Badanie odporności rzepaku ozimego na porażenie przez Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary.

Eligia Starzycka, Michał Starzycki, Henryk Cichy*, Katarzyna Mikołajczyk Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Roślin Oleistych w Poznaniu

*Zakład Doświadczalny Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Małyszynie

Badanie odporności rzepaku ozimego na porażenie

przez Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary

Examination on resistance of winter oilseed rape (B. napus)

to Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary

Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary jest

jedną z groźniejszych chorób rzepaku ozimego. Patogen często występuje lokalnie, przyczynia-jąc się do dużego spadku plonu nasion. Na świecie obserwuje się coraz większe zaintereso-wanie samym patogenem oraz formami rzepaku o podwyższonej odporności. Pod względem odporności na S. sclerotiorum przebadano wysoko plonujące odmiany i rody rzepaku ozi-mego. Inokulację metodą pinezkową wykonano w okresie pełni kwitnienia. Po zbiorze oceniono liczbę porażonych roślin oraz procent obniżenia plonu nasion w stosunku do roślin kontrolnych. Najmniejsze porażenie obserwowano u odmian: MAH 1996, Valesca, Passat, Libero, BKH 894; a największe u odmian: Leo, Silvia, Kana. Naj-mniejszy spadek plonu odnotowano u odmian: Passat, BOH 1794, Jantar; a największy u odmian: Limbo, BKH 894, MAH 2196, Leo, Lirajet. Aby stwierdzić ewentualny polimorfizm pomiędzy DNA sklerocjum a wyhodowaną z niego grzybnią wykonano dodatkowo analizę PCR – RAPD przy użyciu 10 starterów. Pomiędzy badanymi patotypami nie stwier-dzono polimorfizmu.

Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary belongs

to the most dangerous diseases of winter oilseed rape, causing a significant decrease in seed crop. Interest in the pathogen itself and also in rapeseed forms having higher resistance is still increasing worldwide. Winter oilseed rape varieties and cultivars leading in yield were examined concerning S. sclerotiorum resistance. „Drawing-pin” method of inoculation was performed during full flowering stage. A number of infected plants and percentage of seed crop decrease were estimated in comparison with control plants after harvest. Cultivars: MAH 1996, Valesca, Passat, Libero and BKH 894 showed the lowest number of infected plants whereas cultivars: Leo, Silvia and Kana — the highest one. The lowest seed crop decrease calculated per one infected plant was observed for varirties: Passat, BOH 1794, Jantar and the highest one for: Limbo, BKH 894, MAH 2196, Leo, Lirajet. Additional PCR – RAPD analysis was performed with the use of 10 primers in order to search for polymorphism between sclerotium and mycelium DNA’s. No polymorphism was detected among the examined phathotypes.

Wstęp

Zgnilizna twardzikowa powodowana przez Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary jest jedną z groźniejszych chorób rzepaku ozimego. Pierwotnym źródłem zakażenia roślin rzepaku jest najczęściej gleba skażona resztkami pożniwnymi

przedplonu. Największe jednak znaczenie w porażeniu roślin w warunkach natu-ralnych mają przenoszone przez wiatr zarodniki workowe (askospory), powstałe w owocnikach (apotecjach) wyrosłych ze sklerocjów. Krytycznym okresem porażenia dla rzepaku jest faza pełni kwitnienia, w której obserwuje się największy stopień uszkodzenia roślin. Patogen często występuje lokalnie, przyczyniając się do dużego spadku plonu nasion, przekraczającego w wielu wypadkach poziom 30% i więcej. Na świecie obserwuje się duże zainteresowanie samym patogenem oraz formami rzepaku o podwyższonej odporności (Starzycka i Starzycki 1994; Sansford 1995; Philips i Raymer 1995; Turner i Hardwick 1995; Davies 1995; Morral i Thomson 1995; Hu 1995; Luth i Eiben 1995; Mullins i in. 1995).

W prezentowanym opracowaniu przebadano pod względem odporności na

S. sclerotiorum wysoko plonujące odmiany i rody rzepaku ozimego. Podjęto także

próbę analizy patogena przy pomocy techniki PCR – RAPD.

Materiały i metody

Inokulację 26 rodów i odmian rzepaku ozimego metodą pinezkową (Starzycka i Starzycki 1997) wykonano w roku 1997 w okresie pełni kwitnienia rzepaku na poletkach hodowlanych ZDHAR w Małyszynie. Do inokulacji roślin wykorzystano agresywny poznański patotyp Ss–3. Doświadczenie zostało wyko-nane w dwóch powtórzeniach. Łącznie, na pojedynczym analizowanym obiekcie (odmiana lub ród) inokulowano 20 pojedynków wybierając je z środkowej części łanu. Taka sama liczba egzemplarzy dla każdego z powtórzeń stanowiła kontrolę. Po zbiorze oceniono liczbę porażonych roślin oraz procent obniżenia plonu nasion w stosunku do roślin kontrolnych. Do obliczeń statystycznych wykorzystano test t-Studenta.

Aby stwierdzić ewentualny polimorfizm pomiędzy DNA sklerocjum a wyho-dowaną z niego grzybnią wykonano analizę PCR – RAPD przy użyciu 10 starterów RAPD firmy OPERON Technologies, oznaczonych: W02, W04, W06, W07, W09, W011, W012, W015, W16, W017. Analizie poddano dwa patotypy: Ss–3 z Pozna-nia i M–11 z Małyszyna. Izolację DNA wykonano wg zmodyfikowanej metody Doyle i Doyle (1990), a analizę RAPD wg metody Williams’a i in. (1990).

Wyniki

Wyniki porażenia różnych odmian i rodów rzepaku ozimego zostały przedsta-wione w tabeli 1. Na fotografii 1 przedstawiono rozwój grzybni i sklerocjów, z których po wykonaniu analizy DNA PCR – RAPD dla dwóch różnych patotypów (fot. 2, 3) nie stwierdzono polimorfizmu.

Tabela 1 Porównanie plonu rodów i odmian rzepaku ozimego, roślin porażonych grzybem

S. sclerotiorum do plonu roślin kontrolnych — Comparison between seed crop value of winter oilseed rape varieties and cultivars infected with S. sclerotiorum fungus and uninfected control plants (1997)

Lp. No. Odmiana lub ród Variety or cultivar Liczba roślin porażonych na 20 inokulowanych Number of infected plants from 20 plants inoculated Średni plon nasion z roślin inokulowanych

Average seed crop value of inoculated plants [g] Średni plon nasion z roślin kontrolnych Average seed crop value of control plants [g] % obniżenia plonu w wyniku porażenia przez S. sclerotiorum Percentage of seed crop decrease caused

by S. sclerotiorum infection 1 Leo 11 9,6 13,0 26,2 2 Silvia 11 12,1 15,6 22,4 3 Kana 9 15,3 20,4 25,0 4 Mar 8 17,9 20,9 14,4 5 Polo 8 16,8 21,9 23,3 6 Karola 8 21,1 25,5 17,3 7 Limbo 8 11,1 19,1 41,9 8 Marita 6 16,7 19,4 13,9 9 Linfort 6 16,8 21,1 20,4 10 Bolko 5 16,3 21,5 24,2 11 Lirajet 5 14,7 21,6 31,9 12 Liropa 5 14,6 18,0 18,9 13 Wotan 5 16,1 20,6 21,8 14 MAH 2096 5 19,3 23,8 18,9 15 MAH 2196 5 16,2 25,2 35,7 16 Bermuda 5 23,9 26,8 10,8 17 Jantar 5 19,3 21,4 9,8 18 LAH 895 5 18,2 23,4 22,2 19 Bor 4 21,4 25,8 17,8 20 LAH 595 4 19,1 26,2 27,1 21 BOH 1794 4 32,3 35,8 9,7 22 BKH 894 3 21,3 31,5 32,4 23 Libero 3 19,7 23,7 16,9 24 Passat 3 26,3 28,4 7,4 25 Valesca 2 17,7 21,9 19,2 26 MAH 1996 1 14,7 18,7 21,4

wartość TEST.T = 3,88645E-17**

Najmniej porażonych roślin po inokulacji obserwowano u odmian: MAH 1996, Valesca, Passat, Libero, BKH 894; a najwięcej u odmian: Leo, Silvia, Kana. Najmniejszy spadek plonu porażonych roślin odnotowano u odmian: Passat, BOH 1794, Jantar; a największy u odmian: Limbo, BKH 894, MAH 2196, Leo, Lirajet.

Fot. 1. Patotypy S. sclerotiorum analizowane metodą PCR – RAPD — S. sclerotiorum pathotypes

analyzed with PCR – RAPD

21226 2027 1904 1584 1375 947 831 564

a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b

a — DNA z grzybni — DNA from mycelium; b — DNA ze sklerocjów — DNAfrom sclerotium

Fot. 2. Wyniki analizy PCR – RAPD, Patotyp Ss-3 — Results PCR – RAPD, pathotypes Ss-3

21226 2027 1904 1584 1375 945 831 564

a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b

Dyskusja

Dotychczasowe prace w zakresie poznania patogena S. sclerotiorum, a także porażenia przez niego rzepaku ozimego, oprócz badań w Instytucie Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Poznaniu (Starzycka i in. 1993; Starzycka i Starzycki 1994; Starzycka i Starzycki 1997) były wykonane przez zespół fitopatologów IGR w Poznaniu (Frencel i in. 1991; Lewartowska i in. 1993, 1996a, 1996b; Jędryczka i in. 1996, 1997). W prezentowanym opracowaniu otrzymano zgodne wyniki poziomu porażenia różnych odmian rzepaku ozimego po inokulacji patogenem z wynikami zespołu IGR, pomimo stosowanych różnych sposobów zakażania. Nasze badania zostały rozszerzone o wyniki obniżenia plonu rzepaku ozimego (tab. 1) spowodowane inokulacją grzybem S. sclerotiorum (Starzycka i Starzycki 1997). Wykazano, że odmiany: Passat, MAH-1996, BOH-1794, Jantar miały najmniejszą liczbę porażonych roślin oraz charakteryzowały się najmniejszym spadkiem plonu, natomiast odmiany najsilniej porażane i wykazujące najwyższy spadek plonu to: Leo, Silvia, Kana, Limbo, MAH-2196, Lirajet. Stwierdzono ponadto testem — T (Test.T 3.88645E-17**) statystycznie istotne różnice pomiędzy średnim plonem nasion roślin inokulowanych, w stosunku do średniego plonu roślin kontrolnych. Powyższa informacja powinna być dobrą wskazówką dla rolnictwa w doborze odmian rzepaku do uprawy zwłaszcza tam, gdzie występuje duże zagrożenie ze strony omawianego patogena.

Na świecie inną grupę zagadnień stanowią badania związane z genetyką odporności roślin i poznaniem samego patogena. Brak dotychczas opracowań opisujących całkowitą odporność roślin rzepaku jarego i ozimego na porażenie

S. sclerotiorum. Informacją w tej dziedzinie może być praca Dickson’a i Petzoldt’a

(1994) o całkowitej odporności obserwowanej u pokrewnego gatunku Brassica

oleracea L. Autorzy skrzyżowali formy podatne i odporne kalafiora na S. sclerotiorum. W pokoleniu F2 oraz krzyżowaniu wstecznym otrzymali oni wynik

wskazujący na monogeniczny charakter odporności. Dodatkowo autorzy wskazali na możliwość występowania genów modyfikatorów odpowiedzialnych za tę odpor-ność. Podobnie Page i in. (1997) badając odporność koniczyny czerwonej przy pomocy analizy PCR – RAPD stwierdzili także monogeniczny charakter ności roślin na porażenie przez S. sclerotiorum. Interesujące badania nad odpor-nością B. napus wykonano w 1995 roku (Grezes-Besset i in. 1995) wprowadzając do rzepaku za pomocą Agrobacterium rhizogenes gen warunkujący syntezę chitynazy. Odporność na porażenie przez patogena S. sclerotiorum po 54 dniach od inokulacji roślin transgenicznych była na tyle wysoka, że mała plama infekcyjna wielkości 6,9 cm nie stanowiła zagrożenia dla roślin. U roślin kontrolnych, nie transformowanych obserwowano całkowity brak odporności.

W dziedzinie poznania patogena S. sclerotiorum interesujące badania wykonali Kohn i in. (1991). Wykorzystali oni technikę Southern blotting

polega-jącą na hybrydyzacji sond z badanymi odcinkami DNA, przeniesionymi z żelu na membranę nitrocelulozową. Sondami w tych pracach najczęściej były znane, znakowane radioaktywnie fragmenty DNA, których obecność stwierdzano na podstawie chemiluminiscencji. Technika ta pozwoliła na określenie w badanym DNA odcinków komplementarnych do sondy o znanej sekwencji zasad. Przy pomocy wspomnianej metody Kohn i in. (1991) badając 63 izolaty S. sclerotiorum przeprowadzili molekularną identyfikację szczepów grzyba znajdujących się w jednej grupie zgodności grzybniowej (MCG — Mycelial Compatibility Group). Po analizie DNA wyniki pozwoliły na stwierdzenie, że badana populacja jest podzielona na dwie podstawowe mało różniące się grupy. Dodatkowo, w celu identyfikacji liczby chromosomów, wspomniani badacze przy użyciu pulsującego pola elektrycznego stwierdzili występowanie w strzępkach grzyba 5 lub 6 chromo-somów. W naszych badaniach nad S. sclerotiorum dwóch patotypów pochodzą-cych z różnych miejsc, przy użyciu techniki RAPD i 10 starterów nie stwierdzi-liśmy polimorfizmu, co stanowi informację o mało zróżnicowanej populacji patogena w rejonie Wielkopolski. Otrzymane przez nas zgodne wyniki analizy DNA – RAPD ze sklerocjów i grzybni wskazują na możliwość stosowania dowolnych fragmentów grzyba w celu izolacji, a następnie identyfikacji DNA (także z apotecjów, wyników nie przedstawiono).

Wnioski

• • • •

Po indywidualnej inokulacji roślin odnotowano różnice odmianowe w pozio-mie plonowania porażonych pojedynków.

Wśród odmian: Passat, MAH 1996, BOH 1794, Jantar odnotowano najmniej-szą liczbę porażonych roślin oraz najmniejszy spadek plonu.

Odmiany najsilniej porażane oraz wykazujące najwyższy spadek plonu to: Leo, Silvia, Kana, Limbo, MAH 2196, Lirajet.

Analiza PCR – RAPD przy użyciu 10 różnych starterów, nie wykazała poli-morfizmu pomiędzy DNA ze sklerocjów i grzybni S. sclerotiorum.

Literatura

tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 3: 1010-1011. Dickson M. H., Petzoldt R. 1994. White mold or Sclerotinia resistance in B. oleracea. Ninth Crucifer

Doyle J. J., Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissues. Focus, 12: 13-15.

Frencel I. M., Lewartowska E., Jędryczka M. 1991. The spectrum and severity of fungal diseases in field infections of winter oilseed rape in Poland. Integrated Control in Oilseed Crops, Proceedings of the meetings at Rothamsted – United Kingdom, 1-3 March 1990, WPRS Bulletin 1991/XIV/6: 137-140.

Grezes-Besset B., Grison R., Villeger M. J., Nicolas C., Topan A. 1995. Field testing against four fungal pathogens of transgenic Brassica napus constitutively expressing a chitinase gene. Rapeseed today and tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 3: 781-783.

Hu B. C. 1995. Stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) tolerance and disease avoidance in CMS lines of

Brassica napus. Rapeseed today and tomorrow, 9th International Rapeseed Congress,

Cambridge, UK 4-7 July 1995, 4: 1211-1213.

Jędryczka M., Lewartowska E., Frencel I., Drobnik M. 1996. Evaluation resistance of polish oilseed winter rape cultivars to stem canker and Sclerotinia stem rot. Plant Breeding and Seed Science, Vol. 40, No. 1-2: 17-23.

Jędryczka M., Lewartowska E., Ziman L. 1997. Pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum strains from different host-plants to oilseed rape (Brassica napus), Tenth Crucifer Genetics Workshop, ISHS Symposium on Brassicas, 23-27 September 1997, Rennes – France: 196.

Kohn L. M., Stasovski E., Carbone I., Royer J., Anderson J. B. 1991. Mycelial incompatibility and molecular markers identify genetic variability in field populations of Sclerotinia sclerotiorum. Phytopathology 81: 480-485.

Lewartowska E., Jędryczka M., Frencel I., Górski P., Konopka W. 1993. Występowanie chorób grzybowych rzepaku ozimego w rejonach Żuław Gdańskich (1987–1992). XXXIII Sesja Naukowa Instytutu Ochrony Roślin, Poznań: 156-161.

Lewartowska E., Jędryczka M., Frencel I. 1996a. Charakterystyka polskich izolatów grzyba

Sclerotinia sclerotiorum z porażonych roślin rzepaku ozimego. Postępy w Ochronie Roślin,

1996. Vol. 36, No. 2: 179-181.

Lewartowska E., Jędryczka M., Frencel I. 1996b. Patogeniczność izolatów grzyba Sclerotinia

sclerotiorum (Lib.) de Bary z lokalnych środowisk uprawy rzepaku ozimego na terenie kraju.

Choroby roślin a środowisko, Polskie Towarzystwo Fitopatologiczne, Poznań, 27-28 czerwca 1996: 259-262.

Luth P., Eiben U. 1995. First results in the development of biocontrol agent against Sclerotinia

sclerotiorum, the disease-causing agent of stem rot in oilseed rape. Rapeseed today and

tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 4: 1275-1277. Morral R. A. A., Thomson J. R. 1995. Four years experience in western Canada with commercial

petal testing to forecast Sclerotinia. Rapeseed today and tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 3: 1013-1015.

Mullins E., Quinlan C., Jones P. 1995. Studies on partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum in oilseed rape. Rapeseed today and tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 4: 1280- 1282.

Page D., Delclos B., Aubert G., Bonavent J. F., Mousset-Declas C. 1997. Sclerotinia rot resistance in red clover: Identification of RAPD markers using bulked segregant analysis. Plant Breeding (1997) 116: 73-78.

Phillips D. V., Raymer P. L. 1995. The relationship between time of development of apothecia and appearance of symptoms of Sclerotinia sclerotiorum stem rot in the southeastern USA. Rapeseed today and tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 2: 637-639.

Sansford C. E. 1995. Oilseed rape: development of stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) and its effect on yield. Rapeseed today and tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 2: 634- 636.

Starzycka E., Starzycki M., Krzymański J. 1993. Doskonalenie metod oceny odporności rzepaku ozimego na Sclerotinia sclerotiorum. Postępy Nauk Rolniczych, 5/93: 141-144.

Starzycka E., Starzycki M. 1994. Badanie podatności pędów i liści rzepaku ozimego na porażenie przez Sclerotinia sclerotiorum. Rośliny Oleiste, XV: 83-85.

Starzycka E., Starzycki M. 1997. Nowa metoda inokulacji roślin rzepaku ozimego patogenem

Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Rośliny Oleiste, XVIII: 315-320.

Turner J. A., Hardwick N. V. 1995. The rise and fall of Sclerotinia sclerotiorum, the cause of stem rot of oilseed rape in the UK. Rapeseed today and tomorrow, 9th International Rapeseed Congress, Cambridge, UK 4-7 July 1995, 2: 640-642.

Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., Tingey S. V. 1990. DNA poly-morphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleid Acid Research 18: 6531-6535.