techniki, a także wybrane metody hybrydyzacyjne [1, 2]. Nowym narzędziem, które zaczyna wkraczać również w ten obszar diagnostyki, są mikromacierze. Największym osiągnięciem jest jednak wprowadzanie do laboratoriów zautomatyzowa-nych analizatorów, pozwalających na upowszechnianie tego rodzaju oznaczeń poprzez uproszczenie procedur prowa-dzących do uzyskania poprawnego wyniku.

Dobór metody diagnostycznej zależy od potrzeb oraz stopnia znajomości sekwencji materiału genetycznego pa-togenów. Badanie rozpoczyna się od wyizolowania kwasu nukleinowego, kolejny etap stanowi właściwa analiza z wy-korzystaniem wymienionych wcześniej metod. Materiałem do badania może być każdy materiał biologiczny, w tym: krew, płyn mózgowo-rdzeniowy, stawowy, otrzewnowy, opłucnowy, wymaz, bioptat lub mocz. Należy pamiętać o ja-łowym pobieraniu materiału w celu zapobiegania kontami-nacji i uzyskiwania wyników fałszywie dodatnich. W przy-padku krwi konieczne jest pobranie materiału do probówki z antykoagulantem innym niż heparyna, która hamuje re-akcje PCR, przez co przyczynia się do uzyskania wyników fałszywie ujemnych [3].

Metody oparte o łańcuchową reakcję

polimerazy

Podstawowym narzędziem jest polimerazowa reakcja łańcuchowa, która umożliwia szybką syntezę dużej ilości

Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.

(2)

348 © Evereth Publishing, 2013 Forum Zakażeń 2013;4(6)

wybranego fragmentu DNA. PCR jest odzwierciedleniem in

vitro procesu replikacji, w którym dochodzi do powielenia

fragmentów kwasów nukleinowych [4]. Pozwala na namno-żenie – za pomocą komplementarnych swoistych starte-rów – wybranej na potrzeby analizy sekwencji. Otrzyma-nie produktu reakcji PCR, którego ocena odbywa się przez elektroforezę w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, w przypadku poszukiwania patogenów na drodze analizy jakościowej dostarcza pożądanej informacji diagnostycznej „obecny” lub „nie”. Jednocześnie PCR jest metodą, która może poprzedzać następne działania, przez co jest trakto-wana jako narzędzie umożliwiające zwiększenie ilości mate-riału genetycznego, który może zostać wykorzystany do dal-szych badań.

Łańcuchowa reakcja polimerazy składa się z trzech cy-klicznie powtarzanych etapów (około 30–40 cykli), przebie-gających w odpowiednich temperaturach:

t denaturacji DNA (90–95°C);

t annealingu, czyli przyłączenia starterów na drodze swoistej hybrydyzacji (45–70°C, zależnie od składu nukleotydowego starterów);

t elongacji, czyli wydłużania/syntezy nici DNA (około 72°C – optymalna temperatura dla pracy polimerazy) [5].

Metody oparte na PCR charakteryzują się wysoką czu-łością i specyficznością, dodatkowo w wielu przypadkach diagnostyki chorób zakaźnych skracają czas oczekiwania na wyniki (w porównaniu z klasycznymi metodami stoso-wanymi w diagnostyce mikrobiologicznej) [2]. Przykładem zastosowania łańcuchowej reakcji polimerazy jest wykry-wanie patogenów przed pojawieniem się objawów choro-bowych lub w okresie „okienka serologicznego”. Obecnie analiza jakościowa oparta o reakcję PCR jest wykorzystywa-na do identyfikacji wirusów: HPV (ang. Human Papilloma Virus, wirus brodawczaka ludzkiego), zwłaszcza wysokoon-kogennych HPV 16 i 18, HSV 1 i 2 (ang. Herpes Simplex Virus, wirus opryszczki pospolitej), CMV (ang. Cytomega-lovirus, wirus cytomegalii), EBV (ang. Epstein-Barr Virus, wirus Epsteina-Barr), HBV (ang. Hepatitis B Virus, wiru-sowe zapalenie wątroby typu B – wzw B) oraz bakterii, np.:

Mycoplasma hominis, Mycoplasm genitalium, Ureaplasma urealyticum, Neisseria gonorrhoae, Chlamydia pneumoniae, Bordetella pertussis, Legionella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae.

Oprócz reakcji PCR, w diagnostyce chorób zakaźnych stosowanych jest również kilka jej modyfikacji, do których należą: PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR), multiplex-PCR, gniazdowy PCR (ang. nested PCR) czy też PCR poprzedzony reakcją odwrotnej transkrypcji [4].

PCR w czasie rzeczywistym jest metodą ilościową wy-korzystującą barwniki niespecyficzne lub – w przypadku diagnostyki chorób zakaźnych – swoiste sondy do moni-torowania przebiegu reakcji [6]. Real-time PCR jest

sto-sowany do oceny zaawansowania procesu chorobowego poprzez określenie ilości kopii (np. wirusa). Ta technika pozwala na zróżnicowanie infekcji przetrwałej od aktyw-nej. W przypadku flory komensalnej daje natomiast moż-liwość określenia dopuszczalnego bezpiecznego poziomu. W obydwu wymienionych przykładach, wykonując analizę ilościową i posługując się wartościami odcinającymi, moż-na stwierdzić, czy u pacjenta poziom danego patogenu jest podwyższony. Jednym z najważniejszych zastosowań meto-dy real-time jest monitorowanie chorych w celu wczesnego wykrycia zakażenia (przy wynikach fałszywie ujemnych dla klasycznych metod) oraz oceny skuteczności zastosowanej terapii. Przykładem może być monitorowanie pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego pod kątem zakażenia wi-rusem CMV. W przypadku stwierdzenia infekcji, wyniki uzyskiwane techniką real-time PCR są wykorzystywane do kontroli leczenia poprzez ocenę np. zmniejszenia ilości kopii wirusa [7]. Innym przykładem jest wykrywanie wirusa WZW typu B, w przypadku którego po analizie jakościowej przeprowadza się analizę ilości kopii DNA wirusa w celu oceny stanu wiremii. Real-time PCR jest zalecany również w diagnostyce boreliozy (Borrelia burgdorferii sensu lato), gdzie wykrywa się ilość kopii DNA trzech gatunków bakte-rii: Borrelia burgdorferii sensu stricto, Borrelia garinii

i Bor-relia afzelii przede wszystkim w bioptatach ze zmian

skór-nych, a także w płynach ustrojowych.

Należy pamiętać, że analiza ilościowa w większości przy-padków powinna być poprzedzona oceną jakościową, po-nieważ tylko w sytuacji potwierdzenia obecności danego patogenu dalsze badanie ilościowe ma sens [8].

Kolejną modyfikacją reakcji PCR jest multiplex-PCR. Dzięki wykorzystaniu kilku par swoistych starterów umoż-liwia namnażanie kilku fragmentów DNA (jednego lub różnych genów) w jednej mieszaninie reakcyjnej (jednej probówce). Dodatkowo w tej reakcji obok genu badane-go/ genów badanych możliwe jest namnażanie tzw. genu referencyjnego (standardu wewnętrznego), pełniącego rolę odnośnika lub swoistej kontroli reakcji. Jest to możli-we dzięki zastosowaniu genu metabolizmu podstawomożli-wego, tzw. (ang.) housekeeping gene, który jest obecny w każdej komórce w niezmiennej ilości kopii. Multiplex-PCR ma za-stosowanie w wykrywaniu kilku, a nawet kilkudziesięciu patogenów jednocześnie, co pozwala na przyspieszenie dia-gnostyki chorób bakteryjnych bądź wirusowych, zmniejsze-nie ilości pobieranego materiału oraz ograniczezmniejsze-nie kosztów. Multiplex-PCR okazał się niezwykle przydatny w diagno-styce sepsy, w której w krótkim czasie oceniany jest panel kilkunastu lub kilkudziesięciu patogenów (w tym grzybów) z jednoczesną wstępną oceną lekowrażliwości [9, 10]. Tech-nika multiplex-PCR jest coraz częściej wykorzystywana w testach diagnostycznych, w których ocenia się w jednej mieszaninie reakcyjnej panel patogenów związanych z: in-fekcjami układu moczowo-płciowego, układu

oddechowe-Artykuł jest dostępny na zasadzie dozwolonego użytku osobistego. Dalsze rozpowszechnianie (w tym umieszczanie w sieci) jest zabronione i stanowi poważne naruszenie przepisów prawa autorskiego oraz grozi sankcjami prawnymi.

(3)

349 © Evereth Publishing, 2013

Forum Zakażeń 2013;4(6)

go, zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych lub infekcjami grzybiczymi.

W przypadku gdy materiał do badań stanowi RNA, ko-nieczne jest zastosowanie metody PCR z odwrotną trans-kryptazą (ang. reverse transcriptase-PCR – RT-PCR), w któ-rej reakcję PCR poprzedza proces odwrotnej transkrypcji, w którym to RNA zostaje przepisany na komplementarny DNA (ang. complementary DNA – cDNA) przy użyciu en-zymu odwrotnej transkryptazy, pochodzącej z ptasich wi-rusów. Tak uzyskane cDNA jest poddawane namnażaniu w klasycznym PCR. Metoda ta służy do diagnostyki chorób zakaźnych, najczęściej wykrywania wirusów (których ma-teriał genetyczny stanowi właśnie RNA) oraz do oceny eks-presji genów markerowych. Przykładem jest wykrywanie RNA wirusa WZW typu C [11, 12]. Innym zastosowaniem RT-PCR jest badanie mRNA (transkryptu) wirusa HPV w celu wykrycia infekcji przetrwałej, podczas której może dojść do nasilenia ekspresji wirusowych onkogenów E6 i E7, co może z kolei prowadzić do zmian nowotworowych w ko-mórkach szyjki macicy [13].

Najczęściej wykorzystywaną modyfikacją klasycznej re-akcji łańcuchowej polimerazy jest gniazdowy PCR, który polega na przeprowadzeniu następujących po sobie dwóch reakcji PCR, gdzie produkt pierwszej reakcji staje się ma-trycą do drugiej reakcji [4]. Wykorzystuje się dwie pary starterów komplementarnych do poszukiwanego frag-mentu o różnej wzajemnej lokalizacji. W pierwszej reakcji PCR wykorzystywana jest para starterów obejmująca długi fragment, w drugiej stosuje się startery komplementarne do sekwencji znajdujących się wewnątrz fragmentu DNA namnożonego w pierwszej reakcji. Zastosowanie dwóch następujących po sobie PCR pozwala na zwiększenie specy-ficzności reakcji i zmniejszenie ryzyka uzyskania wyników fałszywie negatywnych w przypadku patogenów, które wy-stępują w niewielkiej ilości w organizmie człowieka. Metoda ta jest zalecana w diagnostyce chorób zakaźnych ze względu na wysoką czułość i swoistość.

Metody oparte o hybrydyzację

Drugą grupę metod diagnostycznych stanowią metody oparte o hybrydyzację.

Hybrydyzacja jest techniką pozwalającą na identyfikację i lokalizację określonych sekwencji nukleotydowych. Istotą tego procesu jest zdolność kwasów nukleinowych do two-rzenia stabilnych dwuniciowych struktur pomiędzy dwoma komplementarnymi jednoniciowymi fragmentami. Na pro-ces hybrydyzacji składają się następujące etapy: izolowanie kwasu nukleinowego, elektroforeza, denaturacja termiczna/ chemiczna, transfer i unieruchomienie badanego kwasu nu-kleinowego na filtrze nylonowym lub nitrocelulozowym, hy-brydyzacja z wyznakowaną sondą molekularną, wypłukanie

niezwiązanych fragmentów sondy oraz detekcja powstałych dupleksów (zależnie od sposobu wyznakowania sondy) [1].

Do poszukiwania DNA stosuje się hybrydyzację typu (ang.) southern blot, której istotą jest tworzenie komplek-sów DNA–DNA, a celem – poszukiwanie określonej se-kwencji w mieszaninie kwasów nukleinowych, otrzymanej w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi. Metoda ta może służyć do wykrycia „obcego” DNA lub potwier-dzenia bądź wykluczenia obecności transgenu w genomie biorcy. Podczas badania RNA stosuje się hybrydyzację (ang.) northern blot, która jest oparta na tworzeniu hybry-dów RNA–DNA. W przypadku mRNA nie ma konieczności trawienia enzymami restrykcyjnymi, więc fragmenty kwa-sów nukleinowych poddawane są bezpośrednio elektrofo-rezie i denaturacji, a następnie przenoszone na filtr. mRNA ulega hybrydyzacji z wyznakowaną sondą DNA, a komplek-sy RNA–DNA wykrywa się zależnie od sposobu znakowania sondy.

W celu wykorzystania metod southern i northern blot konieczna jest znajomość sekwencji nukleotydowej mate-riału genetycznego patogenu, którego poszukujemy. Daje to możliwość zaprojektowania sond oligonukleotydowych, które posłużą do potwierdzenia lub wykluczenia obecno-ści zakażenia. Istnieje także trzeci rodzaj analizy hybrydy-zacyjnej, służący do wykrywania konkretnych białek. Jest to metoda western blot, która znalazła zastosowanie w dia-gnostyce boreliozy, zakażeń wirusowych (HIV, HSV) oraz wykrywaniu koronawirusów wywołujących zespół ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej (ang. severe acute respi-ratory syndrome – SARS).

Jednym z najnowszych osiągnięć biologii molekularnej są tzw. mikromacierze (ang. microarray). Mikromacierz stanowi uporządkowany układ sond molekularnych, unie-ruchomionych na nylonowych membranach albo płytkach szklanych bądź plastikowych. Podstawą tej techniki jest przygotowanie sond w postaci jednoniciowego DNA lub oligonukleotydów reprezentujących fragmenty genów i sta-bilne związanie ich z powierzchnią membrany lub płytki w określonej kolejności. Kwas nukleinowy przeznaczony do analizy należy wyznakować i poddać hybrydyzacji z son-dami. Dane uzyskane podczas detekcji są poddawane ana-lizie z zastosowaniem systemów informatycznych. Technika ta jest stosowana m.in. do oceny ekspresji genów, badania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów, panelowej oce-ny wybraoce-nych procesów biochemiczoce-nych oraz dysfunkcji określonych narządów/układów. W 2002 roku Wilson i wsp. wykorzystali mikromacierze do identyfikacji 18 patogenów, wykazując ich wysoką swoistość i czułość, która wynosiła około 10 fg oczyszczonego genomowego DNA i 500 fg DNA patogenu w próbce [14]. Wydawało się, że mikromacierze znajdą zastosowanie w oznaczaniu patogenów wywołu-jących infekcje naturalne, jednakże kolejna dekada poka-zała, że badania tego typu stanowią narzędzie przyszłości

(4)

350 © Evereth Publishing, 2013 Forum Zakażeń 2013;4(6)

dla diagnostyki molekularnej chorób zakaźnych, a obecnie wykorzystywane są głównie w laboratoriach naukowo-ba-dawczych. Nowym zastosowaniem wydaje się być uży-cie mikromauży-cierzy do wykrywania czynników w atakach bioterrorystycznych [15].

Na rynku diagnostycznym pojawiły się również analizato-ry stanowiące zautomatyzowane, zamknięte systemy oparte na technikach molekularnych. Jednym z przykładów urzą-dzeń do diagnostyki molekularnej jest analizator BD MAX™ System (Becton Dikinson Diagnostic), będący zautomaty-zowaną platformą umożliwiającą wykonanie szerokiego zakresu wystandaryzowanych oznaczeń molekularnych. Na analizator ten został opracowany test, będący w pełni zautomatyzowaną metodą opartą o reakcje PCR, służący do wykrywania paciorkowców z grupy B GBS (ang. group B Streptococcus) w wymazach pobranych z pochwy lub od-bytu kobiet ciężarnych. Gatunek ten jest składnikiem flory fizjologicznej, bywa jednak przyczyną groźnych zakażeń wewnątrzowodniowych płodu lub noworodków, a także każeń połogowych u kobiet. Również firma bioMérieux za-proponowała automatyczne systemy do izolowania kwasów nukleinowych (NucliSENS® easyMAG® lub miniMAG®), a także analizator do diagnostyki molekularnej (NucliSENS EasyQ®), pozwalający na namnażanie kwasów nukleinowych oraz detekcję w czasie rzeczywistym w technologii real-time NASBA (ang. Nucleic Acid Sequence Based Amplification). Obecnie dostępne są oferowane przez bioMérieux zestawy do diagnostyki zakażenia wirusem HIV, zakażeń dolnego układu oddechowego spowodowanych RSV (ang. Respira-tory Syncytial Virus), Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia

pneumoniae, a także zakażeń centralnego układu

nerwowe-go wywołanych przez enterowirusy.

Podsumowanie

Diagnostyka molekularna charakteryzuje się dużą czu-łością i swoistością diagnostyczną. Należy jednak pamiętać, że w pracy z tymi technikami może również dojść do po-jawienia się wyników zarówno fałszywie dodatnich, jak i fałszywie ujemnych. Wyniki fałszywie dodatnie, w przy-padku technik biologii molekularnej wykorzystujących PCR, są najczęściej rezultatem kontaminacji próby badanej materiałem genetycznym wprowadzonym z zewnątrz przez

osobę wykonującą badanie bądź też pojawiają się na skutek wykorzystywania sprzętu laboratoryjnego nie spełniającego standardów czystości zalecanych do pracy tymi metodami. Natomiast wyniki fałszywie ujemne pojawiają się w wyni-ku: nieprawidłowego procesu izolowania RNA i/lub DNA, niewłaściwej jakości otrzymanych kwasów nukleinowych, obecności inhibitorów reakcji PCR, a wreszcie doboru nie-właściwego zestawu diagnostycznego w stosunku do bada-nego materiału i poszukiwado bada-nego patogenu.

Konflikt interesów: nie zgłoszono.

Piśmiennictwo

1. Bartkowiak J. Badania molekularne w rozpoznawaniu i różnicowaniu

chorób zakaźnych. Przegl Epidemiol 2003;57(2):381–389.

2. Pieniążek NJ. Diagnostyka chorób infekcyjnych i inwazyjnych. In:

Bal J (ed.). Biologia Molekularna w Medycynie. 1st_{edn. Wydawnictwo}

Naukowe PWN, Warszawa, 2001, pp. 342–356.

3. Kennedy S, Oswald N (eds). PCR Troubleshooting and Optimization: The

Essential Guide Book. 1st_{edn. Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2011.}

4. Słomski R (ed.). Analiza DNA – Teoria i Praktyka. 1st_{edn. Wydawnictwo}

Uniwersytetu Przyrodniczego, Poznań, 2008.

5. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am

1990;262(4):56–61, 64–65.

6. Studzińska A, Tyburski J, Daca P, Tretyn A. PCR w czasie rzeczywistym.

Część I – istota metody i strategie monitorowania przebiegu reakcji. Bio-technologia 2008;1(80):71–85.

7. Krawczyk B. Diagnostyka molekularna w zakażeniach szpitalnych. Post

Mikrobiol 2007;46(4):367–378.

8. Bastien P, Procop GW, Reischl U. Quantitative real-time PCR is not more

sensitive than „conventional” PCR. J Clin Microbiol 2008;46(6):1897–1900.

9. Tsalik EL, Jones D, Nicholson B et al. Multiplex PCR to diagnose

blood-stream infections in patients admitted from the emergency department with sepsis. J Clin Microbiol 2010;48(1):26–33.

10. Lucignano B, Ranno S, Liesenfeld O et al. Multiplex PCR allows rapid and accurate diagnosis of bloodstream infections in newborns and children with suspected sepsis. J Clin Microbiol 2011;49(6):2252–2258. 11. Germer JJ, Zein NN. Advances in the molecular diagnosis of hepatitis C

and their clinical implication. Mayo Clin Proc 2001;76(9):911–920. 12. Chevaliez S, Bouvier-Alias M, Rodriguez C, Soulier A, Poveda JD,

Pawlot-sky JM. The Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HCV test, version 2.0, real--time PCR assay accurately quantifies hepatitis C virus genotype 4 RNA. J Clin Microbiol 2013;51(4):1078–1082.

13. Salimović-Bešić I, Tomić-Čiča A, Smailji A, Hukić M. Comparison of the detection of HPV-16, 18, 31, 33, and 45 by type-specific DNA- and E6/ E7 mRNA-based assays of HPV DNA positive women with abnormal Pap smears. J Virol Methods 2013;194(1–2):222–228.

14. Wilson WJ, Strout CL, DeSantis TZ, Stilwell JL, Carrano AV, Andersen GL. Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using microarray technology. Mol Cell Probes 2002;16(2):119–127.

15. Robertson BH, Nicholson JK. New microbiology tools for public health and their implications. Annu Rev Public Health 2005;26:281–302.