Medycyna Wet. 2011, 67 (9) 630
Praca oryginalna Original paper
Wprowadzenie zakazu stosowania antybiotykowych stymulatorów wzrostu (ASW) w ¿ywieniu zwierz¹t wymusi³o potrzebê poszukiwania nowych, najlepiej naturalnych stymulatorów odpornoci, które poprzez korzystny wp³yw na uk³ad immunologiczny zmniej-sza³yby podatnoæ organizmu na choroby. Jak wyka-za³y wczeniejsze badania, substancjami takimi mog¹ byæ prebiotyki, a wród nich zw³aszcza â-glukany i mannanooligosacharydy, które stymuluj¹ znacz¹co odpornoæ organizmu (12, 13, 19). Substancje te po-zyskiwane s¹ ze cian komórkowych dro¿d¿y Saccha-romyces cerevisae (21) i ciesz¹ siê szczególnym zain-teresowaniem hodowców. W przeciwieñstwie do pro-biotyków charakteryzuj¹ siê wiêksz¹ trwa³oci¹, a ich dzia³anie nie jest uwarunkowane prze¿ywalnoci¹ po spo¿yciu. Jako jeden z wielu komponentów mog¹ byæ dodawane do ró¿nych produktów paszowych (21). Szczegó³owe mechanizmy dzia³ania zarówno tylozy-ny stosowanej do niedawna jako ASW, jak i prebioty-ków nie zosta³y dotychczas poznane. Obecnie tylozy-na mo¿e byæ stosowatylozy-na tylozy-nadal w formie doustnej jako substancja czynna w paszach leczniczych. Dotychczas dowiedziono, ¿e antybiotyk ten wp³ywa³a korzystnie na zmiany w strukturze cian jelit zwierz¹t, a poprzez
lepsze ich ukrwienie i poprawê resorpcji sk³adników pokarmowych pozwala³a uzyskaæ lepsze efekty pro-dukcyjne (15). Ponadto, podobnie jak prebiotyki, ty-lozyna równie¿ uwa¿ana jest przez niektórych bada-czy za substancjê o w³aciwociach immunomodulu-j¹cych (1).
Niniejsze opracowanie stanowi kontynuacjê wcze-niejszych badañ, w których wykazano korzystny wp³yw prebiotyków i tylozyny na wybrane parametry odpor-noci humoralnej, stan funkcjonalny ¿wacza oraz efek-ty produkcyjne i ogóln¹ zdrowotnoæ ciel¹t (10-13).
Obecne badania mia³y na celu ocenê wp³ywu za-równo tylozyny, jak i prebiotyków na aktywnoæ fa-gocytarn¹ granulocytów obojêtnoch³onnych we krwi obwodowej ciel¹t.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na 36 klinicznie zdrowych cie-lêtach rasy ncb, w wieku 6-8 tygodni. Po dwutygodniowym okresie adaptacji po przebytym transporcie, zwierzêta zo-sta³y podzielone losowo na trzy równe grupy (n = 12). Do grupy I zaliczono cielêta, które przez okres 7 tygodni otrzy-mywa³y paszê z dodatkiem premiksu Tylan G 100 (Elan-co). Jeden kilogram premiksu zawiera 100 g substancji
Wp³yw tylozyny i prebiotyków
na aktywnoæ fagocytarn¹ granulocytów
obojêtnoch³onnych krwi ciel¹t
MONIKA SZYMAÑSKA-CZERWIÑSKA, DARIUSZ BEDNAREK
Zak³ad Chorób Byd³a i Owiec Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Szymañska-Czerwiñska M., Bednarek D.
Effect of tylosin and prebiotics on the phagocytic activity of polimorfonuclear blood leukocytes in calves
Summary
The aim of the study was to estimate the effect of tylosin and prebiotics (â-glucans and mannanooligo-saccharides) added to feed on the phagocitc activity of polimorfonuclear leukocytes (PMNL) in calves. The study was performed on 36 clinically healthy, Black and White Lowland calves, aged 6-8 weeks. The animals were randomly divided into three equal groups. Calves in group I were fed a feedingstuff supplemented with tylosin. Group II received prebiotics, and group III (control) was fed the same feedingstuff without additives. The following phagocytic parameters were determined in the peripheral blood of the calves: phagocytic index (IF), the percentages of phagocytic (%kf) and NBT-positive cells, and the spontaneous migration of neutrophils (MG). The results showed that both prebiotics and tylosin caused a significant increase in the phagocytic activity of PMNL in the experimental groups. This was expressed by the higher values of the examined phagocytic parameters compared with the controls.
Medycyna Wet. 2011, 67 (9) 631
czynnej w postaci fosforanu tylozyny. Ka¿dorazowo, sto-suj¹c ten premiks, przygotowywano cielêtom w grupie I mieszankê paszy treciwej (CJ) z tylozyn¹, na wzór pasz leczniczych. Podawano j¹ raz dziennie, na czczo w godzi-nach porannych, a jednorazowa dzienna dawka tylozyny na zwierzê wynosi³a 9,4 mg/kg m.c. Z kolei cielêta z dru-giej grupy eksperymentalnej (gr. II) ¿ywione by³y pasz¹ CJ z dodatkiem prebiotyku w postaci preparatu Alphamune (Alpharma), zawieraj¹cego w swoim sk³adzie â-glukany (26%) i mannanooligosacharydy (MOS) (28%). Wspomnia-ne prebiotyki podawano cielêtom tej grupy równie¿ przez 7 tygodni w jednorazowych, dziennych dawkach, odpo-wiednio: â-glukany 49 mg/kg m.c. i MOS 52 mg/kg m.c. Pozosta³e zwierzêta, które stanowi³y grupê kontroln¹, ¿ywione by³y t¹ sam¹ mieszank¹ CJ bez wspomnianych wy¿ej dodatków.
Krew do badañ laboratoryjnych pobierano od ciel¹t z ¿y³y szyjnej zewnêtrznej, przez okres 7 tygodni, dwukrotnie w ci¹gu tygodnia. Zbierano j¹ do probówek z antykoagu-lantem (heparyna; 20 U/ml krwi).
Kompleksowe badanie zdolnoci fagocytarnych granu-locytów obojêtnoch³onnych we krwi obwodowej ciel¹t
okrelano na podstawie ustalenia odsetka aktywnych w pro-cesie fagocytozy komórek (% kf), ich indeksu fagocytar-nego (IF) oraz odsetka granulocytów NBT dodatnich i pola spontanicznej migracji neutrofilów. Dwa pierwsze paramet-ry, tj. % kf i IF oceniano przy zastosowaniu metody lopka (16) w odniesieniu do 100 przebadanych neutrofilów (PMNL), przy czym za komórki fagocytuj¹ce uznawano te, które w cytoplazmie zawiera³y co najmniej 3 poch³o-niête bakterie. Natomiast indeks fagocytarny okrelano na podstawie redniej liczby poch³oniêtych bakterii przypa-daj¹cych na jedn¹ komórkê ¿ern¹.
Przy u¿yciu spektrofotometrycznego testu redukcji b³ê-kitu nitrotetrazoliowego (NBT; Nitro Blue Tetrazolium Test) wg Ramana i Polanda z póniejszymi modyfikacjami Czar-nomysy-Furowicz i Furowicz (5) oznaczano odsetek gra-nulocytów NBT-dodatnich we krwi obwodowej ciel¹t. Na-tomiast zdolnoæ spontanicznej migracji granulocytów obo-jêtnoch³onnych ciel¹t (MG) oceniano metod¹ wg Søborga (cyt. za 6).
Otrzymane wyniki badañ poddano analizie statystycz-nej z wykorzystaniem programu Statgraphics Centurion. W celu porównania grup eksperymentalnych z grup¹
kon-Objanienie: * ró¿nice istotne statystycznie przy á = 0,05 w porównaniu do grupy kontrolnej
Tab. 1. rednie wartoci wskaników aktywnoci fagocytarnej u ciel¹t ¿ywionych pasz¹ z dodatkiem tylozyny (gr. I), prebio-tyków (gr. II) i kontrolnych (gr. III)
ñ e iz D a i n a d a b ) D S ± x ( y rt e m a r a P f k % IF NBT(%) MG(mm2) a p u r g grupa grupa grupa I II III I II III I II III I II III 0 ±821,,0000 ±842,,0605 ±822,,0000 ±220,,1805 ±220,,0778 ±222,,0034 ±120,,0594 ±120,,1604 ±120,,2854 ±111,,9163 ±110,,4336 ±110,,0571 2 ±801,,0000 ±832,,6078 ±812,,0000 ±202,,5373* ±210,,1853 ±200,,6871 ±130,,2600 ±105,,7574* ±120,,4230 ±111,,7023 ±102,,5120* ±91,6,491 7 ±851,,0000 ±934,,0677* ±832,,3331 ±202,,7100* ±201,,6710* ±191,,9175 ±140,,3608 ±141,,5402 ±130,,2355 ±102,,7433* ±100,,4330 ±100,,2923 9 ±823,,0000 ±924,,5627* ±803,,0201 ±200,,2360* ±201,,4403* ±190,,1674 ±130,,5210 ±131,,2105 ±110,,8865 ±111,,5226* ±100,,1704 ±90,2,739 4 1 ±851,,0000 ±915,,5333* ±814,,0306 ±212,,0217* ±202,,2800* ±180,,8731 ±130,,3586 ±130,,7683 ±130,,0554 ±101,,9874* ±102,,4510* ±100,,4452 6 1 ±861,,0000 ±921,,5323* ±831,,6573 ±201,,3800* ±202,,5730* ±190,,5630 ±140,,2543 ±114,,5738* ±120,,3631 ±101,,7639* ±102,,7138* ±100,,6761 1 2 ±835,,3033 ±896,,3433 ±801,,3533 ±200,,2760* ±202,,3460* ±190,,0976 ±130,,7299 ±130,,9157 ±120,,7884 ±102,,6128* ±102,,3145* ±100,,5476 3 2 ±822,,3038 ±931,,0363* ±801,,0000 ±202,,1953* ±203,,1953* ±200,,2186 ±121,,5040 ±120,,2814 ±121,,5266 ±123,,1932* ±103,,4722* ±100,,9496 8 2 ±813,,0006 ±828,,0687* ±802,,0000 ±231,,6333 ±217,,7580* ±211,,8676 ±103,,3386* ±102,,5452* ±100,,7397 ±110,,1704 ±110,,8606 ±110,,7761 0 3 ±811,,0000 ±819,,0000* ±811,,0000 ±203,,9103* ±204,,4773* ±190,,9135 ±103,,3628* ±103,,2273* ±120,,0760 ±91,7,098 ±101,,5153* ±90,4,687 5 3 ±811,,0503 ±817,,1657* ±821,,0000 ±211,,7407 ±240,,4577 ±190,,6630 ±121,,7141 ±111,,4626 ±100,,9998 ±112,,6352* ±112,,3903* ±90,1,640 7 3 ±813,,5333* ±837,,0000* ±791,,0000 ±200,,9100 ±203,,3623* ±200,,3206 ±103,,7037* ±113,,0724* ±110,,3334 ±101,,9990* ±100,,4887* ±90,2,385 2 4 ±811,,3533 ±813,,5637* ±801,,0000 ±211,,0353* ±203,,8990* ±190,,1332 ±104,,6978* ±103,,3971* ±110,,5290 ±101,,4747* ±90,,9201* ±80,4,333 4 4 ±812,,5333* ±811,,0000 ±791,,3533 ±200,,5674 ±221,,0701 ±190,,6472 ±124,,6317 ±114,,1838* ±110,,6683 ±110,,2007* ±90,,5387* ±70,7,333
Medycyna Wet. 2011, 67 (9) 632
troln¹ wykonano analizê wariancji oraz wyznaczono naj-mniejsze istotne ró¿nice LSD Fishera na poziomie istot-noci á = 0,05.
Wyniki i omówienie
Przeprowadzone badania wykaza³y, ¿e podawanie prebiotyków (gr. II) i tylozyny (gr. I) wp³ynê³o istotnie na wzrost odsetka komórek fagocytuj¹cych (% kf) i indeksu fagocytanego (IF) oraz ich zdolnoci do spon-tanicznej migracji (MG) (tab. 1). U ciel¹t z grupy II miêdzy pierwszym (próba O) a 14. dniem dowiad-czenia, kiedy to % kf by³ najwy¿szy, wartoci analizo-wanego parametru wzros³y z 84,00 ± 2,65 do 95,33 ± 1,53%. Natomiast indeks fagocytarny uleg³ zwiêk-szeniu z 22,07 ± 0,78 do 27,50 ± 1,78 w 28. dniu do-wiadczenia. Wielkoæ pola migracji PMNL u ciel¹t z grupy II wzros³a z 11,43 ± 0,36 mm2 do 13,72 ± 0,42
mm2 w 23. dniu prowadzonych badañ. Tendencje
wzro-stowe by³y obserwowane u ciel¹t grupy I, ¿ywionych pasz¹ z dodatkiem tylozyny, niemniej jednak % kf, IF, jak równie¿ wielkoæ pola spontanicznej migracji gra-nulocytów kszta³towa³y siê na ni¿szym poziomie ni¿ w grupie II. Otrzymane wartoci ró¿ni³y siê jednak istotnie w porównaniu z grup¹ kontroln¹. Ponadto, w przypadku ciel¹t grupy II zaobserwowano statystycz-nie istotny wzrost odsetka komórek NBT-dodatnich ju¿ w drugim dniu badania w porównaniu do grupy kontrolnej (tab. 1). Natomiast w grupie I istotne staty-stycznie ró¿nice (á = 0,05) odnonie do tego paramet-ru zanotowano dopiero w 28. dniu dowiadczenia, przy czym najwy¿sza jego wartoæ stwierdzona zosta³a w 42. dniu badania i wynosi³a ona 14,98 ± 0,67%. Dla porównania: w grupie kontrolnej odsetek granulo-cytów NBT-dodatnich w tym samym czasie wynosi³ 11,59 ± 0,20%.
O wyranych w³aciwociach immunostymuluj¹-cych â-glukanów i tylozyny wiadcz¹ zaobserwowa-ne w badaniach w³asnych zmiany w zakresie aktyw-noci fagocytarnej neutrofilów we krwi obwodowej badanych ciel¹t. Oceniane parametry (% kf, IF, NBT, MG) wskazuj¹ jednoznacznie na zwiêkszenie tej ak-tywnoci. Nale¿y jednak podkreliæ, ¿e zdecydowanie silniejsze zdolnoci fagocytarne wykazywa³y komór-ki ¿erne (neutrofile) ciel¹t, u których zastosowano w ¿ywieniu dodatek prebiotyków. Wielu autorów zwra-ca te¿ uwagê na poprawê aktywnoci fagocytarnej leu-kocytów u ró¿nych gatunków zwierz¹t po eksperymen-talnym podaniu im â-1,3/1,6 glukanów (3, 9, 14, 17, 18, 21, 22). Szczegó³owa analiza wczeniejszych wy-ników w³asnych badañ (13) wykaza³a znacz¹ce pobu-dzenie zdolnoci fagocytarnych komórek ¿ernych w przypadku ciel¹t ¿ywionych pasz¹ z dodatkiem ty-lozyny, co mo¿na wi¹zaæ z bezporednim wp³ywem TNF na ten proces, którego iloæ zwiêksza³a siê istot-nie u tych zwierz¹t (13). Jak wiadomo, TNF aktywuje neutrofile, zwiêkszaj¹c ich w³aciwoci fagocytarne i przyspiesza ich uwalnianie ze szpiku. Stymuluje on tak¿e wytwarzanie reaktywnych form tlenu w
cytoplaz-mie komórek ¿ernych i wzmaga ich w³aciwoci bak-teriobójcze oraz cytotoksyczne (2). Rezultaty badañ Baba i wsp. (1) wskazuj¹ równie¿ na wiod¹c¹ rolê tej i innych cytokin w immunomoduluj¹cym mechanizmie dzia³ania tylozyny.
Jak zaobserwowali Sakurai i wsp. (7), wp³yw â-glu-kanów na aktywnoæ fagocytarn¹ komórek w du¿ej mierze uzale¿niony jest od dawki i drogi ich podania. W badaniach Milewskiego i wsp. (4) stosowano â-glu-kany per os u jagni¹t, w dawce 80 mg/kg m.c.; bada-nia w³asne wykaza³y, ¿e zastosowanie podobn¹ drog¹ â-glukanów ju¿ w dawce 49 mg/kg m.c. przynosi ko-rzystne efekty w stymulacji uk³adu immunologiczne-go ciel¹t. Z kolei do¿ylne stosowanie â-glukanów in-dukuje istotnie makrofagi do produkcji H2O2 i IL-1 oraz wzmaga zdolnoci bakteriobójcze zale¿ne od tlenu, natomiast dootrzewnowa droga ich podania nie powo-duje takiej reakcji. Dane literaturowe wskazuj¹ rów-nie¿, ¿e u myszy, szczurów, ryb oraz jagni¹t doustne podawanie â-glukanów wp³ywa efektywnie na popra-wê aktywnoci fagocytarnej komórek ¿ernych tych zwierz¹t (8, 14, 19, 20). Doniesienia te s¹ jednak nie-liczne i nie prezentuj¹ w pe³ni danych odnonie do innych zwierz¹t, w tym zw³aszcza byd³a. Badania w³as-ne dostarczaj¹ wiêc nowe informacje na ten temat.
Reasumuj¹c, uzyskane wyniki wskazuj¹, ¿e prebio-tyki, jak równie¿ tylozyna pobudza³y istotnie aktyw-noæ fagocytarn¹ granulocytów obojêtnoch³onnych we krwi obwodowej ciel¹t (PMNL) w zakresie wzrostu odsetka komórek fagocytuj¹cych (% kf) i NBT-dodat-nich, wartoci indeksu fagocytarnego (IF) oraz pola spontanicznej migracji tych komórek (MG).
Pimiennictwo
1.Baba T., Yamshita N., Kodama H., Mukamoto M., Asada M., Nakamoto K., Nose Y., Mcgruder E. D.: Effect of tylosin tartrate (Tylan soluble) on cellular immune responses in chickens. Poult. Sci. 1998, 77, 1306-1311.
2.Go³¹b J., Jakóbisiak M., Lasek W.: Immunologia. PWN, Warszawa 2002. 3.Guz L., Sopiñska A.: Wp³yw â (1,3)-D-glukanu i lipopolisacharydu na
od-pornoæ karpi przeciwko Aeromonas hydrophila. Medycyna Wet. 2009, 65, 715-718.
4.Milewski S., Wójcik R., Ma³aczewska J., Trapkowska S., Siwicki K. A.: Wp³yw â-1,3/1,6-D-glukanu na cechy u¿ytkowoci miêsnej oraz nieswoiste humo-ralne mechanizmy obronne jagni¹t. Medycyna Wet. 2007, 63, 360-363. 5.Raman U., Poland R. L.: A new micro-quantitative Nitro Blue Tetrazolium
Test. Ped. Res. 1975, 9, 334-336.
6.Richmond D. E., Doak P. B., North J. D. K.: Inhibition of leukocyte migra-tion as an index of rejecmigra-tion in renal transplant recipients. Clin. Exp. Immu-nol. 1973, 15, 17-25.
7.Sakurai T., Ohno N., Yadomae T.: Intravenously administrated (1-3)-beta-D--glucan, SSG, obtained from Sclerotina sclerotium IFO 9395 augments murine peritoneal macrophage functions in vivo. Chem. Pharm. Bull. 1992, 40, 2120-2124.
8.Siwicki A. K., Anderson D. P., Rumsey G. L.: Dietary intake of immuno-stimulants by rainbow trout affects non-specific immunity and protection against furunculosis. Vet. Immunol. Immunopathol. 1994, 41, 125-139. 9.Siwicki A. K., Kazuñ K., G³¹bski E., Terech-Majewska E., Baranowski P.,
Trapkowska S.: The effect of beta-1.3/1.6-glucan in diets on the effective-ness of anti-Yersinia Ruckeri Vaccine an experimental study in rainbow trout (Oncorhynchus Mykiss). Pol. J. Food Nutri. Sci. 2004, 54, 59-61. 10.Szymañska-Czerwiñska M., Bednarek D.: Wp³yw tylozyny i prebiotyków na
stan funkcjonalny ¿wacza oraz parametry produkcyjne ciel¹t. Medycyna Wet., w druku.
Medycyna Wet. 2011, 67 (9) 633
11.Szymañska-Czerwiñska M., Bednarek D.: Wp³yw tylozyny i prebiotyków na wybrane parametry hematologiczne i stan zdrowotny ciel¹t. Medycyna Wet. 2011, 67, 207-212.
12.Szymañska-Czerwiñska M., Bednarek D.: Wp³yw tylozyny i prebiotyków na wybrane parametry odpornoci humoralnej u ciel¹t. Medycyna Wet. 2011, 67, 275-278.
13.Szymañska-Czerwiñska M., Bednarek D., Zdzisiñska B., Kandefer Szerszeñ M.: Effect of tylosin and prebiotics on the level of cytokines and lymphocyte immunophenotyping parameters in calves. Cent. Eur. J. Immun. 2009, 34, 1-6.
14.Suzuki I., Tanaka H., Kinoshita A., Oikawa S., Osawa M., Yadomae T.: Effect of orally administrated â-glucan on macrophage function in mice. Int. J. Immunopharmacol. 1990, 12, 675-684.
15.li¿ewska K., Biernasiak J., Libudzisz Z.: Probiotyki jako alternatywa dla antybiotyków. Zesz. Nauk. Politechniki £ódzkiej 984, Chemia spo¿ywcza i biotechnologia 2006, 79-91.
16.lopek S.: Immunologia praktyczna. PZWL, Warszawa 1971, 210-221. 17.wi¹tkiewicz S., Korelski J.: Dodatki paszowe o dzia³aniu
immunomodula-cyjnym w ¿ywieniu drobiu. Medycyna Wet. 2007, 63, 1291-1295.
18.wi¹tkiewicz S., wi¹tkiewicz M.: Zastosowanie fruktanów o w³aciwociach prebiotycznych w ¿ywieniu zwierz¹t gospodarskich. Medycyna Wet. 2008, 64, 987-990.
19.Wójcik R.: Effect of brewers yest (Sachcaromyces cerevisae) exctract on selected parameters of humoral and cellular immunity in lambs. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2010, 54, 181-187.
20.Wójcik R., Janowska E., Ma³aczewska J., Siwicki A. K.: Effect of â-1,3/1,6--D-glucan on the phagocytic acitvity and oxidative metabolism of peripheral blood granulocytes and monocytes in rats. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2009, 53, 241-246.
21.Wójcik R., Ma³aczewska J., Trapkowska S., Siwicki A. K.: Wp³yw â-1,3/1,6--D-glukanu na nieswoiste komórkowe mechanizmy obronne jagni¹t. Medy-cyna Wet. 2007, 63, 84-86.
22.Yoshida T., Kruger R., Inglis V.: Augmentation of nonspecific protection in African catfish, Clarias gariepinus (Burchell), by the long-term oral admini-stration of immunostimulants. J. Fish. Dis. 1995, 18, 195-198.
Adres autora: dr Monika Szymañska-Czerwiñska, al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy; e-mail: monika.szymanska@piwet.pulawy.pl