Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 557
Praca oryginalna Original paper
Zainteresowanie zjawiskiem mineralizacji tkanki kostnej jest w obecnej chwili niewielkie. Natomiast schorzenia metaboliczne organizmu czy te¿ aparatu ruchu wywo³uj¹ce zmiany w kociach s¹ przedmio-tem licznych badañ naukowych. W wyniku braku ro-zumienia podstawowych zjawisk mineralizacji koci proponuje siê ró¿ne metody ich leczenia, które nie maj¹ istotnego prze³o¿enia na procesy czynnociowo-mor-fologiczne.
Proces mineralizacji zale¿y od wielu czynników hormonalnych, witamin czy te¿ niezbêdnych pierwiast-ków. Zwi¹zane z tym nieprawid³owoci w ¿ywieniu, fizjologii wch³aniania czy wydalania doæ ³atwo mo¿e je zaburzyæ. Wed³ug jednych autorów jest to proces fizykochemiczny (9), wed³ug innych w znacznej mie-rze uzale¿niony i kontrolowany pmie-rzez komórki tkanki kostnej na drodze dwóch niezale¿nych dzia³añ (6, 8, 10). Pierwszym jest inicjacja procesu mineralizacji poprzez wydzielenie pêcherzyków macierzy, drugim szeroko pojêta kontrola sk³adu macierzy miêdzyko-mórkowej (w tym p³ynu ródtkankowego) i wp³ywa-nie w ten sposób bezporednio lub porednio na wzrost kryszta³ów w obszarze kontrolowanym przez grupê osteocytów, dziêki czemu stale wzrasta gêstoæ koci, a¿ do mierci komórek, kiedy indukowany jest lokal-nie proces przebudowy tkanki kostnej. Polokal-niewa¿ jest on kontrolowany przez hormony i witaminy, a jego efektem jest wzrost lub spadek poziomu jonów wap-nia we krwi, uwa¿a siê, ¿e jest to g³ówny proces zwi¹za-ny z homeostaz¹ tego pierwiastka w organizmie (6-8). Fenomen mineralizacji wydaje siê ju¿ poznany, po-zostaje jednak nie do koñca wyjaniony zakres wp³y-wu poszczególnych czynników na sk³ad mineralny
macierzy oraz jej stopieñ wysycenia. Do dzi nie wia-domo, czy mo¿e dochodziæ w warunkach in vivo do wyp³ukania, a nastêpnie do remineralizacji macie-rzy miêdzykomórkowej tkanki kostnej. Niektómacie-rzy au-torzy uwa¿aj¹, ¿e takie odwapnianie koci ma miejs-ce stale w organizmie, co w konsekwencji doprowa-dza do zwyrodnieñ, w tym do osteoporozy i osteope-nii (2, 4, 7, 8, 10).
Inicjacja mineralizacji jest zwi¹zana z wytworze-niem przez komórki tzw. pêcherzyków macierzy, które s¹ ma³ymi (0,1-0,2 µm), pozakomórkowymi pê-cherzykami wybiórczo umieszczonymi w macierzy miêdzykomórkowej spotykanych w p³ytce wzrostu chrz¹stki nasadowej koci d³ugich, rozwijaj¹cej siê koci oraz kostninie (1, 3, 10). Pêcherzyki te zawiera-j¹ liczne enzymy (fosfataza zasadowa, ATP-aza zasa-dowa oraz pirofosfataza), bia³ka oraz lipidy, które od-dzia³ywuj¹c miêdzy sob¹ doprowadzaj¹ do rozpoczê-cia mineralizacji. Inicjacja mineralizacji rozpoczyna siê na wewnêtrznej powierzchni pêcherzyków, gdzie powstaj¹ pierwsze kryszta³y hydroksyapatytu w kszta³-cie kszta³-cienkich igie³ek, które rosn¹c powoli, zmieniaj¹ kszta³t pêcherzyków macierzy, aby w konsekwencji doprowadziæ do ich rozerwania. B³ona zewnêtrzna pêcherzyków jest biologicznie aktywna, co oznacza, ¿e ma ona zdolnoæ do wybiórczego rozpoznania miejsca zakotwiczenia w macierzy miêdzykomórko-wej (1, 3).
Pierwsza faza jest wiêc procesem z³o¿onym inter-akcji pomiêdzy cz¹steczkami wi¹¿¹cymi wapñ a en-zymami bior¹cych udzia³ w przemianach fosforu zlo-kalizowanych w okolicy b³ony pêcherzyków macie-rzy. Faza druga rozpoczyna siê w momencie kontaktu
Mineralizacja tkanki kostnej
PIOTR KUROPKA, JAN KURYSZKO, SYLWIA MAZURKIEWICZ-£YCZEWSKA
Zak³ad Histologii i Embriologii, Katedra Anatomii i Histologii Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej, AR Wroc³aw, ul. Ko¿uchowska 5, 51-631 Wroc³aw
Kuropka P., Kuryszko J., Mazurkiewicz-£yczewska S.
Bone mineralization Summary
The study looked at various different authors opinions on the process of bone mineralization. Its aim was to induce the mineralization of decalcified bones in-vitro. The study used dog, sheep as well as human bones which were subjected to decalcification after a preliminary analysis of their composition of elements using a scanning electron microscope equipped with an X-ray probe. Following this, re-mineralization was attempted by submersion in a replete solution of calcium phosphate and free vaporization of the water in a temperature of 35°C. This resulted in attaining crystals which were not hydrocsyapatite on the bones surface. The study indicated that simple chemical phenomena cannot be the main factor causing bone mineralization.
Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 558
nowo powsta³ego kryszta³u na p³yn ródtkankowy. Sta-je siê on wówczas j¹drem krystalizacji, wokó³ którego na jego powierzchni rozpoczyna siê wzrost kryszta³u poprzez wytr¹canie kolejnych warstw jonów wapnia i fosforu.
Mineralizacja jest wiêc procesem fizykochemicz-nym, w znacznym stopniu uzale¿nionym od sk³adu p³ynu ródtkankowego, w tym bia³ek kolagenowych oraz niekolagenowych. O roli, jak¹ odgrywaj¹ te bia³-ka, niech wiadczy fakt, ¿e osteokalcyna, bia³ko wy-dzielane przez osteoblasty w pónej fazie ró¿nicowa-nia, wi¹¿¹c siê z wapniem na powierzchni hydroksy-apatytu, hamuje wzrost kryszta³u, jednoczenie staj¹c siê czynnikiem chemotaktycznym dla osteoklastów (2, 5, 6).
Przedstawiony mechanizm wskazuje, ¿e ostateczny sk³ad oraz stopieñ mineralizacji jest uzale¿niony od komórek pozostaj¹cych w tkance kostnej, bêd¹c jed-noczenie odbiciem stanu metabolicznego ca³ego or-ganizmu. Powracaj¹ce dyskusje dotycz¹ce metaboliz-mu wapnia, w których pomijane b¹d te¿ nadmiernie eksponowane s¹ zjawiska zachodz¹ce w kociach, doniesienia o zjawisku nadmiernej mineralizacji bla-szek kostnych po mierci komórek kostnych oraz licz-ne w³aslicz-ne obserwacje sk³oni³y nas do przeprowadze-nia licznych badañ porównawczych z zakresu minera-lizacji tkanki kostnej u zwierz¹t wraz z prób¹ wywo-³ania zjawiska remineralizacji w³ókien kolagenowych w warunkach in vitro.
Materia³ i metody
Badania wykonywano w Pracowni Mikroskopii Elektro-nowej przy pomocy skaningowego mikroskopu elektrono-wego (SEM) Zeiss 435VP wyposa¿onego w mikrosondê rentgenowsk¹. Materia³ do badañ (18 sztuk) pochodzi³ z trzonów koci d³ugich (udowej i piszczelowej) zdrowych psów, owiec oraz cz³owieka w ró¿nym wieku pozosta³ych w Zak³adzie po innych badaniach, które po wczeniejszej mikroanalizie rentgenowskiej by³y odwapniane w werse-nianie dwusodowym (EDTA), a nastêpnie zanurzane w
roz-tworze nasyconym fosforanu wapnia, który by³ poddany powolnemu odparowywaniu wody w temperaturze 35°C. Nastêpnie materia³ by³ suszony w punkcie krytycznym i analizowany w SEM. Obiekty wykazuj¹ce budowê kry-staliczn¹ analizowano przy pomocy mikrosondy rentgenow-skiej. Wykonany maping pierwiastków mia³ na celu zobra-zowanie rozk³adu przede wszystkim wapnia, fosforu oraz wêgla. Analizowano dodatkowo ilociowy sk³ad pierwiast-ków w próbkach i okrelano w³aciwe dla gatunku stosun-ki wapnia do fosforu (Ca/P).
Wyniki i omówienie
Dysponuj¹c relatywnie niewielk¹ iloci¹ materia³u o du¿ym zró¿nicowaniu, trudno by³o przeprowadziæ dok³adne badania mineralizacji koci cz³owieka oraz zwierz¹t, analizuj¹c je pod k¹tem wieku, p³ci czy te¿ sposobu od¿ywiania. Materia³ od ludzi pochodzi³ od osób w wieku 60-70 lat, od psów 2-17 lat, a od owiec tylko od samic w wieku 3 lat. Istotne jest, ¿e we wszystkich próbkach obserwowane kryszta³y powsta-³e w wyniku remineralizacji zachodz¹cej na powierzch-ni odmineralizowanych w³ókien kolagenowch tkanki kostnej nie by³y hydroksyapatytami. Najczêciej by³y to kalcyty oraz syderyty (ryc. 3, 4). Uwa¿amy, ¿e sy-deryty powsta³y w najwiêkszym stopniu jako artefak-ty, gdy¿ ¿elazo w tych warunkach musia³o pochodziæ ze zhemolizowanych erytrocytów. Kalcyty natomiast notowano niemal w ka¿dym przypadku. Du¿e i ma³e kryszta³y tych minera³ów uk³ada³y siê na powierzch-ni koci pomiêdzy w³óknami kolagenowymi poszcze-gólnych blaszek kostnych. Ich rozmiary waha³y siê od 10 do 150 µm. Wykonany maping nie wykaza³ istot-nego powi¹zania atomów wapnia i fosforu w próbkach. Interesuj¹cy jest fakt, ¿e równie¿ w kociach nie pod-danych ¿adnej obróbce nie uda³o siê stwierdziæ upo-rz¹dkowanego rozmieszczenia wapnia i fosforu typo-wego dla kryszta³ów hydroksyapatytu. Wykonana wczeniej analiza sk³adu pierwiastkowego wykaza³a, ¿e we wszystkich przypadkach dominuj¹cymi pier-wiastkami by³y: C, O, Ca, P oraz niewielkie iloci Mg,
Ryc. 1. Przyk³adowy wykres sk³adu pierwiastkowego koci
Medycyna Wet. 2006, 62 (5) 559
Zn, Na, Fe (ryc. 1). Uzyskane t¹ metod¹ relacje sto-sunku wapnia do fosforu (Ca/P) wykaza³y, ¿e najni¿-szym rednim wskanikiem charakteryzowa³y siê ko-ci psów 1,3, cz³owieka 1,41, a najwy¿szym owcy oko³o 1,49, przy czym w kociach cz³owieka wystê-powa³y najwiêksze zró¿nicowania, zarówno w mikro-obszarach, jak i porównuj¹c koci w ró¿nym wieku oraz p³ci. U zwierz¹t brak ww. fluktuacji mo¿e byæ spowodowany relatywnie krótkim czasem ¿ycia, gdy¿ nawet u relatywnie starego psa (17 lat) czas zwi¹zany z zaistnieniem istotnych zmian w kociach mo¿e byæ zbyt krótki w porównaniu z cz³owiekiem. W kociach poddanych procesowi remineralizacji, poza obszara-mi wystêpowania kalcytów, doobszara-minuj¹cym pierwiast-kiem, obok wêgla i tlenu pozosta³ fosfor, którego za-wartoæ w kociach kilkukrotnie przewy¿sza³a zawar-toæ wapnia (ryc. 2).
Reasumujac, przeprowadzone badania metod¹ od-parowywania wody z nasyconego roztworu fosforanu wapnia w obecnoci odmineralizowanej koci nie mo¿na doprowadziæ do remineralizacji macierzy tkanki kostnej, co sugeruje, ¿e proste zjawiska fizykochemicz-ne nie mog¹ byæ g³ówn¹ przyczyn¹ fenomenu prze-mian wapnia w kociach. Jednoczenie nie mo¿na wykluczyæ, ¿e w tak prostym eksperymencie zabrak³o kilku istotnych czynników, takich jak regulacja pH czy te¿ wymuszony przep³yw p³ynów spowodowany na-prê¿eniami czynnociowymi, na jakie jest nara¿ona koæ w trakcie pe³nienia swojej funkcji.
Pimiennictwo
1.Bonucci E.: Electron microscope studies of the early stage of the calcifica-tion process: role of matrix vesicles. Prog. Clin. Biol. Res. 1989, 295, 109-114. 2.Glimcher M. J.: The structure of mineral component of bone and the mecha-nism of calcification, [w:] Coe F. L., Favus M. J.: Disorders of bone and mineral metabolism. Raven Press, New York 1992.
3.Harada K., Oida S., Saski S.: Chondrogenesis and osteogenesis of bone mar-row-derived cells by bone inductive factor. Bone 1988, 9, 177-183. 4.Kokot F., Ficek R.: Regulacja gospodarki wapniowej. Nowe aspekty
pato-fizjologiczne. Pol. Arch. Med. Wewn. 2000, 104, 621-630.
Ryc. 4. Skaningogram odwapnionej koci owcy po próbie wywo³anej remineralizacji. Widoczne na powierzchni koci kalcyty powsta³y po wolnym odparowaniu wody z zawiesiny fosforanu wapnia. SEM 2300 ×
Ryc. 3. Skaningogram odwapnionej koci cz³owieka. Widocz-ny fragment naczynia oraz w³ókna kolagenowe. SEM pow. 1000 ×
5.Lindholm T. S., Nilsson O. S., Lindholm T. C.: Extraskeletal and intraskeletal new bone formation induced by demineralized bone matrix combined with bone marrow cells. Clin. Orthop. 1982, 171, 251-255.
6.Mundy R. G., Martin T. J. (ed.): Physiology and pharmacology of bone. Sprin-ger Verlag. Berlin, Heildelberg, New York 1993.
7.Murray J., Gagel R. F., Christakos S., Kleerekoper M., Shane E., Langman C., Stewart A., Whyte M.: Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism; Lippincott-Raven, Philadelphia, New York 1993. 8.Parfitt A. M.: Morphologic basis for bone mineral measurements: transient
and steady state effects of treatment in osteoporosis. Miner. Electrolyte Me-tab. 1980, 4, 273-287.
9.Pawlikowski M.: Kryszta³y w organizmie cz³owieka. Secesja. Kraków 1993. 10.Scherft J. P., Groot C. G.: The electron microscopic structure of the osteo-blast. Ultrastructure of skeletal tissues. Bone and cartilage in health and disease. Kulwer Akademic Publishers Boston-Dordrecht-London 1990. Adres autora: dr Piotr Kuropka, ul. Ko¿uchowska 5, 51-631 Wroc³aw
