Medycyna Wet. 2010, 66 (10) 680
Praca oryginalna Original paper
Obserwowana w ostatnich latach intensyfikacja pro-dukcji gêsi (zarówno stad reprodukcyjnych, jak i gêsi przeznaczonych do tuczu) oraz szeroki obrót materia-³em hodowlanym na wiecie prowadz¹ do wzrostu za-gro¿enia epidemiologicznego i w konsekwencji wy-buchu chorób zakanych. Wed³ug Samorek-Salamo-nowicz i wsp. (6), przyczyn¹ padniêæ gêsi s¹ przede wszystkim choroby bakteryjne (od 24,5% do 30,0%, w tym g³ównie zaka¿enia wywo³ane przez Salmonel-la, PasteurelSalmonel-la, Mycoplasma i E. coli) oraz zaka¿enia grzybicze (od 15,5% do 20% padniêæ). Niemniej za-ka¿enia wirusowe, w tym najgroniejsza choroba Derz-syego (DD), która stanowi od 16,5% do 19,5% diag-nozowanych przypadków, s¹ istotn¹ przyczyn¹ strat w produkcji. Pomimo stosowanej od 1982 r. w kraju immunoprofilaktyki choroby Derzsyego notowany jest wzrost wystêpowania tej choroby u g¹si¹t pochodz¹-cych od rodziców ze stad szczepionych. Wród czyn-ników wp³ywaj¹cych negatywnie na powstawanie swoistych przeciwcia³ poszczepiennych anty-DDV i serokonwersjê wymienia siê: inwazje nicieni ¿o³¹d-kowo-jelitowych, stres, zaka¿enia bakteryjne i inne zaka¿enia wirusowe (6, 11). W ostatnich latach w Eu-ropie pojawiaj¹ siê nowe jednostki chorobowe gêsi,
wczeniej nie notowane, jak cirkowiroza (8) lub go-r¹czka zachodniego Nilu (5).
Pierwsze doniesienia na temat zaka¿eñ cirkowirusa-mi gêsi (Goose circowirus GoCV) pochodz¹ z 1997 r. z terenów po³udniowej Brandenburgii w Niemczech (8). W du¿ej fermie gêsi (czeskie hybrydy) zaobser-wowano w trakcie okresu produkcyjnego spadek masy cia³a rednio 500 g na ptaka pod koniec 9-tygodnio-wego okresu odchowu oraz istotny wzrost odsetka ptaków wybrakowanych. G¹siêta odchowywa³y siê le pocz¹wszy od pierwszego tygodnia ¿ycia, ale objawy kliniczne w stadzie ograniczy³y siê jedynie do zabu-rzenia (opónienia) wzrostu i opierzania. Obserwacje prowadzone w fermie wskazywa³y, ¿e etiologia przy-czyn strat jest z³o¿ona, wieloprzy-czynnikowa. Nie wyklu-czono równie¿ udzia³u czynnika chorobowego o dzia-³aniu immunosupresyjnym. Szczegó³owym badaniom diagnostycznym poddano gêsi 2- i 9-tygodniowe. W badaniu anatomopatologicznym stwierdzono jedy-nie u jedy-niektórych ptaków ³agodne zmêtjedy-niejedy-nie worków powietrznych. W badaniu histopatologicznym wyka-zano zmiany w narz¹dach limfatycznych, w tym de-plecjê limfocytów w bursie Fabrycjusza, ledzionie i grasicy. Stwierdzono równie¿ obecnoæ
ródcyto-Charakterystyka molekularna krajowych szczepów
cirkowirusów izolowanych od gêsi
MACIEJ KUCZKOWSKI, TOMASZ PIASECKI, ANNA WONIAK, ALINA WIELICZKO
Katedra Epizootiologii z Klinik¹ Ptaków i Zwierz¹t Egzotycznych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, pl. Grunwaldzki 45, 50-366 Wroc³aw
Kuczkowski M., Piasecki T., Woniak A., Wieliczko A.
Molecular characteristics of Polish circovirus strains isolated from geese Summary
Goose circovirus (GoCV) infections are commonly found in geese on European and Asian farms, but the role of GoCV as a causative agent of the problem in geese production has not been established yet. The aim of the study was to investigate the prevalence and molecular characteristics of circovirus infection in commercial geese farms located in South-East Poland. Tissue samples of spleen or bursa of Fabricius from 95 dead geese of different ages have been collected from 28 farms/flocks between April and September 2005. None of the clinical signs and important problems with production were reported during the time of the investigation. A polymerase chain reaction (PCR) was designed for the diagnosis of the infection. From positive samples a C1 gene fragment which encodes the capsid protein (after translation of 250 amino sizes), using two pair of primers has been amplified and a sequencing reaction was performed in both directions. The nucleotide sequences were aligned with the sequences geese circovirus strains obtained from GeneBank by BioEdit sequence alignment editor software using Clustal W multiple alignment algorithm. Prevalence of GoCV was found in 18 (18.9%) spleens or bursa of Fabricius samples from geese from 14 (35.0) flocks. All positive birds were more than 5-weeks-old. The nucleotide sequence of C1 gene fragment of Polish GoCV showed 99% to 84% identity with C1 gene sequenced by Todd et al. (accession number AJ304456 GenBank database).
Medycyna Wet. 2010, 66 (10) 681
Ryc. 1. Drzewo filogenetyczne wykrelone na podstawie sekwencji bia³-ka C1 polskich GoCV i pochodz¹cych z GenBank
Q91EK1 9CIRC - Tood GOCV13
GOCV31 GOCV11 GOCV53
Q8BCC1 9CIRC - Chen Q8AZ13 9CIRC - Chen Q8BCC0 9CIRC - Chen Q8AYZ1 9CIRC - Chen Q3HUU1 9CIRC - Yu Q6GVI7 9CIRC - Yu Q3HUV7 9CIRC - Yu Q3HUW5 9CIRC - Yu Q3HUV3 9CIRC - Yu Q3HUW1 9CIRC - Yu Q8AYW9 9CIRC - Chen Q3HUT3 9CIRC - Yu Q3HUU5 9CIRC - Yu GOCV56 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025
plazmatycznych, zasadoch³onnych cia³ek wtrêtowych w makrofagach grudek ch³onnych bursy Fabrycjusza (praktycznie u wszystkich badanych ptaków). W mi-kroskopie elektronowym wykazano w bursie Fabry-cjusza, grasicy, ledzionie obecnoæ charakterystycz-nych, circovirus-like cz¹stek wirusowych. Natomiast w badaniach mikrobiologicznych wyizolowano z za-tok oko³onosowych oraz z mózgu Riemerella anati-pestifer. W trakcie odchowu w stadzie tym diagnozo-wano równie¿ aspergilozê. Uznano, ¿e zaka¿enie wi-rusem powoduj¹cym zmiany w narz¹dach limfatycz-nych ma charakter immunosupresyjny, co predyspo-nuje do wtórnych zaka¿eñ bakteryjnych i grzybiczych, a w konsekwencji do du¿ych strat
ekono-micznych.
Od tej pory w wielu krajach wiata z roz-winiêt¹, intensywn¹ produkcj¹ gêsi rozpoczê-to monirozpoczê-toringowe badania, maj¹ce na celu wyjanienie przyczyn problemów w produk-cji. W badaniach tych uwzglêdniono równie¿ zaka¿enia wirusowe, w tym cirkowirusowe (1, 2, 7, 10). Równie¿ w Polsce podjêto pró-bê okrelenia prewalencji zaka¿eñ cirkowi-rusowych w stadach gêsi towarowych.
Celem badañ by³o okrelenie czêstotliwo-ci i wystêpowania zaka¿eñ GoCV w stadach gêsi w po³udniowo-zachodniej Polsce oraz charakterystyka molekularna izolatów.
Materia³ i metody
Pomiêdzy kwietniem a sierpniem 2005 r. od 95 pad³ych ptaków pochodz¹cych z 40 ferm gêsi z terenów po³udnio-wo-zachodniej Polski pobrano ledziony lub/i bursê Fabry-cjusza celem izolacji genomowego DNA. W trakcie pobie-rania prób u ptaków nie stwierdzano istotnych objawów klinicznych choroby ani zmian patologicznych. Zgroma-dzone próbki do czasu izolacji DNA przechowywano w temperaturze 20°C. Przed przyst¹pieniem do izolacji DNA tkanki homogenizowano. Izolacjê DNA przeprowa-dzono z zastosowaniem DNeasy kit (QIAGEN), zgodnie z protoko³em za³¹czonym przez producenta.
Do identyfikacji zaka¿eñ GoCV zastosowano metodê PCR z u¿yciem pary starterów dla sekwencji genu rep GoCV: P328f 5-GAC GAA GAT AAT GAA GAA TAT T-3 i P715r 5-AAG GCA GCC ACC CAT A(A/G)A AAT-3 (3). Zastosowana reakcja zosta³a zoptymalizowana. Mie-szanina reakcyjna o objêtoci 25 µl zawiera³a: 16,5 µl wody dejonizowanej; 2,5 µl 10 × stê¿onego buforu Tag z jonami MgCl2; 1 µl Polimerazy RedTag (Sigma); 2,5 µl mieszaniny nukleotydów (0,2 nM ka¿dego z czterech dNTP); 0,25 µl ka¿dego ze starterów (0,1 µM) oraz 2 µl wyizolowanego DNA. Reakcjê PCR przeprowadzono w nastêpuj¹cych warunkach: wstêpna denaturacja 94°C przez 5 min., nastêpnie 30 cykli denaturacja: 94°C przez 1 min., przy³¹czanie starterów: 55°C przez 1 min. i synteza komplementarnego DNA: 72°C przez 1 min. oraz koñco-wa elongacja: 72°C przez 7 min. Wizualizacjê produktu o d³ugoci 388 bp dokonano w 1,5% ¿elu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Uzyskane produkty, dla
po-twierdzenia, zosta³y zsekwencjonowane w Oligo IBB War-szawa z u¿yciem ww. pary starterów.
Kolejnym etapem badañ by³a amplifikacja fragmentu C1 genomu wirusa GoCV (nukleotydy od 1761 do 1009). W tym celu próby genowego DNA pochodz¹ce od gêsi, w których wykryto GoCV, poddano dwóm kolejnym reakcjom PCR z dwoma parami starterów: zestaw 1: 5 TAA ATG CGA GTT TGA TGT GTC T-3, i 5-CAT TTA ACC CCT TCC AAA GAG T-3 (nukleotydy od 1401 do 837) oraz zestaw 2: 5-GTG TGC CTT CTT TCT CTC C-3 i 5-CTG CGT AGG GGT CTA TGT TC-3 (nukleotydy od 1290 do 226). Uzyskane produkty poddano sekwencjonowaniu w obu kie-runkach w Oligo IBB Warszawa. Sekwencje z³o¿ono i po-równano w programie BioEdit metod¹ Clustal, a nastêpnie dokonano translacji. Uzyskane sekwencje porównano tak-¿e z sekwencjami fragmentów C1 genomu GoCV wcze-niej izolowanymi na wiecie i wczewcze-niej umieszczonymi w bazie danych GenBank. Analizê filogenetyczn¹ przepro-wadzono w programie MEGA 4 i uzyskano dendrogram (ryc. 1).
Wyniki i omówienie
W przeprowadzonych badaniach wykryto metod¹ PCR GoCV w narz¹dach wewnêtrznych 18 (18,9%) ptaków pochodz¹cych ze stad towarowych gêsi z tere-nu zachodnio-po³udniowej Polski. Zbadane próbki od ptaków w wieku 1-3 dni nie wykaza³y obecnoci ge-nomu GoCV, natomiast u ptaków starszych, 5-7-ty-godniowych, jak i pod koniec tuczu, tj. 14-16-tygod-niowych wykazano obecnoæ genomu GoCV, odpo-wiednio, u 33,3% i 46,1%. Zaka¿one ptaki
pochodzi-Medycyna Wet. 2010, 66 (10) 682
³y z 14 ró¿nych stad (35,0%), przy czym w stadach gêsi powy¿ej 5 tygodni ¿ycia czêstoæ zaka¿eñ wyno-si³a ponad 60% (tab. 1).
W ramach badañ przeprowadzonych przez autorów, uzyskano 5 ró¿nych sekwencji genu C1 koduj¹cego bia³ko kapsydu polskich izolatów GoCV (nukleotydy 1009-1761). Porównano je z sekwencjami GoCV izo-lowanymi wczeniej na ca³ym wiecie, pozyskanymi z bazy danych GenBank. Stwierdzono, ¿e sekwencje badanych nukleotydów genu C1 polskich izolatów GoCV wykazuj¹ od 99% do 84% podobieñstwo z sek-wencjami izolatów pochodz¹cymi z Niemiec, Chin i Tajwanu. Analiza filogenetyczna tego genu wykaza-³a, ¿e tworz¹ jeden du¿y klaster, wyranie wyodrêb-niaj¹c polski izolat GOCV56, którego sekwencja nuk-leotydów jest nieco odmienna od zawartych w Gen-Bank. Z kolei w obrêbie tej du¿ej grupy wyodrêbniaj¹ siê mniejsze klastery izolaty azjatyckie tworz¹ce 3 mniejsze grupy, oraz czwarta europejska zawiera-j¹ca izolat niemiecki z czterema polskimi (GOCV13, GOCV31, GOCV13 i GOCV53) (ryc. 1).
Podobny monitoring stad gêsi towarowych w kie-runku zaka¿eñ GoCV przeprowadzony na Wêgrzech w latach 2000-2001 obejmowa³ 76 stad gêsi (1). Obec-noæ DNA cirkowirusa gêsi (GoCV) (metoda PCR) wykazano u 64,5% ptaków pochodz¹cych z 49 ró¿-nych stad. Objawy kliniczne choroby obserwowano jedynie w 33 stadach pozytywnych w kierunku zaka-¿enia GoCV. Manifestowa³y siê one kulawiznami, opónieniem rozwoju, objawami ze strony uk³adu od-dechowego i nerwowego oraz ogóln¹ z³¹ kondycj¹ pta-ków. Kulawizny i opónienie rozwoju by³y najczêst-szymi z notowanych objawów (odpowiednio, w 21 i 7 stadach). Zmiany histopatologiczne w bursie Fabry-cjusza, typowe dla zaka¿enia cirkowirusami, potwier-dzono jedynie u ptaków pochodz¹cych z 3 stad. Do-datkowo przeprowadzone na Wêgrzech badania labo-ratoryjne w monitorowanych stadach pozwoli³y na zdiagnozowanie infekcji reowirusowych, parwowiru-sowych, polyomawirusowych oraz zaka¿eñ wywo³a-nych przez Salmonella, Pasteurella, Mycoplasma, Streptococcus i Candida. W wiêkszoci przypadków infekcje te stwierdzano zarówno w stadach zaka¿o-nych, jak te¿ niezaka¿onych circowirusami gêsi. Zde-cydowanie czêciej (wykazano dodatni¹ korelacjê) w stadach zaka¿onych GoCV stwierdzano infekcje reowirusowe (odpowiednio, 38,6% w stadach GoCV
pozytywnych i 14,8% w stadach GoCV negatywnych). Autorzy wê-gierscy wykonali równie¿ analizê wieku zaka¿onych ptaków. Wyka-za³a ona, ¿e podobnie jak w Polsce, zaka¿enia GoCV wystêpowa³y bar-dzo rzadko u gêsi m³odszych ni¿ 5 tygodni (3,8% wszystkich wyni-ków pozytywnych). Autorzy wê-gierscy sugeruj¹, ¿e m³ode g¹siêta do 3.-4. tygodnia ¿ycia mog¹ chro-niæ przed infekcj¹ przeciwcia³a matczyne. Z drugiej strony, obecnoæ wirusa u 1-tygodniowych ptaków na-suwa podejrzenie, ¿e GoCV, podobnie jak inne wirusy z rodziny Circoviridae, szerzy siê równie¿ drog¹ pio-now¹ (wertykaln¹).
Badania prowadzone przez Chen i wsp. (2) w popu-lacji gêsi na Tajwanie potwierdzi³y endemiczne wy-stêpowanie zaka¿eñ cirkowirusem gêsi. Obecnoæ DNA GoCV stwierdzono w 16 (76,2%) na 21 bada-nych stadach gêsi pochodz¹cych z ró¿bada-nych ferm zlo-kalizowanych na ca³ym obszarze kraju. Autorzy pod-krelaj¹, ¿e objawy kliniczne (najczêciej oko³o 9. ty-godnia odchowu) w postaci zahamowania wzrostu i zaburzenia w pierzeniu obserwowano u 5-30% pta-ków na wszystkich fermach.
Intensywnie prowadzone s¹ równie¿ badania filo-genetyczne genomu GoCV (2, 10). Poznano ca³kowi-t¹ sekwencjê genomowego DNA wirusa GoCV (12). Genom tego wirusa ma wielkoæ 1821 nukleotydów i zawiera dwie g³ówne ramki odczytu V1 i C1, które ko-duj¹, odpowiednio, bia³ka zwi¹zane z replikacj¹ (Rep) i bia³ka kapsydu. Genom GoCV zawiera równie¿ dwie mniejsze ramki odczytu V2 i C2, których funkcja pozostaje nieznana. Porównanie sekwencji cirkowiru-sów wykaza³o, ¿e GoCV posiada genom, którego cechy s¹ wspólne z gnomem cirkowirusów wiñ (PCV1, PCV2) oraz choroby dzioba i piór papug (BFDV). Co wiêcej, wirus ten wykazuje homologiê sekwencji aminokwa-sów bia³ka C1 z ww. cirkowirusami na poziomie od 43,2% do 46,4%, a bia³ka Rep od 22,3% do 29,1% (2).
Kolejne badania ca³ych genomów wirusów przepro-wadzone przez Chen i wsp., jak i Johne i wsp. (3, 4) wykaza³y wyran¹ homologiê genomu cirkowirusów izolowanych od gêsi (GoCV) i kaczek (DuCV). Ana-liza filogenetyczna wykaza³a, ¿e izolaty GoCv i DuCV tworz¹ jeden klaster wyodrêbniony z pozosta³ych cir-kowirusów izolowanych od ptaków i izolowanych od wiñ.
Analiza genomu GoCV pozwoli³a wykazaæ, ¿e izo-laty tego wirusa nale¿¹ do trzech ró¿nych grup gene-tycznych. Ró¿nice nukleotydów pomiêdzy poszczegól-nymi grupami wynosz¹ oko³o 7%, a w poszczególnych grupach mniej ni¿ 1%. Przypuszcza siê, ¿e wirusy na-le¿¹ce do tych grup, w tym jedna z Niemiec i dwie z Tajwanu, kr¹¿¹ po Europie i Azji. Nie wykazano do-tychczas ró¿nic w patogennoci pomiêdzy wirusami nale¿¹cymi do poszczególnych grup (2, 10).
i s ê g k e i W i s ê g a b z c i L h c y n a d a b u k n u r e i k w V C o G i c o n c e b o ñ e z d r e i w t o p ) % ( a b z c i L ¹ d o t e m h c y t y r k y w V C o G h c a d ¹ z r a n w R C P i s ê g h c y n z rt ê n w e w d a t s ) % ( a b z c i L h c y n a d a b i s ê g u k n u r e i k w V C o G i c o n c e b o d a t s ) % ( a b z c i L ¹ i c o n c e b o z i s ê g h c y t y r k y w V C o G R C P ¹ d o t e m i n d 3 -1 51 0(0,0) 17 0(0,0) i n d o g y t 7 -5 18 6(33,3) 18 5(62,5) i n d o g y t 6 1 -4 1 26 12(46,1) 15 9(60,0) m e ³ ó g O 95 18(18,9) 40 14(35,0)
Medycyna Wet. 2010, 66 (10) 683 Reasumuj¹c, nale¿y podkreliæ, ¿e
przeprowadzo-ne badania na wiecie, jak i w Polsce wskazuj¹ na wy-sok¹ czêstoæ zaka¿eñ GoCV w stadach towarowych gêsi. Jednoznaczna rola cirkowirusów gêsi w powo-dowaniu bezporednich strat na fermach mo¿e byæ dyskusyjna, niemniej rola porednia jako czynnika immunosupresyjnego, choæ wymaga prowadzenia dal-szych badañ, jest oczywista. Potwierdzeniem immu-nosupresyjnego dzia³ania GoCV mo¿e byæ fakt obser-wowania zmian histopatologicznych w narz¹dach lim-fatycznych deplecjê limfocytów oraz wzrost liczby histiocytów w bursie Fabrycjusza, ledzionie i grasicy (9).
Pimiennictwo
1.Ball N. W., Smyth J. A., Weston J. H., Borghmans B. J., Palya V., Glavits R., Ivanics E., Dan A., Todd D.: Diagnosis of goose circovirus infection in Hun-garian geese samples using polymerase chain reaction and dot blot hybridi-zation tests. Avian Pathol. 2004, 33, 51-58.
2.Chen C.-L., Chang P. C., Lee M. S., Hien J. H., Ou S. J., Shieh H. K.: Nucleotide sequences of goose circovirus isolated in Tajwan. Avian Pathol. 2003, 32, 165-171.
3.Chen C.-L., Wang P.-X., Lee M.-S., Shien J.-H., Shieh H. K., Ou S.-J., Chen C.-H., Chang P.-C.: Development of a polymerase chain reaction procedure for detection and differentiation of duck and goose circovirus. Avian Dis. 2006, 50, 92-95.
4.Johne R., Fernandez-de-Luco D., Hofle U., Muller H.: Genome of a novel circovirus of starlings, amplified by multiply primed rolling-circle amplifi-cation. J. Gen. Virol. 2006, 87, 1189-1195.
5.Glávits R., Ferenczi E., Ivanics E., Bakonyi T., Mató T., Zarka P., Palya V.: Co-occurrence of West Nile Fever and circovirus infection in a goose flock in Hungary. Avian Pathol. 2003, 34, 408-414.
6.Samorek-Salamonowicz E., Czekaj H., Kozdruñ W.: Choroby zakane wystêpuj¹ce u drobiu wodnego. Medycyna Wet. 1998, 54, 305-308. 7.Smyth J., Soike D., Moffett D., Weston J. H., Todd D.: Circovirus-infected
geese studied by in situ hybridization. Avian Pathol. 2005, 34, 227-232. 8.Soike D., Kohler B., Albrecht K.: A circovirus-like infection of geese related
to a runting syndrome. Avian Pathol. 1999, 28, 199-202.
9.Todd D.: Circoviruses: immunosuppressive threats to avian species: a re-view. Avian Pathol. 2000, 29, 373-394.
10.Todd D., Feston J. H., Soike D., Smyth J. A.: Genome sequence determina-tions and analyses of novel circoviruses from goose and pigeon. Virology 2001, 286, 354-362.
11.Ziomko I., Kuczyñska E., Samorek-Salamonowicz E., Czekaj H.: Wp³yw inwazji ¿o³¹dkowo-jelitowych na serokonwersjê po szczepieniu przeciwko chorobie Derzsyego u gêsi. Medycyna Wet. 1998, 54, 268-270.
Adres autora: dr Maciej Kuczkowski, pl. Grunwaldzki 45, 50-366 Wro-c³aw; e-mail: maciej.kuczkowski@up.wroc.pl
